Summary
호중구 세포 트랩 (그물) DNA, 히스톤 및 호중구 단백질의 네트워크입니다. 선천성 면역 반응의 구성 요소이지만, 그물자가 면역 및 혈전증에 연루되어있다. 이 프로토콜은 개과 호중구 분리 및 마이크로 플레이트 형광 분석법을 이용하여 그물 정량화하기위한 간단한 방법을 설명한다.
Introduction
만 70 애완 동물 개 1 혼자 미국에 있습니다. 소중한 가족으로,이 동물은 종종 가장자리 치료를 절단받을 수 있습니다. 그들은 우리의 환경을 공유 마찬가지로 때문에, 개는 인간의 질병 1의 병인과 치료에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 그러나, 의학적 치료 또는 그 반대에 인간 의약 발견 변환 여부는 완전히 같은 선천성 면역 반응 심지어 고도로 보존 시스템 종 변형을 특성화하는 것이 중요하다. 송곳니와 인간의 선천성 면역 시스템 사이의 차이의 예는 개 호중구 (2) 높은 표현 CD4을 포함한다; 개 3의 세포질 플라 젤린 센서 IPAF의 기능 동족체의 부재와 육식 4에서 카스파 제 1/4 하이브리드의 표현.
호중구 세포 트랩 (그물) 선천성 면역 (5)의 비교적 최근에 발견 된 구성 요소입니다. 그물 네트워크입니다감염성 또는 염증성 자극 (6)의 넓은 범위에 응답하여 해제 DNA, 핵 단백질의 입상. NET 같은 구조 닭 7, 8 물고기, 연체 동물류 (9, 10)을 포함하는 많은 종 acoelomates 통해 입증되었지만 종 차이가있다. 예를 들어, 쥐의 호중구 인간 호중구보다 NETosis 자극에 더 느리게 응답, 덜 확산 그물 (11)을 형성한다. 그물 직접 병원균 12,13 죽이는 데 관여 할 수 이상의 논쟁 미생물 포획, 복수 종 증거하는 큰 몸체있다. 그러나 NET 구성 요소는 또한, 조직 손상을 강화 14, 15을자가 항원으로 혈전증 행동을 촉진. 그물의 유익하고 해로운 영향 사이의 균형은 종과 관심의 조건에 모두 그물을 조사하는 것이 중요하다 제안, 다른 질병과 다른 종 사이에 차이가있을 수 있습니다.
여기에 우리유도와 송곳니 호중구 그물의 방출을 측정하기위한 간단한 프로토콜을 설명한다. 이 방법은 호중구 (16)을 분리하여 다른 종 NETosis을 유도하기 위해 사용 된 것과 유사하지만, 이러한 효능 제 농도 및 배양 시간 등의 조건은 개과 호중구에 대해 최적화되었다. 유사한 NET 정량화 DNA 분리 분석은 다른 종에서 설명되었지만, 여기에 제시된 방법은 또한 개 8,17,18에 최적화되어있다.
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Protocol
모든 실험은 아이오와 주립 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회에서 윤리적 허가 하였다.
1. 혈액 컬렉션
- 직접 항응고제로 복재, 두부 또는 경정맥에서 혈액의 9 ml의 그리기 (예를 들어, 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA), 1.8 mg의 K 2 EDTA / ml의 혈액) vacutainers, 또는 EDTA 함유 혈액 튜브에 즉시 전송 주사기로. 부드럽게 굴러 또는 혈액 항응고제의 적절한 혼합을 보장하기 위해 혈액 튜브를 반전한다.
2. 호중구 격리
- 한 50㎖ 원추형 튜브에 멸균 실온 동량 혈액을 3 % 혼합하여 부드러운 반전 덱스-500 (0.9 % 멸균 식염수에 만든). 실온에서 18 ~ 20 분 동안 똑바로 서 둡니다. 그것은 더 이상 낮은 적색 층에 의해 오염없이 수집 할 수 없습니다 때까지 새로운 튜브에 밀짚 색깔의 상위 계층을 전송합니다. 일의 적혈구즉 원래 튜브는 폐기 될 수있다.
