Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Оптимизированного протокола для эффективного радиоактивной наночастиц золота с помощью Published: October 10, 2016 doi: 10.3791/54759
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2, 1, 1,2, 1, 1,2
1Advanced Radiation Technology Institute, Korea Atomic Energy Research Institute, 2Department of Radiation Biotechnology and Applied Radioisotope Science, University of Science and Technology

Summary

Подробный порядок синтеза 125 I-меченого азида и радиомечения из dibenzocyclooctyne (DBCO) -группа-сопряженными, 13-нм размера наночастиц золота с использованием меди , свободной от реакции щелчка описана.

Protocol

Внимание: окисленная форма радиоактивного йода довольно неустойчив и должны быть обработаны с адекватными свинцовыми щитами и свинцовых флаконах. Все радиохимических шаги должны проводиться в хорошо вентилируемом активированным углем капот, а также экспериментальные процедуры должны контролироваться устройствами обнаружения радиоактивности.

1. Приготовление химических веществ и обратного фазового картриджа для синтеза 125 I-меченого азида

  1. Приготовление реагентов в растворе
    1. Растворите 1 мг азида предшественника (2) в 150 мкл абсолютного этилового спирта (рисунок 1).
      Примечание: Подробное синтетическая процедура предшественника азида (2) сообщалось в предыдущей статье 22.
    2. Растворите 1 мг хлорамина T в 20 мкл 1х фосфатного буфера солевым раствором (рН = 7,4).
    3. Растворите 2 мг метабисульфит натрия в 20 мкл H 2 O.
  2. PREPARAции картриджа
    1. Промыть картридж tC18 с 10 мл абсолютного этанола , а затем 10 мл H 2 O. Не сушить матрицу картриджа с воздухом.

2. Radiosynthesis 125 I-меченого азида ортопедической группы

  1. Радиоиодирования реакции предшественника
    1. Добавляют раствор предшественника азид (1 мг в 150 мкл абсолютного этанола) и уксусную кислоту (10 мкл) в 1,5 мл трубки микроцентрифужных.
    2. Добавьте 150 МБк [125 I] NaI в 0,1 М NaOH (50 мкл) к реакционной смеси.
    3. Добавление хлорамин Т раствор (1 мг в 20 мкл 1х фосфатного буферного раствора) и закройте микроцентрифужных пробирку, содержащую реакционную смесь.
    4. Инкубируют реакционную смесь при комнатной температуре в течение 15 мин, пока реакция радиоиодирования не будет завершена.
    5. Добавление метабисульфит натрия (2 мг в 20 мкл H 2 O) к реакционной смеси ,для гашения реакции радиоиодирования.
    6. Вывод 0,2 мкл неочищенного продукта , а затем разбавить его 100 мкл раствора (H 2 O / CH 3 CN, 1: 1) для анализа ВЭЖХ.
      Примечание: Для всех экспериментов ВЭЖХ используют 0,1% муравьиной кислоты , содержащей H 2 O (растворитель А) и 0,1% кислоты , содержащей ацетонитрил муравьиную (растворитель B) в качестве растворителей.
    7. Анализ разбавленный сырой продукт с помощью обращенно-фазовой аналитической радио-ВЭЖХ (С18 с обращенной фазой; скорость потока: 1 мл / мин, элюент градиент: 20% растворител в течение 0-2 мин, 20-80% растворител для 2-22 мин, 80-100% растворител в течение 22-23 мин, и 100% растворителя в в течение 23-28 мин; время удерживания: 16,4 мин) (рисунок 2).
  2. После очистки сырого продукта с помощью препаративной ВЭЖХ
    Примечание: Обеспечить достаточное количество свинца экранирование вокруг ВЭЖХ частей, таких как инжектор, колонка, детектор, сбор флаконов, и контейнером, в котором собирается выходящий поток.
    1. Вывод-йе Всю реакционную смесь в ВЭЖХ емкость. Ополосните реакционную трубку с ацетонитрилом (0,5 мл) и добавляют полоскание в том же флаконе для инъекций. Развести собранный раствор с H 2 O (1 мл).
    2. Вводят сырой продукт на препаративной радио-ВЭЖХ (С18 с обращенной фазой; скорость потока: 10 мл / мин; элюирование с градиентом: 20% растворител в течение 0-2 мин, 20-80% растворител в течение 2-22 мин, 80-100% растворител в течение 22-23 мин, и 100% растворител в течение 23-28 мин).
    3. Собирают радиоактивный пик , представляющий 125 I-меченый азид (1) (T R в этих условиях ВЭЖХ 17.8-18.8 мин) в стеклянной пробирке (рисунок 2).
    4. Измерьте радиохимический выход фракции с использованием радиоактивной дозы калибратор в соответствии с протоколом производителя.
    5. Вводят очищенного продукта на аналитическую радио-ВЭЖХ с использованием тех же условиях ВЭЖХ для определения радиохимической чистоты продукта.
  3. Твердофазной экстракции продукта
    1. Развести фракцию , содержащую целевой продукт реакции (1) с 40 мл чистого H 2 O.
    2. Добавьте разбавленный раствор в переобусловленного tC18 картриджа.
    3. Промыть картридж с дополнительным 15 мл H 2 O.
    4. Элюции продукт (1) запертых в картридже с 2 мл ацетона в 10 мл стеклянную пробирку, которая защищена свинцовым экраном. Измерьте радиоактивность элюированного продукта с использованием радиоактивной дозы калибратор в соответствии с протоколом производителя.
      Примечание: диметилсульфоксиде (ДМСО) или абсолютный этанол также может быть использован для элюирования продукта из картриджа. Примерно 5-10% радиоактивности обычно прилипает к патрону, а оставшийся радиоактивно меченный продукт не может быть полностью элюировали с использованием избыточных количеств органического растворителя.
    5. Выпаривают ацетон с потоком азота или газообразного аргона.
    6. Растворить повторноsidue с ДМСО (100-200 мкл) на следующей стадии радиоактивной.

