De indirekta Neuron-astrocyternas Coculture analys: En<em> In Vitro</em> Set-up för detaljerad undersökning av Neuron-Glia interaktioner
Summary
Detta protokoll beskriver den indirekta neuron-astrocyternas samodling för compartmentalized analys av neuron-glia växelverkan.
Abstract
Korrekt neuronal utveckling och funktion är en förutsättning för utveckling och den vuxna hjärnan. Emellertid är de mekanismer som ligger bakom den starkt kontrollerade bildningen och underhållet av komplexa neuronala nätverk inte fullständigt klarlagd hittills. De öppna frågorna om nervceller i hälsa och sjukdom är olika och sträcker sig från att förstå den grundläggande utveckling undersöka mänskliga relaterade sjukdomar, t.ex. Alzheimers sjukdom och schizofreni. Den mest detaljerade analysen av neuroner kan utföras in vitro. Men neuroner krävande celler och behöver extra stöd av astrocyter för sin överlevnad på lång sikt. Denna cellulära heterogenitet är i konflikt med målet att dissekera analysen av neuroner och astrocyter. Vi presenterar här en cellodlingsanalys som gör det möjligt att på lång sikt samodling av rena primära nervceller och astrocyter, som delar samma kemiskt definierat medium, samtidigt som fysisktseparerat. Med den här inställningen kulturerna överleva i upp till fyra veckor och analysen är lämplig för en mångfald av undersökningar rörande neuron-glia växelverkan.
Introduction
Alltigenom de senaste decennierna har den allmänna tolkningen av neuroglia funktion utvecklats från tilldelningen av en enbart stödjande mot en aktiv reglerande roll om neuronal funktion 1. På grund av deras framträdande inverkan på hjärnans homeostas vid hälsa och sjukdom 2, astrocyter är av särskilt intresse för det vetenskapliga samfundet. Under de senaste åren har en mångfald av studier inriktade på neuron-Glia interaktioner in vivo och in vitro 3. Men de flesta av de kultursystem tillåter inte för separat analys av båda celltyperna och deras respektive secretomes.
Flera tillvägagångssätt utnyttjar direkt samodling av nervceller och glia att uppnå långvarig överlevnad och fysiologiskt relevanta neuronala nätverket utveckling 4-6. Det nuvarande protokollet når samma mål samtidigt båda celltyper fysiskt separerade 7. Jämfört med conditioned mediet närmar 8,9, vårt system gör det möjligt att studera dubbelriktad kommunikation mellan nervceller och astrocyter. Uttrycket av utsöndrade signalmolekyler kan övervakas medan cellerna ska mogna i det delade mediumet. Denna möjlighet är särskilt relevant, eftersom astrocyter släppa lösliga faktorer, såsom cytokiner, tillväxtfaktorer och extracellulära matrixmolekyler 10,11, därmed reglera neuronal tillväxt och funktion 7,12. Sålunda har det visats att tillsatsen av trombospondin till retinala ganglionceller in vitro inducerar bildningen av synapser 13. Men andra ännu okända faktorer är nödvändiga för att göra synapser funktionella 13. Dessutom molekyler frigörs genom astrocyter måste identifieras för att förstå grunden för neuron-glia växelverkan.
Odling av primära neuroner och astrocyter från mus och råtta har beskrivits tidigare 14-16. Här vipresentera en elegant och mångsidigt verktyg för att kombinera båda celltyperna i en indirekt coculture strategi. Eftersom de två kulturerna är fysiskt åtskilda men delar samma medium, effekterna av neuroner, astrocyter och lösliga molekyler kan analyseras separat, vilket skapar ett kraftfullt verktyg för neuron-glia interaktionsstudier.
Protocol
Representative Results
Discussion
Huvudsyftet med det nuvarande protokollet är helt separata neuronala och astrocytiska kulturer, samtidigt som dem i delat medium. Av denna anledning, bör verifieras renheten av odlingarna erhållna i början av förfarandet. Vi rekommenderar användning av neuron-specifik tubulin, neurofilament eller Neun protein som neuronala markörer, GFAP som astrocytisk markör, O4 antigen som oligodendrocyt föregångare markör och Iba1 protein för att identifiera mikroglia.
Ägna särskild uppmär…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The present work was supported by the German research foundation (Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG: GRK 736, Fa 159/22-1; the research school of the Ruhr University Bochum (GSC98/1) and the priority program SSP 1172 “Glia and Synapse”, Fa 159/11-1,2,3).
