Summary
En detaljeret procedure til syntesen af et 125I-mærket azid og radioaktiv mærkning af dibenzocyclooctyne (DBCO) -gruppe-konjugerede, 13-nm-størrelse guld nanopartikler ved anvendelse af en kobber-fri klik reaktion er beskrevet.
Protocol
Forsigtig: oxiderede form af radioaktivt jod er ret svingende og skal håndteres med passende bly skjolde og bly hætteglas. Alle radiokemiske trin skal udføres i et godt ventileret kul-filtreret hætte, og de eksperimentelle procedurer skal overvåges af radioaktivitet sporingsudstyr.
1. Fremstilling af kemikalier og Reverse Phase Cartridge til syntese af 125I-mærket azid
- Fremstilling af reagenser i opløsning
- Opløs 1 mg af azidet precursor (2) i 150 pi absolut ethanol (figur 1).
BEMÆRK: En detaljeret syntetisk procedure for azid forløber (2) blev rapporteret i tidligere papir 22. - Opløs 1 mg chloramin T i 20 pi 1x phosphatbuffer saltvand (pH = 7,4).
- Opløs 2 mg natriummetabisulfit i 20 pi H 2 O.
- Opløs 1 mg af azidet precursor (2) i 150 pi absolut ethanol (figur 1).
- preparation af patronen
- Vask tC18 patron med 10 ml absolut ethanol efterfulgt af 10 ml H2O Tør ikke matrix af patronen med luft.
2. Radiosynthesis af 125I-mærket Azide prostetiske gruppe
- Radioiodering reaktion af precursoren
- Tilføj azidet precursor-opløsning (1 mg i 150 pi absolut ethanol) og eddikesyre (10 pi) til et 1,5 ml mikrocentrifugerør.
- Tilføj 150 MBq [125I] NaI i 0,1 M NaOH (50 pi) til reaktionsblandingen.
- Tilføj en chloramin T-opløsning (1 mg i 20 pi 1x phosphatbuffer saltvand) og luk mikrocentrifugerør indeholdende reaktionsblanding.
- Inkuber reaktionsblandingen ved stuetemperatur i 15 minutter, indtil radioaktiv iodering reaktionen er afsluttet.
- Tilføj et natriummetabisulfitopløsning (2 mg i 20 pi H2O) til reaktionsblandingenat standse radioaktiv iodering reaktionen.
- Udtag 0,2 pi af det rå produkt, og derefter fortyndes den med 100 pi opløsning (H2O / CH3CN, 1: 1) til HPLC-analyse.
BEMÆRK: For alle HPLC eksperimenter bruge 0,1% myresyre indeholdende H2O (opløsningsmiddel A) og 0,1% myresyre indeholdende acetonitril (opløsningsmiddel B) som eluenter. - Analyser den fortyndede rå produkt ved anvendelse af en omvendt-fase analytisk radio-HPLC (C18 omvendt fase-søjle, strømningshastighed: 1 ml / min; eluent gradient: 20% opløsningsmiddel B i 0-2 minutter, 20-80% opløsningsmiddel B til 2-22 min, 80-100% opløsningsmiddel B i 22-23 minutter og 100% opløsningsmiddel B i 23-28 minutter; retentionstid: 16,4 min) (figur 2).
- Oprensning af det rå produkt med en præparativ HPLC
BEMÆRK: Sørg for tilstrækkelig blyafskærmning omkring HPLC dele såsom injektoren, kolonne, detektor, indsamling hætteglas, og den beholder, hvori spildevandet opsamles.- Træk the hele reaktionsblandingen i et HPLC hætteglas. Skyl reaktionsrøret med acetonitril (0,5 ml) og tilsæt skyllevæsken ind i den samme hætteglas. Fortynd den opsamlede opløsning med H2O (1 ml).
- Injicer råproduktet på en præparativ radio-HPLC (C18 omvendt fase-søjle, strømningshastighed: 10 ml / min; eluent gradient: 20% opløsningsmiddel B i 0-2 minutter, 20-80% opløsningsmiddel B i 2-22 minutter, 80-100% opløsningsmiddel B i 22-23 minutter og 100% opløsningsmiddel B i 23-28 minutter).
- Opsaml radioaktive spids, der repræsenterer den 125I-mærket azid (1) (tR under disse HPLC-betingelser er fra 17,8 til 18,8 min) i et reagensglas (figur 2).
- Mål radiokemiske udbytte af fraktionen ved anvendelse af en radioaktivitet dosiskalibrator ifølge fabrikantens protokol.