3. Синтез DBCO-группа-сопряженного наночастиц золота

  1. Поверхностная модификация 13-нм размера наночастиц золота с DBCO-группы , содержащей полиэтиленгликоль
    1. Готовят натрия цитрат-стабилизированные наночастицы золота (3) (средний размер = 13 нм) , в соответствии с предыдущим докладе 24.
    2. Добавление водного раствора Tween 20 (1 мМ, 1,5 мл) к цитратной-стабилизированных наночастиц золота (10 нМ, 15 мл). Взболтать раствор в течение 20 мин на орбитальном шейкере.
    3. Добавьте водный раствор DBCO-группы, содержащей полиэтиленгликоль тиола (средняя молекулярная масса = 5000, 100 мкМ, 1,5 мл). Встряхнуть раствор в течение 2 ч на орбитальном шейкере.
  2. Очистка наночастиц золота с модифицированной DBCO-группы,
    1. Очищают модифицированные DBCO-группы-наночастицы золота (4) </ Сильный> путем последовательного центрифугирования (11400 XG, 15 мин х 3).
    2. Слейте супернатант и добавить чистую воду для взмучивания золотых наночастиц гранул.

4. радиоактивной из DBCO-модифицированной группы наночастиц золота через неомедненная Нажмите реакции

  1. Синтез 125 I-меченных наночастиц золота с использованием 125 I-меченый азид (1)
    1. Приготовить концентрированный раствор наночастиц золота модифицированного DBCO-группы, с помощью центрифугирования (11400 XG, 15 мин), а также регулировать концентрацию наночастиц золота до 2 мкм.
    2. Добавить 4,1 МБк 125 I-меченый азида (1) в ДМСО (5 мкл) к суспензии наночастиц золота (4) (2 мкМ, 50 мкл).
    3. Выдержите полученной реакционной смеси при 40 & deg; С в течение 60 мин.
    4. Вывод аликвоту (0,2 мкл) из сырого продукта и применять его на кремнезем-COованные тонкослойной хроматографии (ТСХ) пластины.
    5. Разработка пластины тонкослойной хроматограммы, использу этилацетат в качестве подвижной фазы.
    6. Поместите пластину ТСХ на сканер радио-ТСХ и запустить сканер для контроля реакции радиоактивной (рисунок 3) в соответствии с протоколом производителя.
  2. После очистки сырого продукта
    1. Очищают реакционной смеси , содержащей 125 I-меченных наночастиц золота (4) путем центрифугирования (11400 XG, 15 мин).
    2. Слейте супернатант и добавить чистую воду для взмучивания золотых наночастиц гранул.
    3. Вывод аликвоту (0,2 мкл) из очищенного продукта и применять его на кремнеземную покрытием ТСХ пластины.
    4. Разработка пластины тонкослойной хроматограммы, использу этилацетат в качестве подвижной фазы.
    5. Поместите пластину ТСХ на сканер радио-ТСХ и запустить сканер для определения радиохимический выход и радиохимической чистоты 125 I-меченый голег наночастицы (4) (Рисунок 3) в соответствии с протоколом производителя.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Реакция радиоиодирования из stannylated предшественника (2) проводили с использованием 150 МБк [125 I] NaI, уксусную кислоту, и хлорамин Т при комнатной температуре в течение 15 мин , чтобы обеспечить радиоактивно меченого продукта (1). После препаративной ВЭЖХ очистки сырой смеси целевой продукт был получен с 75 ± 10% (n = 8) радиохимический выход. Аналитическую ВЭЖХ показал , что радиохимической чистоты 125 I-меченого продукта было более чем на 99% (рисунок 2), а наблюдаемый удельная радиоактивность продукта 1 составляет 40,7 МБк / мкмоль. Твердофазной экстракции из фракции , содержащей очищенный продукт, используя картридж при условии , ацетон раствор 1. С помощью потока азота или газообразного аргона, органический растворитель может быть выпаривали, а затем остаток можно растворить снова в ДМСО или абсолютном этаноле в течение следующего STEп.

Для получения 125 I-мечения наночастиц золота полиэтилен-гликоль-модифицированный, то DBCO-группа-модифицированные наночастицы золота были получены по методике , показанной на рисунке 1. Избыточное количество полиэтиленгликоля тиола (MW 5000) с DBCO группами подвергали взаимодействию с цитратной, стабилизированные наночастицы золота 13 нм. После стадии модификации, продукт очищают путем последовательного центрифугирования с получением DBCO-функционализированные наночастицы золота (3). На стадии радиоактивной, 3,7 МБк 1 добавляли 2 мкМ 3 (~ 400 мкМ DBCO групп), и реакционную смесь мечение проводили при 40 ° С в течение 1 часа. Радио-ТСХ анализ показал , что более 95% от 1 подвергали взаимодействию с функциональными группами DBCO-группы-золотых наночастиц (3) в течение 60 мин. Реакцию проводили в течение 60 мин, а затем неочищенный продукт был PURманьяков с помощью центрифугирования. 125 I-меченый наночастицы золота (4) были получены с> 99% (n = 4) радиохимический выход , как определено по радио ТСХ (рисунок 3).

Рисунок 1
Рисунок 1. Radiosynthesis из 125 I-меченного азида (1) и 125 I-меченые наночастицы золота (4). Реагенты и условия: (а) [125 I] NaI, уксусная кислота, хлорамин Т, РТ, 15 мин, 75 ± 10% (N = 8) радиохимический выход; (Б) DBCO-ПЭГ-SH (MW 5000), H 2 O, RT, 2 ч; ~ 40 ° C, 60 мин,> 99% радиохимический выход. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

