Summary
该协议描述了神经元的神经胶质细胞相互作用的条块分析间接神经元的星形胶质细胞共培养。
Abstract
正确的神经细胞的发育和功能是发展中国家和成人大脑的先决条件。然而，复杂的神经元网络的高度控制形成和维护背后的机制尚未完全迄今理解。关于健康和疾病的神经元的开放式问题是多种多样的，从理解基本的发展，人类的调查相关疾病， 如阿尔茨海默氏症和精神分裂症深远。可以在体外进行的神经元的最详细的分析。然而，神经元细胞，要求和需要为他们的长期生存的额外支持星形胶质细胞。此细胞异质性是在与目标解剖神经元和星形胶质细胞的分析冲突。我们在这里提出一个细胞培养测定法，其允许纯原代神经元和星形胶质细胞，其共享相同的化学上确定的培养基的长期共培养，而在物理上分开。在此设置中，培养物存活多达四个星期，该测定是适于关于神经元的神经胶质细胞的相互作用研究的多样性。
Introduction
纵观几十年来，神经胶质细胞功能的一般性解释已经从一个单纯的支持对有关神经功能1积极调节作用的归属演变。因为对健康和疾病的2脑稳态其突出的影响，星形胶质细胞是科学界特别感兴趣的。在过去的几年中，研究一个多样性集中于神经胶质细胞的相互作用中体内和体外 3。然而，大多数的培养系统的不允许这两种细胞类型的单独分析和各自secretomes的。
有几种方法利用神经元和神经胶质细胞的直接共培养，实现长期持久的生存与生理有关的神经网络的发展4-6。本协议达到同样的目标，同时保持物理上分离的7两种细胞类型。相比conditioneD培养基接近8,9，我们的系统可以让研究神经细胞和星形胶质细胞之间的双向通信。分泌的信号分子的表达可以在细胞中的共享介质maturate进行监测。这个机会是特别相关的，因为星形细胞释放可溶性因子，如细胞因子，生长因子和细胞外基质分子10,11，从而调节神经元生长和功能7,12。因此，已经证明，另外在体外血小板反应蛋白视网膜神经节细胞的诱导突触13的形成。然而，其他未知因素是必要的，以使突触功能13。此外，通过星形胶质细胞释放分子具有以了解神经胶质细胞的相互作用的基础上被识别。
从小鼠和大鼠原代神经元和星形胶质细胞的培养先前已14-16所述。在这里，我们提出了一种优雅和多功能的工具，这两种细胞类型中的一种间接共培养方法结合起来。由于两个培养物物理分离但共享相同的介质，神经元，星形细胞和可溶性分子的影响，可以分别进行分析，从而为神经胶质细胞的相互作用的研究的强有力的工具。
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Protocol
小鼠实验是按照德国法律和德国社会为畜牧业的神经科学的指导方针。在波鸿鲁尔大学的动物保护与利用委员会授予相应的许可证。
1.准备和皮层星形胶质细胞的培养
注：进行下一个步骤，有准备的神经元前的星形胶质细胞的文化应该发展成融合单层之前完成这些步骤，该协议至少7天的。原发性星形胶质细胞从各地日龄（P），0-3的乳鼠获得的混合胶质细胞培养的。每T75烧瓶三大脑（6皮层）都可以使用。
- 通过用无菌条件下10％体积/体积马血清和0.1％体积/体积庆大霉素补充的Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）制备星形细胞介质。储存在4℃的培养基中达2周。
- 大衣3倍T75瓶无线第10微克/毫升聚-D-赖氨酸（PDL;在细胞培养级水中）在37℃下在6％的体积/体积的 CO 2的存在下至少1小时。涂布后，用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗烧瓶两次以除去未结合的阳离子，并添加9毫升星形细胞培养基。
- 对于大脑的制备中，加入10毫升Hank氏平衡盐溶液（HBSS）为1x 10cm培养皿和1mL的HBSS至1x 15毫升管（无论将要使用的大脑的数量）。保持一双手术剪，2细镊子，并在过程中达到双目。
- 快速斩首3幼仔的手术剪和收集元首在一个空的10cm平皿。