- Injicer det rensede produkt på en analytisk radio-HPLC under anvendelse af de samme HPLC-betingelser til bestemmelse af radiokemiske renhed af produktet.
- Fastfaseekstraktion af produktet
- Fortynd fraktionen indeholdende det ønskede produkt (1) med 40 ml ren H 2 O.
- Tilsæt fortyndede opløsning i en prækonditioneret tC18 patron.
- Patronen vaskes med yderligere 15 ml H2O
- Eluering af produktet (1) fanget i patronen med 2 ml acetone i en 10-ml hætteglas, der er beskyttet af en blyafskærmning. Måle radioaktiviteten af det eluerede produkt med en radioaktivitet dosiskalibrator ifølge fabrikantens protokol.
BEMÆRK: Dimethylsulfoxid (DMSO) eller absolut ethanol kan også anvendes til eluering af produktet fra patronen. Ca. 5-10% af radioaktiviteten stikker normalt til patronen, og den resterende radiomærkede produkt kan ikke fuldt elueres ved anvendelse af overskydende mængder af organisk opløsningsmiddel. - Inddamp acetone med en strøm af nitrogen eller argon gas.
- Opløs residue med DMSO (100-200 pi) for det næste radiomærkning trin.
3. Syntese af DBCO-gruppe-konjugeret Gold Nanopartikler
- Surface modifikation af 13-nm-sized guld nanopartikler med DBCO-gruppe-holdige polyethylenglycol
- Forbered natrium-citrat-stabiliseret guld nanopartikler (3) (gennemsnitlig størrelse = 13 nm) i henhold til en tidligere rapport 24.
- Tilføj en vandig opløsning af Tween 20 (1 mM, 1,5 ml) til citratet-stabiliserede nanopartikler af guld (10 nM, 15 ml). Ryst opløsningen i 20 minutter på en orbitalryster.
- Tilføj en vandig opløsning af DBCO-gruppe-indeholdende polyethylenglycol thiol (gennemsnitlig molekylvægt = 5.000, 100 uM, 1,5 ml). Ryst opløsningen i 2 timer på en orbitalryster.
- Oprensning af DBCO-gruppe-modificerede guld nanopartikler
- Rense DBCO-gruppe-modificerede guld nanopartikler (4) </ Strong> ved successiv centrifugering (11.400 x g, 15 min x 3).
- Dekanteres og tilsæt rent vand til resuspension af guld nanopartikel pellets.
4. Radiomærkning af DBCO-gruppe-modificerede Gold Nanopartikler via kobber-fri Klik Reaktion
- Syntese af 125I-mærkede guld nanopartikler ved hjælp af 125I-mærket azid (1)
- Forbered en koncentreret opløsning af DBCO-gruppe-modificerede guld nanopartikler ved hjælp af centrifugering (11.400 xg, 15 min), og juster koncentrationen af guld nanopartikler til 2 uM.
- Tilføj 4,1 MBq af 125I-mærket azid (1) i DMSO (5 pl) til en suspension af guld nanopartikler (4) (2 uM, 50 pi).
- Inkubér den resulterende reaktionsblanding ved 40 ° C i 60 min.
- Trække en portion (0,2 pi) fra det rå produkt og anvende det på en silica-coated tyndtlagskromatografi (TLC) -plade.
- Udvikle TLC-pladen ved anvendelse af ethylacetat som en mobil fase.
- Anbring TLC-pladen på en radio-TLC-scanner og køre scanneren at overvåge radioaktiv mærkning reaktion (figur 3) ifølge fabrikantens protokol.
- Oprensning af det rå produkt
- Oprens reaktionsblandingen indeholdende 125I-mærket guld nanopartikler (4) ved centrifugering (11.400 xg, 15 min).
- Dekanteres og tilsæt rent vand til resuspension af guld nanopartikel pellets.
- Trække en portion (0,2 pi) fra det rensede produkt og anvende det på en siliciumoxid-belagte TLC-plade.
- Udvikle TLC-pladen ved anvendelse af ethylacetat som den mobile fase.
