Summary
Ein detailliertes Verfahren für die Synthese eines 125 I-markierten Azid und die radioaktiven Markierung von dibenzocyclooctyne (DBCO) -Gruppe-konjugierten, 13 nm große Goldnanopartikel einen kupferfreien Klick - Reaktion beschrieben.
Protocol
Achtung: Die oxidierte Form von radioaktivem Jod ist sehr volatil und mit ausreichenden Bleiabschirmungen und Blei Fläschchen behandelt werden. Alle radiochemischen Schritte sollten in einem gut belüfteten Holzkohle gefiltert Haube, und die experimentellen Verfahren müssen durchgeführt werden, durch Radioaktivität Detektionsgeräten überwacht werden.
1. Herstellung von Chemikalien und der Umkehrphasen - Patrone für die Synthese der 125 I-markiertem Azide
- Vorbereitung der Reagenzien in Lösung
- Man löst 1 mg des Azids Vorläufers (2) in 150 ul absolutem Ethanol (Abbildung 1).
HINWEIS: Eine detaillierte Syntheseverfahren für die Azid - Vorläufers (2) wurde in der vorherigen Papier 22 ausgewiesen. - Man löst 1 mg Chloramin T in 20 ul 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (pH = 7,4).
- Man löst 2 mg Natriummetabisulfit in 20 & mgr; l H 2 O.
- Man löst 1 mg des Azids Vorläufers (2) in 150 ul absolutem Ethanol (Abbildung 1).
- preparation der Patrone
- Waschen Sie die TC18 - Kartusche mit 10 ml absolutem Ethanol , gefolgt von 10 ml H 2 O Trocknen Sie nicht die Matrix der Patrone mit Luft.
2. Radiosynthese des 125 I-markierten prosthetischen Gruppe Azid
- Radioiodierung Reaktion des Vorläufers
- Fügen Sie die Azid-Vorläufer-Lösung (1 mg in 150 ul absolutem Ethanol) und Essigsäure (10 ul) in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
- Mit 150 MBq [125 I] NaI in 0,1 M NaOH (50 ul) zu dem Reaktionsgemisch.
- Fügen Sie eine Chloramin T-Lösung (1 mg in 20 ul 1x Phosphatpuffer-Salzlösung) und schließen Sie das Mikroröhrchen, das Reaktionsgemisch.
- Inkubieren der Reaktionsmischung bei Raumtemperatur für 15 min, bis die Radioiodierung Reaktion abgeschlossen ist.
- Fügen eine Natriummetabisulfit - Lösung (2 mg in 20 & mgr; l H 2 O) zu der Reaktionsmischungdie Radioiodierung Reaktion zu quenchen.
- Zurückzuziehen 0,2 & mgr; l des Rohproduktes und dann verdünnt mit 100 & mgr; l der Lösung (H 2 O / CH 3 CN, 1: 1) für die HPLC - Analyse.
HINWEIS: Für alle HPLC - Experimente verwenden 0,1% Ameisensäure H 2 O (Lösungsmittel A) enthält , und 0,1% Ameisensäure enthält , Acetonitril (Lösungsmittel B) als Eluierungsmittel. - Analysieren Sie den verdünnten Rohprodukt durch eine Umkehrphasen-analytische Radio-HPLC unter Verwendung von (C18-Umkehrphasensäule; Fließgeschwindigkeit: 1 ml / min; Eluent Gradient: 20% Lösungsmittel B für 0-2 min, 20-80% Lösungsmittel B 2-22 min, 80-100% Lösungsmittel B für 22-23 min und 100% Lösungsmittel B für 23-28 min; Retentionszeit: 16,4 min) (Abbildung 2).