- 执行双目下的皮质的准备。使用两个细镊子，在中线删除从头骨的背部皮肤，从颈部，迈向眼睛的水平开始。此后，其血管，大脑颅骨下可见。
- 在一双镊子的喙端固定头切开颅骨的中线，开始在后端。接着，夹断以暴露脑的右和头骨的左侧半部。
- 关闭钳子的前端和脑下它腹侧的位置。解除脑出颅骨，并转移到HBSS填充10cm培养皿。与剩余的标本继续以同样的方式，直到所有的大脑中的菜收集。
- 收集大脑后，开始与皮质通过夹断使用一对像一把剪刀镊子的后脑的分离。一个钳子执行两半球之间的正中切口。仔细固定用钳子脑和切断脑和使用第二镊子嗅球与皮质半部到结束。
- 修复一个半皮质与一个钳子和拆卸他们˚F剥离从半球脑膜ROM中的横向边缘，并使用第2钳子从皮质表面随后拉动它们。
- 翻转皮质一半在其表面面向下来，对盘中;仔细剖析并删除月牙形海马使用一个钳子。转移单皮质成使用一个封闭的镊子进行个别皮质锥形15毫升管。
- 收集所有皮质，过渡到无菌层流罩，并与筹备皮层组织的解离后开始。
- 添加1毫升的DMEM到一个2毫升的反应管中，加入0.1％w / v的木瓜蛋白酶（30单位）。孵育在水浴悬浮液，在37℃直至澄清溶液开发（约3分钟）。添加0.24毫克/毫升的L-半胱氨酸和20微克/毫升DNA酶，轻轻摇晃。
注：对于消化，需要约1毫升酶液。 - 过滤器（0.22微米孔径）将之前获得1毫升无菌溶液它的皮层组织。温育30分钟的管- 1小时，在37℃（ 即在水浴中）。
注意：步骤1.11 - 1.14是关键的，应在15分钟内完成。 - 终止消化反应，加1毫升星形胶质细胞中，并用1毫升吸管仔细磨碎消化的组织。进行研制，轻轻移动吸移管柱塞，从而吸移和挤出皮层组织悬浮液中。
- 一旦组织已被解离成单细胞悬浮液中，加入5毫升星形细胞介质和离心机在216×g下5分钟。
- 从所得的沉淀小心吸出上清液并重新悬浮于1mL星形胶质细胞培养基中的细胞。
- 细胞悬浮液加入到9毫升星形胶质细胞培养基（见1.2）补充T75瓶。
- 孵育所述细胞在37℃下在6％的体积/体积的 CO 2的存在下孵化。 4 d后，执行第一次完全培养基变化（10毫升）中。此后，改变培养基，每2 - 3天。
- 7天后，检查细胞形成融合单层。如果没有，再等2 - 3天的文化完全融合直至达到。
注：星形胶质细胞显示大扁平细胞体，定位在烧瓶底部，不开发显着的细胞过程。他们从小相衬亮祖细胞和小胶质驻留在单层17的顶部有所不同。 - 为了摆脱祖细胞，并获得纯星形胶质细胞文化，将T75瓶上轨道摇床，动摇文化O / N在250转。确保温度调节至37℃，并且将烧瓶中的过滤器是用实验室膜密封，以防止二氧化碳的蒸发。
- 第二天，吸出培养基，并添加有20μM的胞嘧啶-1-β-D-阿拉伯呋喃糖苷（阿糖胞苷）补充10mL的新鲜培养基来eliminaTE残留分裂的细胞。
注：孵育阿糖胞苷2 -在37℃下在孵化3天，6％的CO 2，将导致一个纯星形胶质细胞培养。 - 监视星形细胞培养的通过视觉检查在光学显微镜下的纯度。如果残留相衬亮祖细胞和小胶质细胞仍驻留在星形细胞单层17的顶部（见步骤1.16），重复步骤1.18和1.19。
注：汇合和纯星形胶质细胞单层可在继续下一步骤之前被保持在孵化器达14天（37℃，6％体积/体积的 CO 2）。一半的培养基改变每3天。不收集，冻结和解冻的星形胶质细胞，因为这些细胞会通过存储过程失去神经的支持性能。
2.准备星形胶质细胞的间接共培养
注：48 - 72小时准备神经元，星形胶质细胞转移到CEL前L-培养插入。通常，一个单一的T75烧瓶提供了足够数量的细胞，以支持与一种制备得到的神经元培养物。
- 根据需要于24孔板将尽可能多的插入。外套每个插入用10微克/毫升的PDL（溶于细胞培养级水中）下进行约1小时，在37℃，6％体积/体积的 CO 2。培养后，用PBS洗插入两次。在此期间，继续星形胶质细胞的准备。