- Anbring TLC-pladen på en radio-TLC-scanner og køre scanneren til at bestemme den radiokemiske udbytte og den radiokemiske renhed af 125I-mærket gold nanopartikler (4) (figur 3) i henhold til fabrikantens protokol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den radioiodering Omsætningen af stannylated precursor (2) blev udført under anvendelse af 150 MBq [125I] NaI, eddikesyre, og chloramin T ved stuetemperatur i 15 minutter for at tilvejebringe den radiomærkede produkt (1). Efter præparativ HPLC-rensning af den rå blanding blev det ønskede produkt opnået med 75 ± 10% (n = 8) af radiokemisk udbytte. Analytisk HPLC viste, at den radiokemiske renhed af 125I-mærket produkt var mere end 99% (figur 2), og den observerede specifikke radioaktivitet af produkt 1 er 40,7 MBq / pmol. Fastfaseekstraktion af fraktionen indeholdende det oprensede produkt ved hjælp patronen tilvejebragt en acetoneopløsning af 1. Ved hjælp af en strøm af nitrogen eller argon gas, kan det organiske opløsningsmiddel afdampes, og derefter blev remanensen kan opløses igen i DMSO eller absolut ethanol for næste stes.
For 125I-mærkning af polyethylen-glycol-modificeret guld nanopartikler blev DBCO-gruppe-modificerede guldnanopartikler fremstillet ved den i figur 1. En overskydende mængde af polyethylenglycol thiol (MW 5.000) med DBCO grupper blev omsat med citreret, stabiliseret 13-nm guld nanopartikler. Efter modifikationen trin blev produktet oprenset ved successiv centrifugering for at give DBCO-funktionaliseret guld nanopartikler (3). I radioaktiv mærkning trin blev 3,7 MBq 1 tilsat til 2 pM af 3 (~ 400 pM af DBCO grupper), og reaktionen mærkning blev udført ved 40 ° C i 1 time. Radio-TLC-analyse viste, at over 95% af 1 blev omsat med DBCO-gruppe-funktionaliseret guld nanopartikler (3) inden for 60 min. Reaktionen blev udført i 60 min, og derefter blev råproduktet var purficeret ved centrifugering. 125I-mærket guld nanopartikler (4) blev opnået med> 99% (n = 4) radiokemisk udbytte som bestemt ved radio TLC (figur 3).
Figur 1. Radiosynthesis af 125I-mærket azid (1) og 125I-mærkede guld nanopartikler (4). Reagenser og betingelser: (a) [125I] NaI, eddikesyre, chloramin T, RT, 15 min, 75 ± 10% (n = 8) radiokemisk udbytte; (B) DBCO-PEG-SH (MW 5.000), H2O, RT, 2 timer; ~ 40 ° C, 60 min,> 99% radiokemisk udbytte. Klik her for at se en større version af dette tal.
t = "Figur 2" src = "/ files / ftp_upload / 54.759 / 54759fig2.jpg" />
Figur 2. Analytisk HPLC kromatogrammet af 125I-mærket azid (1). (A) radiochromatogram af det rå produkt. (B) radiochromatogram af det oprensede produkt. (C) UV kromatogram (254 nm) af det rensede produkt. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Radio-TLC resultaterne af de 125I-mærkede guld nanopartikler (4) (Rf af 4 = 0,05, Rf for 1 = 0,45, elueringsmiddel: ethylacetat) (a) efter en 60 minutters reaktion og (b) efter oprensning./ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54759/54759fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Generelt er den observerede radiokemiske udbytte af det oprensede 125I-mærket azid (1) var 75 ± 10% (n = 8). Den radiomærkning blev opnået med 50-150 MBq radioaktivitet, og den radiokemiske resultaterne er ganske konsistente. Hvis [125I] NaI (t 1/2 = 59,4 d) der undergik radioaktivt henfald i mere end en måned blev anvendt i radioaktiv iodering reaktion, den radiokemiske udbytte på 1 blev observeret at være faldet en smule (53-65%). Det anbefales derfor, at [125I] Nal anvendes, så snart det er fremstillet, eller leveres til laboratoriet for at opnå optimeret radiokemisk udbytte. Desuden bør en frisk fremstillet chloramin T-opløsning også anvendes i reaktionen til opnåelse af den ønskede radiokemisk udbytte.
Fordi forstadiet (2) var temmelig hydrofobe, bør tilføjes 150 pi absolut ethanol for at opløse 1 mg af
Før anvendelse af præparativ HPLC til oprensning af det rå produkt indeholdende 1, skal vaskes med opløsningsmidler A og B (strømningshastighed omvendt fase HPLC-kolonne: 10 ml / min; eluent gradient: 100% opløsningsmiddel B i 0-10 min, 100 -0% opløsningsmiddel B i 10-25 minutter og 0% opløsningsmiddel B i 25-30 min) for at fjerne spormængde af urenheder fra systemet. Dernæst omvendt fase HPLC-søjle ækvilibreret med 20% opløsningsmiddel B i 80% opløsningsmiddel A i mindst 20 minutter for at opnåkonsekvent retentionstid på 1.
