Summary
中性粒细胞胞外陷阱（英语教师）是DNA，组蛋白和中性粒细胞的蛋白质网络。虽然先天免疫反应的一个组成部分，母语有牵连的自身免疫和血栓形成。这个协议描述了犬嗜中性粒细胞的分离和使用微板荧光测定教师的量化的简单方法。
Introduction
有超过7000万只宠物狗在美国独自1。为尊贵的家族成员，这些动物经常收到尖端的医疗护理。同样，因为他们分享我们的环境，狗可以提供深入了解人类疾病1的发病机理和治疗。然而，无论是在人类医学成兽医治疗或反之亦然翻译的发现，它彻底表征即使在高度保守的系统种类的变化，例如先天免疫应答是重要的。的犬和人先天免疫系统之间的差异例子包括中性粒细胞的狗2高表达CD4;缺乏胞质鞭毛传感器IPAF犬3功能同系物的和在食肉动物4胱天蛋白酶1/4混合的表达。
中性粒细胞胞外陷阱（英语教师）是先天免疫5的相对最近发现的组成部分。篮网是网络S IN响应释放到大范围炎性或传染性刺激6的DNA的核和颗粒状蛋白质。网状结构已被证实在许多物种包括鸡7，鱼8，软体动物9和acoelomates 10，但也有物种变体。例如，嗜中性粒细胞的小鼠更响应缓慢NETosis刺激比人类嗜中性粒细胞，形成弥漫性减弱英语教师11。有一个庞大的身躯从多个物种蚊帐坑害微生物和更具争议可以直接参与杀灭病原体12,13证据。然而，.NET组件也增强了组织的损伤，促进血栓形成，并作为自身抗原14,15。教师的有益和有害作用之间的平衡可能不同的疾病和不同物种之间变化，这表明，调查无论是在物种和感兴趣条件母语是重要的。
在这里，我们描述了诱导和中性粒细胞犬测量母语释放一个简单的协议。此方法类似于那些用于分离嗜中性粒细胞16和在其他物种中诱发NETosis，但如激动剂浓度和温育时间条件已为犬嗜中性粒细胞进行了优化。类似的NET定量的DNA释放测定也已在其它物种中描述，但这里介绍的方法也为狗8,17,18优化。
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Protocol
所有实验均来自爱荷华州立大学机构动物护理和使用委员会批准伦理进行。
1.采血车
- 绘制的9ml血从隐，头或颈静脉直接进入抗凝剂（ 例如，乙二胺四乙酸（EDTA），1.8毫克的 K 2 EDTA /毫升血）真空采血管，或与直接传送到含有EDTA的血液管的注射器。轻轻摇动或反转血管，以确保血液和抗凝血剂的充分混合。
2.中性粒细胞隔离
- 在50ml锥形管中，用等体积的无菌室温度的混合血3％葡聚糖-500（0.9％无菌盐水组成）轻轻翻转。留在室温下直立18-20分钟。的稻草色上层转移到一个新的试管，直至其不再能够不污染由下红色层收集。在日红细胞Ë原管可被丢弃。
- 离心上清在500 xg离心在4℃下10分钟。抽出并丢弃上清液。手动重新悬浮在10毫升室温的无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）细胞沉淀。注意，涡旋不应该被用来在这个协议中的任何阶段重新悬浮中性粒细胞。手工绘制关闭，而不是浇灭上清还建议在整个协议以最大限度地提高细胞产量。
- 10毫升室温多聚蔗糖和泛影酸钠细胞分离溶液（ 例如 ，的Histopaque 1077）添加到50毫升锥形管中。小心层在细胞分离溶液中的含细胞溶液。注意这并没有平衡到室温可减少细胞产量，使用细胞分离溶液。
- 离心在300×g离心在室温下与制动切断30分钟。
- 嗜中性粒细胞是在梯度的最低层，抽出并丢弃UPPER 3层，血浆和血小板，单核细胞的窄的白色带和密度梯度介质的透明层的上层的构成。
- 以溶解任何残留的红细胞，再悬浮在10毫升室温的水中的嗜中性粒细胞颗粒。
- 30秒后，通过加入10ml的无菌室温1.8％氯化钠恢复张力和轻轻地倒转混合。
- 离心机在500×g离心在4℃下5分钟。抽出上清液并丢弃。
- 如果丸粒仍然是红色，重复裂解步骤。如果颗粒是白色的（或者如果裂解已经执行两次），轻轻地在10ml无菌PBS重新悬浮细胞。
- 计数使用自动计数器或血球细胞。典型产量是每毫升血液中的至少10 6个细胞。
- 离心机在500×g离心在4℃下5分钟。抽出上清液并丢弃。
- 重新悬浮细胞在无菌室温PBS中所需的浓度。佛r中的DNA释放测定在第2节以每毫升5×10 6个细胞中所述，重悬。
