Summary
Een gedetailleerde procedure voor de synthese van een 125 I-gemerkt azide en het radioactief merken van dibenzocyclooctyne (DBCO) -groep geconjugeerd, 13-nm-sized goud nanodeeltjes met behulp kopervrij click reactie wordt beschreven.
Protocol
Let op: De geoxideerde vorm van radioactief jodium is vrij volatiel en moet met voldoende lood schilden en lead flacons worden behandeld. Alle radiochemische stappen moeten in een goed geventileerde houtskool gefilterd kap worden uitgevoerd, en de experimentele procedures moeten worden gevolgd door radioactiviteit detectie-apparaten.
1. Bereiding van chemicaliën en de omgekeerde fase cartridge voor de synthese van de 125I-gemerkte azide
- Bereiding van reagentia in oplossing
- Los 1 mg van het azide precursor (2) in 150 pi absolute ethanol (figuur 1).
OPMERKING: Een gedetailleerde syntheseprocedure voor de azide precursor (2) gemeld bij het vorige artikel 22. - Los 1 mg chloramine T in 20 pl 1x fosfaatbuffer zoutoplossing (pH = 7,4).
- Los 2 mg natriummetabisulfiet in 20 ui H2O
- Los 1 mg van het azide precursor (2) in 150 pi absolute ethanol (figuur 1).
- preparatie van het patroon
- Was de TC18 patroon met 10 ml absolute ethanol, gevolgd door 10 ml H2O Laat de matrix van de cartridge met lucht niet droog.
2. radiosynthese van de 125I-gemerkte azide prosthetische groep
- Radioactieve jodering reactie van de precursor
- Voeg het azide precursor-oplossing (1 mg in 150 pi absolute ethanol) en azijnzuur (10 ui) aan een 1,5 ml microcentrifugebuis.
- Voeg 150 MBq [125I] NaI in 0,1 M NaOH (50 pl) aan het reactiemengsel.
- Toevoegen chloramine T-oplossing (1 mg in 20 pl 1 x met fosfaat gebufferde zoutoplossing) en sluit de microcentrifugebuis bevattende reactiemengsel.
- Incubeer het reactiemengsel bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten totdat de reactie voltooid radioactieve jodering.
- Toevoegen natriummetabisulfietoplossing (2 mg in 20 gl H 2 O) aan het reactiemengselde radioactieve jodering reactie te blussen.
- Trekken 0,2 pi van het ruwe product en verdun vervolgens met 100 ul oplossing (H2O / CH3CN, 1: 1) voor HPLC analyse.
Opmerking: Voor alle HPLC experimenten, gebruik 0,1% mierenzuur bevattende H2 O (oplosmiddel A) en 0,1% mierenzuur bevattende acetonitril (oplosmiddel B) als elutiemiddelen. - Analyseer het verdunde ruwe product met behulp van een omgekeerde fase analytische radio-HPLC (C18 omgekeerde fasekolom, stroomsnelheid: 1 ml / min; eluens gradiënt: 20% solvent B gedurende 0-2 min, 20-80% oplosmiddel B 2-22 min, 80-100% solvent B gedurende 22-23 min, en 100% solvent B gedurende 23-28 min, retentietijd: 16,4 min) (figuur 2).
- Zuivering van het ruwe product met preparatieve HPLC
OPMERKING: Laat voldoende loden mantel rond HPLC onderdelen zoals de injector, kolom detector, inzameling flesjes en de houder waarin het effluent verzameld.- intrekken the gehele reactiemengsel in een HPLC flesje. Spoel de reactiebuis met acetonitril (0,5 ml) en voeg de spoeling in dezelfde injectieflacon. Verdun de verzamelde oplossing met H2O (1 ml).
- Injecteer het ruwe product op een preparatieve radio-HPLC (C18 omgekeerde fasekolom, stroomsnelheid: 10 ml / min; eluens gradiënt: 20% solvent B gedurende 0-2 min, 20-80% solvent B gedurende 2-22 min, 80-100% solvent B gedurende 22-23 min, en 100% solvent B gedurende 23-28 min).
- Verzamel de radioactieve piek die de 125I-gemerkte azide (1) (tR HPLC onder deze omstandigheden 17,8-18,8 min) in een glazen reageerbuis (figuur 2).
- Meet de radiochemische opbrengst van de fractie met een radioactiviteit dosiskalibrator volgens het protocol van de fabrikant.
- Injecteer het gezuiverde product op een analytische radio-HPLC met behulp van dezelfde HPLC-omstandigheden voor de bepaling van de radiochemische zuiverheid van het product.
