Summary
एक 125 मैं लेबल azide के संश्लेषण और dibenzocyclooctyne (DBCO) -group संयुग्मित, 13 एनएम आकार सोने की एक तांबे के लिए क्लिक प्रतिक्रिया का उपयोग नैनोकणों के radiolabeling के लिए एक विस्तृत प्रक्रिया में वर्णित है।
Protocol
सावधानी: रेडियोधर्मी आयोडीन का ऑक्सीकरण प्रपत्र काफी अस्थिर है और पर्याप्त नेतृत्व ढालें और नेतृत्व शीशियों के साथ संभाला जाना चाहिए। सभी radiochemical कदम एक अच्छी तरह हवादार लकड़ी का कोयला फ़िल्टर हुड में बाहर किया जाना चाहिए, और प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं रेडियोधर्मिता का पता लगाने के उपकरणों के द्वारा नजर रखी जा करने की जरूरत है।
125 मैं लेबल Azide के संश्लेषण के लिए रसायन और रिवर्स चरण कारतूस 1. तैयारी
- समाधान में अभिकर्मकों की तैयारी
- 150 μl में azide अग्रदूत (2) पूर्ण इथेनॉल (चित्रा 1) के 1 मिलीग्राम भंग।
नोट: azide अग्रदूत के लिए एक विस्तृत सिंथेटिक प्रक्रिया (2) पिछले पेपर 22 में बताया गया था। - 1x फॉस्फेट बफर खारा (पीएच = 7.4) के 20 μl में 1 मिलीग्राम chloramine टी भंग।
- 20 μl एच 2 ओ में 2 मिलीग्राम सोडियम metabisulfite भंग
- 150 μl में azide अग्रदूत (2) पूर्ण इथेनॉल (चित्रा 1) के 1 मिलीग्राम भंग।
- तैयारीकारतूस की tion
- 10 मिलीलीटर निरपेक्ष 10 मिलीलीटर एच 2 ओ के द्वारा पीछा इथेनॉल के साथ tC18 कारतूस धो हवा के साथ कारतूस के मैट्रिक्स सूखा नहीं है।
2. 125 मैं लेबल Azide कृत्रिम समूह के Radiosynthesis
- अग्रदूत के Radioiodination प्रतिक्रिया
- एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब azide अग्रदूत समाधान और एसिटिक एसिड (10 μl) (पूर्ण इथेनॉल के 150 μl में 1 मिलीग्राम) जोड़ें।
- प्रतिक्रिया मिश्रण करने के लिए 0.1 एम NaOH (50 μl) में की [125 मैं] NaI 150 MBq जोड़ें।
- एक chloramine टी समाधान (1x फॉस्फेट बफर खारा के 20 μl में 1 मिलीग्राम) जोड़ें और microcentrifuge ट्यूब युक्त प्रतिक्रिया मिश्रण को बंद करें।
- radioiodination प्रतिक्रिया पूरा हो गया है जब तक 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर प्रतिक्रिया मिश्रण सेते हैं।
- एक सोडियम metabisulfite समाधान (2 20 में मिलीग्राम μl एच 2 ओ) प्रतिक्रिया मिश्रण में जोड़ेंradioiodination प्रतिक्रिया बुझाने के लिए।
- कच्चे तेल उत्पाद के 0.2 μl वापस ले लें और फिर समाधान के 100 μl के साथ पतला (एच 2 ओ / CH 3 सीएन, 1: 1) एचपीएलसी विश्लेषण के लिए।
नोट: सभी एचपीएलसी प्रयोगों के लिए, एच 2 ओ (विलायक ए) युक्त 0.1% फार्मिक एसिड और eluents के रूप में 0.1% फार्मिक एसिड युक्त acetonitrile (विलायक बी) का उपयोग करें। - C18 एक रिवर्स चरण विश्लेषणात्मक रेडियो-एचपीएलसी का उपयोग करके पतला कच्चे तेल उत्पाद विश्लेषण (रिवर्स चरण स्तंभ, प्रवाह दर: 1 मिलीग्राम / मिनट; eluent ढाल: 0-2 मिनट के लिए 20% विलायक बी, 20-80% विलायक बी के लिए 2-22 मिनट, 22-23 मिनट के लिए 80-100% विलायक बी, और 23-28 मिनट के लिए 100% विलायक बी, अवधारण समय: 16.4 मिनट) (चित्रा 2)।
