Summary
이 프로토콜은 신경 세포 - glia의 상호 작용의 실형 분석을위한 간접적 인 신경 세포 성상 세포의 공 배양을 설명합니다.
Abstract
적절한 신경 개발 및 기능은 개발 및 성인 뇌의 전제 조건입니다. 그러나, 복잡한 신경 네트워크의 고도의 제어 형성과 유지 관리의 기초가되는 메커니즘은 완전히 지금까지 이해되지 않습니다. 건강과 질병에서 신경 세포에 관한 개방형 질문은 인간과 관련된 병리, 예를 들어, 알츠하이머 병 및 정신 분열증 조사에 기본 개발을 이해에서 다양하고 도달한다. 뉴런의 가장 상세한 분석은 시험 관내에서 수행 될 수있다. 그러나 신경 세포를 요구하고 장기적인 생존을위한 성상 교세포의 추가 지원이 필요합니다. 이 세포의 이질성은 신경 세포와 성상 세포의 분석을 해부하는 목표와 충돌합니다. 물리적 인하면서, 여기에 동일한 화학적 한정 배지를 공유 순수한 차 뉴런 및 성상 세포의 장기간 동시 배양 허용 세포 배양 분석을 제시분리. 이 설정에서, 문화는 최대 4 주 동안 생존 분석은 신경 세포 - glia의 상호 작용에 관한 연구의 다양성에 적합하다.
Introduction
지난 수십 년 동안, 신경 교세포 기능의 일반적인 해석은 신경 기능 (1)에 관한 적극적인 규제 역할 향해 단순히 지원의 속성에서 진화했다. 때문에 건강과 질병이 뇌의 항상성에 자신의 눈에 띄는 영향으로, 성상 세포는 과학계에 대한 특별한 관심이 있습니다. 지난 몇 년 동안, 연구는 다양한 생체 내 및 생체 외 3 뉴런 - 아교 세포의 상호 작용에 초점을 맞추고있다. 그러나, 배양 시스템의 대부분은 두 종류의 세포 분리 및 분석을 위해 해당 secretomes으로 허용되지 않는다.
몇몇 접근 방식이 오래 지속 생존과 관련된 신경 생리 네트워크 개발을 달성하기 위해 4-6 뉴런 및 아교 세포의 직접 동시 배양을 이용한다. 물리적으로 분리 된 두 7 세포 형태를 유지하면서, 본 프로토콜은 동일한 목표에 도달한다. conditione에 비해D 매체는 우리의 시스템은 신경 세포와 성상 세포 사이의 양방향 통신을 연구 할 수 있습니다, 8,9 접근한다. 세포를 상기 공유 매체에 성숙하다 동안 분비 신호 분자의 발현을 모니터링 할 수있다. 성상 교세포함으로써 신경 세포의 성장을 조절, 같은 사이토 카인, 성장 인자 및 세포 외 기질 분자 10, 11 등의 수용성 요소를 해제하고 7,12을 기능으로이 기회, 특히 관련이있다. 따라서, 시험 관내에서 망막 신경절 세포 트롬의 첨가가 시냅스 (13)의 형성을 유도하는 것으로 입증되었다. 그러나, 다른 아직 알려지지 않은 요소 (13) 기능 시냅스를 렌더링하는 데 필요한. 또한, 성상 세포에 의해 방출 분자는 신경 아교 세포 - 상호 작용에 기초를 이해하기 위해 식별되어야한다.
마우스와 래트 차 뉴런 및 성상 세포의 배양은 14-16 앞서 설명되었다. 여기에 우리간접 공 배양 방법에서 두 종류의 세포를 결합 우아하고 다양한 도구를 제시한다. 두 문화가 아직 실제로 동일한 매체, 뉴런, 아스트로 사이트 및 수용성 분자의 영향을 공유 분리되어 있기 때문에, 이와 별도로 뉴런 신경교 상호 작용의 연구를위한 강력한 도구를 만드는, 분석 될 수있다.
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Protocol
쥐 실험 동물 사육의 신경 과학 지침에 대한 독일의 법률과 독일의 사회에 따라했다. 루르 - 대학 보훔의 동물 관리 및 사용위원회는 적절한 허가를 부여했다.
