Summary
Bu protokol nöron glia etkileşimlerinin bölümlere analizi için dolaylı nöron astrosit kokültürü açıklar.
Abstract
Uygun nöronal gelişim ve fonksiyon gelişen ve yetişkin beyin ön koşuldur. Bununla birlikte, kompleks nöronal ağların son derece kontrollü oluşumu ve bakım altında yatan mekanizmaları tam bugüne kadar anlaşılamamıştır. Sağlıkta ve hastalıkta nöronlar ile ilgili açık sorular insan ile ilgili patolojiler, örneğin, Alzheimer hastalığı ve Şizofreni soruşturma temel gelişmeyi anlamaktan çeşitli ve kapsamlıdır. Nöronların en ayrıntılı analizi, in vitro olarak yapılabilir. Ancak, nöronlar hücreleri talep ve uzun vadeli hayatta kalmak için astrositlerin ek desteğe ihtiyacı vardır. Bu hücresel heterojenlik nöron ve astrositlerin analizini incelemek amacıyla çelişmektedir. Fiziksel olarak ederken, aynı burada kimyasal olarak tanımlanmış bir ortam paylaşan saf birincil nöronlar ve astrositler, uzun süreli birlikte yetiştirme için izin veren bir hücre kültürü tahlil mevcutayrıldı. Bu ayarda, kültürler en fazla dört hafta boyunca hayatta ve tahlil nöron glia etkileşimine ilişkin araştırmaların bir çeşitlilik için uygundur.
Introduction
Geçtiğimiz yıllar içinde, nöroglia fonksiyonunun genel yorumlama nöronal fonksiyonu 1 ile ilgili aktif bir düzenleyici rolüne yönelik bir sadece destekleyici bir atıf dönüşmüştür. Çünkü sağlık ve hastalık 2 beyin homeostazisi üzerindeki belirgin etkisi, astrositler bilimsel topluluk için özel bir öneme sahiptir. Son birkaç yıl içinde, çalışmalar çeşitliliği in vivo ve in vitro 3 nöron-glia etkileşimlerine odaklanmıştır. Ancak, kültür sistemlerinin çoğu, her iki hücre tiplerinin ayrı bir analiz için ve ilgili secretomes arasında izin vermez.
Çeşitli yaklaşımlar uzun ömürlü sağkalım ve fizyolojik ilgili nöronal ağ geliştirme 4-6 ulaşmak için nöronların ve glia doğrudan kültürleştirilmeye istifade eder. Fiziksel olarak 7 ayrı iki hücre tipleri tutarken mevcut protokol aynı hedefleri ulaşır. conditione karşılaştırıldığındad orta sistemimiz nöronlar ve astrositler arasındaki çift yönlü iletişimi çalışma sağlar, 8,9 yaklaşır. Hücreler paylaşılan ortam içinde olgunlaşmak ise salgılanan sinyal molekülleri ekspresyonu izlenebilir. Astrositler ve böylece sinir hücresi büyümesini düzenleyen, sitokinler, büyüme faktörleri ve hücre dışı matris moleküllerinin 10,11 gibi çözünür faktörlerin, serbest ve 7,12 fonksiyonu olarak fırsat ilişkindir. Nedenle, in vitro olarak, retinal bez hücrelerin trombospondin eklenmesi sinaps 13 oluşumunu uyardığını ortaya konmuştur. Bununla birlikte, diğer henüz bilinmeyen faktörler 13 fonksiyonel sinaps oluşturmak için gereklidir. Ayrıca, astrositler tarafından yayımlanan moleküller nöron glia etkileşimleri temelini anlamak için tespit edilmelidir.
Fare ve sıçan primer nöron ve astrositler ekimi önce 14-16 tarif edilmiştir. buradadolaylı kokültürünün yaklaşımla hem hücre tipleri birleştirmek için zarif ve çok yönlü bir araç sunuyoruz. iki kültür fiziksel ama aynı ortam, nöronlar, astrositler ve çözünür moleküllerin etkisi, dövme ayrılmış olması nedeniyle, ayrıca bu şekilde nöron glia etkileşim çalışmaları için güçlü bir araç sunar analiz edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
fareler ile deneyler hayvancılığın Nörobilim kurallarına Alman Hukuku ve Alman Derneği ile uyumluydu. Ruhr-University Bochum hayvan bakımı ve kullanım komiteleri uygun izinleri verdiniz.
1. Hazırlık ve Kortikal Astrositler Yetiştiriciliği
Not: nöronlar hazırlanır önce astrosit kültürleri birleşen mono tabakaları haline gerektiği gibi, sonraki adımlara geçmeden önce protokolü en az 7 gün, bu adımları tamamlayın. Primer astrosit doğum sonrası gün (P) 0-3 etrafında fare yavrular elde edilen karışık bir glial kültürlerden elde edilir. T75 şişesi başına üç beyinleri (6 korteks) kullanılmalıdır.