- एक प्रारंभिक एचपीएलसी के साथ कच्चे तेल उत्पाद की शुद्धि
नोट: इस तरह के इंजेक्टर, स्तंभ, डिटेक्टर, संग्रह शीशियों, और कंटेनर में जो प्रवाह के रूप में एकत्र किया जाता है एचपीएलसी भागों के आसपास पर्याप्त नेतृत्व परिरक्षण प्रदान करें।- वापस लेने वेंएक एचपीएलसी शीशी में ई पूरे प्रतिक्रिया मिश्रण। acetonitrile (0.5 एमएल) के साथ प्रतिक्रिया ट्यूब कुल्ला और एक ही इंजेक्शन की शीशी में कुल्ला जोड़ें। एच 2 ओ (1 एमएल) के साथ एकत्र समाधान पतला।
- (एक प्रारंभिक रेडियो-एचपीएलसी पर कच्चे तेल उत्पाद इंजेक्षन C18 रिवर्स चरण स्तंभ, प्रवाह दर: 10 मिलीग्राम / मिनट; eluent ढाल: 20% विलायक बी 0-2 मिनट, 20-80% विलायक बी के लिए 2-22 मिनट के लिए, 22-23 मिनट के लिए 80-100% विलायक बी, और 23-28 मिनट के लिए 100% विलायक बी)।
- रेडियोधर्मी शिखर 125 मैं लेबल azide (1) का प्रतिनिधित्व कर लीजिए एक गिलास टेस्ट ट्यूब में (चित्रा 2) (टी आर इन एचपीएलसी की शर्तों के तहत 17.8-18.8 मिनट है)।
- अंश निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार एक रेडियोधर्मिता खुराक अंशशोधक का उपयोग करने का radiochemical उपज उपाय।
- एक विश्लेषणात्मक रेडियो-एचपीएलसी उत्पाद की radiochemical पवित्रता का निर्धारण करने के लिए एक ही एचपीएलसी शर्तों का उपयोग पर शुद्ध उत्पाद इंजेक्षन।
- उत्पाद की ठोस चरण निष्कर्षण
- 40 मिलीलीटर शुद्ध एच 2 ओ के साथ वांछित उत्पाद (1) युक्त अंश पतला
- एक preconditioned tC18 कारतूस में पतला समाधान जोड़ें।
- एक अतिरिक्त 15 मिलीलीटर एच 2 ओ के साथ कारतूस धो
- उत्पाद (1) एक 10 मिलीलीटर कांच की शीशी है कि एक का नेतृत्व ढाल द्वारा संरक्षित है में 2 मिलीलीटर एसीटोन के साथ कारतूस में फंस Elute। निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार एक रेडियोधर्मिता खुराक अंशशोधक का उपयोग कर eluted उत्पाद की रेडियोधर्मिता मापने।
नोट: डाइमिथाइल sulfoxide (DMSO) या पूर्ण इथेनॉल भी कारतूस से उत्पाद की क्षालन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। रेडियोधर्मिता का लगभग 5-10% सामान्य रूप से कारतूस के लिए चिपक जाती है, और शेष radiolabeled उत्पाद पूरी तरह से कार्बनिक विलायक की अधिक मात्रा का उपयोग करके eluted नहीं किया जा सकता। - नाइट्रोजन या आर्गन गैस की एक धारा के साथ एसीटोन लुप्त हो जाना।
- फिर से भंगअगले कदम के लिए radiolabeling DMSO (100-200 μl) के साथ sidue।
3. DBCO-समूह संयुग्मित सोने के नैनोकणों के संश्लेषण
- 13 एनएम आकार सोने की सतह संशोधन DBCO-समूह युक्त पॉलीथीन ग्लाइकोल साथ नैनोकणों