1. 준비 및 두피 성상의 재배
참고 : 뉴런이 준비되기 전에 성상 세포 배양이 합류 단층으로 개발해야로서, 다음 단계로 진행하기 전에 프로토콜 적어도 7 일 이내의 다음 단계를 완료합니다. 차 성상 세포는 출생 후 하루 (P) 0-3 주위에 마우스 새끼에서 얻은 혼합 폐해 문화에서 파생됩니다. T75 플라스크 당 세 뇌 (피질 6)이 사용되어야한다.
- 무균 조건에서 10 %의 v / V 말 혈청과 0.1 % V / V의 겐타 마이신으로 둘 베코의 수정 독수리 중간 (DMEM)을 보완하여 성상 세포 매체를 준비합니다. 최대 2 주 동안 4 ° C에서 매체를 저장합니다.
- 코트 배 T75은 위스콘신 플라스크6 % V / V의 CO 2의 존재하에 37 ℃에서 적어도 1 시간 동안 (세포 배양 등급의 물 PDL) 10 μg의 / ㎖ 폴리 D 라이신 번째. 도포 후, 결합되지 않은 양이온을 제거하고, 9 ㎖의 성상 세포의 배지를 추가하는 인산염 완충 식염수 (PBS)로 두 번 플라스크를 세척 하였다.
- 뇌의 준비를 위해, (에 관계없이 사용되는 뇌의 수) 10 ㎖ 행크의 균형 소금 솔루션 (HBSS)을 15 mL의 튜브를 1 배인 10cm 페트리 접시 1 ㎖의 HBSS를 1 배에 추가. 수술 가위,이 미세 집게 한 쌍 및 절차 범위 내에서 쌍안경을 유지합니다.
- 수술 가위로 빠르게 3 새끼 목을 벨과 빈 10cm 접시에 머리를 수집합니다.
- 양안에서 피질의 준비를 수행합니다. 이 미세 집게를 사용하여 눈의 수준으로 목부터 시작하여 중간 선에서 두개골의 지느러미 피부를 제거합니다. 그 후, 그 혈관과 뇌는 두개골에서 볼 수 있습니다.
- 포셉 쌍 입쪽 끝에 헤드를 고정하고 후방 단부에서 시작 두개골의 정중선을 절개. 이어서, 뇌를 노출 오른쪽 두개골의 왼쪽 절반을 클립.
- 포셉의 끝을 닫고 뇌에서 복부를 놓습니다. 두개골에서 뇌를 들어 올려 HBSS 가득 10cm 페트리 접시로 전송합니다. 모든 뇌는 접시에 수집 될 때까지 남아있는 시료와 동일한 방식으로 진행.
- 뇌를 수집 한 후, 가위 등 포셉 한 쌍을 사용하여 후뇌을 곤란에 의한 피질의 분리로 시작합니다. 포셉 한 쌍의 두 반구 사이의 중간 선 절개를 수행합니다. 조심스럽게 집게로 뇌를 수정하고 중뇌을 차단하고, 두 번째 집게를 사용 후각 전구는 대뇌 피질의 절반으로 끝낼 수 있습니다.
- 포셉 한 쌍의 하나 대뇌 피질의 절반을 해결와 F를 분리하여 반구의 수막을 벗겨측면 가장자리 ROM이어서 제 집게를 사용하여 피질 표면을 당기는.
- 접시를 향해 아래로 향한 표면과 대뇌 피질의 절반 플립; 신중하게 해부 포셉 한 쌍을 사용하여 초승달 모양의 해마를 제거합니다. 개인 피질을 수행하는 하나의 닫힌 집게를 사용하여 원뿔 15 ML의 튜브에 단일 피질을 전송합니다.
- 멸균 층류 후드에 모든 피질, 대중 교통을 수집하고 대뇌 피질 조직의 분리를위한 준비를 시작 후.
- 2 mL의 반응 관에 1 mL의 DMEM을 추가 및 v 파파인 (30 대) 승 / 0.1 %를 추가합니다. 정화 된 용액 (3 분)을 나타낼 때까지 37 ℃의 수조에서 현탁액을 부화. 0.24 ㎎ / ㎖의 L 시스테인 20 μg의 / mL의 DNase를 추가하고 부드럽게 흔들어.