- steril koşullar altında,% 10 h / h at serumu ve% 0.1 hacim / hacim gentamisin içeren Dulbecco Modifiye Eagle ortamı (DMEM) ilave etmek suretiyle astrosit hazırlarlar. 2 hafta boyunca 4 ° C 'de orta saklayın.
- Coat 3x T75 wi şişeleri% 6 hacim / hacim CO2 varlığında 37 ° C'de en az 1 saat boyunca, (hücre kültürü dereceli su içinde PDL) 10 ug / ml poli-D-lizin Th. Kaplamadan sonra, bağlanmamış katyonları çıkaracaklardır, ve 9 ml astrosit orta eklemek için fosfat tamponlu tuz (PBS) ile iki kez şişeler yıkayın.
- beyin hazırlanması için, (bağımsız olarak kullanılacak beyin sayısı), 10 mL Hank'in dengeli tuz çözeltisi (HBSS) bir 15 ml tüp 1x 10 santimetrelik bir petri tabağına ve 1 mL HBSS 1x ekle. cerrahi makas, 2 ince forseps bir çift ve işlem için ulaşılabilecek bir Dürbünü tutun.
- cerrahi makas ile hızlı bir şekilde 3 yavrular başını kesmek ve boş 10 cm çanak başkanları toplamak.
- binoküler altında korteks hazırlanmasını gerçekleştirin. İki ince forseps kullanarak, göz hizasına doğru boyun yukarı başlayarak, orta hatta kafatası dorsal cilt kaldırın. Bundan sonra, onun kan damarları ile beyin kafatası altında görülebilir.
- forseps bir çift ile rostral sonunda baş düzeltmek ve arka sonunda başlayarak, kafatasının orta hat insizyon. Daha sonra, beyin açığa hakkı ve kafatasının sol yarısını off klibi.
- forseps ucu kapatın ve beyin altında ventral konumlandırmak. Kafatasının dışında beyin kaldırın ve HBSS dolu 10 cm Petri kabı içine aktarın. Tüm beyinleri tabağı içinde toplandı kadar kalan örnek ile aynı şekilde devam ediniz.
- beyinleri topladıktan sonra, bir makas gibi forseps bir çift kullanarak arka beyin kapalı kısma korteks ayrılması ile başlar. forseps bir çift ile iki hemisfer arasında bir orta hat kesi gerçekleştirin. Dikkatli bir forseps ile beyin düzeltmek ve Ortabeyin kesti ve ikinci forseps kullanarak koku ampuller kortikal yarısı ile sonuna kadar.
- forseps bir çift bir kortikal yarısını düzeltmek ve f bunları ayırarak hemispheres gelen meninksler soymayanal kenar rom ve daha sonra ikinci bir forseps kullanarak kortikal yüzeyinden çekerek.
- çanak aşağı doğru yönlendirilmiş yüzeyi ile kortikal yarısını çevirin; dikkatle incelemek ve forseps bir çift kullanarak hilal şeklinde hipokampus kaldırın. Tek bir korteksi taşımak için bir kapalı forseps kullanılarak konik 15 ml tüp içine tek korteks aktarın.
- Steril laminer akış kaputu tüm korteks, geçiş toplama ve kortikal doku ayrışması için hazırlıklarını başladıktan sonra.
- 2 ml reaksiyon tüpüne 1 ml DMEM ilave edin ve h papain (30 birim) w /% 0.1 ekleyin. Bir açıklık çözeltisi (yaklaşık 3 dk) gelişene kadar 37 ° C'de bir su banyosu içinde süspansiyon inkübe edin. 0.24 mg / ml L-sistein ve 20 ug / ml DNAz ekleyin ve yavaşça çalkalayın.
Not: sindirim, enzim çözeltisi, yaklaşık 1 ml gereklidir. - ilave edilmeden önce 1 ml steril bir çözelti elde etmek için filtre (0.22 um gözenek boyutu)kortikal doku. (Bir su banyosu içinde, örneğin,) 37 ° C'de 1 saat - 30 dakika boyunca inkübe edin.
NOT: 1.11 Adımları - 1.14 kritik ve 15 dakika içinde tamamlanmalıdır. - Sindirim reaksiyonu sonlandırmak için, 1 ml astrosit ortamı ilave edin ve dikkatli bir şekilde 1 mL pipet kullanılarak sindirilmiş doku Karışım. toz haline için, hafifçe böylece aspirasyon ve kortikal doku süspansiyonu ekstrüzyon, pipet pistonu hareket ettirin.