注：填充有PBS中插入可以保持，直到星形胶质细胞悬浮液是准备使用。 - 吸星形细胞培养基（与阿糖胞苷）中，用10毫升PBS洗涤培养一次，以确保任何剩余的血清被去除。
- 加入3毫升0.05％胰蛋白酶-EDTA（乙二胺四乙酸）到烧瓶孵育胰蛋白酶将细胞在37℃，6％体积/体积的 CO 2约10分钟。
- 控制通过目测用显微镜和facilita的细胞脱离通过敲击针对桌面烧瓶的侧TE上的细胞的分离。
注意：步骤2.5 - 2.8是关键的，并应15内完成 - 20分钟。 - 继胰蛋白酶，轻轻重新悬浮在7mL的星形胶质细胞培养基中的细胞和细胞悬浮液转移到15毫升管中。离心机在216×g下5分钟。
- 小心吸出上清液并重新悬浮于1mL星形胶质细胞培养基中的细胞沉淀。
- 算使用计数室中的细胞。
- 填补24孔板用500微升星形胶质细胞培养基的孔的底部和25,000个细胞在500μL的星形胶质细胞培养基转移到每个单独的插入物。孵育培养在37℃，6％体积/体积的 CO 2。
注：42后 - 72小时的培养将达到约100％汇合。在这一阶段，培养的纯度可以通过免疫细胞化学11进行验证。汇合培养物可维持到7天，直到继续到下一步。一半的培养基改变每3天。
3.初级海马神经元的制备
注：主小鼠海马神经元应从E15.5导出 - 定时孕鼠胚胎E16。
- 制备神经元培养基（MEM用10mM丙酮酸钠，0.1％w / v的卵清蛋白，2％体积/体积B27培养基补充剂，和0.1％体积/体积庆大霉素（无菌过滤）），并且制备培养基（HBSS用0.6％重量/ v葡萄糖和10mM的HEPES（4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙磺酸））。预先温暖和预平衡在过滤烧瓶神经元培养基中在37℃，6％体积/体积的 CO 2。
- 放置玻璃盖玻片（12毫米直径）到24孔板的孔中（使用特殊的盖玻片，其缺口与细胞培养插入的使用）。
- 外套与15微克/毫升聚-DL-鸟氨酸在水（细胞培养级）在37℃下至少1小时。至少使用500微升每孔，以保证盖玻片完全覆盖。用PBS洗涤各孔两次。离开PBS中的孔，直到镀覆的细胞。确保孔不干燥。
- 解剖海马，准备3倍10厘米充满制备介质菜肴和1个2毫升管1毫升的准备中。准备好剪刀和2细镊子。
- 通过颈脱位牺牲怀孕小鼠，消毒用70％V / V乙醇洗涤腹部，并用锋利的剪刀打开腹部。用剪刀仔细地切除子宫串珠和器官转移到1X 10cm皿充满了制备介质。
- 接下来，请从子宫的胚胎。小心切开子宫，取出羊膜，而不使用2钳伤害胚胎。此后，斩首用剪刀的每个胚胎和磁头转移到与制备介质提供的第二10cm皿。
- 与头的准备（类似prepar继续1.7） - 通货膨胀在1.4描述。
- 固定有一对镊子的头部和切割在颈部区域中的颅骨和皮肤靠近后脑，垂直于神经轴。使用第二对镊子解除两者头骨和覆盖皮肤和弯曲朝向头部的喙端软颅盖，从而露出大脑。
- 为2钳子的帮助下，从颅腔分离大脑。要做到这一点，接近1钳子和脑启动在嗅球，并朝着移动后脑颅骨分离。收集再过10 cm培养皿充满制备介质的大脑。
- 如上对于星形细胞制备（步骤1.6）中描述从皮质部分解剖海马。从每个半球中取出海马，并收集他们在2毫升管中充满制备介质。
- 在完成剥离之后，将管转移到无菌的层流工作台和diges吨，含木瓜蛋白酶1毫升消解液中的海马组织。如步骤1.9所述，准备消解液 - 1.10，但使用MEM代替DMEM。
注意：步骤3.9 - 3.12是关键的，应10内完成 - 15分钟。 - 消化完成后，小心地撤回通过温和抽吸用移液器将消化溶液。
- 依次添加，然后小心地吸每个洗涤周期1毫升新鲜培养基清洗海马神经元与介质3倍。不要离心细胞悬液。
- 最后的洗涤步骤之后，请仔细磨碎在1毫升神经元中的组织。
- 算使用计数室对细胞和板35,000个细胞在500μL的神经介质每一个24孔板（在3.2中提到的板）的单个孔。