- तैयार सोडियम साइट्रेट स्थिर सोने के नैनोकणों (3) (औसत आकार = 13 एनएम) पिछले एक रिपोर्ट के अनुसार 24।
- बीच 20 (1 मिमी, 1.5 एमएल) की एक जलीय घोल साइट्रेट स्थिर सोने के नैनोकणों में जोड़ें (10 एनएम, 15 मिलीलीटर)। एक कक्षीय प्रकार के बरतन पर 20 मिनट के लिए समाधान हिला।
- DBCO-समूह युक्त पॉलीथीन ग्लाइकोल thiol (औसत आणविक वजन = 5000, 100 सुक्ष्ममापी, 1.5 एमएल) की एक जलीय समाधान जोड़ें। एक कक्षीय प्रकार के बरतन पर 2 घंटे के लिए समाधान हिला।
- DBCO-समूह-संशोधित सोने के नैनोकणों की शुद्धि
- शुद्ध DBCO-समूह-संशोधित सोने के नैनोकणों (4) </ Strong> लगातार centrifugation (11,400 XG, 15 मिनट एक्स 3) द्वारा।
- सतह पर तैरनेवाला छानना और सोने nanoparticle छर्रों के मेजबान के लिए शुद्ध पानी जोड़ें।
4. कॉपर-मुक्त रिएक्शन क्लिक के माध्यम से DBCO-समूह-संशोधित सोने के नैनोकणों radiolabeling
- 125 मैं लेबल सोना 125 मैं लेबल azide का उपयोग कर नैनोकणों के संश्लेषण (1)
- centrifugation (11,400 XG, 15 मिनट) का उपयोग करके DBCO-समूह-संशोधित सोने के नैनोकणों का एक केंद्रित समाधान तैयार है, और 2 माइक्रोन करने के लिए सोने के नैनोकणों की एकाग्रता को समायोजित।
- DMSO (5 μl) में 125 मैं लेबल azide (1) के 4.1 MBq सोने के नैनोकणों के निलंबन में जोड़े (4) (2 माइक्रोन, 50 μl)।
- 60 मिनट के लिए 40 डिग्री सेल्सियस पर जिसके परिणामस्वरूप प्रतिक्रिया मिश्रण सेते हैं।
- कच्चे तेल उत्पाद से एक विभाज्य (0.2 μl) वापस लेने और एक सिलिका-सह पर इसे लागूपैदा पतली परत क्रोमैटोग्राफी (टीएलसी) थाली।
- एक मोबाइल चरण के रूप में एथिल एसीटेट का उपयोग कर टीएलसी प्लेट का विकास करना।
- एक रेडियो टीएलसी स्कैनर पर टीएलसी थाली प्लेस और स्कैनर radiolabeling प्रतिक्रिया (चित्रा 3) निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार निगरानी के लिए चला रहे हैं।
- कच्चे तेल उत्पाद की शुद्धि
- प्रतिक्रिया 125 मैं लेबल सोने के नैनोकणों (4) centrifugation द्वारा (11,400 XG, 15 मिनट) से युक्त मिश्रण शुद्ध।
- सतह पर तैरनेवाला छानना और सोने nanoparticle छर्रों के मेजबान के लिए शुद्ध पानी जोड़ें।
- शुद्ध उत्पाद से एक विभाज्य (0.2 μl) वापस लेने और एक सिलिका लेपित टीएलसी थाली पर लागू होते हैं।
- मोबाइल चरण के रूप में एथिल एसीटेट का उपयोग कर टीएलसी प्लेट का विकास करना।
- एक रेडियो टीएलसी स्कैनर पर टीएलसी थाली प्लेस और स्कैनर radiochemical उपज और 125 मैं लेबल गोल की radiochemical पवित्रता का निर्धारण करने के लिए चलाडी नैनोकणों (4) (चित्रा 3) निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार।
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Representative Results
