Summary

Dolaylı nöron astrosit Coculture Deneyi: Bir<em> İn Vitro</em> Nöron glia Etkileşimleri Detaylı Soruşturma Set-up

Published: November 14, 2016
doi:

Summary

Bu protokol nöron glia etkileşimlerinin bölümlere analizi için dolaylı nöron astrosit kokültürü açıklar.

Abstract

Uygun nöronal gelişim ve fonksiyon gelişen ve yetişkin beyin ön koşuldur. Bununla birlikte, kompleks nöronal ağların son derece kontrollü oluşumu ve bakım altında yatan mekanizmaları tam bugüne kadar anlaşılamamıştır. Sağlıkta ve hastalıkta nöronlar ile ilgili açık sorular insan ile ilgili patolojiler, örneğin, Alzheimer hastalığı ve Şizofreni soruşturma temel gelişmeyi anlamaktan çeşitli ve kapsamlıdır. Nöronların en ayrıntılı analizi, in vitro olarak yapılabilir. Ancak, nöronlar hücreleri talep ve uzun vadeli hayatta kalmak için astrositlerin ek desteğe ihtiyacı vardır. Bu hücresel heterojenlik nöron ve astrositlerin analizini incelemek amacıyla çelişmektedir. Fiziksel olarak ederken, aynı burada kimyasal olarak tanımlanmış bir ortam paylaşan saf birincil nöronlar ve astrositler, uzun süreli birlikte yetiştirme için izin veren bir hücre kültürü tahlil mevcutayrıldı. Bu ayarda, kültürler en fazla dört hafta boyunca hayatta ve tahlil nöron glia etkileşimine ilişkin araştırmaların bir çeşitlilik için uygundur.

Introduction

Geçtiğimiz yıllar içinde, nöroglia fonksiyonunun genel yorumlama nöronal fonksiyonu 1 ile ilgili aktif bir düzenleyici rolüne yönelik bir sadece destekleyici bir atıf dönüşmüştür. Çünkü sağlık ve hastalık 2 beyin homeostazisi üzerindeki belirgin etkisi, astrositler bilimsel topluluk için özel bir öneme sahiptir. Son birkaç yıl içinde, çalışmalar çeşitliliği in vivo ve in vitro 3 nöron-glia etkileşimlerine odaklanmıştır. Ancak, kültür sistemlerinin çoğu, her iki hücre tiplerinin ayrı bir analiz için ve ilgili secretomes arasında izin vermez.

Çeşitli yaklaşımlar uzun ömürlü sağkalım ve fizyolojik ilgili nöronal ağ geliştirme 4-6 ulaşmak için nöronların ve glia doğrudan kültürleştirilmeye istifade eder. Fiziksel olarak 7 ayrı iki hücre tipleri tutarken mevcut protokol aynı hedefleri ulaşır. conditione karşılaştırıldığındad orta sistemimiz nöronlar ve astrositler arasındaki çift yönlü iletişimi çalışma sağlar, 8,9 yaklaşır. Hücreler paylaşılan ortam içinde olgunlaşmak ise salgılanan sinyal molekülleri ekspresyonu izlenebilir. Astrositler ve böylece sinir hücresi büyümesini düzenleyen, sitokinler, büyüme faktörleri ve hücre dışı matris moleküllerinin 10,11 gibi çözünür faktörlerin, serbest ve 7,12 fonksiyonu olarak fırsat ilişkindir. Nedenle, in vitro olarak, retinal bez hücrelerin trombospondin eklenmesi sinaps 13 oluşumunu uyardığını ortaya konmuştur. Bununla birlikte, diğer henüz bilinmeyen faktörler 13 fonksiyonel sinaps oluşturmak için gereklidir. Ayrıca, astrositler tarafından yayımlanan moleküller nöron glia etkileşimleri temelini anlamak için tespit edilmelidir.

Fare ve sıçan primer nöron ve astrositler ekimi önce 14-16 tarif edilmiştir. buradadolaylı kokültürünün yaklaşımla hem hücre tipleri birleştirmek için zarif ve çok yönlü bir araç sunuyoruz. iki kültür fiziksel ama aynı ortam, nöronlar, astrositler ve çözünür moleküllerin etkisi, dövme ayrılmış olması nedeniyle, ayrıca bu şekilde nöron glia etkileşim çalışmaları için güçlü bir araç sunar analiz edilebilir.