- Doku, tek bir hücre süspansiyonu içine ayrışmış sonra, 216 x g'de 5 dakika boyunca 5 ml astrosit orta ve santrifüj ekleyin.
- Elde edilen pelet dikkatlice süpernatant aspirat ve 1 mL astrosit ortamda hücrelerin tekrar süspansiyon.
- 9 ml astrosit ortamı (1.2) ile doldurulan T75 balonlarına hücre süspansiyonları ekleyin.
- % 6 hacim / hacim CO2 varlığında, bir inkübatörde 37 ° C'de inkübe hücreleri. 4 gün sonra, (ilk tam orta değişikliği gerçekleştirmek10 mL) eklenmiştir. 3 D - Daha sonra, kültür ortamı, her 2 değiştirin.
- Hücreler konfluent tek tabaka oluşmuş varsa 7 gün sonra kontrol edin. Kültürün tam izdiham ulaşılana kadar 3 gün - Değilse, başka bir 2 için bekleyin.
NOT: Astrositler büyük düzleştirilmiş hücre gövdeleri görüntülemek şişenin dibinde lokalize ve önemli hücresel süreçleri ortaya çıkmaz. Onlar tek tabakalı 17 üstünde bulunan küçük faz-kontrast parlak progenitör hücreler ve mikroglia farklıdır. - sırayla progenitör hücrelerin kurtulmak ve saf astrosit kültürü elde, bir orbital çalkalayıcı üzerinde T75 şişeler yerleştirmek ve 250 rpm'de kültürleri O / N sallamak. Sıcaklık, 37 ° C arasında ve şişeye filtre CO2 buharlaşmasını önlemek için laboratuar tipi film ile kapatılmış olduğundan ayarlanmış olduğundan emin olun.
- Sonraki gün, Elimina 20 uM sitosin-1-β-D-arabinofuranosid (AraC) ile doldurulan 10 ml taze kültür ortamı aspire orta ekleyinte kalıntı bölünen hücreler.
Not: 2 araC inkübasyon - 37 ° C'de inkübatör içinde 3 gün,% 6 CO2 saf astrosit kültürü ile sonuçlanacaktır. - ışık mikroskobu altında görsel inceleme ile astrosit kültürlerinin saflığı izleyin. Artık faz-kontrast parlak progenitör hücrelerin ve mikroglia hala astrositik tek tabakalı 17 üstünde bulunuyorsa, tekrar 1.18 ve 1.19 adımları (adım 1.16 bakınız).
Not: konfluent ve saf astrosit mono tabakalar bir sonraki aşamaya geçmeden önce inkübatör içerisine 14 D (37 ° C,% 6 hacim / hacim CO2) muhafaza edilebilir. orta yarısı her 3 d değiştirin. Bu hücreler depolama prosedürü yoluyla nöronal destekleyici özelliklerini kaybeder olarak, toplamak, dondurma ve astrositler çözülme etmeyin.
Dolaylı kokültürü 2. hazırlanması Astrositler
Not: 48-72 saat cel nöronların transfer astrositler hazırlamadan öncel-kültür ekleri. Genel olarak, tek bir T75 şişesi bir preparat elde nöron hücreleri desteklemek için yeterli hücre sayısını verir.
- 24-iyi-tabak içine gerektiği kadar ekler yerleştirin. Ceket, 37 ° C'de yaklaşık 1 saat boyunca 10 ug / ml PDL (hücre kültürü dereceli su içinde çözülmüş) ile birlikte her bir delik,% 6 hacim / hacim CO2. İnkübasyondan sonra, PBS ile iki kez uçlar yıkayın. Bu arada, astrositler hazırlanması devam edin.
Not: astrosit hücre süspansiyonu kullanıma hazır olana kadar, PBS ile doldurulmuş uçlar tutulabilir. - (AraC) ile astrosit orta aspire ve kalan serum kaldırılır sağlamak için 10 ml PBS ile bir kez kültür yıkayın.
- Şişelere% 0.05 tripsin-EDTA (etilendiamintetraasetik asit), 3 ml ilave edilir ve yaklaşık 10 dakika boyunca 37 ° C'de,% 6 hacim / hacim CO2 de trypsinization hücreleri inkübe edin.
- Bir mikroskop ve facilita kullanarak görsel muayene ile hücre dekolmanı kontrolMasaüstünde karşı matara yan dokunarak hücrelerin dekolmanı te.
NOT: 2.5 Adımları - 2.8 kritik ve 15 içinde bitmiş olmalıdır - 20 dakika. - Tripsinizasyonu takiben hafifçe 7 ml astrosit orta hücrelerin yeniden askıya ve 15 ml tüp hücre süspansiyonu aktarın. 216 x g'de 5 dakika boyunca santrifüje.
