Summary
I 125 - 표지 지드의 합성 및 무도 클릭 반응을 이용 dibenzocyclooctyne (DBCO) - 기 - 컨쥬 게이트 13 나노 크기의 금 나노 입자의 방사성 표지에 대한 세부 절차를 설명한다.
Protocol
주의 : 방사성 요오드의 산화 된 형태가 매우 휘발성 적절한 리드 방패와 리드 유리 병 취급해야합니다. 모든 방사 단계는 통풍이 잘되는 숯을 여과 후드에서 수행 한 실험 절차는 방사능 검출 장치에 의해 모니터링해야한다.
I 125 - 표지 된 아 지드의 합성 화학 및 역상 카트리지 (1)의 제조
- 용액의 시약의 조제
- 150 μL의 아 지드 전구체 (2) 무수 에탄올 (그림 1)의 1 mg의 용해.
참고 : 아 지드 전구체에 대한 자세한 합성 절차 (2) 이전의 종이 (22)에보고되었다. - 1X 인산 완충 생리 식염수 (pH는 7.4) 20 μL를 1 mg을 클로라민 T를 녹인다.
- 20 μL의 H 2 O 2 mg의 나트륨 메타 비설 파이트를 녹여
- 150 μL의 아 지드 전구체 (2) 무수 에탄올 (그림 1)의 1 mg의 용해.
- Prepara카트리지 기
- 10 ㎖의 H 2 O이어서 10 ㎖의 무수 에탄올로 TC18 카트리지 워시 공기와 카트리지의 행렬을 건조하지 마십시오.
125 I 표지 아 지드 보철 그룹의 2 Radiosynthesis
- 전구체의 방사성 요오드화 반응
- 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브에 지드 전구체 용액 및 아세트산 (10 μL) (무수 에탄올 150 ㎕의 1 mg)을 추가한다.
- 반응 혼합물에 0.1 M의 NaOH (50 μL)에 [125 I]의 NaI 150 MBq의 추가.
- 클로라민 T 용액 (1X 인산 완충 식염수 20 ㎕의 1 mg)을 첨가하고 튜브를 마이크로 원심 함유하는 반응 혼합물을 닫는다.
- 방사성 요오드화 반응이 완료 될 때까지 실온에서 15 분간 반응 혼합물을 인큐베이션.
- 반응 혼합물에 소듐 메타 바이 설 파이트 용액 (2 ㎎을 20 μL의 H 2 O)를 추가방사성 요오드화 반응을 해소합니다.
- 조 생성물을 0.2 μl를 인출 한 후 용액을 100 ㎕로 희석 (H 2 O / CH 3 CN, 1 : 1) HPLC 분석.
참고 : 모든 HPLC 실험의 경우, H 2 O (용매 A)를 포함하는 0.1 % 포름산 및 이동상 0.1 % 포름산 함유 아세토 니트릴 (용매 B)를 사용합니다. - 칼럼 상 반전 (역상 분석 무선-HPLC를 이용하여 희석하고, 조 생성물을 C18 분석; 유속 : 1 ml / 분 용리액 구배 : 0-2 분 동안 20 % 용매 B, 20 % ~ 80 % 용매 B에 대한 2-22 분, 22 ~ 23 분 80~100% 용매 B, 그리고 23-28 분 동안 100 % 용매 B, 체류 시간 : 16.4 분) (그림 2).
- 분취 HPLC로 조 생성물을 정제하여
주 : 이러한 주입기, 컬럼, 검출기 수집 튜브 및 폐수 수집 된 컨테이너 HPLC 부품 주위에 충분한 납 차폐를 제공한다.- 일 철수HPLC 바이알에 전체 반응 혼합물을 전자. 아세토 니트릴 (0.5 mL)로 반응 관을 씻어 동일한 주입 병에 린스를 추가합니다. H 2 O (1 mL)로 수집 된 용액을 희석.