- Vastefase-extractie van het product
- Verdun de fractie die het gewenste product (1) met 40 ml zuiver H2O
- Voeg de verdunde oplossing in een geconditioneerd TC18 cartridge.
- Spoel de patroon met een extra 15 ml H2O
- Elueer het product (1) opgesloten in de patroon met 2 ml aceton in een 10-ml glazen flacon die wordt beschermd door een loden schild. Meet de radioactiviteit van het eluaat met een radioactieve dosis calibrator volgens het protocol van de fabrikant.
OPMERKING: Dimethylsulfoxide (DMSO) of absolute ethanol kunnen ook worden gebruikt voor elutie van het product uit de patroon. Ongeveer 5-10% van de radioactiviteit gewoonlijk vast aan de patroon, en de resterende radiogelabelde product niet volledig geëlueerd met overmaat organisch oplosmiddel. - Damp het aceton met een stroom stikstof of argongas.
- Los het residue met DMSO (100-200 ul) voor de volgende radiomerking stap.
3. Synthese van DBCO-group-geconjugeerde Gold Nanodeeltjes
- Modificatie van het oppervlak van 13-nm-sized gouden nanodeeltjes met DBCO-groep bevattende polyethyleenglycol
- Bereid natrium-citraat gestabiliseerd gouden nanodeeltjes (3) (gemiddelde size = 13 nm) op basis van een vorige verslag 24.
- Voeg een waterige oplossing van Tween 20 (1 mM, 1,5 ml) waardoor de citraat gestabiliseerde gouden nanodeeltjes (10 nM, 15 ml). De oplossing wordt gedurende 20 minuten op een rondschudapparaat.
- Voeg een waterige oplossing van DBCO-bevattende polyethyleenglycol thiol (gemiddeld molecuulgewicht = 5000, 100 pM, 1,5 ml). De oplossing wordt gedurende 2 uur op een rondschudapparaat.
- Zuivering van het DBCO groep gemodificeerde goud nanodeeltjes
- Zuiver het-DBCO-groep gemodificeerde gouden nanodeeltjes (4) </ Strong> Door opeenvolgende centrifugeren (11.400 x g, 15 min x 3).
- Giet het supernatant en voeg zuiver water voor resuspensie van het goud nanodeeltjes pellets.
4. Radioactief merken van DBCO-groep gemodificeerde Gold Nanodeeltjes via de Copper-vrije Click Reaction
- Synthese van 125I-gemerkt goud nanodeeltjes met de 125 I-gemerkt azide (1)
- Bereid een geconcentreerde oplossing van DBCO-groep gemodificeerd goud nanodeeltjes door centrifugatie (11.400 x g, 15 min), en dient de concentratie van de nanodeeltjes van goud tot 2 uM.
- Voeg 4,1 MBq van de 125-gemerkte azide (1) in DMSO (5 ui) aan een suspensie van gouden nanodeeltjes (4) (2 uM, 50 ui).
- Incubeer het verkregen reactiemengsel bij 40 ° C gedurende 60 minuten.
- Onttrek een aliquot (0,2 pl) van het ruwe product en toepassen op een silica-coated dunnelaagchromatografie (TLC) plaat.
- Ontwikkel het TLC plaat onder toepassing van ethylacetaat als mobiele fase.
- Plaats de TLC plaat op een radio-TLC scanner en laat de scanner het radioactief reactie (figuur 3) volgens het protocol van de fabrikant te volgen.
- Zuivering van het ruwe product
- Zuiver het reactiemengsel dat de 125-gemerkte gouden nanodeeltjes (4) door centrifugeren (11.400 x g, 15 min).
- Giet het supernatant en voeg zuiver water voor resuspensie van het goud nanodeeltjes pellets.
- Onttrek een aliquot (0,2 pl) van het gezuiverde product en toepassen op een met siliciumdioxide beklede TLC platen.
- Ontwikkel het TLC-plaat met ethylacetaat als de mobiele fase.
- Plaats de TLC plaat op een radio-TLC scanner en start de scanner om de radiochemische opbrengst en radiochemische zuiverheid van het 125-I gemerkt gol bepalend nanodeeltjes (4) (figuur 3) volgens het protocol van de fabrikant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De radioactieve jodering reactie van de precursor stannylated (2) gebruikte 150 MBq [125I] NaI, azijnzuur en chloramine T bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten uitgevoerd om het radioactief gemerkte product te verschaffen (1). Na preparatieve HPLC zuivering van het ruwe mengsel, werd het gewenste product verkregen met 75 ± 10% (n = 8) van radiochemische opbrengst. Analytische HPLC wees uit dat de radiochemische zuiverheid van de 125I-gemerkte product was meer dan 99% (figuur 2), en de waargenomen specifieke radioactiviteit van product 1 is 40,7 MBq / umol. Vastefase-extractie van de fractie die het gezuiverde product met het patroon ontvangen een acetonoplossing van 1. Met een stroom stikstof of argon, kan het organische oplosmiddel verdampt, en het residu kan opnieuw worden opgelost in DMSO of absolute ethanol komende step.