注意：任选地，细胞等分试样可以用台盼蓝进行复染，以评估细胞制剂的活力。控制通过视觉检查接种密度离子使用显微镜（一般为90 - 每一个标准10X物镜的视场110细胞）。 - 在孵化器处的神经元，在37℃，1小时6％体积/体积的 CO 2。
- （去籽与融合星形胶质细胞单层）从孵化器中孵化后，把准备好的插件（见步骤2.8）。通过抽吸星形胶质细胞中，用500微升新鲜的神经元中替换它交换媒介。
注意：应插入后2怀有星形胶质细胞融合单层- 3 DIV（天体外 ）。 - 将带有星形胶质细胞刀片小心地插入包含神经元文化（3.13步），使用无菌镊子井。
- 放置导致的间接神经元星形胶质细胞共培养放回培养箱中于37℃，6％体积/体积的 CO 2。
注意：在这些条件下，神经元可以在完全确定的培养基中培养长达4周。无介质的改变是必要的。对于长期培养物时，建议以填充ÈMPTY井用无菌水，以减少从24孔板的蒸发。 - 进行体外细胞分析所需的培养后时段（ 例如，免疫细胞化学，PCR，Western印迹，电生理记录（膜片钳或者多电极阵列））7,15,18。
注：培养系统也适合于培养11急性和慢性药物治疗。
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Representative Results
通过间接共培养系统中的神经元培养物的分析是多方面的，可以在培养的成熟的不同阶段进行。由于这样的事实，该细胞可被保持长达4周，培养物的长期的调查是可能的。
在图1中的中间左侧面板概略说明了共培养设置。与使用该系统，可以执行这两种细胞类型的活细胞成像，由星形胶质细胞单层（左上面板）和神经元网络（左下面板）的相衬图像作为例证。固定后，免疫细胞化学评估是可能的，如图右上和右下面板。
神经元开始建立突触连接开始在我们的模型中在约7 DIV（未示出数据）。通过14天第四多个突触神经元网络内形成，所确定的前和突触后的标记（ 图1，右下面板）合并的免疫细胞化学检测。重要的是，不仅突触标记泪点的数量可以可视化，并使用该方法量化，而且结构上完成突触，其中最有可能有助于与网络连接。
星形胶质细胞培养不仅提供神经元营养11支持，而且合成参与神经可塑性几个分泌因子19,20。这些因素，即基质金属蛋白酶2（MMP2）之一的表达，是展示图1中的右上面板。有趣的是，在使用蛋白质印迹（ 图1，中间偏右面板的共存培养基中检测到2个不同的MMP2-亚型）。星形胶质细胞可能分泌MMP2成Shared介质，从而影响神经元的可塑性。此外腱生蛋白C，轴突生长，细胞迁移和分化21已知调节的多种亚型进行鉴定。
两者合计，这些结果表明两个例子，并由此对各种星形胶质细胞，神经元和可使用本文所述的间接共培养方法来实现他们的相互通信的调查提供原则证明。
图1：间接星形胶质细胞，神经元共培养系统允许星形胶质细胞，神经元和分泌分子介质的单独分析 前面板，左侧 ：星形胶质细胞形成单层的细胞培养插入细胞膜，相衬;比例尺：250微米顶板，右 ：作为trocytes被免疫染色胶质酸性纤维状蛋白（GFAP）（小鼠克隆GA5）和基质金属蛋白酶2（MMP2）（兔多克隆）;比例尺：250微米中间面板，左侧 ：该方案展示了间接共培养的设置。虽然两种文化在物理上分开，它们共享同一介质中间面板，右 ：神经胶质细胞相互作用的两个分泌分子介质，揭示在使用免疫印迹共培养基。 。韧粘素C（TNC），一个轴突生长调节因子，MMP2，细胞外基质修改，都记录下面板的多种亚型左 ：初级神经元开发来自公司种植，相衬的第 14天高度互联网络; 。比例尺：250微米底板，右 ：首先是在体外 14天，多突触连接的神经元之间建立，免疫细胞化学标记的检测;比例尺：50微米。突触前标记巴松管（兔多克隆）的共定位与突触后PSD95支架蛋白（小鼠克隆6G6-1C9）记录了结构上完成了突触的形成。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