- (조제 무선 HPLC 상에 주입하여 조 생성물을 C18 컬럼 상 역방향 유속 : 10 ㎖ / 분 용리액 구배 : 2-22 분 동안 0-2 분, 20 % ~ 80 % 용매 B 20 % 용매 B를 22 ~ 23 분 동안 80~100% 용매 B, 그리고 23-28 분 동안 100 % 용매 B).
- I 125 - 표지 지드 (1)를 나타내는 피크 방사능 수집을 유리 시험관에 (도 2) (이들의 HPLC 조건에서의 t R은 17.8-18.8 분이다).
- 제조사의 프로토콜에 따라 방사선 도즈 교정기를 사용하여 분획의 방사 화학적 수율을 측정한다.
- 제품의 방사 화학적 순도를 결정하기위한 동일한 HPLC 조건을 사용하여 분석 무선 HPLC로 정제 된 생성물을 주입한다.
- 제품의 고체상 추출
- 40ml의 순수 H 2 O로 원하는 생성물 (1)을 포함하는 분획을 희석
- 컨디셔닝 TC18 카트리지에 희석액을 추가합니다.
- 추가로 15 ML의 H 2 O와 카트리지를 세척
- 리드 방패에 의해 보호되는 10 ml의 유리 바이알에 2 ㎖의 아세톤으로 카트리지에 갇혀 제품 (1) 용출. 제조사의 프로토콜에 따라 방사선 도즈 교정을 사용하여 용출 된 생성물의 방사능을 측정한다.
주 : 디메틸 설폭 사이드 (DMSO) 또는 무수 에탄올 또한 카트리지로부터의 생성물의 용출을 위해 사용될 수있다. 방사능의 약 5-10 %는 보통 카트리지 스틱, 남은 방사선 표지 생성물은 완전히 유기 용매의 과잉을 사용하여 용출 될 수 없다. - 질소 또는 아르곤 가스의 흐름과 함께 아세톤을 증발시켰다.
- 재를 녹여다음 방사성 표지 단계에 대한 DMSO (100-200 μL)와 sidue.
DBCO 기 - 금 나노 입자 컨쥬 게이트 (3)의 합성
- 13 나노 크기의 금 표면 변형 DBCO 기 함유 폴리에틸렌 글리콜 나노 입자
- 준비 나트륨 구연산 안정화 된 금 나노 입자 (3) (평균 크기 = 13 ㎚) 이전의 보고서 (24)에 따라.
- (10 nM 내지 15 mL) 중 시트 레이트 - 안정화 된 금 나노 입자에 트윈 20 (1 ㎜, 1.5 ㎖)의 수용액을 추가한다. 궤도 통에 20 분의 솔루션을 흔들어.
- DBCO 기 함유 폴리에틸렌 글리콜 티올 (평균 분자량 = 5,000, 100 μM, 1.5 ㎖)의 수용액을 추가한다. 오비탈 진탕 기에서 2 시간 동안 용액을 흔들어.
- DBCO 그룹 - 개질 된 금 나노 입자의 정제
- 정제 DBCO 그룹 - 개질 된 금 나노 입자 (4) </ 연속 원심 분리 (11,400 XG, 15 분 × 3)로> 강한.
- 뜨는을 가만히 따르다 및 금 나노 입자 펠릿의 재 부유 순수을 추가합니다.
4. 구리 무료 클릭 반응을 통해 DBCO - 그룹 - 개질 된 금 나노 입자의 방사성 표지
- I 125 - 표지 된 아 지드를 사용하여 125 I 표지 된 금 나노 입자의 합성 (1)
- 원심 분리 (11,400 × g으로 15 분간)을 사용하여 DBCO 그룹 - 개질 된 금 나노 입자의 농축 용액을 제조하고, 2 μM로 금 나노 입자의 농도를 조절한다.
- 금 나노 입자의 현탁액을 DMSO (5 μL)의 125I 표지 지드 (1) 4.1 MBq의 추가 (4) (2 μM, 50 μL).