- 如果需要的话，直接转移细胞的一小体积或使用cytocentrifuge到载玻片。允许细胞干燥并使用根据制造商的指令的快速固定和染色试剂盒染色。如果在显微镜下观察的嗜中性粒细胞分离已经成功，有核细胞的至少95％应是粒细胞（嗜中性粒细胞，嗜碱性粒细胞，嗜酸性粒细胞）以最小的红细胞的污染。
3. DNA释放分析
- 中性粒细胞后，立即隔离设立DNA释放试验。
- 如果细胞聚集存在于原液通过光学显微镜检查，立即设置在测定前通过无菌70微米无菌过滤器通过细胞悬浮液。
- 到无菌的96孔板的每个测试孔中，加入5×10 4个细胞/孔;激动剂和罗斯威尔公园备忘录不含酚红和补充有0.5％热灭活的胎牛血清100-200微升的最终体积里亚尔研究所-1640（RPMI）培养基。包括其中的中性粒细胞原液是由等体积的PBS替换每激动剂至少两个空白孔。注意，对于每个激动剂设置空白孔是在通过用荧光测定激动剂排除激动剂或干扰的DNA污染重要。
- 孵育在39℃下，在二氧化碳（4％）培养箱中30分钟。
- 在所需的浓度和细胞不可渗透的核酸染料添加激动剂。注意细胞不可渗透的染料的最佳浓度将不同的核酸染料之间变化。其中激动剂由等体积的培养基代替非刺激对照应包括在每个实验。
注意：所希望的是稀释在培养基中的类似体积的激动剂保持孔之间是一致的条件。 200最终也卷＆＃181; l已成功使用，如果这个被改变，以及量应保持在所有条件相同。佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯（PMA）（最终浓度≥0.1微米）或血小板活化因子（PAF）（最终浓度≥31微米）可被用作阳性对照。激动剂应至少一式两份进行测定。 - 孵育在39℃。用酶标仪在2小时后，或在所需的时间间隔测量荧光。需要注意的是最佳的时间间隔将与所用激动剂而变化。
注：波长将依赖于所用的染料。 - 计算平均荧光之前减去空白荧光。
- 允许个人之间以及板之间的比较，由非刺激孔的平均荧光除以刺激孔的平均荧光计算荧光的倍数变化。
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Representative Results
使用该协议，应该有在荧光与阳性对照，PMA和PAF刺激嗜中性粒细胞后强烈的倍数变化。如在图1B中 ，犬嗜中性粒细胞的刺激所示用31微米的PAF 1小时的结果，平均4.0倍的增加的荧光与未刺激细胞（范围2.0-5.8中，n = 5只犬）18进行比较。 PMA在0.1微米（ 图1A）是较慢激动剂不导致荧光的增加，直到2小时，但最终会产生荧光的类似倍的增加（平均：3.3，范围1.36-5.4，每组5只）18。尽管它的慢动力学，有对PMA的优点，作为阳性对照：它具有高浓度的PAF相比是相对便宜的，它已被广泛应用在小鼠和人的研究。
核酸染料的荧光是不发因为它也将是否有细胞死亡通过其它机制或如果试剂污染的DNA发生pecific净形成。 如图2中所示，市售的LPS制剂产生了非常高的荧光在没有中性粒细胞，大概是由于细菌DNA污染。建议确认通过其他方法，如免疫荧光网的形成。
图1：PMA和小区不透水核酸染料的PAF增加荧光具有不同动力学嗜中性粒细胞中的细胞不可渗透的核酸染料的存在下与0.1μMPMA（A）或31μMPAF（B）的刺激。荧光物在每小时间隔相比计算非刺激的细胞中刺激的细胞的荧光的倍数变化进行测定。荧光增加ð显著1和2之间小时为PMA（重复测量单向ANOVA，然后通过多个t检验和Bonferroni的校正，多重校正P = 0.04;误差棒是平均值±5个人标准误差），但已经由鳍为PAF 1小时。这个数字已经从杰弗里ü修改， 等狗撒网太：中性粒细胞犬外陷阱健康和免疫介导性溶血性贫血。兽医免疫学和免疫病理学，168（3-4），262-8，DOI：10.1016 / j.vetimm.2015.10.014（2015）18 请点击此处查看该图的放大版本。
图2：空白孔是重要的激动剂，以排除DNA污染或干扰 LPS的商业来源。加入含有RPMI无细胞的孔中。含无刺激的中性粒细胞相比，井荧光大倍数变化表明，与细菌DNA激动剂的污染。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