주 : 소화 효소 용액을 대략 1 mL의 필요하다. - 추가하기 전에 1 mL의 멸균 용액을 얻었다 필터 (0.22 ㎛의 공극 크기)그것은 대뇌 피질의 조직. (수욕, IE) 37 ° C에서 1 시간 - 30 분 동안 튜브를 부화.
주 : 1.11 단계 - 1.14가 중요하며 15 분 이내에 완료해야합니다. - 소화 반응을 종료하려면, 1 ML의 성상 세포 매체를 추가하고 신중 1 ML의 피펫을 사용하여 소화 조직을 씹다. 분쇄를 들어, 부드럽게하여 흡입 및 대뇌 피질의 조직 현탁액을 압출, 피펫 플런저를 이동합니다.
- 조직을 단일 세포 현탁액 내로 해리되면, 216 x g에서 5 분 동안 5 ㎖의 성상 매체 원심 분리기를 추가.
- 그 결과 펠렛에서 조심스럽게 뜨는을 대기음 1 ML의 성상 세포 배지에서 세포를 재현 탁.
- 9 ML의 성상 세포 배지 (1.2 참조) 보충 T75 플라스크에 세포 현탁액을 추가합니다.
- 6 % V / V의 CO 2 존재 하에서 인큐베이터에서 37 ℃에서 세포를 인큐베이션. 4 D 후 (최초 완전 배지 변경을 수행10 ㎖). 3 일 - 그 후, 배지마다 2를 변경합니다.
- 세포가 합류 단층을 형성 한 경우 7 일 이내 후 확인합니다. 문화의 완전한 합류가 달성 될 때까지 삼일 -하지 않으면, 또 다른 2 기다립니다.
참고 : 성상 큰 평평한 세포 기관을 표시는 플라스크의 바닥에 지역화 및 주목할만한 세포 과정을 개발하지 않습니다. 이들은 단일 층 (17)의 상부에있는 작은 위상차 밝은 전구 세포 및 미세 아교 다르다. - 위해서는 전구 세포 없애과 순수 성상 세포 배양을 구 궤도 통에 T75 플라스크를 배치하고 250 rpm에서 문화 O / N를 흔들 수 있습니다. 온도를 37 ℃로하고, 플라스크의 필터가 CO (2)의 증발을 방지하기 위해 실험실 필름으로 밀봉되도록 조정되는 것을 보장한다.
- 다음 날, elimina 20 μM 사이토 신-1-β-D-아라 비노 푸라 노 시드 (AraC)와 보충 10 mL의 신선한 문화 매체를 매체를 대기음 및 추가테 잔류 분할 세포.
참고 : 2 AraC와 배양 - 37 ° C에서 인큐베이터에서 3 일이 6 % CO 2는 순수 성상 세포 배양에 발생합니다. - 광 현미경으로 육안 검사에 의한 성상 세포 배양의 순도를 모니터링합니다. 잔여 위상 대비 밝은 전구 세포 및 미세 아교 세포는 여전히 성상 세포 단일 층 (17)의 상단에있는 경우, 반복 1.18 및 1.19 단계 (단계 1.16 참조).
참고 : 융합과 순수한 성상 세포 단일 층은 다음 단계로 진행하기 전에 인큐베이터에서 최대 14 일 (37 ° C, 6 % V / V의 CO 2)를 위해 유지 될 수있다. 매체의 반마다 3 일을 변경합니다. 이러한 세포가 저장 프로 시저를 통해 연결을 지원 특성을 잃게됩니다로서, 수집, 동결 및 성상 세포를 해동하지 마십시오.
간접 공동 배양 2. 준비 성상
참고 : 48-72 시간을 CEL에 신경 전달 성상을 준비하기 전에1- 문화 삽입. 일반적으로, 하나의 T75 플라스크에 제조 한 얻은 신경 세포 배양을 지원하기 위해 셀의 충분한 수를 제공한다.