Stannylated अग्रदूत (2) के radioiodination प्रतिक्रिया 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर [125 मैं] नई, एसिटिक एसिड, और chloramine टी के 150 MBq का उपयोग किया गया radiolabeled उत्पाद प्रदान करने के लिए (1)। कच्चे तेल के मिश्रण के प्रारंभिक एचपीएलसी शुद्धि के बाद, वांछित उत्पाद radiochemical उपज का 75 ± 10% (एन = 8) के साथ प्राप्त हुई थी। विश्लेषणात्मक एचपीएलसी से पता चला है कि 125 मैं लेबल उत्पाद की शुद्धता radiochemical 99% से अधिक (चित्रा 2) था, और उत्पाद 1 से मनाया विशिष्ट रेडियोधर्मिता 40.7 MBq / μmol है। कारतूस का उपयोग करके शुद्ध उत्पाद युक्त अंश की ठोस चरण निष्कर्षण 1 के एक एसीटोन समाधान प्रदान की है। नाइट्रोजन या आर्गन गैस की एक धारा का उपयोग करना, कार्बनिक विलायक सुखाया जा सकता है, और उसके बाद छाछ अगले काएं के लिए DMSO या निरपेक्ष इथेनॉल में फिर से भंग किया जा सकतापी।
पॉलीथीन-ग्लाइकोल संशोधित सोने के नैनोकणों के 125 मैं लेबलिंग के लिए, DBCO-समूह-संशोधित सोने के नैनोकणों DBCO समूहों के साथ प्रक्रिया चित्र 1 में दिखाया द्वारा तैयार किए गए थे। पॉलीथीन ग्लाइकोल thiol की एक अतिरिक्त राशि (मेगावाट 5000) के साथ प्रतिक्रिया व्यक्त की गई थी citrated, 13 एनएम सोने के नैनोकणों स्थिर हो। संशोधन के कदम के बाद, उत्पाद लगातार centrifugation द्वारा शुद्ध किया गया था DBCO-क्रियाशील सोने के नैनोकणों देने के लिए (3)। Radiolabeling चरण में, 1 की 3.7 MBq 3 के 2 माइक्रोन (~ 400 DBCO समूहों के माइक्रोन) के लिए जोड़ा गया है, और लेबलिंग प्रतिक्रिया 1 घंटे के लिए 40 डिग्री सेल्सियस पर बाहर किया गया था। रेडियो-टीएलसी विश्लेषण से पता चला है कि 1 से 95% से अधिक 60 मिनट के भीतर DBCO-समूह-क्रियाशील सोने के नैनोकणों (3) के साथ प्रतिक्रिया व्यक्त की गई थी। प्रतिक्रिया 60 मिनट के लिए बाहर किया गया था, और उसके बाद कच्चे तेल उत्पाद पुर थाified द्वारा centrifugation। 125 मैं लेबल सोना (4) नैनोकणों के रूप में रेडियो टीएलसी (चित्रा 3) द्वारा निर्धारित> 99% (एन = 4) radiochemical उपज के साथ प्राप्त किया गया।
चित्रा 1. 125 मैं लेबल azide के Radiosynthesis (1) और 125 मैं लेबल सोने के नैनोकणों (4)। अभिकर्मकों और शर्तों: (क) [125 मैं] नई, एसिटिक एसिड, chloramine टी, आर टी, 15 मिनट, 75 ± 10% (एन = 8) radiochemical उपज; (ख) DBCO खूंटी एसएच (मेगावाट 5000), एच 2 ओ, आरटी, 2 घंटा; ~ 40 डिग्री सेल्सियस, 60 मिनट,> 99% radiochemical उपज। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
टी = "चित्रा 2" src = "/ files / ftp_upload / 54759 / 54759fig2.jpg" />