- Reinigung des Rohprodukts mit einer präparativen HPLC
HINWEIS: Für ausreichend Blei Abschirmung um HPLC Teile wie den Injektor, Säule, Detektor, Sammelfläschchen und der Behälter, in dem das Abwasser aufgefangen wird.- Ziehen Sie the gesamte Reaktionsgemisch in eine HPLC-Phiole. Spülen Sie das Reaktionsrohr mit Acetonitril (0,5 ml) und die Spülung in die gleiche Injektionsvial hinzuzufügen. Man verdünnt das gesammelte Lösung mit H 2 O (1 ml).
- Spritzen Sie das Rohprodukt auf eine präparative HPLC-Radio (C18-Umkehrphasensäule; Fließgeschwindigkeit: 10 ml / min; Eluent Gradient: 20% Lösungsmittel B für 0-2 min, 20-80% Lösungsmittel B für 2-22 min, 80-100% Lösungsmittel B für 22-23 min und 100% Lösungsmittel B für 23-28 min).
- Sammeln Sie die radioaktiven Peak , die die 125 I-markiertem Azid (1) (t R unter diesen HPLC - Bedingungen ist 17,8 bis 18,8 min) in ein Glasteströhrchen (Abbildung 2).
- Messen Sie die radiochemische Ausbeute der Fraktion mit einer Radioaktivität Dosiskalibrator Verwendung gemäß dem Protokoll des Herstellers.
- Injizieren des gereinigten Produkts auf eine analytische HPLC-Radio unter Verwendung der gleichen HPLC-Bedingungen für die radiochemische Reinheit des Produkts zu bestimmen.
- Festphasenextraktion des Produkts
- Verdünne die Fraktion mit dem gewünschten Produkt (1) mit 40 ml reinem H 2 O.
- Fügen Sie die verdünnte Lösung in eine vorkonditionierte TC18 Patrone.
- Die Kartusche wird mit einem zusätzlichen 15 ml H 2 O.
- Eluieren des Produkts (1) eingefangen in der Kartusche mit 2 ml Aceton in einen 10-ml - Glasampulle , die durch eine Bleiabschirmung geschützt. Messen der Radioaktivität der eluierten Produkt eine Radioaktivität Dosiskalibrator Verwendung gemäß dem Protokoll des Herstellers.
HINWEIS: Dimethylsulfoxid (DMSO) oder absolutem Ethanol kann auch zur Elution des Produkts aus der Patrone verwendet werden. Etwa 5-10% der Radioaktivität klebt normalerweise an der Patrone und der verbleibende radioaktiv markierte Produkt kann nicht vollständig durch die Verwendung von überschüssigen Mengen an organischen Lösungsmittel eluiert werden. - Man dampft das Aceton mit einem Strom von Stickstoff oder Argongas.
- Man löst die Wiedersidue mit DMSO (100-200 ul) für den nächsten Schritt der radioaktiven Markierung.
3. Synthese von DBCO-Gruppe konjugierte Goldnanopartikel
- Die Oberflächenmodifikation von 13 nm großen Goldnanopartikeln mit DBCO-Gruppen enthaltenden Polyethylenglykol
- Bereiten Natrium-Citrat-stabilisierten Goldnanopartikel (3) (durchschnittliche Größe = 13 nm) nach einem früheren Bericht 24.
- Hinzufügen einer wässrigen Lösung von Tween 20 (1 mM, 1,5 ml) zu den Citrat stabilisiertem Goldnanopartikel (10 nM, 15 ml). Schütteln Sie die Lösung für 20 Minuten auf einem Orbitalschüttler.
- Hinzufügen, um eine wässrige Lösung von DBCO gruppenhaltigen Polyethylenglykol-thiol (durchschnittliches Molekulargewicht = 5.000, 100 uM, 1,5 ml). Schütteln Sie die Lösung für 2 Stunden auf einem Schüttler.
- Reinigung der Goldnanopartikel DBCO gruppenmodifizierte
- Reinige die DBCO-Gruppe-modifizierten Goldnanopartikeln (4) </ Strong> durch aufeinanderfolgende Zentrifugation (11.400 · g, 15 min x 3).
- Den Überstand abgießen und fügen Sie reines Wasser für Aufwirbelung der Gold-Nanopartikel-Pellets.