- 24 웰 플레이트에 필요한만큼의 삽입을 놓습니다. 코트 37 ° C에서 약 1 시간 10 μg의 / mL의 PDL (세포 배양 등급의 물에 용해)와 각 삽입, 6 % V / V의 CO 2. 배양 한 후, PBS로 두 번 삽입을 씻는다. 한편, 성상 세포의 준비를 진행합니다.
참고 : 성상 세포의 세포 현탁액 사용할 준비가 될 때까지 PBS로 가득 인서트가 유지 될 수있다. - (AraC 포함) 성상 세포 매체를 기음과 잔여 혈청을 제거하기 위해 10 mL의 PBS와 문화를 한 번 씻는다.
- 플라스크에 0.05 % 트립신 EDTA (에틸렌 디아민 테트라 아세트산) 3 mL를 넣고 약 10 분 동안 37 ° C, 6 % V / V의 CO 2에서 트립신의 세포를 배양한다.
- 현미경 및 facilita를 사용하여 육안 검사에 의한 세포 분리를 제어바탕 화면에 대한 플라스크의 측면을 눌러 세포의 분리를 테.
참고 : 2.5 단계 - 2.8이 중요한 15 내에 완료되어야한다 - 20 분. - 트립신 처리 후, 부드럽게 7 ML의 성상 세포 배지에서 세포를 다시 정지하고 15 ㎖의 튜브에 세포 현탁액을 전송. 216 X g에서 5 분 동안 원심 분리기.
- 조심스럽게 뜨는을 대기음 1 ML의 성상 세포 배지에서 세포 펠렛을 resuspend.
- 카운팅 챔버를 사용하여 세포를 카운트.
- 500 μL의 성상 세포 배지로 24 웰 플레이트의 웰의 바닥을 채우고 각 인서트에 500 μL의 성상 세포 배지에서 25,000 세포를 옮긴다. 37 ° C, 6 % V / V의 CO 2의 문화를 품어.
참고 : 42 후 - 72 시간 배양은 약 100 %의 합류에 도달합니다. 이 단계에서 배양액의 순도는 11 면역 세포에 의해 확인 될 수있다. 합류 배양이 진행까지 7 일 동안 유지 될 수있다다음 단계. 매체의 반마다 3 일을 변경합니다.
차 해마 신경 세포의 3. 준비
참고 : 기본 마우스 해마의 신경 세포가 E15.5에서 유래한다 - 시간 초과 임신 쥐의 E16 배아.
- / w 0.6 %와 신경 세포 배지 (10 mM의 피루브산 나트륨과 MEM, w 0.1 % / V의 난백 알부민, 2 % V / V의 B27 매체 보충, 0.1 % V / V의 겐타 마이신 (멸균 여과)), 및 준비 매체 (HBSS를 준비 V 포도당과의 10mM HEPES (4- (2- 히드 록시 에틸) -1- 피페 라진 에탄 술폰산)). 사전 따뜻한 사전 평형 37 ° C, 6 % V / V의 CO 2에서 필터 플라스크에 신경 매체를.
- 24- 웰 플레이트의 웰에 유리 커버 슬립 (12mm 직경) 위 (세포 배양 인서트와 함께 사용하기 위해 절결 된 특수 커버 슬립을 사용).
- 37 ° C에서 물 (세포 배양 등급) 15 μg의 / mL의 폴리 DL-오르니 틴 적어도 1 시간 동안 코트. 을 보장하기 위하여 잘 당 최소 500 μL를 사용하여커버 슬립이 완전히 덮여있다. PBS로 두 번 우물을 씻으십시오. 세포를 도금 할 때까지 우물에서 PBS를 남겨주세요. 우물이 건조하지 않도록해야합니다.
- 해마를 해부하기 위해 준비 매체 가득 배 10cm 요리와 1 mL를 준비 매체와 1X 2 mL의 튜브를 준비합니다. 위 및 2 미세 집게를 준비합니다.
- 자궁 전위에 의해 임신 한 마우스를 희생 70 % v / V를 에탄올로 세척하여 복부를 소독하고 날카로운 가위를 사용하여 복부를 엽니 다. 가위로 조심스럽게 페르시 자궁을 절제하고 준비 매체 가득 1X 10cm 접시에 오르간을 전송합니다.
