Summary
125 I標識アジドの合成と銅のないクリック反応を用いて、dibenzocyclooctyne（DBCO） -基コンジュゲート、13-nmサイズの金ナノ粒子の放射性標識のための詳細な手順が記載されています。
Protocol
注意：放射性ヨウ素の酸化形態は非常に揮発性であり、十分なリードシールドとリードバイアルで処理する必要があります。すべての放射化学的手順は風通し木炭濾過フード内で行われるべきであり、実験手順は、放射能検出装置によって監視される必要があります。
125 I標識アジドの合成のための化学物質と逆相カートリッジの調製
- 溶液中の試薬の調製
- 150μlの無水エタノール中アジド前駆体（2）（ 図1）1mgを溶解させます。
注：アジド前駆体の詳細な合成手順は、（2）前報22で報告されました。 - 1×リン酸緩衝生理食塩水（pHは= 7.4）20μlに1mgのクロラミンTを溶解させます。
- 20μlのH 2 Oで2 mgのメタ重亜硫酸ナトリウムを溶解させます
- 150μlの無水エタノール中アジド前駆体（2）（ 図1）1mgを溶解させます。
- Preparaカートリッジの化
- 10ミリリットルのH 2 O、続いて10ミリリットル無水エタノールでTC18カートリッジを洗います空気とカートリッジのマトリックスを乾燥させないでください。
125 I標識アジド補欠分子族の2放射合成
- 前駆体の放射性ヨウ素化反応
- 1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブにアジド前駆体溶液（無水エタノールを150μl中1mg）および酢酸（10μl）を追加します。
- 反応混合物に0.1 MのNaOH（50μL）の[125 I]のNaI 150 MBqのを追加します。
- クロラミンT溶液（1×リン酸緩衝生理食塩水の20μlの中で1 mg）を加え、反応混合物を含むマイクロチューブを閉じます。
- 放射性ヨウ素化反応が完了するまで、15分間室温で反応混合物をインキュベートします。
- 反応混合物にメタ重亜硫酸ナトリウム溶液（20μlのH 2 O中の2 mg）を加えます放射性ヨウ素化反応を停止します。
- 粗生成物の0.2μLを撤回した後、溶液100μl（H 2 O / CH 3 CN、1：1）を用いて希釈し、HPLC分析のために。
注：すべてのHPLC実験のために、H 2 O（A溶媒）及び溶離剤としてアセトニトリル（溶媒B）を含有する0.1％ギ酸を含む0.1％ギ酸を使用します。 - 逆相分析用無線-HPLCを（逆相C18カラムを用いて希釈し、粗生成物を分析;流速：1ml /分;溶離剤勾配：0-2分20％溶媒Bのため20〜80％溶媒B 2-22分、22-23分80〜100％の溶媒B、および23から28分間、100％溶媒B;保持時間：16.4分）（ 図2）。
- 分取HPLCで粗生成物の精製
注：このような注入器、カラム、検出器、コレクションバイアル、および流出物は収集された容器としてHPLC部品の周囲に十分な鉛遮蔽を提供します。- 目を撤回HPLCバイアル中に反応混合物全体を電子。アセトニトリル（0.5ml）で反応管を洗浄し、同じ注射バイアルにリンスを追加します。 H 2 O（1mL）で回収した溶液を希釈します。
- 取ラジオ-HPLC（逆相C18カラムを上に、粗生成物を注入し、流速：10ml /分;溶離液勾配：0-2分20％溶媒B、2-22分間の百分の20から80溶媒B、 22-23分80〜100％の溶媒B、および23から28分間、100％溶媒B）。
- ガラス試験管において125 I標識アジド（1）（これらのHPLC条件下でのt Rは 17.8から18.8分である）（ 図2）を表す放射性ピークを集めます。
- 製造業者のプロトコルに従って放射能線量キャリブレータを使用して、画分の放射化学的収率を測定します。
- 生成物の放射化学的純度を決定するための同一のHPLC条件を使用して分析ラジオHPLCに精製された生成物を注入します。
- 製品の固相抽出
- 40ミリリットルで、所望の生成物（1）を含む画分を希釈し、純粋なH 2 O
- 予め調整TC18カートリッジに希釈した溶液を加えます。
- 追加の15ミリリットルのH 2 Oでカートリッジを洗浄
- 生成物を溶出（1）鉛シールドによって保護されている10-mlのガラスバイアルに2ミリリットルのアセトンでカートリッジ内に閉じ込められました。製造業者のプロトコルに従って放射能線量キャリブレータを用いて溶出し、製品の放射能を測定します。
注：ジメチルスルホキシド（DMSO）または無水エタノールは、また、カートリッジからの生成物の溶出のために使用することができます。放射能の約5〜10％、通常カートリッジに付着し、残りの放射性標識生成物が完全に有機溶媒の過剰量を用いて溶出することができません。 - 窒素またはアルゴンガスの流れでアセトンを蒸発させます。
- 再溶解させます次の放射性標識工程のためのDMSO（100〜200μl）を持つsidue。
DBCO-基結合金ナノ粒子の3合成
- DBCO基含有ポリエチレングリコールと13-nmサイズの金ナノ粒子の表面修飾
- 既報24に従って、クエン酸ナトリウム安定化金ナノ粒子（3）（平均サイズ= 13 nm）を準備します。
- （10 nMの15 ml）をクエン酸で安定化した金ナノ粒子にTween 20を（1mMの1.5 ml）の水溶液を加えます。オービタルシェーカー上で20分間この溶液を振ります。
- DBCO基含有ポリエチレングリコールチオール（平均分子量= 5,000、100μM1.5 ml）の水溶液を加えます。オービタルシェーカー上で2時間のためのソリューションを振ります。