Materials
| Reagents | |||
| B27 | Gibco (Life Technologies) | 17504-044 | |
| Cell culture grade water | MilliQ | ||
| Cell culture grade water | MilliQ | ||
| Cytosine-ß-D arabinofuranoside (AraC) | Sigma-Aldrich | C1768 | CAUTION: H317, H361 |
| DMEM | Gibco (Life Technologies) | 41966-029 | |
| DNAse | Worthington | LS002007 | |
| Gentamycin | Sigma-Aldrich | G1397 | CAUTION: H317-334 |
| Glucose | Serva | 22700 | |
| HBSS | Gibco (Life Technologies) | 14170-088 | |
| HEPES | Gibco (Life Technologies) | 15630-056 | |
| Horse serum | Biochrom AG | S9135 | |
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | C-2529 | |
| MEM | Gibco (Life Technologies) | 31095-029 | |
| Ovalbumin | Sigma-Aldrich | A7641 | CAUTION: H334 |
| Papain | Worthington | 3126 | |
| PBS | self-made | ||
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P0899 | |
| Poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich | P3655 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco (Life Technologies) | 25300054 | |
| Equipment | |||
| 24 well plates | Thermoscientific/Nunc | 142475 | |
| 24-wells plate (for the indirect co-culture) | BD Falcon | 353504 | |
| Binocular | Leica | MZ6 | |
| Cell-culture inserts | BD Falcon | 353095 | |
| Centrifuge | Heraeus | Multifuge 3S-R | |
| Counting Chamber | Marienfeld | 650010 | |
| Forceps | FST Dumont (#5) | 11254-20 | |
| glass cover slips (12 mm) | Carl Roth (Menzel- Gläser) | P231.1 | |
| Incubator | Thermo Scientific | Heracell 240i | |
| Micro tube (2 ml) | Sarstedt | 72,691 | |
| Microscope | Leica | DMIL | |
| Millex Syringe-driven filter unit | Millipore | SLGV013SL | |
| Orbital shaker | New Brunswick Scientific | Innova 4000 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| Petri dishes (10 cm) | Sarstedt | 833,902 | |
| pipette (1 ml) | Gilson | Pipetman 1000 | |
| Sterile work bench | The Baker Company | Laminar Flow SterilGARD III | |
| Surgical scissors | FST Dumont | 14094-11 | |
| Syringe | Henry Schein | 9003016 | |
| T75 flask | Sarstedt | 833,911,002 | |
| tube (15 ml) | Sarstedt | 64,554,502 | |
| Water bath | GFL | Water bath type 1004 |
References
- Volterra, A., Meldolesi, J. Astrocytes, from brain glue to communication elements: the revolution continues. Nat Rev Neurosci. 6, 626-640 (2005).
- Barreto, G. E., Gonzalez, J., Torres, Y., Morales, L. Astrocytic-neuronal crosstalk: implications for neuroprotection from brain injury. Neurosci Res. 71, 107-113 (2011).
- Araque, A., Carmignoto, G., Haydon, P. G. Dynamic signaling between astrocytes and neurons. Annu Rev Physiol. 63, 795-813 (2001).
- Dityatev, A., et al. Activity-dependent formation and functions of chondroitin sulfate-rich extracellular matrix of perineuronal nets. Dev Neurobiol. 67, 570-588 (2007).
- Robinette, B. L., Harrill, J. A., Mundy, W. R., Shafer, T. J. In vitro assessment of developmental neurotoxicity: use of microelectrode arrays to measure functional changes in neuronal network ontogeny. Front Neuroeng. 4, 1 (2011).
- Voigt, T., Opitz, T., de Lima, A. D. Synchronous Oscillatory Activity in Immature Cortical Network Is Driven by GABAergic Preplate Neurons. J Neurosci. 21 (22), 8895-8905 (2001).
- Geissler, M., Faissner, A. A new indirect co-culture set up of mouse hippocampal neurons and cortical astrocytes on microelectrode arrays. J Neurosci Methods. 204, 262-272 (2012).
- Yu, C. Y., et al. Neuronal and astroglial TGFbeta-Smad3 signaling pathways differentially regulate dendrite growth and synaptogenesis. Neuromolecular Med. 16, 457-472 (2014).
- Yu, P., Wang, H., Katagiri, Y., Geller, H. M. An in vitro model of reactive astrogliosis and its effect on neuronal growth. Methods Mol Biol. 814, 327-340 (2012).
- Kucukdereli, H., et al. Control of excitatory CNS synaptogenesis by astrocyte-secreted proteins Hevin and SPARC. PNAS. 108, E440-E449 (2011).
- Pyka, M., Busse, C., Seidenbecher, C., Gundelfinger, E. D., Faissner, A. Astrocytes are crucial for survival and maturation of embryonic hippocampal neurons in a neuron-glia cell-insert coculture assay. Synapse. 65, 41-53 (2011).
- Navarrete, M., Araque, A. Basal synaptic transmission: astrocytes rule!. Cell. 146, 675-677 (2011).
- Christopherson, K. S., et al. Thrombospondins are astrocyte-secreted proteins that promote CNS synaptogenesis. Cell. 120, 421-433 (2005).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Geissler, M., et al. Primary hippocampal neurons, which lack four crucial extracellular matrix molecules, display abnormalities of synaptic structure and function and severe deficits in perineuronal net formation. J Neurosci. 33, 7742-7755 (2013).
- Dzyubenko, E., Gottschling, C., Faissner, A. Neuron-Glia Interactions in Neural Plasticity: Contributions of Neural Extracellular Matrix and Perineuronal Nets. Neural Plast. 2016, 5214961 (2016).
- McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J Cell Biol. 85, 890-902 (1980).
- Pyka, M., et al. Chondroitin sulfate proteoglycans regulate astrocyte-dependent synaptogenesis and modulate synaptic activity in primary embryonic hippocampal neurons. Eur J Neurosci. 33, 2187-2202 (2011).
- Eroglu, C. The role of astrocyte-secreted matricellular proteins in central nervous system development and function. J Cell Commun Signal. 3, 167-176 (2009).
- Ethell, I. M., Ethell, D. W. Matrix metalloproteinases in brain development and remodeling: synaptic functions and targets. J Neurosci Res. 85, 2813-2823 (2007).
- Theocharidis, U., Long, K., ffrench-Constant, C., Faissner, A., Dityatev, A. l. e. x. a. n. d. e. r., Wehrle-Haller, B. e. r. n. h. a. r. d., Asla, P. i. t. k. &. #. 2. 2. 8. ;. n. e. n. . Prog Brain Res. 214, 3-28 (2014).
- Dityatev, A., Rusakov, D. A. Molecular signals of plasticity at the tetrapartite synapse. Curr Opin Neurobiol. 21, 353-359 (2011).
- Ippolito, D. M., Eroglu, C. Quantifying synapses: an immunocytochemistry-based assay to quantify synapse. JoVe. , (2010).
