간접 신경-성상 세포 공동 배양 분석 일 :<em> 체외</em> 신경 세포 - glia 상호 작용의 상세한 조사를위한 셋업
Summary
이 프로토콜은 신경 세포 – glia의 상호 작용의 실형 분석을위한 간접적 인 신경 세포 성상 세포의 공 배양을 설명합니다.
Abstract
적절한 신경 개발 및 기능은 개발 및 성인 뇌의 전제 조건입니다. 그러나, 복잡한 신경 네트워크의 고도의 제어 형성과 유지 관리의 기초가되는 메커니즘은 완전히 지금까지 이해되지 않습니다. 건강과 질병에서 신경 세포에 관한 개방형 질문은 인간과 관련된 병리, 예를 들어, 알츠하이머 병 및 정신 분열증 조사에 기본 개발을 이해에서 다양하고 도달한다. 뉴런의 가장 상세한 분석은 시험 관내에서 수행 될 수있다. 그러나 신경 세포를 요구하고 장기적인 생존을위한 성상 교세포의 추가 지원이 필요합니다. 이 세포의 이질성은 신경 세포와 성상 세포의 분석을 해부하는 목표와 충돌합니다. 물리적 인하면서, 여기에 동일한 화학적 한정 배지를 공유 순수한 차 뉴런 및 성상 세포의 장기간 동시 배양 허용 세포 배양 분석을 제시분리. 이 설정에서, 문화는 최대 4 주 동안 생존 분석은 신경 세포 – glia의 상호 작용에 관한 연구의 다양성에 적합하다.
Introduction
지난 수십 년 동안, 신경 교세포 기능의 일반적인 해석은 신경 기능 (1)에 관한 적극적인 규제 역할 향해 단순히 지원의 속성에서 진화했다. 때문에 건강과 질병이 뇌의 항상성에 자신의 눈에 띄는 영향으로, 성상 세포는 과학계에 대한 특별한 관심이 있습니다. 지난 몇 년 동안, 연구는 다양한 생체 내 및 생체 외 3 뉴런 – 아교 세포의 상호 작용에 초점을 맞추고있다. 그러나, 배양 시스템의 대부분은 두 종류의 세포 분리 및 분석을 위해 해당 secretomes으로 허용되지 않는다.
몇몇 접근 방식이 오래 지속 생존과 관련된 신경 생리 네트워크 개발을 달성하기 위해 4-6 뉴런 및 아교 세포의 직접 동시 배양을 이용한다. 물리적으로 분리 된 두 7 세포 형태를 유지하면서, 본 프로토콜은 동일한 목표에 도달한다. conditione에 비해D 매체는 우리의 시스템은 신경 세포와 성상 세포 사이의 양방향 통신을 연구 할 수 있습니다, 8,9 접근한다. 세포를 상기 공유 매체에 성숙하다 동안 분비 신호 분자의 발현을 모니터링 할 수있다. 성상 교세포함으로써 신경 세포의 성장을 조절, 같은 사이토 카인, 성장 인자 및 세포 외 기질 분자 10, 11 등의 수용성 요소를 해제하고 7,12을 기능으로이 기회, 특히 관련이있다. 따라서, 시험 관내에서 망막 신경절 세포 트롬의 첨가가 시냅스 (13)의 형성을 유도하는 것으로 입증되었다. 그러나, 다른 아직 알려지지 않은 요소 (13) 기능 시냅스를 렌더링하는 데 필요한. 또한, 성상 세포에 의해 방출 분자는 신경 아교 세포 – 상호 작용에 기초를 이해하기 위해 식별되어야한다.