4. Die radioaktive Markierung von DBCO-group-modifizierten Goldnanopartikeln über die Kupferfreie Klick-Reaktion
- Synthese von 125 I-markiertem Goldnanopartikel mit dem 125 I-markiertes Azid (1)
- Bereiten Sie eine konzentrierte Lösung von DBCO-group-modifizierten Goldnanopartikeln durch Zentrifugation (11.400 · g, 15 min), und stellen Sie die Konzentration der Goldnanopartikel zu 2 uM.
- Hinzufügen 4,1 MBq des 125 I-markiertem Azid (1) in DMSO (5 & mgr; l) wurde zu einer Suspension von Goldnanopartikeln (4) (2 & mgr; M, 50 & mgr; l).
- Inkubieren der resultierenden Reaktionsmischung bei 40 ° C für 60 min.
- Ziehen Sie eine aliquote Menge (0,2 ul) aus dem Rohprodukt und wenden sie auf eine Silica-coATED Dünnschichtchromatographie (TLC) Platte.
- Entwickeln Sie die DC-Platte unter Verwendung von Ethylacetat als mobile Phase.
- Legen Sie die DC - Platte auf einem Radio-TLC - Scanner und führen Sie den Scanner die Radiomarkierungsreaktion (Abbildung 3) nach dem Protokoll des Herstellers zu überwachen.
- Die Reinigung des Rohproduktes
- Reinige das Reaktionsgemisch die 125 I-markierten Goldnanopartikel (4) durch Zentrifugation (11.400 xg, 15 min) enthielt.
- Den Überstand abgießen und fügen Sie reines Wasser für Aufwirbelung der Gold-Nanopartikel-Pellets.
- Ziehen Sie eine aliquote Menge (0,2 ul) aus dem gereinigten Produkt und wenden sie auf eine Silica-beschichteten TLC-Platte.
- Entwickeln Sie die DC-Platte unter Verwendung von Ethylacetat als mobile Phase.
- Legen Sie die DC - Platte auf einem Radio-TLC - Scanner und führen Sie den Scanner die radiochemische Ausbeute und radiochemische Reinheit des 125 I-markierten gol zu bestimmend Nanopartikel (4) (Figur 3) nach dem Protokoll des Herstellers.
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Representative Results
Die Radioiodierung Reaktion des stannylierten Vorläufers (2) wurde unter Verwendung von 150 MBq [125 I] NaI, Essigsäure und Chloramin - T bei Raumtemperatur für 15 min das radiomarkierte Produkt bereitzustellen (1). Nach präparativer HPLC-Reinigung des rohen Gemisches wurde das gewünschte Produkt mit 75 ± 10% (n = 8) von radiochemischer Ausbeute. Analytische HPLC zeigte , dass die radiochemische Reinheit des 125 I-markierte Produkt war mehr als 99% (Abbildung 2), und die beobachtete spezifische Radioaktivität von Produkt 1 40,7 MBq / & mgr; mol. Festphasenextraktion der Fraktion , die das gereinigte Produkt enthalten , durch die Kassette unter Verwendung bereitgestellt einer Acetonlösung von 1. Verwendung eines Stroms von Stickstoff oder Argongas, kann das organische Lösungsmittel verdampft werden, und dann kann der Rest wieder für den nächsten ste in DMSO oder absolutem Ethanol gelöst werden,Seite
Für 125 I-Markierung von Polyethylenglykol-modifizierten Goldnanopartikeln, die DBCO-Gruppen modifizierte Gold - Nanopartikel wurden durch das Verfahren in Figur 1 gezeigt , hergestellt. Eine überschüssige Menge an Polyethylenglycol Thiol (MW 5.000) mit DBCO Gruppen wurde mit dem reagierten zitrierten stabilisierte 13-nm-Gold-Nanopartikel. Nach der Modifikationsschritt wurde das Produkt durch aufeinanderfolgende Zentrifugierung gereinigt , um die DBCO-funktionalisierte Goldnanopartikel (3) zu ergeben. In der radioaktiven Markierung Schritt wurde 3,7 MBq von 1 zu 2 & mgr; M von 3 (~ 400 & mgr; M der DBCO Gruppen) und die Markierungsreaktion wurde bei 40 ° C für 1 Stunde durchgeführt. Radio-TLC - Analyse zeigte , dass mehr als 95% von 1 mit den DBCO-Gruppe funktionalisierte Gold - Nanopartikel (3) innerhalb von 60 min umgesetzt wurde. Die Reaktion wurde für 60 min durchgeführt und dann das Rohprodukt wurde purified durch Zentrifugation. 125 I-markiertem Gold - Nanopartikel (4) wurden mit> 99% (n = 4) radiochemische Ausbeute erhalten , wie durch Radio TLC (Figur 3) bestimmt.