т = "Рисунок 2" SRC = "/ файлы / ftp_upload / 54759 / 54759fig2.jpg" />
Рисунок 2. Аналитическая ВЭЖХ хроматограмму 125 I-меченый азида (1). (А) Radiochromatogram сырого продукта. (Б) Radiochromatogram очищенного продукта. (С) УФ - хроматограмма (254 нм) очищенного продукта. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3. Результаты Радио-ТЛК 125 I-меченных наночастиц золота (4) (R F 4 = 0,05, R F 1 = 0,45, элюент: этилацетат) (а) после того, как реакции на 60 мин , и (б) после очистки./ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54759/54759fig3large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В общем случае , наблюдаемая радиохимический выход очищенного 125 I-меченый азида (1) составляло 75 ± 10% (n = 8). Радиоактивной была выполнена с 50-150 МБк радиоактивности и радиохимического результаты вполне согласуются. Если [125 I] NaI (T 1/2 = 59,4 г) , который подвергся радиоактивному распаду в течение более одного месяца использовали в реакции радиоиодирования наблюдалось радиохимический выход 1 , чтобы быть незначительно снизилась (53-65%). Поэтому рекомендуется [125 I] NaI можно использовать , как только он производится или доставляется в лабораторию, чтобы получить оптимизированную радиохимический выход. Кроме того, свежеприготовленный хлорамин Т раствора, следует также использовать в реакции для получения желаемого радиохимический выход.

Поскольку предшественник (2) была достаточно гидрофобным, 150 мкл абсолютного этанола следует добавить , чтобы растворить 1 мг [125 I] NaI. Снижение растворимости предшественника часто приводит к низкой радиохимический выход 1. ДМСО также может быть использован для растворения 2 на стадии радиоактивной. Кроме того, уксусная кислота должна быть добавлена ​​к раствору предшественника для получения высокой радиохимический выход на стадии радиоиодирования.

Перед использованием препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографии для очистки сырого продукта , содержащего 1, то колонке с обращенной фазой ВЭЖХ должна быть вымыта с растворителями А и В (скорость потока: 10 мл / мин, элюент: градиент 100% растворител в течение 0-10 мин, 100 -0% растворител в течение 10-25 мин, и 0% растворителя в в течение 25-30 мин), чтобы удалить следовые количества примесей из системы. Затем колонке с обращенной фазой ВЭЖХ уравновешивали 20% растворител в 80% растворителя, в течение не менее 20 мин, чтобы получитьпоследовательное время удерживания 1.

Фракцию , содержащую очищенный 1 должна быть разбавлена более чем в 4 раза объем H 2 O в процедуре твердофазной экстракции. В противном случае, некоторые из очищенного продукта не могут быть захвачены в картридже tC18. Когда используют ацетон для элюирования очищенного 1 из картриджа, чтобы конечный объем может быть уменьшен за счет испарения ацетона с потоком азота или газообразного аргона при температуре окружающей среды.

Среди нескольких радиоактивных изотопов йода, 125 I был выбран и использован в текущем исследовании. Различные виды радиоизотопов йода должны быть проверены с использованием данного метода в других биологических и медицинских исследований (например, 124 I для работы с изображениями ПЭТ, 131 I для терапевтических целей).

Насколько мы понимаем, настоящий радиоактивной протокол представляет собой первый доклад, описывающий подробную synthetiC шаги по радиоактивным йодом-меченых азида группы. Недавно мы опубликовали еще одну азида простетическую группу, которая имеет другую структуру 23. Тем не менее, радиоактивно азид (1) в текущем методе при условии , немного лучше радиохимических результаты , чем другие с точки зрения радиоактивной эффективности с DBCO-групп , содержащих молекулы. Существующие протезно группы (т.е. N -hydroxysuccinimide и малеимида) для маркировки радиоактивного йода не может обеспечить сайт-специфичность. Тем не менее, данный способ демонстрирует эффективность простой радиоактивной наряду с прекрасными bioorthogonality. Поскольку функциональная группа азид , как известно, обладают высокой устойчивостью в физиологических условиях и в условиях естественных условиях, радиоактивно меченный продукт (1) может быть использован в предварительно целевых исследованиях в естественных изображений. Мы ожидаем , что этот метод будет эффективно применяется как в пробирке и в естественных условиях йодного радиоизотопа LAbeling биомолекул и наноматериалов, которые содержат натянутые структуру cyclooctyne.

