Denne protokollen beskriver indirekte nevron-astrocyte coculture for compartmentalized analyse av nevron-gliaceller interaksjoner.
Riktig neuronal utvikling og funksjon er en forutsetning for utvikling og den voksne hjernen. Imidlertid er mekanismene bak svært kontrollert dannelse og vedlikehold av komplekse nevrale nettverk som ikke er fullstendig forstått så langt. De åpne spørsmål angående nevroner i helse og sykdom er mangfoldige og nå fra å forstå den grunnleggende utvikling for å undersøke menneskerelaterte sykdommer, for eksempel Alzheimers sykdom og schizofreni. Den mest detaljerte analyser av neuroner kan bli utført in vitro. Imidlertid er neuroner krevende celler og trenger ekstra støtte av astrocytter for deres langtidsoverlevelse. Denne mobil heterogenitet er i strid med det formål å dissekere analyse av nevroner og astrocytter. Vi presenterer her en cellekultur-analyse som gjør det mulig for den langsiktige cocultivation av rene primære neuroner og astrocytter, som deler de samme kjemisk definert medium, mens den er fysiskseparert. I dette oppsettet, kulturer overleve i opptil fire uker, og analysen er egnet for et mangfold av undersøkelser vedrørende nevron-gliaceller interaksjon.
Gjennom de siste tiårene har den generelle tolkningen av gliacelle funksjon utviklet seg fra tildeling av en bare støttende mot et aktivt regulerende rolle om nevronale funksjon 1. På grunn av sin fremtredende innvirkning på hjernen homeostase i helse og sykdom 2, astrocytter er av spesiell interesse for det vitenskapelige samfunnet. I de siste årene, har et mangfold av studier fokusert på nevron-gliaceller interaksjoner in vivo og in vitro tre. Men de fleste av de kultursystemer ikke gir mulighet for separat analyse av begge celletyper og deres respektive secretomes.
Flere tilnærminger utnytte direkte cocultivation av nevroner og gliaceller å oppnå langvarig overlevelse og fysiologisk relevant nevronale nettverk utvikling 4-6. Denne protokoll når de samme målene, samtidig som begge celletypene fysisk adskilte 7. Sammenlignet med conditioned medium tilnærminger 8,9, systemet gjør det mulig å studere toveis kommunikasjon mellom nevroner og astrocytter. Ekspresjon av utskilt signalmolekyler kan overvåkes mens cellene maturate i den felles medium. Denne muligheten er spesielt relevant, da astrocytter frigjør oppløselige faktorer, slik som cytokiner, vekstfaktorer og ekstracellulære matriks-molekyler 10,11, for derved å regulere neuronal vekst og funksjon 7,12. Det har således blitt vist at tilsetningen av thrombospondin til gangliecelle in vitro induserer dannelsen av synapser 13. Men andre ennå ukjente faktorer er nødvendig for å gjengi synapser funksjonelle 13. Videre molekyler utgitt av astrocytter har til å bli identifisert for å forstå grunnlaget for neuron-gliaceller interaksjoner.
Dyrking av primære neuroner og astrocytter fra mus og rotte har blitt beskrevet tidligere 14-16. her er vipresentere en elegant og allsidig verktøy for å kombinere begge celletyper i en indirekte coculture tilnærming. Siden de to kulturene er fysisk adskilt, men deler den samme medium, virkningen av neuroner, astrocytter og oppløselige molekyler, kan hver for seg analysert, og dermed skape et kraftig verktøy for neuron-glia interaksjonsstudier.
Hovedmålet med den nåværende protokollen er å helt separate nevronale og astrocytic kulturer, og samtidig opprettholde dem i delt medium. Av denne grunn bør renheten av kulturene som oppnås verifiseres ved begynnelsen av prosedyren. Vi anbefaler bruk av neuron-spesifikke tubulin, nevrofilamenter eller Neun protein som nevrale markører, GFAP som astrocytic markør, O4 antigen som oligodendrocyte forløper markør og Iba1 protein for å identifisere microglia.
Vær spesielt oppmerksom n…
The authors have nothing to disclose.
The present work was supported by the German research foundation (Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG: GRK 736, Fa 159/22-1; the research school of the Ruhr University Bochum (GSC98/1) and the priority program SSP 1172 “Glia and Synapse”, Fa 159/11-1,2,3).
Reagents | |||
B27 | Gibco (Life Technologies) | 17504-044 | |
Cell culture grade water | MilliQ | ||
Cell culture grade water | MilliQ | ||
Cytosine-ß-D arabinofuranoside (AraC) | Sigma-Aldrich | C1768 | CAUTION: H317, H361 |
DMEM | Gibco (Life Technologies) | 41966-029 | |
DNAse | Worthington | LS002007 | |
Gentamycin | Sigma-Aldrich | G1397 | CAUTION: H317-334 |
Glucose | Serva | 22700 | |
HBSS | Gibco (Life Technologies) | 14170-088 | |
HEPES | Gibco (Life Technologies) | 15630-056 | |
Horse serum | Biochrom AG | S9135 | |
L-Cysteine | Sigma-Aldrich | C-2529 | |
MEM | Gibco (Life Technologies) | 31095-029 | |
Ovalbumin | Sigma-Aldrich | A7641 | CAUTION: H334 |
Papain | Worthington | 3126 | |
PBS | self-made | ||
Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P0899 | |
Poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich | P3655 | |
Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | |
Trypsin-EDTA | Gibco (Life Technologies) | 25300054 | |
Equipment | |||
24 well plates | Thermoscientific/Nunc | 142475 | |
24-wells plate (for the indirect co-culture) | BD Falcon | 353504 | |
Binocular | Leica | MZ6 | |
Cell-culture inserts | BD Falcon | 353095 | |
Centrifuge | Heraeus | Multifuge 3S-R | |
Counting Chamber | Marienfeld | 650010 | |
Forceps | FST Dumont (#5) | 11254-20 | |
glass cover slips (12 mm) | Carl Roth (Menzel- Gläser) | P231.1 | |
Incubator | Thermo Scientific | Heracell 240i | |
Micro tube (2 ml) | Sarstedt | 72,691 | |
Microscope | Leica | DMIL | |
Millex Syringe-driven filter unit | Millipore | SLGV013SL | |
Orbital shaker | New Brunswick Scientific | Innova 4000 | |
Parafilm | Bemis | PM-996 | |
Petri dishes (10 cm) | Sarstedt | 833,902 | |
pipette (1 ml) | Gilson | Pipetman 1000 | |
Sterile work bench | The Baker Company | Laminar Flow SterilGARD III | |
Surgical scissors | FST Dumont | 14094-11 | |
Syringe | Henry Schein | 9003016 | |
T75 flask | Sarstedt | 833,911,002 | |
tube (15 ml) | Sarstedt | 64,554,502 | |
Water bath | GFL | Water bath type 1004 |