- Süpernatantı dikkatlice aspire ve 1 mL astrosit ortamında hücre pelletini.
- Bir sayma odacığı kullanarak hücreleri sayın.
- 500 uL astrosit ortam maddesi ile 24 oyuklu plaka deliklerinin taban doldurun ve her bir ekin içine 500 uL astrosit ortamı içinde 25,000 hücre transfer edin. 37 ° C'de,% 6 hacim / hacim CO2 de kültür inkübe edin.
NOT: 42 Sonra - 72 saat kültürleri yaklaşık% 100 izdiham ulaşacaktır. Bu aşamada kültür saflığı 11 immunositokimya ile doğrulanabilir. konfluen kültürlerin geçmeden kadar 7 gün boyunca muhafaza edilebilirSonraki adım. orta yarısı her 3 d değiştirin.
Birincil hippokampal nöronlar 3. hazırlanması
Not: Birincil fare hipokampal nöronları E15.5 elde edilmelidir - zamanlanmış gebe farelerin E16 embriyoların.
- W /% 0.6 nöron ortamı (10 mM sodyum piruvat ile MEM,% 0.1 w / v ovalbümin,% 2 hacim / hacim olarak B27 ortamı takviyesi ve% 0.1 v / v gentamisin (steril filtre edildi)), ve hazırlama ortamı (HBSS hazırlanması h glukoz ve 10 mM HEPES (4- (2-hidroksietil) -1-piperazin etansülfonik asit)). Pre-sıcak ve önceden dengeye 37 ° C'de,% 6 hacim / hacim CO2 filtre şişelerinde nöron orta.
- 24 kuyulu plakalara ait kuyucuklar içerisine cam lamelleri (12 mm çapında) yerleştirilir (hücre kültürü ekler ile kullanım için çentiklenir özel lamelleri kullanımı).
- 37 ° C'de su (hücre kültürü dereceli) 15 ug / mL poli-DL-ornitin ile en az 1 saat boyunca kaplayın. sağlamak için oyuk başına en az 500 ul kullanınlamelleri tamamen kaplıdır. PBS ile iki kez kuyu yıkayın. hücreleri kaplama kadar kuyu PBS bırakın. kuyu kurumaz emin olun.
- Hippocampi incelemek için, hazırlık ortamı ile doldurulmuş 3x 10 cm yemekleri ve 1 mL hazırlık ortamı ile 1x 2 ml tüp hazırlayın. makas ve 2 ince forseps hazırlayın.
- , Servikal dislokasyon ile hamile fare Kurban% 70 v / v etanol ile yıkanarak karın sterilize ve keskin bir makas kullanarak karın açın. makasla dikkatlice boncuklu rahim tüketim ve hazırlık ortamı ile doldurulmuş 1x 10 cm çanak içine organı aktarın.
- Sonra, rahim embriyolar kaldırmak. Dikkatle rahim insizyon ve 2 forseps kullanarak embriyolar zarar vermeden amniyon çıkarın. Bundan sonra, bir makas ile her bir embriyo başını kesmek ve hazırlık ortamı ile birlikte ikinci bir 10 cm çanak içine başlarını aktarın.
- HAZIRLIK benzer kafaları hazırlanması (devam edin1.7) - asyon 1.4 tarif.
- forseps bir çift ile baş hareketsiz ve Neuraxis dik Beyin yakın boyun bölgesinde kafatası ve cilt, insizyon. böylece beyin açığa kafatası ve kaplama cilt hem kaldırın ve baş rostral sonuna doğru yumuşak kafatası kap bükmek için forseps ikinci bir çift kullanın.
- 2 forseps yardımıyla, kafatası boşluğunda beyin ayırın. Bu forseps, 1 yakın çift yapmak ve koku ampuller başlayan ve Beyin doğru hareket kafatası beyin ayırmak için. Hazırlık ortamı ile dolu başka bir 10 cm'lik çanak içinde beyinleri toplayın.
- astrosit hazırlanması (adım 1.6) için yukarıda tarif edildiği gibi korteks parçalarının hippocampi teşrih. Her yarımkürede hippocampi çıkarın ve hazırlık ortamı ile doldurulmuş 2 ml tüp onları toplamak.
- diseksiyon tamamladıktan sonra, steril bir laminer akış tezgah ve Diges tüp transferi1 ml Sindirim solüsyonu papain içeren hipokamp dokusunda t. Adım 1.9 açıklandığı gibi sindirim çözüm hazırlayın - 1.10 ama MEM yerine DMEM kullanın.
NOT: 3.9 Adımları - 3.12 kritik ve 10 içinde tamamlanması gerekmektedir - 15 dakika. - sindirim tamamlandıktan sonra, dikkatlice bir pipet ile hafif bir emme yoluyla sindirim çözümü çekme.