На основании удельной радиоактивности 1, рассчитанное мольное отношение 125 наночастиц I и золота ~ 1: 1 . 125 I-меченые наночастицы золота (4) могут быть использованы в визуализации и биораспределению исследований молекулярных наноматериалов. Текущий метод может быть также применен к радиоактивное мечение йодом различных размеров и форм золотых наноматериалы.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chloramine T trihydrate Sigma 402869
[125I]NaI in aq. NaOH Perkin-Elmer NEZ033A010MC
Sodium metabisulfite  Sigma S9000
Formic acid Sigma 251364
Sep-Pak tC18 plus cartridge Waters WAT036800
Dimethyl sulfoxide  Sigma D2650
Acetone Sigma 650501
Ethanol Sigma 459844
Gold(III) chloride trihydrate Sigma 520918
Tween 20  Sigma P1379
DBCO PEG SH (MW 5,000) NANOCS PG2-DBTH-5k
TLC silica gel 60 F254 Merck
Analytical HPLC Agilent 1290 Infinity Model number
Preparative HPLC Agilent 1260 Infinity Model number
Analytical C18 reverse-phase column Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18
Preparative C18 reverse-phase column Agilent PrepHT XDB-C18
Radio TLC scanner Bioscan AR-2000 Model number
Radioisotope dose calibrator Capintec, Inc CRC -25R dose calibrator Model number