- 60 분 동안 40 ° C에서 얻어진 반응 혼합물을 인큐베이션.
- 조 생성물로부터 분취 량 (0.2 μL)를 인출하고, 실리카 - 코에 적용ated 박층 크로마토 그래피 (TLC) 판.
- 이동상으로서 에틸 아세테이트를 사용하여 TLC 판을 개발한다.
- 전파 TLC 스캐너의 TLC 플레이트를 배치하고, 제조자의 프로토콜에 따라 방사성 표지 반응 (도 3)을 감시하는 스캐너를 실행.
- 조 생성물을 정제하여
- 원심 분리하여 125 I 표지 된 금 나노 입자 (4) (11,400 × g으로 15 분간)를 포함하는 반응 혼합물을 정제 하였다.
- 뜨는을 가만히 따르다 및 금 나노 입자 펠릿의 재 부유 순수을 추가합니다.
- 정제 된 제품에서 나누어지는 (0.2 μl를) 철회 및 실리카 코팅 된 TLC 판에 적용합니다.
- 이동상으로서 에틸 아세테이트를 사용하여 TLC 판을 개발한다.
- 무선-TLC 스캐너에 TLC 판을 놓고 125I 표지 GOL의 방사 화학적 수율 및 방사 화학적 순도를 결정하기 위해 스캐너를 실행제조 업체의 프로토콜에 따라 D 나노 입자 (4) (그림 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
stannylated 전구체 (2)의 방사성 요오드화 반응은 방사능 표지 된 생성물을 제공하기 위해 실온에서 15 분 동안 [125 I] NaI를 아세트산 및 클로라민 T 150 MBq의를 사용하여 수행 하였다 (1). 조 혼합물을 예비 HPLC 정제 후, 목적 생성물을 방사 화학적 수율은 75 ± 10 % (N = 8)을 얻었다. HPLC 분석은 125 I 표지 된 생성물의 방사 화학적 순도는 99 % 이상 (도 2)이고, 제품 (1)의 관찰 특정 방사능 40.7 MBq의 / μmol 않은 것을 확인했다. 카트리지를 사용하여 정제 된 생성물을 함유하는 분획을 고체상 추출 (1)의 아세톤 용액을 제공 하였다. 질소 또는 아르곤 가스의 스트림을 사용하여, 유기 용매가 증발 될 수 있고, 그 잔류 물을 다음 인트 대한 DMSO 또는 무수 에탄올에 다시 용해시킬 수있다피.
폴리에틸렌 글리콜 - 개질 된 금 나노 입자 (125) I-라벨링은 DBCO 그룹 - 개질 된 금 나노 입자를도 1에 도시 된 절차에 의해 제조 하였다. 폴리에틸렌 글리콜 티올 과량 (MW 5,000) DBCO 그룹과 반응시켰다 구연산은 13 나노 금 나노 입자를 안정화. 개질 단계 후, 생성물은 DBCO 기능화 된 금 나노 입자를 수득 연속 원심 분리에 의해 정제 하였다 (3). 방사성 표지 단계 1 3.7 MBq 내지 3의 2 μM합니다 (DBCO 그룹 ~ 400 μM)에 첨가하고, 라벨링 반응물을 1 시간 동안 40 ℃에서 수행 하였다. 무선 TLC 분석은 하나의 95 % 이상이 60 분 이내에 DBCO 기 - 작용 화 된 금 나노 입자 (3)와 반응되었음을 보여 주었다. 반응물을 60 분 동안 수행 한 다음, 조 생성물을 끝까지 마음이었다무선 TLC (도 3)에 의해 측정하여 원심. ified하게는 (4) 125 I 표지 된 금 나노 입자가> 99 % (N = 4) 방사성 수율로 수득 하였다.