- ardışık olarak ilave edilmesi ve daha sonra dikkatli bir şekilde, yıkama döngüsü başına 1 ml taze kültür ortamı aspire hippocampi nöron ortamı ile 3 kez yıkayın. hücre süspansiyonu santrifüj etmeyin.
- Son yıkama aşamasından sonra, dikkatli bir şekilde 1 mL nöron ortam içinde doku Karışım.
- Bir sayma odacığı kullanılarak hücrelerin sayısı ve 24 oyuklu bir plaka (3.2 belirtilen plaka) tek bir oyuk başına 500 uL nöron ortamı içinde 35,000 hücre plaka.
Not: İsteğe bağlı olarak, hücre tümböleni hücre hazırlama canlılığını değerlendirmek için tripan mavisi ile zıt olabilir. Görsel kontrol ile kaplama yoğunluğunu kontrol(- Standart 10X objektif görme alanı başına 110 hücreleri genellikle 90) iyon mikroskobu kullanılarak. - 37 ° C'de, 1 saat boyunca% 6 hacim / hacim CO2 inkübatörde yer nöronlar.
- , Inkübasyon yayınla hazırlanan ekler almak kuluçka (birleşen astrosit mono tabakaları ile tohumlanmış) (adım 2.8 bakınız). astrosit orta aspire ve 500 ul taze nöron ortamı ile değiştirerek orta alışverişinde bulunurlar.
NOT: ekler 2'den sonra birleşik astrosit tek tabakaları liman olmalıdır - 3 DIV (İn Vitro Gün). - dikkatle steril forseps kullanarak nöron kültürleri (3.13 adım) ihtiva kuyulara astrositler ile ekler yerleştirin.
- 37 ° C'de,% 6 hacim / hacim CO2 geri inkübatöre elde dolaylı nöron astrosit kokültürü yerleştirin.
NOT: Bu koşullar altında, nöronlar tam olarak tanımlanmış ortam içinde 4 hafta için yetiştirilebilir. Hiçbir orta değişikliği gerekli. Uzun süre kültürleri için, e doldurmak için tavsiye edilir24 oyuklu bir plaka buharlaşmayı azaltmak için steril su ile mpty kuyu. - Gerçekleştirmek in vitro hücre analizleri sonra kültür dönemleri istenen (örneğin, immünsitokimya, PCR, Western Blot, elektrofizyolojik kayıtlar (yama kelepçe veya multielectrode dizi) için) 7,15,18.
NOT: kültür sistemi, aynı zamanda kültürler 11 akut ve kronik farmakolojik tedavisi için uygundur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dolaylı Coculture sistemiyle nöronal kültürler analizi çok yönlü ve kültür olgunlaşma farklı aşamalarında gerçekleştirilebilir. Hücrede 4 hafta boyunca muhafaza edilebilir olması kültürlerin uzun dönem araştırmalar mümkündür.
Şekil 1 orta sol panelde şematik birlikte üretim kurulumunu göstermektedir. astrosit tek katmanlı (üst sol panel) ve nöronal ağın (sol alt panel) faz kontrast resim örneğinde olduğu gibi bu sistemin kullanılması ile, her iki hücre tipinde canlı hücre görüntüleme, gerçekleştirilebilir. Sağ üst ve alt sağ panellerinde gösterildiği gibi tespit edildikten sonra, immünositokimyasal değerlendirilmesi mümkündür.
Nöronlar modelimizdeki yaklaşık 7 DIV başlangıç sinaptik bağlantıları kurmak başlar (veriler gösterilmemiştir). 14 DÖnceden ve postsinaptik belirteçleri (Şekil 1, sağ alt panel) kombine immünositokimyasal algılama tarafından belirlenen şekilde IV birden sinaps, nöron ağları içinde oluşturulmaktadır. Önemlisi, sinaptik işaretleyici puncta miktarı sadece görüntülendi ve bu yaklaşımı kullanarak sayısal değil, aynı zamanda yapısal ağ bağlantısı katkıda büyük olasılıkla sinaps, tamamlanabilir.
Astrosit kültürleri nöronlar 11 trofik destek sağlamak değil, aynı zamanda nöral plastisite dahil çeşitli salgılanan faktörler 19,20 sentez değil sadece. Bu faktörler, yani matris metalloproteinaz 2 (MMP2) birinin ifadesi, Şekil 1 'in sağ üst panelde gösterilmiştir. İlginç bir şekilde, 2 farklı MMP2-izoformları Western Blot (Şekil 1, sağ orta paneli kullanılarak Coculture ortamı içinde tespit edildi ). Potansiyel astrositler s içine MMP2 salgılarHared ortamı, ve böylece nöronların plastisite etkiler. Ayrıca Tenascin-C, akson büyümesinin, hücre göçü ve farklılaşma 21, bilinen bir regülatör çok izoformu tespit edilmiştir.
