Summary

Die indirekte Neuron-Astrozyten Cokultur Assay: Ein<em> In Vitro</em> Für die detaillierte Untersuchung von Neuron-Glia Interaktionen Set-up

Published: November 14, 2016
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Summary

Dieses Protokoll beschreibt die indirekte Neuron-Astrozyten Co-Kultur für compartmentalized Analyse von Neuron-Glia Interaktionen.

Abstract

Proper neuronaler Entwicklung und Funktion ist die Voraussetzung der Entwicklungs- und adulten Gehirn. Jedoch sind die Mechanismen, die die stark kontrollierten Bildung und Aufrechterhaltung von komplexen neuronalen Netzwerken zugrunde liegenden nicht vollständig bisher verstanden. Die offenen Fragen Neuronen in Gesundheit und Krankheit betreffen , sind vielfältig und das Erreichen von Verständnis der grundlegenden Entwicklung der menschlichen Pathologien zu untersuchen, zum Beispiel Alzheimer-Krankheit und Schizophrenie. Die detaillierte Analyse der Neuronen in vitro durchgeführt werden. Allerdings Neuronen fordern Zellen und brauchen die zusätzliche Unterstützung von Astrozyten für ihre langfristige Überleben. Diese zelluläre Heterogenität in Konflikt mit dem Ziel, die Analyse von Neuronen und Astrozyten zu sezieren. Wir stellen Ihnen hier eine Zellkultur-Assay, der für die langfristige Co-Kultivierung von reinen primären Neuronen und Astrozyten, die die gleiche chemisch definierten Medium gemeinsam nutzen können, während er physisch zu seingetrennt. In diesem Aufbau überleben die Kulturen für bis zu vier Wochen, und der Test ist für eine Vielzahl von Untersuchungen über Neuron-Glia-Interaktion geeignet.

Introduction

In den vergangenen Jahrzehnten hat sich die allgemeine Interpretation von neuroglia Funktion aus der Zuschreibung eines nur unterstützend auf eine aktive regulatorische Rolle in Bezug auf neuronale Funktion 1 entwickelt. Aufgrund ihrer prominenten Auswirkungen auf Gehirn – Homöostase in Gesundheit und Krankheit 2, Astrozyten sind von besonderem Interesse für die wissenschaftliche Gemeinschaft. In den letzten Jahren haben auf Neuron-Glia – Wechselwirkung in vivo und in vitro 3 eine Vielfalt von Studien konzentriert. Doch die meisten der Kultursysteme nicht für die getrennte Analyse der beiden Zelltypen und ihrer jeweiligen secretomes ermöglichen.

Verschiedene Ansätze nutzen die direkte Co – Kultivierung von Neuronen und Glia 4-6 lang anhaltende Überleben und physiologisch relevanten neuronalen Netzwerk Entwicklung zu erreichen. Das vorliegende Protokoll erreicht die gleichen Ziele , während die beiden Zelltypen zu halten 7 physikalisch getrennt. Im Vergleich zu conditioned Medium nähert sich 8,9, unser System ermöglicht die bidirektionale Kommunikation zwischen Neuronen und Astrozyten zu studieren. Die Expression der sekretierten Signalmoleküle können überwacht werden, während die Zellen in dem gemeinsam genutzten Medium maturate. Diese Möglichkeit ist besonders relevant, da Astrozyten lösliche Faktoren freisetzen, wie beispielsweise Zytokinen, Wachstumsfaktoren und extrazelluläre Matrixmoleküle 10,11, wodurch neuronal wachstumsregulierende und Funktion 7,12. Somit wurde gezeigt, dass die Zugabe an retinalen Ganglionzellen in vitro Thrombospondin die Bildung der Synapsen 13 induziert. Jedoch sind auch andere noch unbekannte Faktoren notwendig Synapsen zu machen funktionellen 13. Darüber hinaus haben freigesetzten Moleküle von Astrozyten, um identifiziert zu werden, um die Basis von Neuron-Glia Interaktionen zu verstehen.

Der Anbau von primären Neuronen und Astrozyten aus Maus und Ratte wurde zuvor 14-16 beschrieben. Hier sind wirpräsentieren ein elegantes und vielseitiges Werkzeug beide Zelltypen in einem indirekten Kokultur Ansatz zu kombinieren. Da die beiden Kulturen noch physikalisch getrennt werden, um die gleiche Medium teilen, um die Auswirkungen von Neuronen, Astrozyten und lösliche Moleküle können separat analysiert werden, wodurch ein leistungsfähiges Werkzeug für Neuron-Glia-Interaktionsstudien zu schaffen.