마우스와 래트 차 뉴런 및 성상 세포의 배양은 14-16 앞서 설명되었다. 여기에 우리간접 공 배양 방법에서 두 종류의 세포를 결합 우아하고 다양한 도구를 제시한다. 두 문화가 아직 실제로 동일한 매체, 뉴런, 아스트로 사이트 및 수용성 분자의 영향을 공유 분리되어 있기 때문에, 이와 별도로 뉴런 신경교 상호 작용의 연구를위한 강력한 도구를 만드는, 분석 될 수있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
공유 매체에 그들을 유지하면서 현재 프로토콜의 주요 목표는 완전히 별도의 연결 및 성상 세포 배양 물이다. 이 때문에, 얻어지는 배양액의 순도는 절차의 시작 부분에서 검증되어야한다. 우리는 신경 세포 마커로서 신경 세포 고유의 튜 불린, neurofilaments 또는 NeuN 단백질의 사용을 권장, GFAP는 성상 세포 마커로, 희소 돌기 아교 세포 전구체 마커 Iba1 단백질로 O4 항원은 미세 아교 세포를 식별합?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The present work was supported by the German research foundation (Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG: GRK 736, Fa 159/22-1; the research school of the Ruhr University Bochum (GSC98/1) and the priority program SSP 1172 “Glia and Synapse”, Fa 159/11-1,2,3).
Materials
| Reagents | |||
| B27 | Gibco (Life Technologies) | 17504-044 | |
| Cell culture grade water | MilliQ | ||
| Cell culture grade water | MilliQ | ||
| Cytosine-ß-D arabinofuranoside (AraC) | Sigma-Aldrich | C1768 | CAUTION: H317, H361 |
| DMEM | Gibco (Life Technologies) | 41966-029 | |
| DNAse | Worthington | LS002007 | |
| Gentamycin | Sigma-Aldrich | G1397 | CAUTION: H317-334 |
| Glucose | Serva | 22700 | |
| HBSS | Gibco (Life Technologies) | 14170-088 | |
| HEPES | Gibco (Life Technologies) | 15630-056 | |
| Horse serum | Biochrom AG | S9135 | |
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | C-2529 | |
| MEM | Gibco (Life Technologies) | 31095-029 | |
| Ovalbumin | Sigma-Aldrich | A7641 | CAUTION: H334 |
| Papain | Worthington | 3126 | |
| PBS | self-made | ||
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P0899 | |
| Poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich | P3655 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco (Life Technologies) | 25300054 | |
| Equipment | |||
| 24 well plates | Thermoscientific/Nunc | 142475 | |
| 24-wells plate (for the indirect co-culture) | BD Falcon | 353504 | |
| Binocular | Leica | MZ6 | |
| Cell-culture inserts | BD Falcon | 353095 | |
| Centrifuge | Heraeus | Multifuge 3S-R | |
| Counting Chamber | Marienfeld | 650010 | |
| Forceps | FST Dumont (#5) | 11254-20 | |
| glass cover slips (12 mm) | Carl Roth (Menzel- Gläser) | P231.1 | |
| Incubator | Thermo Scientific | Heracell 240i | |
| Micro tube (2 ml) | Sarstedt | 72,691 | |
| Microscope | Leica | DMIL | |
| Millex Syringe-driven filter unit | Millipore | SLGV013SL | |
| Orbital shaker | New Brunswick Scientific | Innova 4000 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| Petri dishes (10 cm) | Sarstedt | 833,902 | |
| pipette (1 ml) | Gilson | Pipetman 1000 | |
| Sterile work bench | The Baker Company | Laminar Flow SterilGARD III | |
| Surgical scissors | FST Dumont | 14094-11 | |
| Syringe | Henry Schein | 9003016 | |
| T75 flask | Sarstedt | 833,911,002 | |
| tube (15 ml) | Sarstedt | 64,554,502 | |
| Water bath | GFL | Water bath type 1004 |
References
- Volterra, A., Meldolesi, J. Astrocytes, from brain glue to communication elements: the revolution continues. Nat Rev Neurosci. 6, 626-640 (2005).
- Barreto, G. E., Gonzalez, J., Torres, Y., Morales, L. Astrocytic-neuronal crosstalk: implications for neuroprotection from brain injury. Neurosci Res. 71, 107-113 (2011).