- DBCO基変性金ナノ粒子の精製
- 精製DBCO基修飾金ナノ粒子（4）</連続的な遠心分離（11,400×gで、15分×3）によって>強いです。
- 上清を除去し、金ナノ粒子ペレットの再懸濁のための純水を追加します。
4.銅系クリック反応を介したDBCO基修飾金ナノ粒子の放射性標識
- 125 I標識アジドを使用して、125 I標識した金ナノ粒子の合成（1）
- 遠心分離（11,400×gで、15分）を使用してDBCO基修飾金ナノ粒子の濃縮液を用意し、2μMに金ナノ粒子の濃度を調整します。
- （2μM、50μL）（4）金ナノ粒子の懸濁液にDMSO（5μL）に（1）125 I標識アジドの4.1 MBqのを追加します。
- 60分間40℃で得られた反応混合物をインキュベートします。
- 粗生成物からのアリコート（0.2μl）を撤回し、シリカ共にそれを適用します薄層クロマトグラフィー（TLC）プレートated。
- 移動相として酢酸エチルを使用して、TLCプレートを開発。
- 製造業者のプロトコルに従って（ 図3）放射性TLCスキャナーでTLCプレートを配置し、放射性標識反応を監視するためのスキャナを実行します。
- 粗生成物の精製
- 遠心分離（11,400×gで15分間）によって125 I標識された金ナノ粒子（4）を含む反応混合物を精製します。
- 上清を除去し、金ナノ粒子ペレットの再懸濁のための純水を追加します。
- 精製された生成物からのアリコート（0.2μl）を撤回し、シリカ被覆TLCプレート上にそれを適用します。
- 移動相として酢酸エチルを使用して、TLCプレートを開発。
- 放射性TLCスキャナーでTLCプレートを配置し、125 I標識ゴルの放射化学的収率および放射化学的純度を決定するためのスキャナを実行製造業者のプロトコルに従ってDナノ粒子（4）（ 図3）。
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Representative Results
スタンニル化前駆体（2）の放射性ヨウ素化反応は、放射性標識生成物を提供するために15分間室温で[125 I] NaIを、酢酸、及びクロラミンTの150 MBqのを使用して実施した（1）。粗混合物を分取HPLC精製後、所望の生成物は、放射化学的収率の75±10％（N = 8）を得ました。分析用HPLCは、125 I標識産物の放射化学的純度は99％以上（ 図2）であり、生成物1の観察比放射能は40.7 MBqで/モルであることを明らかにしました。カートリッジを使用して精製された生成物を含む画分の固相抽出1のアセトン溶液を得ました。窒素またはアルゴンガス流を用いて、有機溶媒を蒸発させることができ、その後、残留物を次のSTEためにDMSO又は無水エタノールに再溶解することができますP。
ポリエチレングリコール修飾金ナノ粒子の125 I標識のための、DBCO基修飾金ナノ粒子は、図1に示した手順により調製した。DBCO基を有するポリエチレングリコールチオール（MW 5,000）の過剰量と反応させクエン酸、13 nmの金ナノ粒子を安定化させます。変性ステップの後、生成物をDBCO官能化金ナノ粒子（3）を得連続遠心分離により精製しました。放射性標識手順において、1の3.7 MBqの3の2μM（DBCO基〜400μM）に添加し、そして標識反応を1時間40℃で行いました。放射性TLC分析は、1以上の95％が60分以内にDBCO基官能化金ナノ粒子（3）と反応させたことを示しました。反応物を60分間行い、その後、粗生成物をPURありました遠心分離によってified。125 I標識した金ナノ粒子（4）> 99％で得られた（N = 4）無線TLC（ 図3）によって決定される放射化学的収率。
125 I標識アジド（1）および125 I標識した金ナノ粒子（4）の図1放射合成。試薬および条件：（a）[125 I] NaIを、酢酸、クロラミンT、RT、15分間、75±10％（N = 8）の放射化学的収率。 （B）DBCO-PEG-SH（MW 5,000）、H 2 O、RT、2時間。 〜40°C、60分、> 99％放射化学的収率。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
トン= "図2" SRC = "/ファイル/ ftp_upload / 54759 / 54759fig2.jpg" />
125 I標識アジド（1）の図2分析HPLCクロマトグラム。 （a）の粗生成物のラジオクロマトグラム。精製された生成物の（b）のラジオクロマトグラム。精製された生成物の（c）の UVクロマトグラム（254 nm）を。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図 125 I標識した金ナノ粒子の3ラジオTLCの結果（4）（4 = 0.05のF R 1 = 0.45、F R、溶離液：酢酸エチル）で60分反応後の（a）および（b）精製後。/ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54759/54759fig3large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
一般的に、精製された125 I標識アジド（1）の観察された放射化学収率は75±10％であった（n = 8）。放射性標識は、放射能の50から150 MBqので達成された、および放射化学的結果は非常に一貫しています。 [125 I] NaIを（T 1/2 = 59.4 d）の放射性ヨウ素化反応に使用した1ヶ月以上放射性崩壊を受け、1の放射化学的収率があることが観察された場合は、わずかに（53から65パーセント）減少しました。従って、[125 I] NaIを、それが生成されるとすぐに利用すること、または最適化された放射化学的収率を得るために実験室に送達されることが推奨されます。また、新たに調製したクロラミンT溶液は、所望の放射化学的収率を得るために、反応に使用されるべきです。