Fraktionen indeholdende oprensede 1 skal fortyndes med mere end 4 gange volumenet af H2O i fase ekstraktionsprocedure fast stof. Ellers noget af det oprensede produkt kan ikke fanget i tC18 patronen. Når acetone anvendes til at eluere oprenset 1 fra patronen, kan det endelige volumen reduceres ved fordampning af acetone med en strøm af nitrogen eller argon gas ved omgivelsestemperatur.
Blandt flere radioaktive jod, 125I blev udvalgt og anvendt i den aktuelle forskning. Forskellige former for jod radioisotoper bør afprøves anvendelse af den foreliggende fremgangsmåde i andre biologiske og medicinske undersøgelser (f.eks, 124 I for PET imaging, 131 I til terapeutiske formål).
Så vidt vi forstår, det nuværende radioaktiv mærkning protokollen er den første rapport, der beskriver detaljeret synthetic trin for et radioaktivt iod-mærket azid gruppe. For nylig offentliggjorde vi en anden azid proteser gruppe, som har en anden struktur 23. Men den radioaktivt mærkede azid (1) i den nuværende fremgangsmåde, lidt bedre radiokemiske resultater end den anden i form af radioaktiv mærkning effektivitet med DBCO-gruppe-holdige molekyler. Eksisterende proteser grupper (dvs. N-hydroxysuccinimid og maleimid) til mærkning af radioaktivt jod ikke kunne give site-specificitet. Men den foreliggende fremgangsmåde demonstrerer ligetil radiomærkning effektivitet sammen med fremragende bioorthogonality. Da azidet funktionelle gruppe er kendt for at være meget stabile i fysiologiske betingelser og in vivo miljøer, kan den radiomærkede produkt (1) anvendes i præmålrettet in vivo imaging studier. Vi forventer, at denne metode vil blive effektivt anvendt på både in vitro og in vivo jod radioisotop laBeling af biomolekyler og nanomaterialer, der indeholder en anstrengt cyclooctyne struktur.
Baseret på den specifikke radioaktivitet på 1, den beregnede molære forhold af 125I og guld nanopartikler er ~ 1:. 1 125I-mærkede guld nanopartikler (4) kan anvendes i molekylær billeddannelse og biodistributionsstudier ved nanomaterialer. Den aktuelle fremgangsmåde kan også anvendes til radioaktiv jod mærkning af forskellige størrelser og former af guld nanomaterialer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chloramine T trihydrate | Sigma | 402869 | |
| [125I]NaI in aq. NaOH | Perkin-Elmer | NEZ033A010MC | |
| Sodium metabisulfite | Sigma | S9000 | |
| Formic acid | Sigma | 251364 | |
| Sep-Pak tC18 plus cartridge | Waters | WAT036800 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| Acetone | Sigma | 650501 | |
| Ethanol | Sigma | 459844 | |
| Gold(III) chloride trihydrate | Sigma | 520918 | |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | |
| DBCO PEG SH (MW 5,000) | NANOCS | PG2-DBTH-5k | |
| TLC silica gel 60 F254 | Merck | ||
| Analytical HPLC | Agilent | 1290 Infinity | Model number |
| Preparative HPLC | Agilent | 1260 Infinity | Model number |
| Analytical C18 reverse-phase column | Agilent | Zorbax Eclipse XDB-C18 | |
| Preparative C18 reverse-phase column | Agilent | PrepHT XDB-C18 | |
| Radio TLC scanner | Bioscan | AR-2000 | Model number |
| Radioisotope dose calibrator | Capintec, Inc | CRC -25R dose calibrator | Model number |
References
- Jewett, J. C., Bertozzi, C. R. Cu-free Click Cycloaddition Reactions in Chemical Biology. Chem. Soc. Rev. 39, 1272-1279 (2010).
- Debets, M. F., et al. Bioconjugation with Strained Alkenes and Alkyne. Acc. Chem. Res. 44, 805-815 (2011).
- Sletten, E. M., Bertozzi, C. R. From Mechanism to Mouse: A Tale of Two Bioorthogonal Reactions. Acc. Chem. Res. 44, 666-676 (2011).
- Koo, H., et al. Bioorthogonal Cu-Free Click Chemistry in vivo for Tumor-Targeted Delivery of Nanoparticles. Angew. Chem. Int. Ed. 51, 11836-11840 (2012).
- Chang, P. V., et al. Copper-Free Click Chemistry in Living Animals. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 1821-1826 (2010).