- Araque, A., Carmignoto, G., Haydon, P. G. Dynamic signaling between astrocytes and neurons. Annu Rev Physiol. 63, 795-813 (2001).
- Dityatev, A., et al. Activity-dependent formation and functions of chondroitin sulfate-rich extracellular matrix of perineuronal nets. Dev Neurobiol. 67, 570-588 (2007).
- Robinette, B. L., Harrill, J. A., Mundy, W. R., Shafer, T. J. In vitro assessment of developmental neurotoxicity: use of microelectrode arrays to measure functional changes in neuronal network ontogeny. Front Neuroeng. 4, 1 (2011).
- Voigt, T., Opitz, T., de Lima, A. D. Synchronous Oscillatory Activity in Immature Cortical Network Is Driven by GABAergic Preplate Neurons. J Neurosci. 21 (22), 8895-8905 (2001).
- Geissler, M., Faissner, A. A new indirect co-culture set up of mouse hippocampal neurons and cortical astrocytes on microelectrode arrays. J Neurosci Methods. 204, 262-272 (2012).
- Yu, C. Y., et al. Neuronal and astroglial TGFbeta-Smad3 signaling pathways differentially regulate dendrite growth and synaptogenesis. Neuromolecular Med. 16, 457-472 (2014).
- Yu, P., Wang, H., Katagiri, Y., Geller, H. M. An in vitro model of reactive astrogliosis and its effect on neuronal growth. Methods Mol Biol. 814, 327-340 (2012).
- Kucukdereli, H., et al. Control of excitatory CNS synaptogenesis by astrocyte-secreted proteins Hevin and SPARC. PNAS. 108, E440-E449 (2011).
- Pyka, M., Busse, C., Seidenbecher, C., Gundelfinger, E. D., Faissner, A. Astrocytes are crucial for survival and maturation of embryonic hippocampal neurons in a neuron-glia cell-insert coculture assay. Synapse. 65, 41-53 (2011).
- Navarrete, M., Araque, A. Basal synaptic transmission: astrocytes rule!. Cell. 146, 675-677 (2011).
- Christopherson, K. S., et al. Thrombospondins are astrocyte-secreted proteins that promote CNS synaptogenesis. Cell. 120, 421-433 (2005).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Geissler, M., et al. Primary hippocampal neurons, which lack four crucial extracellular matrix molecules, display abnormalities of synaptic structure and function and severe deficits in perineuronal net formation. J Neurosci. 33, 7742-7755 (2013).
- Dzyubenko, E., Gottschling, C., Faissner, A. Neuron-Glia Interactions in Neural Plasticity: Contributions of Neural Extracellular Matrix and Perineuronal Nets. Neural Plast. 2016, 5214961 (2016).
- McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J Cell Biol. 85, 890-902 (1980).
- Pyka, M., et al. Chondroitin sulfate proteoglycans regulate astrocyte-dependent synaptogenesis and modulate synaptic activity in primary embryonic hippocampal neurons. Eur J Neurosci. 33, 2187-2202 (2011).
- Eroglu, C. The role of astrocyte-secreted matricellular proteins in central nervous system development and function. J Cell Commun Signal. 3, 167-176 (2009).
- Ethell, I. M., Ethell, D. W. Matrix metalloproteinases in brain development and remodeling: synaptic functions and targets. J Neurosci Res. 85, 2813-2823 (2007).
- Theocharidis, U., Long, K., ffrench-Constant, C., Faissner, A., Dityatev, A. l. e. x. a. n. d. e. r., Wehrle-Haller, B. e. r. n. h. a. r. d., Asla, P. i. t. k. &. #. 2. 2. 8. ;. n. e. n. . Prog Brain Res. 214, 3-28 (2014).
- Dityatev, A., Rusakov, D. A. Molecular signals of plasticity at the tetrapartite synapse. Curr Opin Neurobiol. 21, 353-359 (2011).
- Ippolito, D. M., Eroglu, C. Quantifying synapses: an immunocytochemistry-based assay to quantify synapse. JoVe. , (2010).