前駆体（2）は 、非常に疎水性であったため、150μlの無水エタノールは、1mgを溶解させるために追加する必要があります
溶離液の勾配; 10ml /分：0-10分間、100％の溶媒B、100 1を含む粗生成物を精製するための分取HPLCを使用する前に、逆相HPLCカラムは、溶媒AおよびB（流速で洗浄する必要があります10月25日分間-0％溶媒B、および0％溶媒B 25-30分間）は、システムから微量の不純物を除去しました。次に、逆相HPLCカラムを得るために少なくとも20分間、80％溶媒A中の20％の溶媒Bで平衡化され1の一貫性の保持時間。
精製された1を含む画分を固相抽出手順におけるH 2 Oの4倍以上の体積で希釈されるべきです。それ以外の場合は、精製された生成物の一部は、TC18カートリッジの中に閉じ込めすることはできません。アセトンがカートリッジから精製された1を溶出するために使用される場合、最終容量は、周囲温度で窒素またはアルゴンガス流でアセトンを蒸発させることによって低減することができます。
いくつかの放射性ヨウ素の中で、125 Iは、現在の研究に選択して使用しました。ヨウ素の放射性同位体の異なる種類の他の生物学的および医学的研究において、本発明の方法を用いて試験する必要がある（ 例えば、PETイメージングのための124 I、治療目的のために131 I）。
限り、我々は理解して、現在の放射性標識プロトコルは、詳細なsynthetiを記述する最初の報告であります放射性ヨウ素で標識されたアジド基のCステップ。最近、我々は異なる構造23を有する別のアジ補欠分子族を、公開されました。しかしながら、現在の方法では、放射性標識アジド（1）DBCO基含有分子と効率を放射標識の点で他よりわずかに良好な放射化学的な結果を提供しました。放射性ヨウ素の標識のための補欠分子族（ すなわち、N個のヒドロキシスクシンイミドおよびマレイミド）を既存のサイト特異性を提供することができませんでした。しかし、本方法は、優れたbioorthogonalityと一緒に簡単な放射性標識効率を示しています。アジド官能基は、生理学的条件下およびインビボ環境において非常に安定であることが知られているので、放射性標識生成物（1）は、 インビボ画像化研究に予め標的化に利用することができます。我々は、この方法が効率的に両方のin vitroおよびin vivoヨウ素の放射性同位体ラ内に適用されることを期待します緊張したシクロオクチン構造が含まれている生体分子とナノ材料のbeling。
1の比放射能に基づいて、125 Iおよび金ナノ粒子の計算されたモル比は約1：1で125 I標識した金ナノ粒子（4）ナノ材料の分子画像化および体内分布研究に使用することができます。現在の方法はまた、異なるサイズおよび金ナノ材料の形状の放射性ヨウ素標識に適用することができます。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chloramine T trihydrate | Sigma | 402869 | |
| [125I]NaI in aq. NaOH | Perkin-Elmer | NEZ033A010MC | |
| Sodium metabisulfite | Sigma | S9000 | |
| Formic acid | Sigma | 251364 | |
| Sep-Pak tC18 plus cartridge | Waters | WAT036800 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| Acetone | Sigma | 650501 | |
| Ethanol | Sigma | 459844 | |
| Gold(III) chloride trihydrate | Sigma | 520918 | |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | |
| DBCO PEG SH (MW 5,000) | NANOCS | PG2-DBTH-5k | |
| TLC silica gel 60 F254 | Merck | ||
| Analytical HPLC | Agilent | 1290 Infinity | Model number |
| Preparative HPLC | Agilent | 1260 Infinity | Model number |
| Analytical C18 reverse-phase column | Agilent | Zorbax Eclipse XDB-C18 | |
| Preparative C18 reverse-phase column | Agilent | PrepHT XDB-C18 | |
| Radio TLC scanner | Bioscan | AR-2000 | Model number |
| Radioisotope dose calibrator | Capintec, Inc | CRC -25R dose calibrator | Model number |
References
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