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jewett, J. C., Bertozzi, C. R. Cu-free Click Cycloaddition Reactions in Chemical Biology. Chem. Soc. Rev. 39, 1272-1279 (2010).
  2. Debets, M. F., et al. Bioconjugation with Strained Alkenes and Alkyne. Acc. Chem. Res. 44, 805-815 (2011).
  3. Sletten, E. M., Bertozzi, C. R. From Mechanism to Mouse: A Tale of Two Bioorthogonal Reactions. Acc. Chem. Res. 44, 666-676 (2011).
  4. Koo, H., et al. Bioorthogonal Cu-Free Click Chemistry in vivo for Tumor-Targeted Delivery of Nanoparticles. Angew. Chem. Int. Ed. 51, 11836-11840 (2012).
  5. Chang, P. V., et al. Copper-Free Click Chemistry in Living Animals. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 1821-1826 (2010).
  6. Bostic, H. E., Smith, M. D., Poloukhtine, A. A., Popik, V. V., Best, M. D. Membrane Labeling and Immobilization via copper-free Click Chemistry. Chem. Commun. 48, 1431-1433 (2012).
  7. Someya, T., Ando, A., Kimoto, M., Hirao, I. Site-Specific Labeling of RNA by Combining Genetic Alphabet Expansion Transcription and Copper-Free Click Chemistry. Nucl. Acids Res. 43, 6665-6676 (2015).
  8. Lee, S. B., et al. Mesoporous Silica Nanoparticle Pretargeting for PET Imaging Based on a Rapid Bioorthogonal Reaction in a Living Body. Angew. Chem. Int. Ed. 52, 10549-10552 (2013).
  9. Sachin, K., et al. F-18 Labeling Protocol of Peptides Based on Chemically Orthogonal Strain-Promoted Cycloaddition under Physiologically Friendly Reaction Conditions. Bioconjugate Chem. 23, 1680-1686 (2012).
  10. Evans, H. L., et al. Copper-Free Click - A Promising Tool for Pre-targeted PET Imaging. Chem. Commun. 48, 991-993 (2012).
  11. Campbell-Verduyn, L. S., et al. Strain-Promoted Copper-Free "Click" Chemistry for 18F Radiolabeling of Bombesin. Angew. Chem. Int. Ed. 50, 11117-11120 (2011).
  12. Arumugam, S., Chin, J., Schirrmacher, R., Popik, V. V., Kostikov, A. P. 18F]Azadibenzocyclooctyne ([18F]ADIBO): A Biocompatible Radioactive Labeling Synthon for Peptides using Catalyst Free [3+2] Cycloaddition. Bioorg. Med. Chem. Lett. 21, 6987-6991 (2011).
  13. Bouvet, V., Wuest, M., Wuest, F. Copper-Free Click Chemistry with the Short-Lived Positron Emitter Fluorine-18. Org. Biomol. Chem. 9, 7393-7399 (2011).
  14. Satpati, D., Bauer, N., Hausner, S. H., Sutcliffe, J. L. Synthesis of [64Cu]DOTA-ADIBON3-Ala-PEG28-A20FMDV2 via Copper-Free Click Chemistry for PET Imaging of Integrin αvβ6. J. Radioanal. Nucl. Chem. 302, 765-771 (2014).