I 125 - 표지 된 아 지드 Radiosynthesis도 1 (1), 125 I 표지 된 금 나노 입자 (4). 시약 및 조건 : (a) [125 I] NaI를 아세트산, 클로라민 T, RT, 15 분, 75 ± 10 % (N = 8) 방사 화학적 수율; (b) DBCO-PEG-SH (MW 5000), H 2 O, RT, 2 시간; ~ 40 ° C, 60 분,> 99 % 방사 화학적 수율. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
t = "그림 2"SRC = "/ 파일 / ftp_upload / 54759 / 54759fig2.jpg"/>
도 125 I 표지 지드 2. 분석 HPLC 크로마토 그램 (1). (a) 미정 제 생성물의 라디오 크로마토 그램. 정제 된 생성물 (b)의 라디오 크로마토 그램. 정제 된 제품의 (c)에 UV 크로마토 그램 (254 ㎚). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
125 I 표지 된 금 나노 입자도 3 무선 TLC 결과 (4) (4 = 0.05의 Rf는, R F 1 = 0.45, 용리액 : 에틸 아세테이트) (a) 60 분 반응 후, (b) 정제 후./ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54759/54759fig3large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
일반적으로, 정제 된 I-125 표지 지드 (1)의 관찰 방사 화학적 수율은 75 ± 10 %이었다 (N = 8). 방사성 표지는 방사능 MBq의 50-150로 수행하고, 그 결과 방사 상당히 일치한다. [125 I]의 NaI (t 1/2 = 59.4 d) 방사성 요오드화 반응에 사용 하였다 개월 이상 방사성 붕괴를 시행 한의 방사 화학적 수율로 관찰하면 약간 (53~65%) 감소 하였다. 따라서, [125 I]의 NaI 그것이 생성 되 자마자 이용 될 최적의 방사 또는 수율을 획득하기 위해 실험실로 전달하는 것이 좋다. 또한, 새로 제조 클로라민 T 용액은 원하는 방사 화학적 수율을 획득하기 위해 상기 반응에 사용되어야한다.
프리 커서 (2)는 매우 소수성이기 때문에, 150 μL의 절대 에탄올을 1 mg의 용해에 추가되어야
용리액 구배, 10 ㎖ / 분 : 0~10 분 동안 100 % 용매 B, 100 (1)을 함유하는 조 생성물의 정제를 위해 조제 적 HPLC를 사용하기 전에, 역상 HPLC 컬럼은 용매 A 및 B (유속으로 세척해야 10-25 분 동안 -0 % 용매 B, 0 % 용매 B 25-30 분) 시스템에서의 불순물의 미량을 제거한다. 이어서, 역상 HPLC 컬럼 얻기 적어도 20 분 동안 80 % 용매 A 20 % 용매 B로 평형화1의 일관성 유지 시간.
정제 된 하나를 포함하는 분획은 고상 추출 과정에서 H 2 O 이상 4 배 부피로 희석한다. 그렇지 않으면, 정제 된 생성물의 일부는 TC18 카트리지에 포집 될 수 없다. 아세톤 카트리지 1 정제를 용출하는데 사용되는 경우, 최종 부피는 주위 온도에서 질소 또는 아르곤 가스의 흐름과 함께 아세톤 증발에 의해 감소 될 수있다.
여러 방사성 iodines 중 125 내가 선택하고, 현재의 연구에 사용됩니다. 요오드 방사성 동위 원소의 여러 가지 다른 생물학적, 의학적 연구에서, 본 방법을 사용하여 시험 될 필요 (예를 들어, PET 이미징 124 I, 치료 목적 131 I).