Birlikte ele alındığında, bu sonuçlar iki örnek göstermek ve böylece astrositler, nöronlar ve burada açıklanan dolaylı birlikte üretim yöntemini kullanarak fark edilebilir onların karşılıklı iletişimin soruşturmaların çeşitli ilkesinin kanıt oluşturmaktadır.
. Şekil 1: Dolaylı Astrosit-Neuron Coculture Sistemi Astrositler, Nöronlar ve salgılanan Moleküler Arabulucular ayrı Analizi izin verir Üst panel, sol: astrositler formu mono tabakaları hücre kültürü eklemek zarının, faz kontrast üzerinde; Ölçek çubuğu: 250 mikron Üst panel, sağ:. olaraktrocytes Glial Asidik Fibrillar Protein (GFAP) (fare klon GA5) ve matriks metaloproteaz 2 (MMP2) (tavşan poliklonal) için immunohistokimyasal edilir; Ölçek çubuğu:. 250 mikron Orta paneli, sol: şeması dolaylı kokültürünün kurulumu gösterilmektedir. Iki kültür fiziksel olarak ayrı olmakla birlikte, bunlar aynı ortam paylaşan orta panel doğru. Nöron glia etkileşimleri, iki salgılanan molekül aracılar Western Blot ile ko-kültivasyon ortamı içinde ortaya çıkar. . Tenascin C (TNC), bir nörit gelişimi regülatörü ve MMP2, bir hücre dışı matriks değiştirici, belgelenen Alt panel, Çoklu izoformları sol: Birincil nöronlar yüksek ekimi, faz kontrast 14. gün ağlar birbirine geliştirirler; . Ölçek çubuğu: 250 mikron Alt panel, sağ: immünositokimyasal etiketleme ile tespit edilen in vitro 14 d ile başlayan çoklu sinaptik bağlantıları, nöronlar arasında kurulan; Ölçek çubuğu: 50 mikron. Postsinaptik PSD95 iskele proteini (fare klonu 6G6-1C9) ile presinaptik işaretleyici Fagot (tavşan poliklonal) eş-lokalizasyonu yapısal tamamlanan sinaps oluşumunu belgelemektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Paylaşılan ortamda bunları korurken mevcut protokolün temel amacı, tamamen ayrı nöronal ve astrositik kültürler etmektir. Bu nedenle, elde edilen kültürlerin saflığı prosedürü başlangıcında kontrol edilmelidir. Biz nöronal belirteç olarak nöron-spesifik tubulin, nörofilament veya Neun proteininin kullanılmasını tavsiye, GFAP astrositik işaretleyici olarak, oligodendrosit öncüsü işareti ve Iba1 protein olarak O4 antijen mikroglia tanımlamak için.
protokol kritik bir adım gerçekleştirirken adım açıklaması öncesi 'NOT' tarafından belirtildiği şekilde, özel dikkat. nöron ve astrosit hem birincil kültürleri oldukça duyarlıdır dikkate alın. Bu nedenle, çeşitli sorunlar prosedürü başlangıcında ortaya çıkabilir. astrositler 10 DIV (protokol bölüm 1) sonra T75 şişeler içinde konfluent tek tabaka ulaşmak yoksa, (son kullanma tarihi için) astrosit ortamı bileşenlerini kontrol edin. Ek olarak,(Yukarı şişesi başına 10 korteks) kültürünü başlatmak için hazırlanmış kortikal doku miktarını artırmak. astrositler 72 saat (protokol bölüm 2) sonra hücre kültürü ekler üzerine konfluent tek tabaka ulaşmak yoksa, taze hazırlanmış kültürleri dışarı plaka astrosit orta ve (son kullanma tarihi için) PDL .try bileşenlerini kontrol canlı oranını belirlemek kaplama ve buna göre hücre sayıları ayarlamak için hücreler önce (örneğin, tripan mavisi counterstaining kullanın). nöronların hayatta kalma, düşük 24 saat sonra tespit edilirse, hipokampus doku yavaşça kadar (protokol adım 3.11) doku ayrışan zaman kabarcık oluşumunu önlemek için .Pay dikkat öğütüldü değildi. nöronların hayatta kalma anlamlı 7 sonra indirilir Eğer - 14 DIV ve nöronlar 3 agrega oluşuyorsa - 7 DIV sonra 5 hücreleri, taze astrositler ile ekler hazırlanmış kullanın, immünhistokimya ile astrosit saflık için kontrol edin ve nöron orta bileşenlerini kontrol edin. nöronların (10'dan fazla hücreleri) büyük agrega v isenizisible, hipokampus doku yeterince eksik ayrışma (protokol adım 3.11) sonuçlanan öğütüldü olmadığını mümkündür. Süspansiyon homojenliği dikkat edin. Nöronal kültür nöronal olmayan hücreler (mikroglia, astrositler, oligodendrosit öncü hücreler, vs.) ile kirlenmiş ise, tamamen hipokampus bitişik komşu kortikal doku (adım 3.7) kaldırmak ve aynı zamanda nöron orta bileşenlerini kontrol edin.