Protocol

fareler ile deneyler hayvancılığın Nörobilim kurallarına Alman Hukuku ve Alman Derneği ile uyumluydu. Ruhr-University Bochum hayvan bakımı ve kullanım komiteleri uygun izinleri verdiniz. 1. Hazırlık ve Kortikal Astrositler Yetiştiriciliği Not: nöronlar hazırlanır önce astrosit kültürleri birleşen mono tabakaları haline gerektiği gibi, sonraki adımlara geçmeden önce protokolü en az 7 gün, bu adımları tamamlayın. Primer astrosit doğum …

Representative Results

Dolaylı Coculture sistemiyle nöronal kültürler analizi çok yönlü ve kültür olgunlaşma farklı aşamalarında gerçekleştirilebilir. Hücrede 4 hafta boyunca muhafaza edilebilir olması kültürlerin uzun dönem araştırmalar mümkündür. Şekil 1 orta sol panelde şematik birlikte üretim kurulumunu göstermektedir. astrosit tek katmanlı (üst sol panel) ve nöronal ağın (sol alt panel) faz kon…

Discussion

Paylaşılan ortamda bunları korurken mevcut protokolün temel amacı, tamamen ayrı nöronal ve astrositik kültürler etmektir. Bu nedenle, elde edilen kültürlerin saflığı prosedürü başlangıcında kontrol edilmelidir. Biz nöronal belirteç olarak nöron-spesifik tubulin, nörofilament veya Neun proteininin kullanılmasını tavsiye, GFAP astrositik işaretleyici olarak, oligodendrosit öncüsü işareti ve Iba1 protein olarak O4 antijen mikroglia tanımlamak için.

protokol krit…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The present work was supported by the German research foundation (Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG: GRK 736, Fa 159/22-1; the research school of the Ruhr University Bochum (GSC98/1) and the priority program SSP 1172 “Glia and Synapse”, Fa 159/11-1,2,3).

Materials

Reagents
B27 Gibco (Life Technologies) 17504-044
Cell culture grade water MilliQ
Cell culture grade water MilliQ
Cytosine-ß-D arabinofuranoside (AraC) Sigma-Aldrich C1768 CAUTION: H317, H361
DMEM Gibco (Life Technologies)  41966-029
DNAse Worthington LS002007
Gentamycin Sigma-Aldrich G1397 CAUTION: H317-334
Glucose Serva 22700
HBSS Gibco (Life Technologies) 14170-088
HEPES Gibco (Life Technologies) 15630-056
Horse serum Biochrom AG S9135
L-Cysteine Sigma-Aldrich C-2529
MEM Gibco (Life Technologies) 31095-029
Ovalbumin Sigma-Aldrich A7641 CAUTION: H334
Papain Worthington 3126
PBS self-made 
Poly-D-lysine Sigma-Aldrich P0899
Poly-L-ornithine Sigma-Aldrich P3655
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich S8636
Trypsin-EDTA Gibco (Life Technologies) 25300054
Equipment
24 well plates Thermoscientific/Nunc 142475
24-wells plate (for the  indirect co-culture) BD Falcon 353504
Binocular Leica MZ6
Cell-culture inserts BD Falcon 353095
Centrifuge Heraeus Multifuge 3S-R
Counting Chamber Marienfeld 650010
Forceps FST Dumont (#5) 11254-20
glass cover slips (12 mm) Carl Roth (Menzel- Gläser) P231.1
Incubator Thermo Scientific Heracell 240i
Micro tube (2 ml) Sarstedt 72,691
Microscope Leica DMIL
Millex Syringe-driven filter unit Millipore SLGV013SL
Orbital shaker New Brunswick Scientific Innova 4000
Parafilm Bemis PM-996
Petri dishes (10 cm) Sarstedt 833,902
pipette (1 ml) Gilson Pipetman 1000
Sterile work bench The Baker Company Laminar Flow SterilGARD III
Surgical scissors FST Dumont 14094-11
Syringe Henry Schein 9003016
T75 flask Sarstedt 833,911,002
tube (15 ml) Sarstedt 64,554,502
Water bath GFL Water bath type 1004