चित्रा 2. 125 मैं लेबल azide का विश्लेषणात्मक एचपीएलसी वर्णलेख (1)। (क) कच्चे तेल उत्पाद की Radiochromatogram। (ख) शुद्ध उत्पाद की Radiochromatogram। (ग) यूवी शुद्ध उत्पाद की वर्णलेख (254 एनएम)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3. रेडियो-टीएलसी 125 मैं लेबल सोने के नैनोकणों के परिणाम (4) (4 = 0.05 की आर एफ, आर एफ 1 = 0.45, eluent की: एथिल एसीटेट) (क) एक 60 मिनट की प्रतिक्रिया के बाद और (ख) शोधन के बाद।/ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54759/54759fig3large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
सामान्य में, शुद्ध 125 मैं लेबल azide (1) का मनाया radiochemical उपज 75 ± 10% थी (एन = 8)। radiolabeling रेडियोधर्मिता का 50-150 MBq के साथ पूरा किया गया था, और radiochemical परिणाम काफी संगत कर रहे हैं। यदि [125 मैं] NaI (टी 1/2 = 59.4 डी) है कि अधिक से अधिक एक महीने के लिए रेडियोधर्मी क्षय कराना पड़ा radioiodination प्रतिक्रिया में इस्तेमाल किया गया था, 1 की radiochemical उपज होने के लिए मनाया था थोड़ा कम (53-65%)। इसलिए, यह सिफारिश की है कि [125 मैं] NaI जैसे ही यह उत्पादन किया जाता है उपयोग किया जा या आदेश अनुकूलित radiochemical उपज प्राप्त करने के लिए प्रयोगशाला को दिया है। इसके अलावा, एक नया तैयार chloramine टी समाधान भी वांछित radiochemical उपज प्राप्त करने के लिए प्रतिक्रिया में इस्तेमाल किया जाना चाहिए।
क्योंकि अग्रदूत (2) काफी हाइड्रोफोबिक था, 150 μl पूर्ण इथेनॉल के 1 मिलीग्राम भंग करने के लिए जोड़ा जाना चाहिए
Eluent ढाल, 10 मिलीग्राम / मिनट: 0-10 मिनट के लिए 100% विलायक बी, 100 कच्चे तेल 1 से युक्त उत्पाद की शुद्धि के लिए प्रारंभिक HPLC का उपयोग करने से पहले, रिवर्स चरण एचपीएलसी स्तंभ सॉल्वैंट्स ए और बी (प्रवाह की दर से धोया जा करने की जरूरत 10-25 मिनट के लिए -0% विलायक बी, और 25-30 मिनट के लिए 0% विलायक बी) प्रणाली से अशुद्धियों की राशि का पता लगाने हटा दें। अगले, रिवर्स चरण एचपीएलसी स्तंभ प्राप्त करने के लिए कम से कम 20 मिनट के लिए 80% विलायक ए में 20% विलायक बी के साथ equilibrated है1 के अनुरूप प्रतिधारण समय।
अंश शुद्ध 1 से युक्त ठोस चरण निष्कर्षण प्रक्रिया में एच 2 ओ की अधिक से अधिक 4 बार की मात्रा के साथ पतला होना चाहिए। अन्यथा, शुद्ध उत्पाद के कुछ tC18 कारतूस में फंस नहीं किया जा सकता। जब एसीटोन कारतूस से शुद्ध 1 elute करने के लिए प्रयोग किया जाता है, अंतिम मात्रा परिवेश के तापमान पर नाइट्रोजन या आर्गन गैस की एक धारा के साथ एसीटोन के वाष्पीकरण से कम किया जा सकता है।
कई रेडियोधर्मी iodines के बीच, 125 मैं चयनित और वर्तमान अनुसंधान के क्षेत्र में इस्तेमाल किया गया था। आयोडीन radioisotopes के विभिन्न प्रकार के अन्य जैविक और चिकित्सा अध्ययन में वर्तमान पद्धति का उपयोग कर परीक्षण किया जा करने की जरूरत है (जैसे, पीईटी इमेजिंग के लिए 124 मैं, 131 चिकित्सीय उद्देश्यों के लिए मैं)।