- 다음으로, 자궁에서 태아를 제거합니다. 조심스럽게 자궁을 절개하고 2 집게를 사용하여 배아를 해치지 않고 양막을 제거합니다. 그 후, 가위 각 배아 목을 벨과 준비 매체와 함께 제공되는 두 번째 10cm 접시에 머리를 전송합니다.
- 위해 준비 할 유사한 헤드의 준비 (진행합니다1.7) - ATION 1.4에 설명.
- 포셉 쌍 헤드를 고정하고 neuraxis 직교 후뇌에 가까운 목 영역의 두개골과 피부를 절개. 하여 뇌를 노출, 두개골과 취재 피부를 모두 들어 올린 머리의 주동이의 끝을 향해 부드러운 두개골 캡이 구부러 집게의 두 번째 쌍을 사용합니다.
- 이 집게의 도움으로, 두개골 캐비티에서 뇌를 분리합니다. 이 포셉, 1 닫기 쌍을하고 후각 전구에서 시작하여 후뇌으로 이동 두개골에서 뇌를 구분합니다. 준비 매체 가득 다른 10cm 접시에 두뇌를 수집합니다.
- 성상 세포의 제조 (단계 1.6)에 대해 상술 한 바와 같이 피질 부분에서 해마를 해부하다. 각 반구에서 해마를 제거하고 준비 매체 가득 2 ㎖의 튜브를 수집합니다.
- 절개를 완료 한 후, 멸균 층류 벤치 diges로 전송 튜브1 ㎖의 분해 용액을 함유하는 파파인과 해마 조직에서 t. 단계 1.9에 기재된 바와 같이 소화 용액을 조제 - 1.10 있지만 MEM 대신 DMEM을 사용한다.
참고 : 3.9 단계 - 3.12이 중요한 10 이내에 완료되어야한다 - 15 분. - 분해 종료 후, 조심스럽게 피펫으로 부드러운 흡입하여 소화 용액을 철회.
- 순차적으로 추가 한 후 조심스럽게 세척 사이클 당 1 mL의 신선한 배지를 흡입하여 해마에게 신경 매체를 3 회 반복한다. 세포 현탁액을 원심 분리하지 마십시오.
- 최종 세척 단계 후, 조심스럽게 1 mL의 뉴런 배지에서 조직을 씹다.
- 카운팅 챔버를 사용하여 세포를 세어 24 웰 플레이트 (3.2에서 언급 한 판)의 단일 웰 당 500 μL 뉴런 배지에 35,000 세포 접시.
참고 : 선택적으로, 셀 나누어지는이 셀 준비의 활력을 평가하기 위해 트리 판 블루와 대조 할 수 있습니다. 시각적 검사에 의해 도금 밀도 제어(- 표준 10 배 대물 렌즈의 시야 당 110 셀 일반적으로 90) 이온 현미경을 사용. - 37 ° C, 1 시간 동안 6 % V / V의 CO 2에서 인큐베이터에 넣어 뉴런.
- , 배양을 게시 준비된 삽입을 인큐베이터 중 (합류 성상 세포 단일 층으로 시드) (단계 2.8 참조). 성상 세포의 배지를 흡인하고 500 ㎕의 신선한 뉴런 배지로 교체하여 배지를 교환한다.
참고 : 삽입 2 이후에 합류 성상 세포 단일 층 항구한다 - 3 DIV (체외에서 일). - 신중하게 멸균 집게를 사용하여 신경 세포 문화 (3.13 단계)에 포함 된 우물에 성상 세포로 삽입을 놓습니다.
- 37 ° C, 6 % V / V의 CO 2에서 다시 인큐베이터로 인해 발생하는 간접적 신경 세포 성상 세포의 공 배양을 놓습니다.