References

  1. Volterra, A., Meldolesi, J. Astrocytes, from brain glue to communication elements: the revolution continues. Nat Rev Neurosci. 6, 626-640 (2005).
  2. Barreto, G. E., Gonzalez, J., Torres, Y., Morales, L. Astrocytic-neuronal crosstalk: implications for neuroprotection from brain injury. Neurosci Res. 71, 107-113 (2011).
  3. Araque, A., Carmignoto, G., Haydon, P. G. Dynamic signaling between astrocytes and neurons. Annu Rev Physiol. 63, 795-813 (2001).
  4. Dityatev, A., et al. Activity-dependent formation and functions of chondroitin sulfate-rich extracellular matrix of perineuronal nets. Dev Neurobiol. 67, 570-588 (2007).
  5. Robinette, B. L., Harrill, J. A., Mundy, W. R., Shafer, T. J. In vitro assessment of developmental neurotoxicity: use of microelectrode arrays to measure functional changes in neuronal network ontogeny. Front Neuroeng. 4, 1 (2011).
  6. Voigt, T., Opitz, T., de Lima, A. D. Synchronous Oscillatory Activity in Immature Cortical Network Is Driven by GABAergic Preplate Neurons. J Neurosci. 21 (22), 8895-8905 (2001).
  7. Geissler, M., Faissner, A. A new indirect co-culture set up of mouse hippocampal neurons and cortical astrocytes on microelectrode arrays. J Neurosci Methods. 204, 262-272 (2012).
  8. Yu, C. Y., et al. Neuronal and astroglial TGFbeta-Smad3 signaling pathways differentially regulate dendrite growth and synaptogenesis. Neuromolecular Med. 16, 457-472 (2014).
  9. Yu, P., Wang, H., Katagiri, Y., Geller, H. M. An in vitro model of reactive astrogliosis and its effect on neuronal growth. Methods Mol Biol. 814, 327-340 (2012).
  10. Kucukdereli, H., et al. Control of excitatory CNS synaptogenesis by astrocyte-secreted proteins Hevin and SPARC. PNAS. 108, E440-E449 (2011).
  11. Pyka, M., Busse, C., Seidenbecher, C., Gundelfinger, E. D., Faissner, A. Astrocytes are crucial for survival and maturation of embryonic hippocampal neurons in a neuron-glia cell-insert coculture assay. Synapse. 65, 41-53 (2011).
  12. Navarrete, M., Araque, A. Basal synaptic transmission: astrocytes rule!. Cell. 146, 675-677 (2011).
  13. Christopherson, K. S., et al. Thrombospondins are astrocyte-secreted proteins that promote CNS synaptogenesis. Cell. 120, 421-433 (2005).
  14. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
  15. Geissler, M., et al. Primary hippocampal neurons, which lack four crucial extracellular matrix molecules, display abnormalities of synaptic structure and function and severe deficits in perineuronal net formation. J Neurosci. 33, 7742-7755 (2013).
  16. Dzyubenko, E., Gottschling, C., Faissner, A. Neuron-Glia Interactions in Neural Plasticity: Contributions of Neural Extracellular Matrix and Perineuronal Nets. Neural Plast. 2016, 5214961 (2016).
  17. McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J Cell Biol. 85, 890-902 (1980).
  18. Pyka, M., et al. Chondroitin sulfate proteoglycans regulate astrocyte-dependent synaptogenesis and modulate synaptic activity in primary embryonic hippocampal neurons. Eur J Neurosci. 33, 2187-2202 (2011).
  19. Eroglu, C. The role of astrocyte-secreted matricellular proteins in central nervous system development and function. J Cell Commun Signal. 3, 167-176 (2009).
  20. Ethell, I. M., Ethell, D. W. Matrix metalloproteinases in brain development and remodeling: synaptic functions and targets. J Neurosci Res. 85, 2813-2823 (2007).
  21. Theocharidis, U., Long, K., ffrench-Constant, C., Faissner, A., Dityatev, A. l. e. x. a. n. d. e. r., Wehrle-Haller, B. e. r. n. h. a. r. d., Asla, P. i. t. k. &. #. 2. 2. 8. ;. n. e. n. . Prog Brain Res. 214, 3-28 (2014).
  22. Dityatev, A., Rusakov, D. A. Molecular signals of plasticity at the tetrapartite synapse. Curr Opin Neurobiol. 21, 353-359 (2011).
  23. Ippolito, D. M., Eroglu, C. Quantifying synapses: an immunocytochemistry-based assay to quantify synapse. JoVe. , (2010).

Play Video

Cite This Article
Gottschling, C., Dzyubenko, E., Geissler, M., Faissner, A. The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions. J. Vis. Exp. (117), e54757, doi:10.3791/54757 (2016).

View Video