- 4 ℃에서 10 분 동안 500 XG에 뜨는을 원심 분리기. 오프 그리기 및 상층 액을 버린다. 수동 10 ㎖를 실온 멸균 인산 완충 식염수 (PBS)으로 세포 펠렛을 다시 일시. 그 텍싱이 프로토콜의 모든 단계에서 다시 일시 중지 호중구에 사용하지 않아야합니다. 수동으로하지 않고 또한 세포 수율을 극대화하기 위해 프로토콜을 통해 추천 상층 액을 붓는 것보다, 오프 그리기.
- 한 50㎖ 원추형 튜브에 실온 polysucrose 나트륨 diatrizoate 세포 분리 용액 (예, Histopaque 1077) 10 ㎖를 추가한다. 조심스럽게 세포 분리 용액을 통해 셀 - 함유 용액을 층을 포함한다. 셀의 수율을 감소시킬 수 실온으로 평형화되지 않았다고하여 세포 분리 용액을 참고.
- 브레이크 해제와 함께 실온에서 30 분 동안 300 XG에 원심 분리기.
- 호중구는 그라데이션의 가장 낮은 층에있는 바와 같이, 오프 그릴과 uppe을 폐기혈장, 혈소판, 단핵 세포의 좁은 대역 흰색 및 밀도 구배 매체를 클리어 층 상층 이루어지는 R 3 층.
- 나머지 적혈구를 용해시키기 위해, 실온에서 물 10ml에 호중구 펠렛을 다시 일시.
- 30 초 후, 멸균 실온 1.8 % 염화 나트륨 10 ㎖를 첨가하여 긴장성 복원하고 온화한 역전에 의해 혼합한다.
- 4 ℃에서 5 분 동안 500 XG에 원심 분리기. 상층 액을 그려 버린다.
- 펠렛 여전히 적색 인 경우, 용해하는 단계를 반복한다. 펠렛은 백색 (또는 용해 이미 두 번 수행 된 경우), 부드럽게 멸균 PBS 10 ㎖로 세포를 다시 정지합니다.
- 자동 카운터 또는 혈구를 사용하여 세포를 계산합니다. 일반적인 금리는 혈액 1 ㎖ 당 적어도 10 6 세포이다.
- 4 ℃에서 5 분 동안 500 XG에 원심 분리기. 상층 액을 그려 버린다.
- 멸균 PBS 실온에서 원하는 농도로 세포를 다시 일시. FOR DNA를 분리 분석은 ml의 당 5 × 10 6 세포에서, 섹션 2에 resuspend을 설명했다.
- 경우에 따라, 세포의 소량을 직접 전송하거나 유리 슬라이드에 cytocentrifuge을 사용. 세포가 건조 얼룩 (가) '지침을 제조에 따라 빠른 고정 및 염색 키트를 사용 할 수 있습니다. 현미경으로 관찰 할 때 호중구의 분리가 성공한 경우 유핵 세포의 적어도 95 %는 최소한의 오염 적혈구와 과립구 (호중구, 호염기구, 호산구)이어야한다.
3. DNA 자료 분석
- 호중구 차단 후 바로 DNA 자료 분석을 설정합니다.
- 세포 응집 광 현미경 원액 시험에 있으면, 즉시 분석을 설정하기 전에 멸균 70 ㎛의 멸균 필터를 이용하여 세포 현탁액을 통과한다.
- 멸균 96 웰 플레이트의 각 실험 웰에 5 × 104 세포 / 웰을 추가; 작용제 및 로스웰 파크 메모페놀 레드와 100-200 μL의 최종 부피로 0.5 % 열 - 불 활성화 소 태아 혈청이없는 리알 연구소-1640 (RPMI) 매체. 호중구 원액 PBS 동량으로 대체되는 작용제 당 적어도 두 블랭크 웰을 포함한다. 각 작용제에 대한 빈 우물을 설정하면 형광 분석과 함께 작용제에 의해 작용제 또는 간섭의 DNA 오염을 배제 중요합니다.
- 탄산 가스 (4 %) 인큐베이터에서 30 분 동안 39 ℃에서 인큐베이션.
- 원하는 농도와 세포 투과성 핵산 염료에 효능을 추가합니다. 다른 핵산 염료 사이에 다릅니다 세포 투과성 염료의 최적 농도를합니다. 작용제 미디어 동량으로 대체되는 무 자극 제어는 각각의 실험에 포함되어야한다.