125I-etikettering van polyethyleenglycol gemodificeerde goud nanodeeltjes werden de DBCO-groep-gemodificeerde goud nanodeeltjes bereid volgens de in figuur 1 procedure. Een overmaat polyethyleenglycol thiol (MW 5000) met DBCO groepen omgezet met de gecitreerd gestabiliseerde 13 nm goud nanodeeltjes. Na de modificatiestap, werd het product gezuiverd door opeenvolgende centrifugatie om de DBCO gefunctionaliseerde nanodeeltjes van goud geven (3). In het radiolabelen stap 3,7 MBq 1 werd toegevoegd aan 2 uM 3 (~ 400 uM van de DBCO groepen) en de labeling reactie werd uitgevoerd bij 40 ° C gedurende 1 uur uitgevoerd. Radio-TLC analyse toonde dat meer dan 95% van 1 omgezet met de DBCO groep gefunctionaliseerde gouden nanodeeltjes (3) binnen 60 min. Het reactiemengsel werd gedurende 60 minuten uitgevoerd, en het ruwe product werd purified door centrifugatie. 125-gemerkte gouden nanodeeltjes (4) werden verkregen met> 99% (n = 4) radiochemische opbrengst zoals bepaald door radio TLC (figuur 3).
Figuur 1. radiosynthese van de 125 I-gemerkt azide (1) en 125I-gemerkt goud nanodeeltjes (4). Reagentia en omstandigheden: (a) [125I] NaI, azijnzuur, chloramine T, RT, 15 min, 75 ± 10% (n = 8) radiochemische opbrengst; (B) DBCO-PEG-SH (MW 5000), H2O, KT, 2 uur; ~ 40 ° C, 60 min,> 99% radiochemische opbrengst. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
t = "Figuur 2" src = "/ files / ftp_upload / 54759 / 54759fig2.jpg" />
Figuur 2. Analytische HPLC chromatogram van de 125-gemerkte azide (1). (A) radiochromatogram van het ruwe product. (B) radiochromatogram van het gezuiverde product. (C) UV chromatogram (254 nm) van het gezuiverde product. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Radio-TLC resultaten van de 125 I-gemerkte gouden nanodeeltjes (4) (R f 4 = 0,05, Rf van 1 = 0,45, eluens: ethylacetaat) (a) na 60 min reactie en (b) na zuivering./ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54759/54759fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In het algemeen, de waargenomen radiochemische opbrengst van het gezuiverde 125-gemerkte azide (1) was 75 ± 10% (n = 8). De radiolabeling werd bereikt met 50-150 MBq radioactiviteit, en de radiochemische resultaten zijn zeer consistent. Als [125I] NaI (t 1/2 = 59,4 d) radioactief verval ondergaan langer dan een maand werd in de radioactieve jodering reactie, de radiochemische opbrengst van 1 werd waargenomen dat enigszins verminderd (53-65%). Derhalve wordt aanbevolen dat [125I] NaI zodra worden gebruikt zoals het wordt geproduceerd of wordt afgeleverd aan het laboratorium om geoptimaliseerde radiochemische opbrengst. Bovendien moet een vers bereide chloramine T-oplossing ook worden gebruikt in de reactie om de gewenste radiochemische opbrengst.
Omdat de voorloper (2) was zeer waterafstotend, moet 150 pi absolute ethanol toegevoegd aan 1 mg oplossen
Alvorens preparatieve HPLC voor zuivering van het ruwe product dat 1, omgekeerde fase HPLC kolom moet worden gewassen met oplosmiddel A en B (stroomsnelheid: 10 ml / min; eluens gradiënt: 100% solvent B gedurende 0-10 min, 100 -0% solvent B gedurende 10-25 min, en 0% solvent B gedurende 25-30 min) tot sporenhoeveelheden verontreinigingen te verwijderen uit het systeem. Vervolgens wordt de omgekeerde fase HPLC-kolom geëquilibreerd met 20% solvent B in 80% oplosmiddel A gedurende ten minste 20 min te verkrijgende consistente retentietijd van 1.