Abbildung 1. Radiosynthese des 125 I-markiertem Azid (1) und 125 I-markiertem gold - Nanopartikel (4). Reagenzien und Bedingungen: (a) [125 I] NaI, Essigsäure, Chloramin T, RT, 15 min, 75 ± 10% (n = 8) radiochemische Ausbeute; (B) DBCO-PEG-SH (MW 5.000), H 2 O, RT, 2 h; ~ 40 ° C, 60 min,> 99% radiochemischer Ausbeute. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Abbildung 2. Analytische HPLC - Chromatogramm des 125 I-markiertem Azid (1). (A) Radiochromatogramm des Rohproduktes. (B) Radiochromatogramm des gereinigten Produkts. (C) UV - Chromatogramm (254 nm) des gereinigten Produkts. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Funk TLC Ergebnisse der 125 I-markierten Goldnanopartikel (4) (R f 4 = 0,05, R f 1 = 0,45, Eluent: Ethylacetat) , (a) nach einer 60 min Reaktion und (b) nach der Reinigung./ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54759/54759fig3large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Im allgemeinen ist die beobachtete radiochemischer Ausbeute des gereinigten 125 I-markiertem Azid (1) betrug 75 ± 10% (n = 8). Die radioaktiven Markierung wurde mit 50-150 MBq Radioaktivität durchgeführt, und die radiochemische Ergebnisse sind recht konsistent. Wenn [125 I] Nal (t 1/2 = 59,4 d) , die den radioaktiven Zerfall seit mehr als einem Monat unterzog sich in der Radioiodierungsverfahren Reaktion verwendet wird , wurde die radiochemische Ausbeute von 1 beobachtet werden leicht zurückgegangen (53-65%). Daher wird empfohlen , dass [125 I] NaI so bald verwendet werden , wie es hergestellt wird oder an das Labor geliefert , um optimierte radiochemischer Ausbeute zu erhalten. Darüber hinaus sollte eine frisch hergestellte Chloramin T-Lösung auch in der Reaktion verwendet werden, um die gewünschte radiochemischer Ausbeute zu erhalten.
Da die Vorstufe (2) ziemlich hydrophob war, 150 ul absolutem Ethanol sollte 1 mg aufzulösen hinzugefügt werden
Vor der Verwendung von präparativer HPLC zur Reinigung des Rohproduktes 1 enthält, wobei die Umkehrphasen - HPLC - Säule muss mit Lösungsmitteln gewaschen A und B (Durchflussrate: 10 ml / min; Eluent Gradient: 100% Lösungsmittel B für 0-10 min, 100 -0% Lösungsmittel B für 10-25 min und 0% Lösungsmittel B für 25-30 min) Spurenmengen von Verunreinigungen aus dem System zu entfernen. Als nächstes wird die Umkehrphasen-HPLC-Säule mit 20% Lösungsmittel B Lösungsmittel A äquilibriert in 80% für mindestens 20 min zu erhalten,die konsequente Retentionszeit von 1.