- Bostic, H. E., Smith, M. D., Poloukhtine, A. A., Popik, V. V., Best, M. D. Membrane Labeling and Immobilization via copper-free Click Chemistry. Chem. Commun. 48, 1431-1433 (2012).
- Someya, T., Ando, A., Kimoto, M., Hirao, I. Site-Specific Labeling of RNA by Combining Genetic Alphabet Expansion Transcription and Copper-Free Click Chemistry. Nucl. Acids Res. 43, 6665-6676 (2015).
- Lee, S. B., et al. Mesoporous Silica Nanoparticle Pretargeting for PET Imaging Based on a Rapid Bioorthogonal Reaction in a Living Body. Angew. Chem. Int. Ed. 52, 10549-10552 (2013).
- Sachin, K., et al. F-18 Labeling Protocol of Peptides Based on Chemically Orthogonal Strain-Promoted Cycloaddition under Physiologically Friendly Reaction Conditions. Bioconjugate Chem. 23, 1680-1686 (2012).
- Evans, H. L., et al. Copper-Free Click - A Promising Tool for Pre-targeted PET Imaging. Chem. Commun. 48, 991-993 (2012).
- Campbell-Verduyn, L. S., et al. Strain-Promoted Copper-Free "Click" Chemistry for 18F Radiolabeling of Bombesin. Angew. Chem. Int. Ed. 50, 11117-11120 (2011).
- Arumugam, S., Chin, J., Schirrmacher, R., Popik, V. V., Kostikov, A. P. 18F]Azadibenzocyclooctyne ([18F]ADIBO): A Biocompatible Radioactive Labeling Synthon for Peptides using Catalyst Free [3+2] Cycloaddition. Bioorg. Med. Chem. Lett. 21, 6987-6991 (2011).
- Bouvet, V., Wuest, M., Wuest, F. Copper-Free Click Chemistry with the Short-Lived Positron Emitter Fluorine-18. Org. Biomol. Chem. 9, 7393-7399 (2011).
- Satpati, D., Bauer, N., Hausner, S. H., Sutcliffe, J. L. Synthesis of [64Cu]DOTA-ADIBON3-Ala-PEG28-A20FMDV2 via Copper-Free Click Chemistry for PET Imaging of Integrin αvβ6. J. Radioanal. Nucl. Chem. 302, 765-771 (2014).
- Lee, D. E., et al. Facile Method To Radiolabel Glycol Chitosan Nanoparticles with 64Cu via Copper-Free Click Chemistry for MicroPET Imaging. Mol. Pharmaceutics. 10, 2190-2198 (2013).
- Zeng, D. 64Cu Core-Labeled Nanoparticles with High Specific Activity via Metal-Free Click Chemistry. ACS Nano. 6, 5209-5219 (2012).
- Jeon, J., et al. Radiosynthesis and in vivo Evaluation of [125I]2-4(iodophenethyl)-2-Methylmalonic Acid as a Potential Radiotracer for Detection of Apoptosis. J. Radioanal. Nucl. Chem. 308, 23-29 (2016).
- Adam, M. J., Wilbur, D. S. Radiohalogens for Imaging and Therapy. Chem. Soc. Rev. 34, 153-163 (2005).
- Jeon, J., et al. Radiosynthesis of 123I-Labeld Hesperetin for Biodistribution Study of Orally Administered Hesperetin. J. Radioanal. Nucl. Chem. 306, 437-443 (2015).
- Kil, K. E., et al. Development of [123I]IPEB and [123I]IMPEB as SPECT Radioligands for Metabotropic Glutamate Receptor Subtype. ACS Med. Chem. Lett. 5, 652-656 (2014).
- Chen, M. K., et al. The Utility of I-123 Pretherapy Scan in I-131 Radioiodine Therapy for Thyroid Cancer. Thyroid. 22, 304-309 (2012).
- Jeon, J., et al. Efficient Method for Iodine Radioisotope Labeling of Cyclooctyne-Containing Molecules using Strain-Promoted Copper-Free Click Reaction. Bioorg. Med. Chem. 23, 3303-3308 (2015).
- Choi, M. H., et al. Synthesis and Evaluation of an 125I-Labeled Azide Prosthetic Group for Efficient and Bioorthogonal Radiolabeling of Cyclooctyne-Group Containing Molecules using Copper-Free Click Reaction. Bioorg. Med. Chem. Lett. 26, 875-878 (2016).
- Kim, Y. H., et al. Tumor Targeting and Imaging Using Cyclic RGD-PEGylated Gold Nanoparticle Probes with Directly Conjugated Iodine-125. Small. 7, 2052-2060 (2011).