De fractie die gezuiverde 1 worden verdund met meer dan 4 maal het volume H 2 O in de vaste fase extractie procedure. Anders enkele gezuiverde product kan niet worden gevangen in de TC18 cartridge. Wanneer aceton wordt gebruikt elueren gezuiverd 1 uit de cassette, kan het resterende volume ingedampt aceton met een stroom stikstof of argongas bij kamertemperatuur.
Onder verscheidene radioactieve jodia, 125 Ik werd geselecteerd en gebruikt in het huidige onderzoek. Verschillende soorten jodium radioisotopen moeten worden getest met de onderhavige werkwijze in andere biologische en medische studies (bijvoorbeeld 124 I voor PET-beeldvorming, 131 I voor therapeutische doeleinden).
Voor zover wij begrijpen, het heden radioactief protocol is het eerste rapport waarin gedetailleerd synthetic stappen voor een radioactief gelabeld azide groep. Onlangs publiceerden we een ander azide prothetische groep, die een andere structuur 23 heeft. De radioactief gemerkte azide (1) in de huidige werkwijze verschaft radiochemische iets betere resultaten dan de andere in termen van radioactief merken efficiëntie DBCO-bevattende moleculen. Bestaande prothetische groepen (dwz, N-hydroxysuccinimide en maleïmide) voor de etikettering van radioactieve jodium kon geen plaats-specificiteit. Echter, de huidige werkwijze toont eenvoudig radiolabeling efficiency samen met een uitstekende bioorthogonality. Omdat het azide functionele groep bekende, zeer stabiel in fysiologische omstandigheden en in vivo omgevingen, kan de radioactief gemerkte product (1) worden gebruikt in pre-gerichte in vivo imaging studies. We verwachten dat deze werkwijze efficiënt worden toegepast op zowel in vitro als in vivo jodium radioisotoop laBeling van biomoleculen en nanomaterialen dat een gespannen cyclooctyne structuur bevatten.
Gebaseerd op de specifieke radioactiviteit van 1, de berekende molaire verhouding van 125 I en goud nanodeeltjes ~ 1. 1 125 gemerkt gouden nanodeeltjes (4) kan worden gebruikt in moleculaire beeldvorming en biodistributie studies van nanomaterialen. De huidige werkwijze kan ook worden toegepast op radioactief jodium labeling van verschillende afmetingen en vormen van goud nanomaterialen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chloramine T trihydrate | Sigma | 402869 | |
| [125I]NaI in aq. NaOH | Perkin-Elmer | NEZ033A010MC | |
| Sodium metabisulfite | Sigma | S9000 | |
| Formic acid | Sigma | 251364 | |
| Sep-Pak tC18 plus cartridge | Waters | WAT036800 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| Acetone | Sigma | 650501 | |
| Ethanol | Sigma | 459844 | |
| Gold(III) chloride trihydrate | Sigma | 520918 | |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | |
| DBCO PEG SH (MW 5,000) | NANOCS | PG2-DBTH-5k | |
| TLC silica gel 60 F254 | Merck | ||
| Analytical HPLC | Agilent | 1290 Infinity | Model number |
| Preparative HPLC | Agilent | 1260 Infinity | Model number |
| Analytical C18 reverse-phase column | Agilent | Zorbax Eclipse XDB-C18 | |
| Preparative C18 reverse-phase column | Agilent | PrepHT XDB-C18 | |
| Radio TLC scanner | Bioscan | AR-2000 | Model number |
| Radioisotope dose calibrator | Capintec, Inc | CRC -25R dose calibrator | Model number |
References
- Jewett, J. C., Bertozzi, C. R. Cu-free Click Cycloaddition Reactions in Chemical Biology. Chem. Soc. Rev. 39, 1272-1279 (2010).
- Debets, M. F., et al. Bioconjugation with Strained Alkenes and Alkyne. Acc. Chem. Res. 44, 805-815 (2011).
- Sletten, E. M., Bertozzi, C. R. From Mechanism to Mouse: A Tale of Two Bioorthogonal Reactions. Acc. Chem. Res. 44, 666-676 (2011).
- Koo, H., et al. Bioorthogonal Cu-Free Click Chemistry in vivo for Tumor-Targeted Delivery of Nanoparticles. Angew. Chem. Int. Ed. 51, 11836-11840 (2012).
- Chang, P. V., et al. Copper-Free Click Chemistry in Living Animals. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 1821-1826 (2010).
