Summary

Le Neuron-astrocyte indirecte coculture Assay: Un<em> In vitro</em> Mise en place pour l'investigation détaillée des interactions Neuron-glie

Published: November 14, 2016
doi:

Summary

Ce protocole décrit la coculture neurone-astrocyte indirect pour l'analyse compartimentée des interactions neurone-glie.

Abstract

le développement neuronal et la fonction est la condition préalable du développement et le cerveau adulte. Cependant, les mécanismes sous-jacents de la formation hautement contrôlé et l'entretien des réseaux neuronaux complexes ne sont pas complètement compris jusqu'à présent. Les questions ouvertes concernant les neurones dans la santé et la maladie sont diverses et allant de la compréhension du développement de base aux enquêtes sur les droits liés à des pathologies, par exemple, les maladies et la schizophrénie d'Alzheimer. L'analyse la plus détaillée de neurones peut être réalisé in vitro. Cependant, les neurones exigent des cellules et ont besoin du soutien supplémentaire de astrocytes pour leur survie à long terme. Cette hétérogénéité cellulaire est en conflit avec le but de disséquer l'analyse des neurones et des astrocytes. Nous présentons ici un essai de culture cellulaire qui permet la co-culture à long terme des neurones et des astrocytes primaires pures, qui partagent le même milieu chimiquement défini, tout en étant physiquementséparé. Dans cette configuration, les cultures survivent jusqu'à quatre semaines et le dosage est adapté à la diversité des enquêtes concernant les interactions neurone-glie.

Introduction

Tout au long des dernières décennies, l'interprétation générale de la fonction névroglie a évolué à partir de l'attribution d'un soutien simplement vers un rôle actif réglementaire concernant la fonction neuronale 1. En raison de leur impact important sur le cerveau homéostasie dans la santé et la maladie 2, astrocytes sont d' un intérêt particulier pour la communauté scientifique. Au cours des dernières années, une diversité d'études ont porté sur les interactions neurone-glie in vivo et in vitro 3. Cependant, la plupart des systèmes de culture ne permettent pas l'analyse séparée des deux types de cellules et de leurs secrétomes respectifs.

Plusieurs approches exploitent la coculture directe des neurones et des cellules gliales pour atteindre la survie à long durable et le développement du réseau neuronal physiologiquement pertinents 4-6. Le présent protocole atteint les mêmes objectifs tout en gardant les deux types de cellules physiquement séparés 7. Par rapport à conditionemoyen d approches 8,9, notre système permet d'étudier la communication bidirectionnelle entre les neurones et les astrocytes. L'expression des molécules de signalisation sécrétées peut être surveillée tandis que les cellules dans le milieu maturate partagé. Cette possibilité est particulièrement importante, car les astrocytes libèrent des facteurs solubles tels que les cytokines, les facteurs de croissance et des molécules de la matrice extracellulaire 10,11, régulant ainsi la croissance neuronale et fonctionnent de 7,12. Ainsi, il a été démontré que l'addition de la thrombospondine aux cellules ganglionnaires de la rétine in vitro induit la formation de synapses 13. Cependant, d' autres facteurs encore inconnus sont nécessaires pour rendre les synapses fonctionnelles 13. En outre, les molécules libérées par les astrocytes doivent être identifiés afin de comprendre la base des interactions neurone-glie.

La culture des neurones primaires et des astrocytes de rat et la souris a été décrit précédemment 14-16. ici, nousprésenter un outil élégant et polyvalent de combiner les deux types de cellules dans une approche indirecte de coculture. Étant donné que les deux cultures sont physiquement séparés encore partager le même milieu, l'impact des neurones, des astrocytes et des molécules solubles, peuvent être analysées séparément, créant ainsi un outil puissant pour les études d'interaction neurone-glie.

Protocol

Les expériences avec des souris étaient conformes à la loi allemande et la Société allemande pour les directives de Neurosciences de l'élevage. Les soins des animaux et de l'utilisation des comités de la Ruhr-Universität Bochum ont accordé les permis appropriés. 1. Préparation et culture de corticale astrocytes Remarque: Effectuez ces étapes du protocole au moins 7 jours avant de procéder aux étapes suivantes, comme les cultures d'astrocyt…

Representative Results

L'analyse des cultures de neurones par l'intermédiaire du système de co-culture indirecte est multiple et peut être effectuée à différents stades de la maturation de la culture. En raison du fait que les cellules peuvent être maintenues pendant jusqu'à 4 semaines, des études à long terme des cultures sont possibles. Le schéma dans le panneau gauche du milieu de la figure 1 montre la conf…

Discussion

L'objectif principal du protocole actuel est de cultures neuronales et astrocytaires complètement séparés, tout en les maintenant dans un milieu partagé. Pour cette raison, la pureté des cultures obtenues doivent être vérifiées au début de la procédure. Nous recommandons l'utilisation de la tubuline spécifique des neurones, neurofilaments ou protéine NeuN comme marqueurs neuronaux, GFAP comme marqueur astrocytaire, antigène O4 comme marqueur de précurseurs d'oligodendrocytes et de protéines Ib…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The present work was supported by the German research foundation (Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG: GRK 736, Fa 159/22-1; the research school of the Ruhr University Bochum (GSC98/1) and the priority program SSP 1172 “Glia and Synapse”, Fa 159/11-1,2,3).

Materials

Reagents
B27 Gibco (Life Technologies) 17504-044
Cell culture grade water MilliQ
Cell culture grade water MilliQ
Cytosine-ß-D arabinofuranoside (AraC) Sigma-Aldrich C1768 CAUTION: H317, H361
DMEM Gibco (Life Technologies)  41966-029
DNAse Worthington LS002007
Gentamycin Sigma-Aldrich G1397 CAUTION: H317-334
Glucose Serva 22700
HBSS Gibco (Life Technologies) 14170-088
HEPES Gibco (Life Technologies) 15630-056
Horse serum Biochrom AG S9135
L-Cysteine Sigma-Aldrich C-2529
MEM Gibco (Life Technologies) 31095-029
Ovalbumin Sigma-Aldrich A7641 CAUTION: H334
Papain Worthington 3126
PBS self-made 
Poly-D-lysine Sigma-Aldrich P0899
Poly-L-ornithine Sigma-Aldrich P3655
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich S8636
Trypsin-EDTA Gibco (Life Technologies) 25300054
Equipment
24 well plates Thermoscientific/Nunc 142475
24-wells plate (for the  indirect co-culture) BD Falcon 353504
Binocular Leica MZ6
Cell-culture inserts BD Falcon 353095
Centrifuge Heraeus Multifuge 3S-R
Counting Chamber Marienfeld 650010
Forceps FST Dumont (#5) 11254-20
glass cover slips (12 mm) Carl Roth (Menzel- Gläser) P231.1
Incubator Thermo Scientific Heracell 240i
Micro tube (2 ml) Sarstedt 72,691
Microscope Leica DMIL
Millex Syringe-driven filter unit Millipore SLGV013SL
Orbital shaker New Brunswick Scientific Innova 4000
Parafilm Bemis PM-996
Petri dishes (10 cm) Sarstedt 833,902
pipette (1 ml) Gilson Pipetman 1000
Sterile work bench The Baker Company Laminar Flow SterilGARD III
Surgical scissors FST Dumont 14094-11
Syringe Henry Schein 9003016
T75 flask Sarstedt 833,911,002
tube (15 ml) Sarstedt 64,554,502
Water bath GFL Water bath type 1004

References

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Gottschling, C., Dzyubenko, E., Geissler, M., Faissner, A. The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions. J. Vis. Exp. (117), e54757, doi:10.3791/54757 (2016).

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