주 : 이러한 조건 하에서, 뉴런 완전히 한정 배지에서 4 주 동안 배양 될 수있다. 어떤 매체 변화는 필요하지 않습니다. 장기간 배양 들어, 예를 채우기 위해 권장24 웰 플레이트에서 증발을 감소시키기 위해 멸균 물 mpty 웰. - 수행 체외 세포 분석 후 배양 기간을 원하는 (예를 들어, 면역 세포, PCR, 웨스턴 블롯, 전기 생리 녹음 (패치 클램프 또는 다중 전극 배열)에 대한) 7,15,18.
주 : 배양 시스템은 배양액 (11)의 급성 및 만성적 인 약물 치료에 적합하다.
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Representative Results
간접 공 배양 시스템을 통해 신경 배양 분석은 여러 가지이며, 배양 성숙의 다른 단계에서 수행 될 수있다. 인해 세포가 4 주 동안 유지 될 수 있다는 사실로 인해, 배양 장기간 조사도 가능하다.
그림 1의 중간 왼쪽 패널의 회로도는 공동 배양 설정을 보여줍니다. 성상 세포 단층 (좌측 상단 패널) 및 신경 네트워크 (왼쪽 아래 패널)의 위상차 이미지로 예시되는 본 시스템의 사용으로, 두 종류의 세포 생균 촬상이 수행 될 수있다. 오른쪽 상단과 오른쪽 하단 패널에 나타낸 바와 같이 고정 후, 면역 세포 화학적 평가는 가능하다.
뉴런은 우리 모델의 약 7 DIV 시작 시냅스 연결을 설정하기 시작한다 (데이터는 보이지 않음). 14 D에 의해사전 및 시냅스 마커 (그림 1, 오른쪽 아래 패널)의 결합 면역 세포 화학적 검출에 의해 식별 IV 여러 시냅스는 신경 세포 네트워크 내에서 형성된다. 중요한 시냅스 마커 puncta의 양뿐만 시각과이 방법을 사용하여 정량 할뿐만 아니라 구조적으로 연결 네트워크에 기여할 가능성이 시냅스를 완료 할 수있다.
성상 세포 배양 신경 영양 (11)에 지원을 제공하지만, 또한 신경 가소성에 관여하는 여러 인자 분비 19,20 합성 아닙니다. 이러한 요인, 즉 매트릭스 메탈 2 (MMP2) 중 하나의 발현은 그림 1의 오른쪽 상단 패널에 설명된다. 흥미롭게도,이 별개의 MMP2 - 동종 서양의 얼룩 (그림 1, 중간 오른쪽 패널을 사용하여 공 배양 배지에서 검출되었다 ). 잠재적 성상 세포의 S에 MMP2을 분비hared 매체는 따라서 신경 세포의 가소성 영향. 또한 테네 스틴-C, 축삭의 파생물, 세포의 이동과 분화 (21)의 알려진 레귤레이터의 여러 아형이 확인되었다.
종합적으로, 이러한 결과는 두 가지 예를 보여하여 아스트로 사이트, 뉴런 및 본원에 기재된 간접 공동 배양 방법을 이용하여 실현 될 수있는 그들의 상호 통신 조사의 다양한 원리의 증명을 제공한다.
. 그림 1 : 간접 성상 세포 - 신경 세포 공동 배양 시스템 성상, 신경 분비 분자 중재자의 별도의 분석을 위해 수 있습니다 톱 패널은 왼쪽 다음 성상 세포 형태의 단층을 세포 배양 삽입 막, 위상차에; 스케일 바 : 250 마이크론 최고 패널, 오른쪽 :. 등trocytes는 폐해 산성 섬유 성 단백질 (GFAP) (마우스 클론 GA5)와 매트릭스 토포 2 (MMP2) (토끼 폴리 클로 날)에 대한 면역 염색된다 스케일 바 :. 250 미크론 중간 패널은 왼쪽 : 계획은 간접 공 배양 설정을 보여줍니다. 두 배양 물은 물리적으로 분리되어 있지만, 이들은 동일한 매체를 공유하는 중앙 패널은 오른쪽 :. 뉴런 - 아교 세포의 상호 작용이 분비 된 분자 매개체 웨스턴 블롯을 사용하여 공동 배양 배지에서 드러난다. . 테네 스틴 C (TNC)와, 신경 돌기 가지 레귤레이터 및 MMP2, 세포 외 매트릭스 수정, 문서화 바닥 패널의 여러 아형 왼쪽 : 차 신경 세포가 매우 재배, 위상차의 14 일 하루 네트워크를 상호 개발한다 . 스케일 바 : 250 미크론 하단 패널, 오른쪽 : 면역 세포 화학적 표지에 의해 검출로 체외에서 14 일부터 시작는 여러 시냅스 연결이 뉴런 사이에 설정되고, 스케일 바 : 50 미크론. 시냅스 PSD95 비계 단백질 (마우스 클론 6G6-1C9)와 시냅스 마커 바순 (토끼 폴리 클로 날)의 공동 현지화가 구조적으로 완성 된 시냅스의 형성을 설명합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
공유 매체에 그들을 유지하면서 현재 프로토콜의 주요 목표는 완전히 별도의 연결 및 성상 세포 배양 물이다. 이 때문에, 얻어지는 배양액의 순도는 절차의 시작 부분에서 검증되어야한다. 우리는 신경 세포 마커로서 신경 세포 고유의 튜 불린, neurofilaments 또는 NeuN 단백질의 사용을 권장, GFAP는 성상 세포 마커로, 희소 돌기 아교 세포 전구체 마커 Iba1 단백질로 O4 항원은 미세 아교 세포를 식별합니다.
프로토콜의 중요한 단계를 수행 할 때 단계를 설명하기 전에 '참고'에 의해 지정된 특별한주의를 기울이십시오. 신경 세포와 성상 세포의 두 차 문화가 오히려 민감한 고려. 따라서, 몇 가지 문제가 절차의 초기에 발생할 수있다. 성상 교세포 (10) DIV (프로토콜 섹션 1) 후 T75 플라스크에 합류 단층에 도달하지 않은 경우 (유효 기간의 경우) 성상 세포 매체의 구성 요소를 확인합니다. 게다가,(최대 플라스크 당 10 피질에) 문화를 시작할 준비가 대뇌 피질의 조직의 양을 증가시킨다. 아스트로 사이트 (72) H (프로토콜 (2)) 이후에 세포 배양 인서트에 합류 단층에 도달하지 않은 경우, 새로 제조 한 배양 물을 플레이트에 성상 매체 (만기 날짜) PDL .Try의 구성 요소를 확인 가능한 비율을 결정 도금 따라서 세포 수를 조절하기 이전의 세포 (예, 트립 판 블루를 사용하여 대조 염색). 뉴런의 낮은 생존율은 24 시간 후에 검출되는 경우, 해마 조직을 충분히 부드럽게 (프로토콜 단계 3.11) 조직 해리 때 기포의 형성을 피하기 위해주의를 .Pay 연화되지 않았다. 뉴런의 생존은 크게 7 후 저하 된 경우 - 14 DIV 뉴런 3의 집합체 형성하는 경우 - 7 DIV 후 5 세포를 갓 성상 세포로 삽입을 준비 사용하여 면역 세포에 의해 성상 세포의 순도를 확인하고, 신경 세포 매체 구성 요소를 확인합니다. 뉴런 (10 개 이상의 세포)의 큰 집계 V 인 경우isible, 상기 해마 조직이 충분히 완전 해리 (프로토콜 단계 3.11)의 결과, 분쇄되지 않은 것이있다. 서스펜션 동질성에주의를 기울이십시오. 신경 세포 배양 비 신경 세포 (미세 아교 세포, 성상 세포, 희소 돌기 아교 세포의 전구 세포 등)로 오염되는 경우, 완전히 해마 인접한 이웃 피질 조직 (단계 3.7)을 제거하고, 또한 뉴런 배지 성분을 확인한다.
차 신경 세포와 성상 세포의 제안 간접 공 배양은 신경 세포 - glia 상호 작용의 장기 조사를위한 다양한 도구를 제공합니다. 중요한 것은,이 프로토콜은 마우스 유전자 모델의 구현에 대한 관점을 열고 마우스 세포에 최적화되어 있습니다. 때문에 두 세포 유형의 완전한 물리적 분리의 뉴런 별개의 유전자형 아스트로 원하는 방식으로 결합 될 수있다.