当前协议的主要目的是完全独立的神经元和星形细胞培养物，同时保持它们在共享介质。由于这个原因，所得到的培养物的纯度应在过程的开始进行验证。我们推荐使用神经元特异性微管蛋白，神经丝或蛋白质的NeuN神经元的标记，GFAP作为星形细胞标记，O4抗原少突胶质细胞前体标记，并Iba1蛋白识别小胶质细胞。
执行该协议的一个关键步骤的时候要特别注意，如由步骤说明之前，'注意'指定。考虑到神经元和胶质细胞的初级文化是相当敏感的。因此，一些问题可以在过程的开始出现。如果星形胶质细胞不经过10 DIV（协议第1节）达到T75烧瓶覆盖单层，检查星形胶质细胞介质（到期日）的组成部分。此外，增加制备以引发培养（每烧瓶10皮层）皮层组织的金额。如果星形胶质细胞不72小时（协议第2节）后达成的细胞培养插入融合单层，检查星形胶质细胞中，PDL（适用于到期日）。尝试的成分直接制版出新鲜烹制的文化，确定可行的比例细胞电镀并据此调整手机号码之前（ 例如 ，使用台盼蓝复染）。如果在24小时后检测神经元的存活率低，海马组织没有被研磨，轻轻足够（协议步骤3.11）。注重以避免气泡的形成解离的组织时。如果神经元的存活后7显著降低 - 14 DIV，如果神经元形成3集合体 - 后7 DIV 5个细胞，使用新准备好的刀片与星形胶质细胞，检查星形胶质细胞纯度免疫细胞，并检查神经细胞培养基成分。如果神经元的（超过10个细胞）的大的聚集体为Visible，它是可能的海马组织没有充分研磨，导致不完全解离（协议步骤3.11）。注意悬挂同质性。如果神经元的培养物污染的非神经元细胞（小胶质细胞，星形胶质细胞，少突胶质细胞前体细胞等 ），完全除去相邻海马邻近皮层组织（步骤3.7），并且检查神经元培养基成分。
初级神经元和胶质细胞的提议间接共培养提供了神经元的神经胶质细胞相互作用的长期调查的多功能工具。重要的是，该协议用于小鼠细胞，这为小鼠遗传模型的实施打开角度进行了优化。因为2细胞类型的完全物理分离的，神经元和不同的基因型的星形细胞可以在所希望的方式组合。
在众多的应用中，这种方法可用于INVestigate神经网络的发展，突触，网络活动和星形胶质细胞，神经元的信号。虽然神经元和星形胶质细胞的间接共培养打开广阔的机会其分离分析和远程信令，缺少直接接触的可能损害突触可塑性22的细微调节。因此，缺乏星形细胞突起和神经元突触之间的相互作用已被仔细地使用该模型时处理。
该测定法是基于对星形胶质细胞和神经元的制剂14,17两个以前的协议和在过去几年的过程中得到了提高。该方法原本已经成立鼠标7和大鼠11细胞。实验室以前的出版物提供关于细胞存活，突触形成和电生理学表征所得细胞7,11,15,18的测定法的详细描述。此外，T他测定法可以适应其它设置，如微电极阵列（MEAs）的7。为未来的应用中，读者应考虑其他协议的突触形成23的详细调查，以及用于体外 MEA分析。总之，该试验提供了用于实验室侧重于神经胶质细胞的相互作用的各个方面的多功能工具。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| B27 | Gibco (Life Technologies) | 17504-044 | |
| Cell-culture-grade water | MilliQ | ||
| Cytosine-β-D-arabinofuranoside (AraC) | Sigma-Aldrich | C1768 | CAUTION: H317, H361 |
| DMEM | Gibco (Life Technologies) | 41966-029 | |
| DNAse | Worthington | LS002007 | |
| Gentamycin | Sigma-Aldrich | G1397 | CAUTION: H317-334 |
| Glucose | Serva | 22700 | |
| HBSS | Gibco (Life Technologies) | 14170-088 | |
| HEPES | Gibco (Life Technologies) | 15630-056 | |