Birincil nöronlar ve astrositler önerilen dolaylı kokültürünün nöron glia etkileşimleri uzun vadeli soruşturma çok yönlü bir araç sağlar. Daha da önemlisi, bu protokol fare genetik modellerin uygulanması için bir perspektif açar fare hücreleri için optimize edilmiştir. Çünkü 2 hücre tiplerinin tam bir fiziksel ayırma, nöronlar ve farklı genotipler astrositler istenilen şekilde kombine edilebilir.
çeşitli uygulamalar arasında, bu yaklaşım, Inv için kullanılabilirsinir ağları geliştirme, sinaptogenez, ağ etkinliği ve astrosit-nöron sinyalini estigate. Nöron ve astrosit dolaylı birlikte üretim kendi ayrılmış analizi ve uzun menzilli sinyalizasyon için büyük fırsatlar açıyor olsa da, doğrudan temas eksikliği sinaptik plastisite 22 ince düzenlenmesini bozabilir. Bu modeli kullanarak Böylece, astrositik çıkıntılar ve nöronal sinaps arasındaki etkileşim olmaması dikkatli bir şekilde tedavi edilmesi gerekir.
Tahlil astrosit ve nöronal hazırlıkları 14,17 için iki önceki protokollere dayalı ve geçmiş yıllarda sırasında geliştirilmiştir. Yaklaşım aslında fare 7 kurulmuş ve 11 hücreleri rat edilmiştir. Laboratuar Önceki yayınlar Nihai hücre 7,11,15,18 hücrelerin hayatta kalma, sinaps oluşumunu ve elektrofizyolojik karakterizasyon ile ilgili tahliller ilişkin ayrıntılı bir özellik sağlar. Bundan başka, To tahlil gibi mikro-elektrot-diziler (ÇÇA) 7 gibi diğer ayarları adapte edilebilir. Gelecekteki uygulamalarda, okuyucu sinaps oluşumu 23, ayrıntılı inceleme için diğer protokolleri dikkate yanı sıra in vitro MEA analiz edilmelidir. Sonuç olarak, deney nöron glia etkileşimleri çeşitli yönlerine odaklanan laboratuvarlar için çok yönlü bir araç sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| B27 | Gibco (Life Technologies) | 17504-044 | |
| Cell-culture-grade water | MilliQ | ||
| Cytosine-β-D-arabinofuranoside (AraC) | Sigma-Aldrich | C1768 | CAUTION: H317, H361 |
| DMEM | Gibco (Life Technologies) | 41966-029 | |
| DNAse | Worthington | LS002007 | |
| Gentamycin | Sigma-Aldrich | G1397 | CAUTION: H317-334 |
| Glucose | Serva | 22700 | |
| HBSS | Gibco (Life Technologies) | 14170-088 | |
| HEPES | Gibco (Life Technologies) | 15630-056 | |
| Horse serum | Biochrom AG | S9135 | |
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | C-2529 | |
| MEM | Gibco (Life Technologies) | 31095-029 | |
| Ovalbumin | Sigma-Aldrich | A7641 | CAUTION: H334 |
| Papain | Worthington | 3126 | |
| PBS | self-made | ||
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P0899 | |
| Poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich | P3655 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco (Life Technologies) | 25300054 | |
| Equipment | |||
| 24-well-plates | Thermoscientific/Nunc | 142475 | |
| 24-wells-plate (for the indirect co-culture) | BD Falcon | 353504 | |
| Binocular | Leica | MZ6 | |
| Cell-culture inserts | BD Falcon | 353095 | |
| Centrifuge | Heraeus | Multifuge 3S-R | |
| Counting Chamber | Marienfeld | 650010 | |
| Forceps | FST Dumont (#5) | 11254-20 | |
| glass cover slips (12 mm) | Carl Roth (Menzel- Gläser) | P231.1 | |
| Incubator | Thermo Scientific | Heracell 240i | |
| Micro-tube (2 mL) | Sarstedt | 72,691 | |
| Microscope | Leica | DMIL | |
| Millex Syringe-driven filter unit | Millipore | SLGV013SL | |
| Orbital shaker | New Brunswick Scientific | Innova 4000 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| Petri dishes (10 cm) | Sarstedt | 833,902 | |
| pipette (1 mL) | Gilson | Pipetman 1000 | |
| Sterile work bench | The Baker Company | Laminar Flow SterilGARD III | |
| Surgical scissors | FST Dumont | 14094-11 | |
| Syringe | Henry Schein | 9003016 | |
| T75 flask | Sarstedt | 833,911,002 | |
| tube (15 mL) | Sarstedt | 64,554,502 | |
| Water bath | GFL | Water bath type 1004 |
References
- Volterra, A., Meldolesi, J. Astrocytes, from brain glue to communication elements: the revolution continues. Nat Rev Neurosci. 6, 626-640 (2005).