- Bostic, H. E., Smith, M. D., Poloukhtine, A. A., Popik, V. V., Best, M. D. Membrane Labeling and Immobilization via copper-free Click Chemistry. Chem. Commun. 48, 1431-1433 (2012).
- Someya, T., Ando, A., Kimoto, M., Hirao, I. Site-Specific Labeling of RNA by Combining Genetic Alphabet Expansion Transcription and Copper-Free Click Chemistry. Nucl. Acids Res. 43, 6665-6676 (2015).
- Lee, S. B., et al. Mesoporous Silica Nanoparticle Pretargeting for PET Imaging Based on a Rapid Bioorthogonal Reaction in a Living Body. Angew. Chem. Int. Ed. 52, 10549-10552 (2013).
- Sachin, K., et al. F-18 Labeling Protocol of Peptides Based on Chemically Orthogonal Strain-Promoted Cycloaddition under Physiologically Friendly Reaction Conditions. Bioconjugate Chem. 23, 1680-1686 (2012).
- Evans, H. L., et al. Copper-Free Click - A Promising Tool for Pre-targeted PET Imaging. Chem. Commun. 48, 991-993 (2012).
- Campbell-Verduyn, L. S., et al. Strain-Promoted Copper-Free "Click" Chemistry for 18F Radiolabeling of Bombesin. Angew. Chem. Int. Ed. 50, 11117-11120 (2011).
- Arumugam, S., Chin, J., Schirrmacher, R., Popik, V. V., Kostikov, A. P. 18F]Azadibenzocyclooctyne ([18F]ADIBO): A Biocompatible Radioactive Labeling Synthon for Peptides using Catalyst Free [3+2] Cycloaddition. Bioorg. Med. Chem. Lett. 21, 6987-6991 (2011).
- Bouvet, V., Wuest, M., Wuest, F. Copper-Free Click Chemistry with the Short-Lived Positron Emitter Fluorine-18. Org. Biomol. Chem. 9, 7393-7399 (2011).
- Satpati, D., Bauer, N., Hausner, S. H., Sutcliffe, J. L. Synthesis of [64Cu]DOTA-ADIBON3-Ala-PEG28-A20FMDV2 via Copper-Free Click Chemistry for PET Imaging of Integrin αvβ6. J. Radioanal. Nucl. Chem. 302, 765-771 (2014).
- Lee, D. E., et al. Facile Method To Radiolabel Glycol Chitosan Nanoparticles with 64Cu via Copper-Free Click Chemistry for MicroPET Imaging. Mol. Pharmaceutics. 10, 2190-2198 (2013).
- Zeng, D. 64Cu Core-Labeled Nanoparticles with High Specific Activity via Metal-Free Click Chemistry. ACS Nano. 6, 5209-5219 (2012).
- Jeon, J., et al. Radiosynthesis and in vivo Evaluation of [125I]2-4(iodophenethyl)-2-Methylmalonic Acid as a Potential Radiotracer for Detection of Apoptosis. J. Radioanal. Nucl. Chem. 308, 23-29 (2016).
- Adam, M. J., Wilbur, D. S. Radiohalogens for Imaging and Therapy. Chem. Soc. Rev. 34, 153-163 (2005).
- Jeon, J., et al. Radiosynthesis of 123I-Labeld Hesperetin for Biodistribution Study of Orally Administered Hesperetin. J. Radioanal. Nucl. Chem. 306, 437-443 (2015).
- Kil, K. E., et al. Development of [123I]IPEB and [123I]IMPEB as SPECT Radioligands for Metabotropic Glutamate Receptor Subtype. ACS Med. Chem. Lett. 5, 652-656 (2014).
- Chen, M. K., et al. The Utility of I-123 Pretherapy Scan in I-131 Radioiodine Therapy for Thyroid Cancer. Thyroid. 22, 304-309 (2012).
- Jeon, J., et al. Efficient Method for Iodine Radioisotope Labeling of Cyclooctyne-Containing Molecules using Strain-Promoted Copper-Free Click Reaction. Bioorg. Med. Chem. 23, 3303-3308 (2015).
- Choi, M. H., et al. Synthesis and Evaluation of an 125I-Labeled Azide Prosthetic Group for Efficient and Bioorthogonal Radiolabeling of Cyclooctyne-Group Containing Molecules using Copper-Free Click Reaction. Bioorg. Med. Chem. Lett. 26, 875-878 (2016).
- Kim, Y. H., et al. Tumor Targeting and Imaging Using Cyclic RGD-PEGylated Gold Nanoparticle Probes with Directly Conjugated Iodine-125. Small. 7, 2052-2060 (2011).