जहां तक हम समझते हैं, वर्तमान radiolabeling प्रोटोकॉल विस्तृत syntheti का वर्णन पहली रिपोर्ट हैएक रेडियो आयोडीन लेबल azide समूह ग कदम। हाल ही में, हम एक और azide कृत्रिम समूह है, जो एक अलग संरचना 23 है प्रकाशित किया। हालांकि, radiolabeled azide (1) वर्तमान पद्धति में DBCO-समूह युक्त अणुओं के साथ दक्षता radiolabeling के मामले में अन्य की तुलना में थोड़ा बेहतर radiochemical परिणाम प्रदान की। मौजूदा रेडियोधर्मी आयोडीन की लेबलिंग के लिए कृत्रिम समूह (यानी, एन -hydroxysuccinimide और maleimide) साइट विशिष्टता प्रदान नहीं कर सके। हालांकि, वर्तमान विधि उत्कृष्ट bioorthogonality के साथ सीधा radiolabeling दक्षता को दर्शाता है। चूंकि azide कार्यात्मक समूह शारीरिक शर्तों और इन विवो वातावरण में अत्यधिक स्थिर होने के लिए जाना जाता है, radiolabeled उत्पाद (1) vivo इमेजिंग अध्ययन में पूर्व लक्षित में उपयोग किया जा सकता है। हम आशा करते हैं कि इस विधि कुशलता ला दोनों इन विट्रो और इन विवो आयोडीन रेडियो आइसोटोप में लागू किया जाएगाbiomolecules और nanomaterials कि एक तनावपूर्ण cyclooctyne संरचना होते beling।
। 1 125 मैं लेबल सोने के नैनोकणों (4) nanomaterials के आणविक इमेजिंग और biodistribution अध्ययन में इस्तेमाल किया जा सकता है: 1 के विशिष्ट रेडियोधर्मिता के आधार पर, 125 मैं और सोने के नैनोकणों की गणना की दाढ़ अनुपात ~ 1 है। वर्तमान विधि भी अलग अलग आकार और सोने nanomaterials के आकार के रेडियोधर्मी आयोडीन लेबलिंग के लिए लागू किया जा सकता है।
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Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Chloramine T trihydrate | Sigma | 402869 | |
[125I]NaI in aq. NaOH | Perkin-Elmer | NEZ033A010MC | |
Sodium metabisulfite | Sigma | S9000 | |
Formic acid | Sigma | 251364 | |
Sep-Pak tC18 plus cartridge | Waters | WAT036800 | |
Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
Acetone | Sigma | 650501 | |
Ethanol | Sigma | 459844 | |
Gold(III) chloride trihydrate | Sigma | 520918 | |
Tween 20 | Sigma | P1379 | |
DBCO PEG SH (MW 5,000) | NANOCS | PG2-DBTH-5k | |
TLC silica gel 60 F254 | Merck | ||
Analytical HPLC | Agilent | 1290 Infinity | Model number |
Preparative HPLC | Agilent | 1260 Infinity | Model number |
Analytical C18 reverse-phase column | Agilent | Zorbax Eclipse XDB-C18 | |
Preparative C18 reverse-phase column | Agilent | PrepHT XDB-C18 | |
Radio TLC scanner | Bioscan | AR-2000 | Model number |
Radioisotope dose calibrator | Capintec, Inc | CRC -25R dose calibrator | Model number |
References
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