- Barreto, G. E., Gonzalez, J., Torres, Y., Morales, L. Astrocytic-neuronal crosstalk: implications for neuroprotection from brain injury. Neurosci Res. 71, 107-113 (2011).
- Araque, A., Carmignoto, G., Haydon, P. G. Dynamic signaling between astrocytes and neurons. Annu Rev Physiol. 63, 795-813 (2001).
- Dityatev, A., et al. Activity-dependent formation and functions of chondroitin sulfate-rich extracellular matrix of perineuronal nets. Dev Neurobiol. 67, 570-588 (2007).
- Robinette, B. L., Harrill, J. A., Mundy, W. R., Shafer, T. J. In vitro assessment of developmental neurotoxicity: use of microelectrode arrays to measure functional changes in neuronal network ontogeny. Front Neuroeng. 4, 1 (2011).
- Voigt, T., Opitz, T., de Lima, A. D. Synchronous Oscillatory Activity in Immature Cortical Network Is Driven by GABAergic Preplate Neurons. J Neurosci. 21 (22), 8895-8905 (2001).
- Geissler, M., Faissner, A. A new indirect co-culture set up of mouse hippocampal neurons and cortical astrocytes on microelectrode arrays. J Neurosci Methods. 204, 262-272 (2012).
- Yu, C. Y., et al. Neuronal and astroglial TGFbeta-Smad3 signaling pathways differentially regulate dendrite growth and synaptogenesis. Neuromolecular Med. 16, 457-472 (2014).
- Yu, P., Wang, H., Katagiri, Y., Geller, H. M. An in vitro model of reactive astrogliosis and its effect on neuronal growth. Methods Mol Biol. 814, 327-340 (2012).
- Kucukdereli, H., et al. Control of excitatory CNS synaptogenesis by astrocyte-secreted proteins Hevin and SPARC. PNAS. 108, E440-E449 (2011).
- Pyka, M., Busse, C., Seidenbecher, C., Gundelfinger, E. D., Faissner, A. Astrocytes are crucial for survival and maturation of embryonic hippocampal neurons in a neuron-glia cell-insert coculture assay. Synapse. 65, 41-53 (2011).
- Navarrete, M., Araque, A. Basal synaptic transmission: astrocytes rule! Cell. 146, 675-677 (2011).
- Christopherson, K. S., et al. Thrombospondins are astrocyte-secreted proteins that promote CNS synaptogenesis. Cell. 120, 421-433 (2005).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Geissler, M., et al. Primary hippocampal neurons, which lack four crucial extracellular matrix molecules, display abnormalities of synaptic structure and function and severe deficits in perineuronal net formation. J Neurosci. 33, 7742-7755 (2013).
- Dzyubenko, E., Gottschling, C., Faissner, A. Neuron-Glia Interactions in Neural Plasticity: Contributions of Neural Extracellular Matrix and Perineuronal Nets. Neural Plast. 2016, 5214961 (2016).
- McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J Cell Biol. 85, 890-902 (1980).
- Pyka, M., et al. Chondroitin sulfate proteoglycans regulate astrocyte-dependent synaptogenesis and modulate synaptic activity in primary embryonic hippocampal neurons. Eur J Neurosci. 33, 2187-2202 (2011).
- Eroglu, C. The role of astrocyte-secreted matricellular proteins in central nervous system development and function. J Cell Commun Signal. 3, 167-176 (2009).
- Ethell, I. M., Ethell, D. W. Matrix metalloproteinases in brain development and remodeling: synaptic functions and targets. J Neurosci Res. 85, 2813-2823 (2007).
- Theocharidis, U., Long, K., ffrench-Constant, C., Faissner, A. Prog Brain Res. Dityatev, A. lexander, Wehrle-Haller, B. ernhard, Asla, P. itkänen 214, Elsevier. 3-28 (2014).
- Dityatev, A., Rusakov, D. A. Molecular signals of plasticity at the tetrapartite synapse. Curr Opin Neurobiol. 21, 353-359 (2011).
- Ippolito, D. M., Eroglu, C. Quantifying synapses: an immunocytochemistry-based assay to quantify synapse. JoVe. , (2010).