| Horse serum | Biochrom AG | S9135 | |
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | C-2529 | |
| MEM | Gibco (Life Technologies) | 31095-029 | |
| Ovalbumin | Sigma-Aldrich | A7641 | CAUTION: H334 |
| Papain | Worthington | 3126 | |
| PBS | self-made | ||
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P0899 | |
| Poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich | P3655 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco (Life Technologies) | 25300054 | |
| Equipment | |||
| 24-well-plates | Thermoscientific/Nunc | 142475 | |
| 24-wells-plate (for the indirect co-culture) | BD Falcon | 353504 | |
| Binocular | Leica | MZ6 | |
| Cell-culture inserts | BD Falcon | 353095 | |
| Centrifuge | Heraeus | Multifuge 3S-R | |
| Counting Chamber | Marienfeld | 650010 | |
| Forceps | FST Dumont (#5) | 11254-20 | |
| glass cover slips (12 mm) | Carl Roth (Menzel- Gläser) | P231.1 | |
| Incubator | Thermo Scientific | Heracell 240i | |
| Micro-tube (2 mL) | Sarstedt | 72,691 | |
| Microscope | Leica | DMIL | |
| Millex Syringe-driven filter unit | Millipore | SLGV013SL | |
| Orbital shaker | New Brunswick Scientific | Innova 4000 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| Petri dishes (10 cm) | Sarstedt | 833,902 | |
| pipette (1 mL) | Gilson | Pipetman 1000 | |
| Sterile work bench | The Baker Company | Laminar Flow SterilGARD III | |
| Surgical scissors | FST Dumont | 14094-11 | |
| Syringe | Henry Schein | 9003016 | |
| T75 flask | Sarstedt | 833,911,002 | |
| tube (15 mL) | Sarstedt | 64,554,502 | |
| Water bath | GFL | Water bath type 1004 |
References
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