Die Fraktion gereinigter 1 enthält , sollte mit mehr als 4 - fache des Volumens von H 2 O in dem Festphasenextraktionsverfahren verdünnt werden. Ansonsten kann ein Teil des gereinigten Produkts nicht in der TC18 Patrone eingefangen werden. Wenn Aceton verwendet wird gereinigtes 1 aus der Kassette zu eluieren, kann das Endvolumen , indem sie mit einem Strom von Stickstoff oder Argongas bei Umgebungstemperatur Verdampfung von Aceton reduziert werden.
Unter mehreren radioaktiven iodines wurde 125 I ausgewählt und in der aktuellen Forschung. Verschiedene Arten von Jod benötigen Radioisotopen getestet werden , um das vorliegende Verfahren in anderen biologischen und medizinischen Studien unter Verwendung von (zB 124 I für die PET - Bildgebung, 131 I für therapeutische Zwecke).
Soweit wir verstehen, ist das vorliegende Protokoll radioaktiven Markierung der erste Bericht detaillierte syntheti- beschreibenc Schritte für eine Radiojod-markiertes Azidgruppe. Kürzlich veröffentlichten wir eine andere Azid prothetische Gruppe, die 23 eine andere Struktur hat. Jedoch das radiomarkierte Azid (1) in der aktuellen Methode etwas bessere Ergebnisse als die radiochemische einander vorgesehen in Bezug auf die Effizienz , mit radioaktiven Markierung DBCO Gruppen enthaltenden Molekülen. Bestehende prosthetische Gruppen (dh, N - Hydroxysuccinimid und Maleimid) für die Kennzeichnung von radioaktivem Jod konnte nicht Ortsspezifität bieten. Allerdings zeigt das vorliegende Verfahren unkompliziert Radiomarkierungseffizienz zusammen mit ausgezeichneten Bioorthogonalität. Da die azide funktionelle Gruppe in physiologischen Bedingungen sehr stabil zu sein , ist bekannt und in vivo Umgebungen kann das radiomarkierte Produkt (1) in pre-zielgerichtete in - vivo - Bildgebungsstudien verwendet werden. Wir gehen davon aus, dass diese Methode effizient sowohl in vitro angewendet werden und in - vivo - Jod - Radioisotop laBeling von Biomolekülen und Nanomaterialien, die eine verspannte Cyclooctin Struktur enthalten.
Auf der Grundlage der spezifischen Radioaktivität von 1 ist das berechnete Molverhältnis von 125 I und Goldnanopartikel ~ . 1: 1 125 I-markiertem gold - Nanopartikel (4) in der molekularen Bildgebung und Biodistribution Studien von Nanomaterialien verwendet werden. Das gegenwärtige Verfahren kann auch an radioaktivem Jod Kennzeichnung verschiedener Größen und Formen von Gold-Nanomaterialien angewendet werden.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chloramine T trihydrate | Sigma | 402869 | |
| [125I]NaI in aq. NaOH | Perkin-Elmer | NEZ033A010MC | |
| Sodium metabisulfite | Sigma | S9000 | |
| Formic acid | Sigma | 251364 | |
| Sep-Pak tC18 plus cartridge | Waters | WAT036800 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| Acetone | Sigma | 650501 | |
| Ethanol | Sigma | 459844 | |
| Gold(III) chloride trihydrate | Sigma | 520918 | |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | |
| DBCO PEG SH (MW 5,000) | NANOCS | PG2-DBTH-5k | |
| TLC silica gel 60 F254 | Merck | ||
| Analytical HPLC | Agilent | 1290 Infinity | Model number |
| Preparative HPLC | Agilent | 1260 Infinity | Model number |
| Analytical C18 reverse-phase column | Agilent | Zorbax Eclipse XDB-C18 | |
| Preparative C18 reverse-phase column | Agilent | PrepHT XDB-C18 | |
| Radio TLC scanner | Bioscan | AR-2000 | Model number |
| Radioisotope dose calibrator | Capintec, Inc | CRC -25R dose calibrator | Model number |
References
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