다양한 애플리케이션 중에는,이 방법은 INV하는데 사용될 수있다신경 네트워크 개발, synaptogenesis, 네트워크 활동 및 성상 세포 - 신경 세포의 신호를 estigate. 신경 세포와 성상 세포의 간접 동시 배양가 분리 분석 및 장거리 신호에 대한 광대 한 기회를 열어 있지만, 직접 접촉의 부족은 시냅스 가소성 (22)의 미묘한 조절을 손상시킬 수 있습니다. 이 모델을 사용하는 경우 즉, 성상 세포 및 신경 돌기 시냅스 사이의 상호 작용의 부족 취급에주의해야한다.
상기 분석은 성상 세포 및 신경 제제 14,17 두 이전의 프로토콜에 기초하여 과거의 과정에서 개선되었다. 접근 방식은 원래 마우스 (7) 설립 11 세포를 쥐되었습니다. 실험실의 이전 출판물은 결과 세포 7,11,15,18의 세포 생존, 시냅스 형성 및 전기 생리 특성에 관한 분석의 상세한 특성을 제공한다. 또한, t그 분석은 예컨대, 마이크로 전극 어레이 (다자간) (7)과 같은 다른 설정을 적용 할 수있다. 미래의 애플리케이션의 경우, 독자는 시냅스 형성 (23)의 상세한 조사를 위해 다른 프로토콜을 고려할뿐만 아니라 시험 관내 MEA 분석한다. 결론적으로, 상기 분석은 뉴런 - 아교 세포의 상호 작용의 다양한 양태에 집중 실험실 다용도 공구를 제공한다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| B27 | Gibco (Life Technologies) | 17504-044 | |
| Cell-culture-grade water | MilliQ | ||
| Cytosine-β-D-arabinofuranoside (AraC) | Sigma-Aldrich | C1768 | CAUTION: H317, H361 |
| DMEM | Gibco (Life Technologies) | 41966-029 | |
| DNAse | Worthington | LS002007 | |
| Gentamycin | Sigma-Aldrich | G1397 | CAUTION: H317-334 |
| Glucose | Serva | 22700 | |
| HBSS | Gibco (Life Technologies) | 14170-088 | |
| HEPES | Gibco (Life Technologies) | 15630-056 | |
| Horse serum | Biochrom AG | S9135 | |
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | C-2529 | |
| MEM | Gibco (Life Technologies) | 31095-029 | |
| Ovalbumin | Sigma-Aldrich | A7641 | CAUTION: H334 |
| Papain | Worthington | 3126 | |
| PBS | self-made | ||
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P0899 | |
| Poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich | P3655 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco (Life Technologies) | 25300054 | |
| Equipment | |||
| 24-well-plates | Thermoscientific/Nunc | 142475 | |
| 24-wells-plate (for the indirect co-culture) | BD Falcon | 353504 | |
| Binocular | Leica | MZ6 | |
| Cell-culture inserts | BD Falcon | 353095 | |
| Centrifuge | Heraeus | Multifuge 3S-R | |
| Counting Chamber | Marienfeld | 650010 | |
| Forceps | FST Dumont (#5) | 11254-20 | |
| glass cover slips (12 mm) | Carl Roth (Menzel- Gläser) | P231.1 | |
| Incubator | Thermo Scientific | Heracell 240i | |
| Micro-tube (2 mL) | Sarstedt | 72,691 | |
| Microscope | Leica | DMIL | |
| Millex Syringe-driven filter unit | Millipore | SLGV013SL | |
| Orbital shaker | New Brunswick Scientific | Innova 4000 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| Petri dishes (10 cm) | Sarstedt | 833,902 | |
| pipette (1 mL) | Gilson | Pipetman 1000 | |
| Sterile work bench | The Baker Company | Laminar Flow SterilGARD III | |
| Surgical scissors | FST Dumont | 14094-11 | |
| Syringe | Henry Schein | 9003016 | |
| T75 flask | Sarstedt | 833,911,002 | |
| tube (15 mL) | Sarstedt | 64,554,502 | |
| Water bath | GFL | Water bath type 1004 |
References
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