지금까지 우리가 이해, 본 방사성 표지 프로토콜 상세 syntheti을 설명하는 첫 번째 보고서입니다방사성 표지 아 지드 그룹 C 단계. 최근에, 우리는 다른 구조 (23)가 다른 아 지드 보철 그룹을 발표했다. 그러나, 현재의 방법에서 방사성 표지 지드 (1) DBCO 기 함유 분자를 방사성 표지 효율의 관점에서 다른 것보다 약간 더 방사 결과를 제공 하였다. 방사성 요오드의 표시를위한 보철 그룹 (즉, N의 -hydroxysuccinimide 및 말레이 미드를) 존재하는 사이트 특이성을 제공 할 수 있습니다. 그러나, 본 방법은 우수한 bioorthogonality 함께 직접적인 방사성 표지 효율을 보여준다. 아 지드 작용기 생리적 조건 및 생체 내 환경에서의 안정성이 높은 것으로 알려져 있기 때문에, 방사성 표지 된 생성물 (1)은 생체 내 영상화 연구 미리 타겟에 이용 될 수있다. 우리는이 방법이 효율적 라 모두 생체 외 및 생체 요오드 방사성 동위 원소에 적용 할 것으로 예상변형 된 cyclooctyne 구조를 포함하는 생체 분자 및 나노 물질의 beling.
. (1) 125 I 표지 된 금 나노 입자 (4)은 나노 물질의 분자 이미징 및 생체 분포 연구에서 사용될 수있다 : 1의 비 방사능에 기초하여, I (125)과 금 나노 입자의 환산 몰비는 ~ 1이다. 현재의 방법은 서로 다른 크기와 모양의 금 나노 물질의 방사성 요오드 라벨에 적용 할 수있다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chloramine T trihydrate | Sigma | 402869 | |
| [125I]NaI in aq. NaOH | Perkin-Elmer | NEZ033A010MC | |
| Sodium metabisulfite | Sigma | S9000 | |
| Formic acid | Sigma | 251364 | |
| Sep-Pak tC18 plus cartridge | Waters | WAT036800 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| Acetone | Sigma | 650501 | |
| Ethanol | Sigma | 459844 | |
| Gold(III) chloride trihydrate | Sigma | 520918 | |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | |
| DBCO PEG SH (MW 5,000) | NANOCS | PG2-DBTH-5k | |
| TLC silica gel 60 F254 | Merck | ||
| Analytical HPLC | Agilent | 1290 Infinity | Model number |
| Preparative HPLC | Agilent | 1260 Infinity | Model number |
| Analytical C18 reverse-phase column | Agilent | Zorbax Eclipse XDB-C18 | |
| Preparative C18 reverse-phase column | Agilent | PrepHT XDB-C18 | |
| Radio TLC scanner | Bioscan | AR-2000 | Model number |
| Radioisotope dose calibrator | Capintec, Inc | CRC -25R dose calibrator | Model number |
References
- Jewett, J. C., Bertozzi, C. R. Cu-free Click Cycloaddition Reactions in Chemical Biology. Chem. Soc. Rev. 39, 1272-1279 (2010).
- Debets, M. F., et al. Bioconjugation with Strained Alkenes and Alkyne. Acc. Chem. Res. 44, 805-815 (2011).
- Sletten, E. M., Bertozzi, C. R. From Mechanism to Mouse: A Tale of Two Bioorthogonal Reactions. Acc. Chem. Res. 44, 666-676 (2011).
- Koo, H., et al. Bioorthogonal Cu-Free Click Chemistry in vivo for Tumor-Targeted Delivery of Nanoparticles. Angew. Chem. Int. Ed. 51, 11836-11840 (2012).
- Chang, P. V., et al. Copper-Free Click Chemistry in Living Animals. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 1821-1826 (2010).
- Bostic, H. E., Smith, M. D., Poloukhtine, A. A., Popik, V. V., Best, M. D. Membrane Labeling and Immobilization via copper-free Click Chemistry. Chem. Commun. 48, 1431-1433 (2012).
- Someya, T., Ando, A., Kimoto, M., Hirao, I. Site-Specific Labeling of RNA by Combining Genetic Alphabet Expansion Transcription and Copper-Free Click Chemistry. Nucl. Acids Res. 43, 6665-6676 (2015).
- Lee, S. B., et al. Mesoporous Silica Nanoparticle Pretargeting for PET Imaging Based on a Rapid Bioorthogonal Reaction in a Living Body. Angew. Chem. Int. Ed. 52, 10549-10552 (2013).