주 : 웰 사이의 일관된 상태를 유지하기 위해 배양액의 유사한 양의 효능을 희석하는 것이 바람직하다. (200)의 최종 아니라 볼륨 &# 181; 난 성공적으로 사용되어왔다이이 변경되는 경우, 잘 볼륨은 모든 조건이 동일 유지해야한다. 포볼 -12- 미리 스테이트 -13- 아세테이트 (PMA) (최종 농도 ≥0.1 μM) 혈소판 활성화 인자 (PAF) (최종 농도 ≥31 μM)을 양성 대조군으로 사용할 수있다. 작용제 중복 적어도 측정해야한다. - 39 ° C에서 품어. 2시간 후, 또는 소정의 간격으로 마이크로 플레이트 판독기를 사용하여 형광을 측정한다. 최적의 시간 간격을 사용 작용제에 따라 달라질 수 있습니다.
참고 : 파장이 사용 염료에 따라 달라집니다. - 평균 형광을 계산하기 전에 빈 형광을 뺍니다.
- 개인간 및 플레이트 사이의 비교를 위해, 비 자극 된 웰의 평균 형광 자극 웰의 평균 형광을 나누어 형광 폴드 변화를 계산한다.
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Representative Results
이 프로토콜을 이용하여, 양성 대조군, 및 PAF PMA로 호중구를 자극 후의 형광 강한 배의 변화가있을 것이다. 비 자극 세포 (범위 2.0-5.8, N = 5 개) 18에 비해 형광의 평균 4.0 배 증가에서 1 시간 결과 31 μM PAF와 그림 1B, 송곳니 호중구의 자극에 도시 된 바와 같이. 0.1 μM (도 1a)에서 PMA 2 시간까지 형광을 증가시키지 않는 느린 작용제하지만 궁극적 유사한 배 형광 증가 생성 (평균 : 3.3 범위 1.36-5.4, N = 5 마리) 18. PAF가 높은 농도에 비해 비교적 저렴하고 광범위 뮤린 및 인간 연구에 사용되었다 : 그 느린 반응 속도에도 불구하고, PMA 장점은 양성 대조군으로 존재한다.
핵산 염료의 형광은 아니다세포 사멸은 다른 메커니즘이있는 경우 또는 시약 DNA로 오염되는 경우 NET 형성 pecific는 또한 발생할 수있다. 도 2에 도시 된 바와 같이, 상용 LPS 준비 아마도 인해 세균 DNA의 오염을, 호중구의 부재 하에서 매우 높은 형광을 일으켰다. 이러한 면역 형광 같은 다른 방법을 통해 NET 형성을 확인하는 것이 좋습니다.
도 1 : PMA 다른 속도론과 세포 투과성 핵산 염료 PAF 증가 형광 호중구 세포 투과성 핵산 염료의 존재하에 0.1 μM PMA (A) 또는 31 μM PAF (B)로 자극 하였다.. 형광은 매시간 간격으로 계산 비 자극 세포에 비해 자극 세포의 형광의 배 변화를 측정 하였다. 형광 증가d를 크게 PMA에 대한 시간 1 ~ 2 (반복 측정 페로 니의 보정 여러 t-테스트, 다수의 조정 P = 0.04 다음 편도 ANOVA, 오차 막대가 5 개인에 대한 표준 오차는 평균 ±에게 있습니다)하지만 이미 의해 PAF에 대한 plateaued했다 1 시간. . 개 호중구 세포 트랩 건강과 면역 매개 성 용혈성 빈혈 :이 수치는 등 너무 개 캐스트 그물, 제프리 U에서 수정되었습니다. 수의학 면역학 및 면역 병리, 168 (3-4), 262-8, 도이 :. 10.1016 / j.vetimm.2015.10.014 (2015) 18 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 빈 우물이 작용제에 의해 DNA 오염이나 간섭을 배제하는 것이 중요 LPS의 상용 소스.RPMI를 함유하는 무 세포 웰에 첨가 하였다. 비 자극 호중구를 포함하는 우물에 비해 형광 큰 배 변화는 세균의 DNA와 작용제의 오염을 제안한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
제시된 DNA 분리 분석은 세포 DNA에 대한 용이 한 정량 분석한다. 이 방법은 다른 종에서 NET 형성을 평가하기 위해 사용 된 유사한 기술에서 채택되었지만, 원심 속도 작용제 농도와 항온 처리 시간은 개과 호중구 8,17,18 함께 사용하기위한 방법을 최적화하기 위해 변경되었다. 유사한 조정이 다른 종의 방법을 적용하도록 할 수있다. 분석은 유동 세포 계측법 또는 이미지 분석으로 NETosis을 측정하는 다른 방법에 비해 간단하고 저렴하다. 또한,이 방법은 상업적으로 생산 누구를 검증 종 반응 항체가 종종 사용할 수없는 위해 이렇게 개에 사용하기에 이상적입니다 NET 구성 요소에 대한 항체를 필요로하지 않습니다.