提出的DNA释放法是外DNA一个容易量化分析。该方法改编自用于评估其他物种NET形成类似的技术，但离心速度，激动剂浓度和温育时间已被改变，以优化使用的方法与犬粒细胞8,17,18。类似的调整可以作出适应其他物种的方法。当与其他方法测量NETosis如流式细胞术或图像分析相比，该法是简单又便宜。该方法也并不需要对.NET组件抗体，所以非常适合在狗使用为谁商业化生产的，经过验证的物种反应性抗体通常是不可用的。
该方法的主要限制是缺乏对NET形成细胞不透核酸染料的特异性。这些染料也进入死亡和垂死的细胞，DNA结合荧光和。因此，FL荧光是不特定净形成。强烈建议使用其他技术（ 如免疫）平行于定量分析，以目视确认激动剂诱导NET形成，而不是其他形式的细胞死亡。该测定法还可以潜在地用作一般筛选分析细胞死亡，例如作为定量细胞毒性体外的装置。
该协议很简单，但也有以确保成功所需的关键步骤。首先，如在协议所指出的，以避免粒细胞分离过程中过量细胞损失是很重要的上清液排出用吸管，而不是由反相管丢弃。其次，测定的成功依赖于残留在一个可行的和静息状态在整个温育非刺激对照的细胞。中性粒细胞可以在任何阶段的协议，应特别注意支付给无创伤采血t内被激活echnique和避免嗜中性粒细胞分离过程创伤处理（ 例如，涡旋）。同样重要的是要记住，嗜中性粒细胞具有有限的寿命，以便在分离的细胞或设置在测定延迟应避免19。如果与激动剂延长孵育尝试中，非刺激的细胞在这个时间段的生存力，应确认。
如图1所示，有在其对NET的激动剂响应狗之间相当大的差异。然而，该测定应当从同一动物重复之间合理一致，根据10重复18 9％的批内变异。如果有重复的较大的变化，细胞聚集可能是负责的。减少细胞聚集措施包括维持在PBS细胞，而不是建立DNA分析，处理细胞轻轻在整个隔离和过滤单元股票之前，含缓冲钙停牌前电镀细胞。
如果这些步骤之后，该协议允许网形成的定量响应于广泛的实验条件和激动剂。这样的研究可以加深我们对犬的健康和疾病的英语教师角色的理解。例如，该技术允许健康犬和那些与免疫或自身免疫疾病，其中NETosis可能受到损害或增强之间NET释放的比较。可替代地，当与其它技术如免疫荧光相结合，该测定可用于鉴定能够诱导NETosis和NETosis的新型抑制剂的新颖激动剂。
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Disclosures
作者什么都没有透露。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plastic Whole Blood tube with spray-coated K2EDTA | BD | 367835 | |
| Histopaque-1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | |
| Dextran-500 | Accurate chemical and scientific corp. | AN228410 | |
| Phosphate buffered saline | ThermoFisher scientific | 20012043 | |
| Fetal bovine calf serum, heat inactivated | ThermoFisher scientific | 10100139 | |
| RPMI Media 1640, without phenol red or L-glutamine | ThermoFisher scientific | 32404-014 | Should be free from phenol red |
| 96 well flat bottomed sterile polystyrene plate | Falcon | 353072 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| Platelet activating factor | Sigma-Aldrich | P4904 | |
| SYTOX Green Nucleic Acid Stain | ThermoFisher scientific | S7020 | |
| Synergy 2 Multi-Mode Reader | BioTek | NA |
References
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