- Sachin, K., et al. F-18 Labeling Protocol of Peptides Based on Chemically Orthogonal Strain-Promoted Cycloaddition under Physiologically Friendly Reaction Conditions. Bioconjugate Chem. 23, 1680-1686 (2012).
- Evans, H. L., et al. Copper-Free Click - A Promising Tool for Pre-targeted PET Imaging. Chem. Commun. 48, 991-993 (2012).
- Campbell-Verduyn, L. S., et al. Strain-Promoted Copper-Free "Click" Chemistry for 18F Radiolabeling of Bombesin. Angew. Chem. Int. Ed. 50, 11117-11120 (2011).
- Arumugam, S., Chin, J., Schirrmacher, R., Popik, V. V., Kostikov, A. P. 18F]Azadibenzocyclooctyne ([18F]ADIBO): A Biocompatible Radioactive Labeling Synthon for Peptides using Catalyst Free [3+2] Cycloaddition. Bioorg. Med. Chem. Lett. 21, 6987-6991 (2011).
- Bouvet, V., Wuest, M., Wuest, F. Copper-Free Click Chemistry with the Short-Lived Positron Emitter Fluorine-18. Org. Biomol. Chem. 9, 7393-7399 (2011).
- Satpati, D., Bauer, N., Hausner, S. H., Sutcliffe, J. L. Synthesis of [64Cu]DOTA-ADIBON3-Ala-PEG28-A20FMDV2 via Copper-Free Click Chemistry for PET Imaging of Integrin αvβ6. J. Radioanal. Nucl. Chem. 302, 765-771 (2014).
- Lee, D. E., et al. Facile Method To Radiolabel Glycol Chitosan Nanoparticles with 64Cu via Copper-Free Click Chemistry for MicroPET Imaging. Mol. Pharmaceutics. 10, 2190-2198 (2013).
- Zeng, D. 64Cu Core-Labeled Nanoparticles with High Specific Activity via Metal-Free Click Chemistry. ACS Nano. 6, 5209-5219 (2012).
- Jeon, J., et al. Radiosynthesis and in vivo Evaluation of [125I]2-4(iodophenethyl)-2-Methylmalonic Acid as a Potential Radiotracer for Detection of Apoptosis. J. Radioanal. Nucl. Chem. 308, 23-29 (2016).
- Adam, M. J., Wilbur, D. S. Radiohalogens for Imaging and Therapy. Chem. Soc. Rev. 34, 153-163 (2005).
- Jeon, J., et al. Radiosynthesis of 123I-Labeld Hesperetin for Biodistribution Study of Orally Administered Hesperetin. J. Radioanal. Nucl. Chem. 306, 437-443 (2015).
- Kil, K. E., et al. Development of [123I]IPEB and [123I]IMPEB as SPECT Radioligands for Metabotropic Glutamate Receptor Subtype. ACS Med. Chem. Lett. 5, 652-656 (2014).
- Chen, M. K., et al. The Utility of I-123 Pretherapy Scan in I-131 Radioiodine Therapy for Thyroid Cancer. Thyroid. 22, 304-309 (2012).
- Jeon, J., et al. Efficient Method for Iodine Radioisotope Labeling of Cyclooctyne-Containing Molecules using Strain-Promoted Copper-Free Click Reaction. Bioorg. Med. Chem. 23, 3303-3308 (2015).
- Choi, M. H., et al. Synthesis and Evaluation of an 125I-Labeled Azide Prosthetic Group for Efficient and Bioorthogonal Radiolabeling of Cyclooctyne-Group Containing Molecules using Copper-Free Click Reaction. Bioorg. Med. Chem. Lett. 26, 875-878 (2016).
- Kim, Y. H., et al. Tumor Targeting and Imaging Using Cyclic RGD-PEGylated Gold Nanoparticle Probes with Directly Conjugated Iodine-125. Small. 7, 2052-2060 (2011).