이 방법의 중요한 한계는 NET 형성 세포 투과성 핵산 염료의 특이성이 부족하다. 이 염료는 죽고 죽어가는 세포, 바인딩 DNA를 입력하고 형광. 따라서, FLuorescence는 NET 형성을위한 특정하지 않습니다. 시각적으로 작용 물질이 세포 사멸의 다른 형태보다는 NET 형성을 유도하는 확인에 대한 정량적 분석과 병행하여 다른 기술 (예를 들면, 면역 형광)를 사용하는 것이 좋습니다. 상기 분석은 잠재적으로 독성 생체를 정량화하는 수단으로서, 예를 들면, 세포 죽음에 대한 일반적인 스크리닝 검사로서 이용 될 수있다.
프로토콜은 간단하지만, 성공을 보장하기 위해 필요한 중요한 단계가있다. 프로토콜에 명시된 바와 같이 우선, 그 상등액을 피펫으로 빠져보다는 튜브 반전 폐기하는 것이 중요 호중구 분리시 과도한 세포 손실을 방지한다. 둘째, 분석의 성공은 배양에 걸쳐 생존하고 휴식 상태에 남아있는 비 자극 된 대조군 세포에 의존한다. 호중구는 매우 세심한주의가 무 외상성 혈액 수집 t에 지불해야하는 프로토콜 동안 모든 단계에서 활성화 될 수 있습니다echnique 및 호중구 분리시 외상 처리 (예를 들어, 텍싱)를 피하는. 이 분석을 세포를 분리 또는 설치의 지연 (19)을 피해야한다 그래서 호중구가 제한된 수명을 기억하는 것이 중요하다. 작용제의 장기간 배양이 시도되는 경우,이 기간 동안 비 자극 된 세포의 생존이 확인되어야한다.
도 1에 도시 된 바와 같이, 작용제 NET 그들의 응답하여 개 사이에 상당한 변화가있다. 그러나, 분석은 10 18 복제에 따라 9 %의 내부 분석 변화와 같은 동물에서 복제 사이에 합리적으로 일치해야합니다. 복제간에 큰 차이가있는 경우, 세포 응집 가능성이 담당한다. 세포 응집을 감소시키는 대책이 아니라 종래 부드럽게 분리 걸쳐 세포의 치료는 DNA 분석을 설정하고, 상기 셀 재고 필터링 완충액을 함유하는 칼슘보다 PBS에서 세포를 유지하는 것을 포함세포를 도금하기 전에 정지.
이러한 단계를 따라하는 경우,이 프로토콜은 실험 조건과 효능의 넓은 범위에 대한 응답으로 NET 형성의 정량화 할 수 있습니다. 이러한 연구는 개과의 건강과 질병에 그물의 역할에 대한 우리의 이해를 깊게 할 수 있습니다. 예를 들어,이 기술은 건강 개와 NETosis 손상 또는 향상시킬 수있는 면역 또는자가 면역 질환을 가진 사람들 간의 NET 방출의 비교를 허용한다. 이러한 면역 등의 다른 기술과 결합 될 때 대안 적으로, 상기 분석은 NETosis 및 NETosis의 신규 억제제를 유도 할 수있는 신규의 효능을 확인하기 위해 사용될 수있다.
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Disclosures
저자는 공개 아무것도 없어.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plastic Whole Blood tube with spray-coated K2EDTA | BD | 367835 | |
| Histopaque-1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | |
| Dextran-500 | Accurate chemical and scientific corp. | AN228410 | |
| Phosphate buffered saline | ThermoFisher scientific | 20012043 | |
| Fetal bovine calf serum, heat inactivated | ThermoFisher scientific | 10100139 | |
| RPMI Media 1640, without phenol red or L-glutamine | ThermoFisher scientific | 32404-014 | Should be free from phenol red |
| 96 well flat bottomed sterile polystyrene plate | Falcon | 353072 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| Platelet activating factor | Sigma-Aldrich | P4904 | |
| SYTOX Green Nucleic Acid Stain | ThermoFisher scientific | S7020 | |
| Synergy 2 Multi-Mode Reader | BioTek | NA |
References
- Schiffman, J. D., Breen, M. Comparative oncology: what dogs and other species can teach us about humans with cancer. Philos Trans Rl Soc B Biol Sci. 370, 1673 (2015).
- Williams, D. L. Studies of canine leucocyte antigens: a significant advance in canine immunology. Vet J. 153 (1), 31-39 (1997).
- Eckhart, L., et al. Duplication of the caspase-12 prodomain and inactivation of NLRC4/IPAF in the dog. Biochem Biophys Res Commun. 384 (2), 226-230 (2009).
- Eckhart, L., et al. Identification of novel mammalian caspases reveals an important role of gene loss in shaping the human caspase repertoire. Mol Biol Evol. 25 (5), 831-841 (2008).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin. J Cell Biol. 198 (5), 773-783 (2012).
- Chuammitri, P., et al. Chicken heterophil extracellular traps (HETs): novel defense mechanism of chicken heterophils. Vet Immunol Immunopathol. 129 (1-2), 126-131 (2009).
- Palić, D., Ostojić, J., Andreasen, C. B., Roth, J. A. Fish cast NETs: neutrophil extracellular traps are released from fish neutrophils. Dev Comp Immunol. 31 (8), 805-816 (2007).
- Poirier, A. C., Schmitt, P., Rosa, R. D., Vanhove, A. S., Kieffer-Jaquinod, S., Rubio, T. P., et al. Antimicrobial histones and DNA traps in invertebrate immunity: evidences in Crassostrea gigas. J Biol Chem. 289 (36), 24821-24831 (2014).
- Robb, C. T., Dyrynda, E. A., Gray, R. D., Rossi, A. G., Smith, V. J. Invertebrate extracellular phagocyte traps show that chromatin is an ancient defense weapon. Nat Commun. 5, 4627 (2014).
- Kaplan, M. J., Radic, M. Neutrophil extracellular traps: double-edged swords of innate immunity. J Immunol. 189 (6), 2689-2695 (2012).
- Menegazzi, R., Decleva, E., Dri, P. Killing by neutrophil extracellular traps: fact or folklore? Blood. 119 (5), 1214-1216 (2012).
- Parker, H., Albrett, A. M., Kettle, A. J., Winterbourn, C. C. Myeloperoxidase associated with neutrophil extracellular traps is active and mediates bacterial killing in the presence of hydrogen peroxide. J Leukoc Biol. 91 (3), 369-376 (2012).
- Martinod, K., Wagner, D. D.
- Pratesi, F., et al. Antibodies from patients with rheumatoid arthritis target citrullinated histone 4 contained in neutrophils extracellular traps. Ann Rheum Dis. 73 (7), 1414-1422 (2014).
- Nauseef, W. M. Isolation of human neutrophils from venous blood. Methods Mol Biol. 1124, 13-18 (2014).
- Gray, R. D., et al. Activation of conventional protein kinase C (PKC) is critical in the generation of human neutrophil extracellular traps. J Inflamm (Lond). 10 (1), 12 (2013).
- Jeffery, U., et al. Dogs cast NETs too: Canine neutrophil extracellular traps in health and immune-mediated hemolytic anemia. Vet Immunol Immunopathol. 168 (3-4), 262-268 (2015).
- McCracken, J. M., Allen, L. A. Regulation of human neutrophil apoptosis and lifespan in health and disease. J Cell Death. 7, 15-23 (2014).