Protocol

Die Versuche mit Mäusen wurden in Übereinstimmung mit dem deutschen Recht und der Deutschen Gesellschaft für Neurologie Leitlinien der Tierhaltung. Die Tierpflege und -nutzung Gremien der Ruhr-Universität Bochum haben die entsprechenden Genehmigungen erteilt. 1. Vorbereitung und Bearbeitung von kortikalen Astrozyten Hinweis: Führen Sie diese Schritte des Protokolls mindestens 7 d, bevor zu den nächsten Schritten fortfahren, da die Astrozytenkulturen in konflu…

Representative Results

Die Analyse der neuronalen Kulturen über den indirekten Cokultur-System ist vielfältig und kann in verschiedenen Stadien der Kultur Reifung durchgeführt werden. Aufgrund der Tatsache, dass die Zellen für bis zu 4 Wochen, sind Langzeituntersuchungen der Kulturen möglich aufrechterhalten werden kann. Das Schema in der Mitte linken Seite von Abbildung 1 zeigt die Co – Kultur – Setup. Mit dem Einsatz dieses S…

Discussion

Das Hauptziel des aktuellen Protokolls ist es, völlig getrennte neuronale und astrozytären Kulturen, während sie in gemeinsam genutzten Medium beibehalten wird. Aus diesem Grund erhalten die Reinheit der Kulturen sollten zu Beginn des Verfahrens überprüft werden. Wir empfehlen die Verwendung von Neuron-spezifischen Tubulin, neurofilaments oder NeuN Protein als neuronale Marker GFAP als astrozytären Marker, O4 Antigen als Oligodendrozyten Vorläufermarker und Iba1 Protein Mikroglia zu identifizieren.

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Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The present work was supported by the German research foundation (Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG: GRK 736, Fa 159/22-1; the research school of the Ruhr University Bochum (GSC98/1) and the priority program SSP 1172 “Glia and Synapse”, Fa 159/11-1,2,3).

Materials

Reagents
B27 Gibco (Life Technologies) 17504-044
Cell culture grade water MilliQ
Cell culture grade water MilliQ
Cytosine-ß-D arabinofuranoside (AraC) Sigma-Aldrich C1768 CAUTION: H317, H361
DMEM Gibco (Life Technologies)  41966-029
DNAse Worthington LS002007
Gentamycin Sigma-Aldrich G1397 CAUTION: H317-334
Glucose Serva 22700
HBSS Gibco (Life Technologies) 14170-088
HEPES Gibco (Life Technologies) 15630-056
Horse serum Biochrom AG S9135
L-Cysteine Sigma-Aldrich C-2529
MEM Gibco (Life Technologies) 31095-029
Ovalbumin Sigma-Aldrich A7641 CAUTION: H334
Papain Worthington 3126
PBS self-made 
Poly-D-lysine Sigma-Aldrich P0899
Poly-L-ornithine Sigma-Aldrich P3655
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich S8636
Trypsin-EDTA Gibco (Life Technologies) 25300054
Equipment
24 well plates Thermoscientific/Nunc 142475
24-wells plate (for the  indirect co-culture) BD Falcon 353504
Binocular Leica MZ6
Cell-culture inserts BD Falcon 353095
Centrifuge Heraeus Multifuge 3S-R
Counting Chamber Marienfeld 650010
Forceps FST Dumont (#5) 11254-20
glass cover slips (12 mm) Carl Roth (Menzel- Gläser) P231.1
Incubator Thermo Scientific Heracell 240i
Micro tube (2 ml) Sarstedt 72,691
Microscope Leica DMIL
Millex Syringe-driven filter unit Millipore SLGV013SL
Orbital shaker New Brunswick Scientific Innova 4000
Parafilm Bemis PM-996
Petri dishes (10 cm) Sarstedt 833,902
pipette (1 ml) Gilson Pipetman 1000
Sterile work bench The Baker Company Laminar Flow SterilGARD III
Surgical scissors FST Dumont 14094-11
Syringe Henry Schein 9003016
T75 flask Sarstedt 833,911,002
tube (15 ml) Sarstedt 64,554,502
Water bath GFL Water bath type 1004

References

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Gottschling, C., Dzyubenko, E., Geissler, M., Faissner, A. The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions. J. Vis. Exp. (117), e54757, doi:10.3791/54757 (2016).

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