  15. Lee, D. E., et al. Facile Method To Radiolabel Glycol Chitosan Nanoparticles with 64Cu via Copper-Free Click Chemistry for MicroPET Imaging. Mol. Pharmaceutics. 10, 2190-2198 (2013).
  16. Zeng, D. 64Cu Core-Labeled Nanoparticles with High Specific Activity via Metal-Free Click Chemistry. ACS Nano. 6, 5209-5219 (2012).
  17. Jeon, J., et al. Radiosynthesis and in vivo Evaluation of [125I]2-4(iodophenethyl)-2-Methylmalonic Acid as a Potential Radiotracer for Detection of Apoptosis. J. Radioanal. Nucl. Chem. 308, 23-29 (2016).
  18. Adam, M. J., Wilbur, D. S. Radiohalogens for Imaging and Therapy. Chem. Soc. Rev. 34, 153-163 (2005).
  19. Jeon, J., et al. Radiosynthesis of 123I-Labeld Hesperetin for Biodistribution Study of Orally Administered Hesperetin. J. Radioanal. Nucl. Chem. 306, 437-443 (2015).
  20. Kil, K. E., et al. Development of [123I]IPEB and [123I]IMPEB as SPECT Radioligands for Metabotropic Glutamate Receptor Subtype. ACS Med. Chem. Lett. 5, 652-656 (2014).
  21. Chen, M. K., et al. The Utility of I-123 Pretherapy Scan in I-131 Radioiodine Therapy for Thyroid Cancer. Thyroid. 22, 304-309 (2012).
  22. Jeon, J., et al. Efficient Method for Iodine Radioisotope Labeling of Cyclooctyne-Containing Molecules using Strain-Promoted Copper-Free Click Reaction. Bioorg. Med. Chem. 23, 3303-3308 (2015).
  23. Choi, M. H., et al. Synthesis and Evaluation of an 125I-Labeled Azide Prosthetic Group for Efficient and Bioorthogonal Radiolabeling of Cyclooctyne-Group Containing Molecules using Copper-Free Click Reaction. Bioorg. Med. Chem. Lett. 26, 875-878 (2016).
  24. Kim, Y. H., et al. Tumor Targeting and Imaging Using Cyclic RGD-PEGylated Gold Nanoparticle Probes with Directly Conjugated Iodine-125. Small. 7, 2052-2060 (2011).

Tags

Химия выпуск 116 радиоактивной радиоизотопные радиотрейсера радиоактивный йод реакция Bioorthogonal неомедненная реакции нажмите простетической группы азида наночастицы золота
Оптимизированного протокола для эффективного радиоактивной наночастиц золота с помощью<sup&gt; 125</sup&gt; I-меченый Azide простетической группы
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jeon, J., Shim, H. E., Mushtaq, S.,… More

Jeon, J., Shim, H. E., Mushtaq, S., Choi, M. H., Park, S. H., Choi, D. S., Jang, B. S. An Optimized Protocol for the Efficient Radiolabeling of Gold Nanoparticles by Using a 125I-labeled Azide Prosthetic Group. J. Vis. Exp. (116), e54759, doi:10.3791/54759 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter