Hög genomströmning Upptäckt av luftvägspatogener i Animal Prover av nano PCR

Summary

Hög genomströmning testning av DNA och RNA baserade patogener av nano PCR beskrivs med en synd hund och häst andnings PCR panel.

Abstract

Nanoliterskala realtids-PCR använder spatial multiplexing så att flera analyser för att köras parallellt på en enda platta utan de typiska nackdelarna med att kombinera reaktioner tillsammans. Vi designade och utvärderade en panel baserad på denna princip att snabbt identifiera närvaron av vanliga smittämnen hos hundar och hästar med akut respiratorisk sjukdom. Detta manuskript beskriver en nanoskala diagnostisk PCR arbetsflöde för provberedning, förstärkning och analys av mål patogener sekvenser, med fokus på rutiner som skiljer sig från mikroliter skala reaktioner. I andnings panelen presenteras, har 18 analyser varje uppsättning i tre exemplar, som rymmer upp till 48 prover per platta. En universell extraktion och pre-förstärkning arbetsflöde var optimerad för hög genomströmning provberedning för att rymma flera matriser och DNA- och RNA-baserade patogener. Representativa data presenteras för en RNA-mål (influensa A matris) och en DNA-mål (häst-herpesvirus1). Förmågan att snabbt och noggrant testa en omfattande, syndrom-baserad grupp av patogener är ett värdefullt verktyg för att förbättra effektiviteten och ergonomi diagnostiska tester och för acute respiratory diagnos och sjukdomsbehandling.

Introduction

Med efterfrågan på snabb och omfattande upptäckt av flera agenter i klinisk diagnostik för människor och djur, en enda organism molecular diagnostiska metoder för detektion av patogener är betungande inte används för ett stort antal prover som testas för en enda sjukdom. Inom veterinär sammanhang, hög genomströmning diagnostiska metoder är särskilt viktig på grund av ytterligare behov för att täcka patogener från en mängd olika arter. OneHealth metoder för hantering av livsmedelsburna sjukdomar och nya övervakning patogen är exempel på testbehov som inkluderar ett antal bakterier, virus (DNA eller RNA-baserade), parasiter och svampar. Utmaningen att kombinera test för multipla analyter tillsammans (multiplexering) i syfte att förbättra testernas effektivitet är en möjlig förlust av känslighet och en stor börda för optimering och validering av analyser.

Nanoliterskala i realtid polymeraskedjereaktion (PCR) är ett alternativ till den praxis som multiplexering som tillåter många separata reaktioner kan köras samtidigt på samma prov ^1. Den OpenArray plattform är en tillämpning av denna princip ^två; den kombinerar microarray-teknik med realtids-PCR. Baserat på begreppet rymdmultiplexering, varje prov testades med avseende på ett stort antal mål i separat genomgående hål. Denna plattform användes ursprungligen med cyanin-baserade dubbelsträngade DNA-bindande kemi ² och är nu tillgänglig för sondbaserad kemi med hjälp av mörka kylnings sonder ^3. Denna plattform har främst använts för genetisk profilering hos människor ⁴ och djur ^5. Det har nyligen anpassats för att detektera blodburna DNA- och RNA-patogener genom Grigorenko et al. ⁶ med användning av en omvänd-transkription / pre-amplifiering förfarande i två steg (preamp).

Vi beskriver här en en-stegs-förförstärkare baserad procedur för att detektera båda typerna av patogener i andnings sekretions och en mängd andra provtyper som kan utföras helt i en vanlig arbetsdag. Vid slutförandet av ett steg förförstärkare, prover överfördes till en 384-brunnar, som är formatet accepterats av automatiserade vätskehanteringssystem som kommer med denna nano PCR plattform. Systemet drar huvudblandning och prov tvärs över ytan på upp till fyra plattor (192 prover och kontroller) i taget. Efter denna laddningsprocessen, beskriver vi hur prover förstärks och analyseras med hjälp av ett makro kalkylblad som sammanfattar genomsnitt 3 tekniska replikat för varje prov / mål kombination i en tabell som passar på en sida.

En enhetlig metod för analys av extraherat DNA och / eller RNA från prover med användning av denna plattform etablerades. Ett stort antal olika prover extraherades, transkriberades omvänt, och pre-amplifierades i en 96-brunnsformat, vilket minimerar risken för fel. Respiratoriska prover testade ingår nasala svabbar, djupa svalg kompresser,trans-luftrör tvättar, lungsköljning och lungvävnad. Eftersom en del av de testade kan även vara närvarande i perifert blod eller avföring medel, inkorporeras vi dessa typer av prov in i förfarandet. Denna strömlinjeformade arbetsflöde hjälper till att spara tid och resurser jämfört med att köra experiment i flera plattor genom att möjliggöra effektiv testning genom panelbaserade patogen och toxin-gen upptäckt i stället för individuell prövning. Andnings panel visat här hade 18 analyser varje utskriven trefaldigt genomgående hål, som rymmer upp till 48 prover per platta. Häst patogener upptäckta ingår häst adenovirus 1 och 2, häst arterit virus, häst rinit virus A och B, häst-herpesvirus (EHV) typ 1 och 4, och Streptococcus equi. Hundens patogener ingår hund andningscorona (betacoronavirus), valpsjukevirus, hund adenovirus, hundparainfluensavirus, hund pneumovirus, Bordetella bronchiseptica och Mycoplasma cynos. enuniversellt influensa A-analys och en intern kontroll (MS2 RNA-fag) ingick också.

Protocol

Inga försökspersoner eller försöksdjur användes för utveckling av detta protokoll. Kontroller genererades genom rening av sekvens bekräftade amplikoner och in vitro transkription för RNA-mål. Kliniska prover lämnades in för rutinmässig diagnostisk testning till Cornell Animal Health Diagnostic Center.

1. Plate Design

1. Använd primer design mjukvara för att verifiera att varje analys överensstämmer med standardsondbaserad realtids-PCR cykelbetingelser med 60 ° C hybridisering med hjälp av primer sondtestverktyget (välj kvantifieringen sonden miljö med standardparametrar).
   OBS: Den representativa RNA-mål användes anpassades från den universella influensa A matris riktad analys publicerad av Shu et al ^7.. Primers och prob är som följer: Framåt primer: GACCRATCCTGTCACCTCTGAC, Reverse Primer: AGGGCATTYTGGACAAAKCGTCTA, Sond: Fam-TGCAGTCCTCGCTCACTGGGCACG-QSY. Den representativa DNA-analysen används här anpassades tillbakam häst herpesvirus typ 1 (EHV-1) detekteringsmetod publicerad av Elia et al. ^8. Primers och prob är som följer: Framåt primer: GCTCTCAGGTTTTACGACATC, Reverse Primer: CTTTACCCAGGCCCTTGAAA, Sond: FAM-TCAACGTGGACAATACCGCAGTGATTAT-QSY.
2. Beställa nanoskala PCR-amplifiering plattor i den önskade konfigurationen.
   OBS: För denna studie var 18x3 genuttryck format som används (Tabell 1). Tillhandahålla sekvenser för alla primrar och prober (eller inventeras analys ID: n) för varje mål till tillverkaren.

2. Nukleinsyra Extraction

1. Extrahera total nukleinsyra (DNA och RNA) av vilken önskad metod.
   OBS: En automatiserad magnetisk pärla baserade utvinning kit användes här i enlighet med tillverkarens instruktioner (se materialtabellen för mer information).
2. Framställning av prover på följande sätt:
   1. Rengör utsidan av varje provbehållare med 10% blekmedel och torka ordentligt. Torka gloved fInger tips med 10% blekmedel mellan prover för att förhindra korskontaminering.
   2. Plats nasal eller djupa svalgpinnar i någon steril, förseglad medicinflaska (t.ex. en röd topp bloduppsamlingsröret) med några droppar saltlösning tillsattes för att förhindra uttorkning före bearbetning.
      OBS: Bomull, plast, trä handtag, och Dacron och andra syntetiska kompresser är alla acceptabla, men undvika kalciumalginat kompresser.
   3. För bomullstoppar och trakeala tvättar, tillsätt Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM), så att det finns minst 1-2 ml vätska. Vortex pinnen och DMEM kraftigt i röret. Använd sedan en pipett för att överföra cirka 1 ml av media till ett nytt rör.
   4. Mekaniskt lysera vävnader (100-200 mg i 1 ml DMEM) med användning av en vävnads disruptor enligt tillverkarens instruktioner, följt av centrifugering under 3 min vid 825 x g. Överlåta 500 pl av supernatanten till ett nytt rör.
   5. För avföring, kombinera 400 mg avföring med 800 pl 1 x fosfatbuffrad salinje pH 7,4 (PBS). Virvel suspensionen under 1 minut eller längre tills provet homogeniseras eller helt avbrytas. Gång homogeniserad, centrifugera suspensionen under 10 min vid 18000 xg, sedan överföra 400 fil till ett nytt rör.
   6. För hela okoagulerat blod, virvel provet och göra en 250 ul alikvot. Lägg sex droppar lytisk reagens och skaka för att blanda. Inkubera 15 min vid 37 ° C.
3. Förbered lys och tvättbuffertar enligt tillverkarens anvisningar. Lägg MS2-fag eller en intern kontroll av val till lysbuffert som en intern positiv extraktion kontroll ^9.
4. Lägg 235 pl lysbuffert och 175 pl prov (eller PBS för negativ kontroll) till varje pärla röret. Fortsätta med tillverkarens protokoll.
   OBS: Renat total nukleinsyra eluerades här i 90 pl.

3. Omvänd transkription / Pre-förstärkning (preamp)

OBS: Se till att alla reagenser och prover som används iförförstärkaren reaktionen på is vid alla tidpunkter. Efter preamp, hålla alla reagenser vid rumstemperatur.

1. Montera eluerade DNA och / eller RNA, PCR-reaktionsblandningen, nukleasfritt vatten som negativ kontroll, och poolade standarder för positiv förstärkning kontroll.
   OBS: Upp till 48 prover kan köras på en förstärkningsplatta inklusive kontroller (åtminstone en negativ extraktion kontroll för varje extraktion platta från vilka proverna dras).
2. Skriv ut en provkarta. Har en andra person kontrollera att kartan och prov layout match.
3. I en 1,5 ml rör, lägg till följande för att förbereda preamp Master Mix.
   ANMÄRKNING: En slutlig volym av 14 | j, l användes här.
   1. Lägga till en pool av förblandade primrar från varje mål, så att den slutliga koncentrationen av varje primer är 900 nM.
      OBS: Poolen används här framställdes vid en 10x koncentration, och 1,4 pl tillsattes per reaktion.
   2. Lägg slumpmässiga primrar till en slutlig koncentration av 600 nM eller 0,1 x. Lägg till 2x RT-qPCR blanda hälften av den slutliga volymen (7 pl här).
   3. Blanda Master Mix komponenterna tillsammans genom att försiktigt vortexa och spinning ner.
4. Utför förförstärkaren i en standard 96-brunnars platta med användning av den vänstra sidan av plattan endast (kolumnerna 1-6).
5. Lägg 8,5 pl preamp huvudblandning och 5,5 pl DNA / RNA-prov till varje brunn.
6. Efter att kombinera alla reagenser (prover, positiva kontroller och negativa kontroller med Preamp mix), grundligt täta standard 96-brunnar med en tydlig självhäftande försegling. Ta bort överflödigt tätningen med ett rakblad för att förhindra bildningen av tätnings luckor under cykling. Centrifugera den förseglade plattan under 20 sek med användning av en PCR-plattan spinner. Kontrollera för att se till alla reagens kombineras i botten av plattbrunnarna.
7. Kör preamp analys på en konventionell termo under följande villkor: 15 minuter vid 50 ° C; 1 min vid 95 ° C; 20 cykler av 15 sek vid 95 ° C, därefter 2 minuter vid 60 ° C; 99,9 & #176; C under 10 min; håll vid 4 ° C. Program dessa villkor före start.
8. Slå på konventionella termo väljer förförstärkaren cykelprogram och starta programmet. Placera 96-brunnar i termocykler endast när den nedre delen av den termocykler (ej locket) når den temperatur som krävs för cDNA produktion (50 ° C) genom att övervaka temperaturen läsning på skärmen. Före detta, hålla plattan kallt för att minimera risken av att producera falska positiva resultat.
9. När preamp körningen är klar, kontrollera att plattan har förblev förseglade.
10. Fortsätt omedelbart till steg 4,1. För att lagra denna platta över natten, utför utspädningen som beskrivs i steg 4,2 till 4,5, utom i stället för löst täcka plattan, försegla plattan med en tydlig självhäftande försegling och plats i en blixtlås lock påse, lagras vid 4 ° C.

4. Spädning av Preamp Plate

1. Ta bort lämpligt antal förstärkningsplattor tillbakam frysen (upp till 4 kan köras på en gång). Inte öppna förpackningen. Låt plattan värmas upp under minst 15 min vid rumstemperatur. Anteckna serienumret och partinummer av plattan.
   OBS: Oöppnade plattor kan förvaras i rumstemperatur i upp till 24 timmar, men för bästa praxis, ta bort dessa från frysen högst 30 minuter innan det behövs.
2. Centrifugera avslutade preamp plattan för 20 sekunder med hjälp av PCR-plattan spinner. Slå på förstärknings maskinen och datorn och starta det associerade programmet.
3. Ta bort alla onödiga objekt från en PCR-installationsområdet. Sätt på dubbla handskar och ärm omslag.
4. Avlägsna förseglingen från förförstärkaren plattan och försiktigt bort och kassera de yttre handskar. Späd förstegs produkterna vid 1: 5 genom tillsats av 56 | il av TE-buffert till varje brunn i kolumnerna 1-6 i 96-brunnars preamp platta och blandning genom pipettering upp och ned. Gå bara till det första stoppet av pipetten, aspire från botten och dispense högre upp men inte skapabubblor. Lägg TE-buffert till alla 6 kolumner oavsett oanvända brunnar.
5. Återförslut plattan med antingen en klar bindemedel eller folietätning, och centrifugera den för 20 sek med användning av PCR-plattan spinnaren. Ställ in den här plattan åt sidan (löst täckt) tills steg 6,1 är klar. Kasta återstående handskar och ärm omslag.

5. Beredning för 384 brunnar Transfer till Amplification Plate

1. Ställ upp material som behövs för att täcka och täta förstärkningsplattan: lock, plugg, spruta med nedsänkning vätska, plattpress, etanol sprutflaska, och luddfritt laboratorie våtservetter. Avlägsna sprutan locket och låsa en liten plastspets på sprutan (kräver kraft). Mata ut en liten mängd av immersionsvätska på en pappershandduk för att avlägsna luft uppbyggd (det är ok om några små luftbubblor kvar i tips). Använd immersionsvätskan inom 60 minuter för att ta bort sprutan från vakuum förseglade aluminiumpåse. När en spruta har öppnats, inte sätta tillbaka lock för senare användning.
2. Kolla uppatt papperskorgen av plattan lastvätske handler är tom och öppna lådan tips. Skriv datum för tips på spetsen lådans lock när en ny ruta öppnas utgången, och se till att tips inte löpt ut. Slå på vätskehanteraren och dator och öppna vätskehanteraren programvara, som kommer att utföra en självtest.
3. Klicka på "Inställningar och Load". Klicka på "Bläddra" för att välja CSV-fil som skapats från prov Tracker. Om filen inte visas, gå till "Instrument / Redigera inställningar" och klicka sedan på "Change" av "Sample Plate Filmapp". Välj den mapp där csv-fil sparas. Klicka sedan på "Setup och Load", sedan "Bläddra" och välj filen.
4. Klicka sedan på "Bläddra" bredvid "Hållare Position 1" och välj TPF-filen (tillhandahålls av tillverkaren) som har samma serienummer som plattan.

6. Flytande Handler Transfer

Obs: Starta inte fifyllning av en 384-brunnar tills alla ovanstående steg är slutförda. Avdunstning är ett bekymmer med små volymer - låt inte 384-brunnar sitta avtäckt med vätska inuti.

1. När alla ovanstående steg är klara sätta på nya, väl utrustade dubbla handskar och hylsan täcker. Lägg sedan till 2,5 l förstärknings Master Mix till en 384-brunnar.
2. Överföra 2,5 pl av spädd preamp produkten till 384-brunnsplatta enligt kartan i tabell 2 och omedelbart täcka plattan tätt med en folietätning. Kasta yttre handskar och ärm omslag.
3. Centrifugera 384-brunnsplatta under 20 s i PCR-plattan spinnaren.
4. Ta inte bort folietätningen, men placera 384-brunnar i vätske föraren.
5. Öppna paketet innehåller en inkapslad förstärkningsplatta och placera den försiktigt i flytande hanterare i första spåret med serienumret till höger - håll fallet i kanterna utan att vidröra ytan of plattan. Använd oöppnade plattor inom en timme efter öppning.
   Obs: Syftet med målet är att skydda plattan från beröring, eftersom detta skulle kunna störa de små mängderna av primers och prober i de genomgående hålen.
6. Ta bort folielocket från 384-brunnar inne i flytande hanterare när allt är på plats. Klicka på Nästa och sedan kontrollera alla rutor som varje steg är klar. Klicka på OK för att starta körningen.
7. Stänga dörren för vätskehanteraren och omedelbart börja fyllningsprocessen. Håll bredvid vätske handler och omedelbart gå vidare till nästa steg när plattan är fylld.
8. Medan vätskan föraren körs bort skyddsfilmen från botten av ett ärende lock.
   OBS: Limmet på botten av lådans lock är täckt av ett rött band och en skyddsfilm. Filmen måste tas bort först för att komma åt byråkrati.
   1. Låt toppfilmen på plats tills steg 6,15. Prime byråkratin genom att dra något till release den från bindemedlet.
9. Ta den laddade (fylld) förstärkningsplattan från flytande hanterare och försiktigt placera den i plåtpress med serienumret till höger.
10. Placera locket på toppen av plattan med den spårade änden på höger och adhesiv på botten (som pekar mot plattan).
11. Dra ner på plattan pressarmen noggrant stänga den; ljuset blinkar under 20 sekunder. Rör inte plåtpress under denna tid. När lampan lyser med fast grönt sken, lyft upp spaken noggrant och försiktigt bort den förseglade plattan genom att hålla den på kanterna.
12. Håll den förseglade förstärkningsplattan vertikalt av kanterna på målet, omedelbart sätta in sprutspetsen i lastningshamnen i slutet av fallet, dosera nedsänkning vätska långsamt i en mild kontinuerlig rörelse för att fylla utrymmet mellan plattan och lock. Lämna en liten luftbubbla i hörnet när plattan är nedsänkt.
13. Samtidigt som man fortsätter att hgamla plattan vertikalt i kanterna, försegla lastningshamnen genom att sätta in kontakten i porten och vrida kontakten medurs, applicera tillräckligt tryck tills handtaget bryts av. Grepp kanterna på fallet ordentligt så att kraften av handtaget brytning orsakar inte fallet att släppa. Om en platta tappas, kassera den.
14. Rengör fallet med en luddfri torka som har noggrant besprutas med etanol. Att torka fallet torka fallet nedåt med en ren torka. hantera fallet försiktigt; vara noga med att inte utöva påtryckningar på glaset ovanför brunnarna.
15. Bringa den förseglade plattan till amplifiering maskinen. Under "Instrument", välj "Instrument Console." Välj förstärknings maskinen och klicka på "Open Door" -knappen.
16. Placera förstärkningsplåten i första spåret på plattan adaptern, kontrollera att adaptern är korrekt uppradade med A1 i övre vänstra hörnet. Orientera plattan med streckkoden uppåt och motframsidan av instrumentet. Klicka på "Stäng dörren" -knappen. Observera användningen av adaptern facket - det finns en gräns på 10 användningsområden.
17. Under fliken Hem längst ned på skärmen, under Kör-menyn, välj OpenArray. Klicka på "Hämta Plate ID." De tomma rutorna fylls i automatiskt med information om plattan. Till att börja körningen, klicka på "Start Run".
18. Stäng vätskehanteringsprogram och stänga av vätske föraren. Placera spetsen täcka över spetsen rack. Kasta tips från avfallsbehållaren och rengör den. Ren och sanera alla poster inklusive arbetsytan, pipett avfallshinken och tips lådor.
19. Täta preamp plattan med en tydlig självhäftande försegling och förvara vid -20 ° C.

7. Resultatanalys

1. När körningen är klar, spara filen och klicka sedan på "X" på fliken med körningen namnet längst ned på skärmen för att avsluta ärendet.
2. Klicka på "Open Door"Längst upp på skärmen för att öppna dörren. Avlägsna förstärkningsplåten, kontrollera att ingen nedsänkning vätska har läckt ut. Klicka på" Stäng dörren "längst upp på skärmen för att stänga dörren.
3. Klicka på "Öppna" och välj kör filen för att öppna den. Tryck på den gröna Analysera knappen längst upp till höger på skärmen. Klicka på "Export" på vänster sida av skärmen och sedan "Start Export" för att exportera resultatet (som en txt-fil). Minimera filen efter den öppnas. Klicka sedan på "Export QC bilder."
4. Granska QC bilderna i bildanalysprogram i enlighet med följande kriterier:
   1. Utvärdera laddningskvalitet med hjälp PRE-READ_CHANNEL_4.tiff och POST-READ_CHANNEL_4.tiff, genom att kontrollera att det inte finns några mörka fläckar eller fläckar.
      OBS: Ett färgämne detekteras genom denna kanal läggs till av tillverkaren till de primrar och prober, som frigörs i lösning när reaktionen är laddad. Läsningen i denna kanal visar att reaktionerna var korrektladdad och att primers och sond blandas med färg var närvarande.
   2. Kontrollera om läckage eller agitation till plattan efter lastning med S02_C001_t03_p001_m1_x2_e1_cp # _spotfind.tiff. Om bilden ser mörk, öka ljusstyrkan (tryck på Ctrl + Skift + C för att öppna kontroller) tills hela plattan är synlig. Kontrollera att bilden ser uniform utan skuggor, bubblor, eller fördrivna prover.
   3. Utvärdera locket placering och skräp under locket (ljuspunkter) med hjälp av STAGE2_CYCLE1_CHANNEL_1.tiff och STAGE2_CYCLE40_CHANNEL_1.tiff.
5. Valfritt: Öppna ett kalkylblad med resultaten Macro (Supplemental kodfil). I den exporterade datafilen, högerklicka på fliken längst ned på skärmen och välj "Flytta eller kopiera". I "boka" -fältet, välj "Resultat Macro.xlsm". Klicka på "Flytta till slut" och markera rutan "Skapa kopia". Sedan klickar du på OK.
   1. Om resultaten Macro alternativet inte visas i "boka" -fältet, simply kopiera innehållet i den exporterade datafilen kalkylblad (klicka på övre vänstra cellen för att markera alla celler och Ctrl-C) och klistra in den i en ny flik.
6. Ta bort den gamla "Export" -fliken och sedan byta namn på nytillkomna fliken som "Export".
7. Klicka på "Alt-F8" (eller klicka på Visa sedan Makron) välj sedan "Macro" och klicka på "Kör". Upprepa sedan detta för Makro2 genom att klicka på "Alt-F8" sedan välja "Makro2" och klicka på "Kör".
8. Byt namn resultat Makro-fil med relevant information (datum och serienummer), sätta denna information över bordet, och spara som samma filnamn i exporterade Resultat mappen. Slutligen, skriva ut makro gett resultat tabellen.
9. I förstärknings maskinens programvara, kontrollera kurvorna för varje prov och kontroll mot makro tabellen genom att välja Analys / Amplification Plot på vänster sida av skärmen. Sedan väljer du fliken Sample, och klicka på varje provbekräfta att det finns 2 eller 3 positiva förstärkningskurvor för var och en av de positiva resultaten i tabellen.
10. Stänga av amplifiering maskinen.

Representative Results

Resultaten visas i figur 1 och 2 för en representativ RNA-analys (matris influensa) och DNA-analys (EHV-1) med en kombination av positiva kontroller och kliniska prover som lämnats in för rutinmässig diagnostisk testning. De fluorescenssignaler som sänds ut i hela denna typisk reaktion visas i fig 1, som plottar råa fluorescensvärden per cykel. Alla relativ cykeltröskel (CT) värden genereras automatiskt av förstärknings maskinens programvara. Bakgrundsfluorescens användes som ett separat mått för bedömning av last kvalitet snarare än att införliva den i fluorescens avläsningar före beräkning Ct-värden.

Den analytiska detektionsgränsen (LOD) för varje mål beräknades baserat på det totala medelvärdet av de Ct-värden vid detekteringsnivån den 95% plus 2 standardavvikelser i en pool av kontroller föralla mål. Den högsta utspädningen där åtminstone 95% av replikaten positiva för de representativa analyserna var 50 kopior; detektering av 5 kopior var framgångsrik i 50% av replikat. Varken analysen upptäcktes vid under en kopia. De bestämningsgränser för RNA och DNA-analys beräknades på Ct-värden av 21,92 och 20,05. Dessa värden ansågs vara cutoffs för rapportering av värden som positiva kontra misstänkt (potentiellt inte repeterbara).

Andra aspekter av analytisk prestanda av målen bedömdes med användning serieutspädningar av poolade positiva kontroller körs på tre olika dagar (figur 2). De genomsnittliga effektiviteten hos de representativa RNA och DNA-analyser var 101,1% och 106,6%; Den genomsnittliga verkningsgraden för alla mål var 101,3%. Analyserna hade också god linjäritet ^(R2> 0,98). Variation inom replikat genomgående hål typiskt var inom standardavvikelser från 0,2 för både kliniska prover end kontroller. Ingen korsreaktivitet mellan någon av målen observerades.

De slutliga resultaten kalkylblad i tilläggsfilen visar representativa kvantitativa resultat för 10 kliniska diagnostiska prov och 4 kontroller. De kliniska prover är en delmängd av de typer av prov rutinmässigt testades inklusive nasal / svalg, lungvävnad, och avföringsprov. En (häst) avföringsprov i denna uppsättning visar en misslyckad MS2 intern kontroll, vilket indikerar närvaron av hämmare i provet. Detta är typiskt hanteras genom utspädning av det eluerade provet och / eller åter extraktion. Vilket är fallet här, bör den negativa förstärkningskontroll vara negativt för alla mål, och den negativa utvinning kontroll ska endast innehålla den interna kontrollen. I den kliniska uppsättningen prover producerade Ct-värden för betacoronavirus, Bordetella bronchiseptica, valpsjukevirus A, hundparainfluensavirus, hund pneumovirus och influensaEN.

Figur 1. Förstärknings tomter. Fluorescensavläsningar plottas mot förstärkningscykler för RNA-analys (A) och DNA-analys (B). Trianglar visas betecknar Ct-värden. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2. Standardkurvor. Standardkurvor från RNA och DNA-analys testades på tre olika dagar är plottade i syfte att visa den linjäritet och intervallet amplifiering med användning av positiva kontroller. Cykel tröskel (Ct) värden plottas mot log (10) av antalet kopior av RNA (A) eller DNA ( Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Tabell 1. Schematisk av förstärkningen plattan och målplatser. Plattorna som används för nanoskala realtids-PCR-testning på denna plattform är objektglas stora och är arrangerade i 48 subsystem av 64 genomgående hål, med totalt 3072 genomgående hål för individuella reaktioner. En undergrupp visas här, med 18 mål i tre exemplar. Varje prov tillsätts till en subanordningen genom vätskehanteraren. Plattor beläggs med hydrofila och hydrofoba föreningar för att hålla kvar reagens i genomgående hål via ytspänning. Chipet rostfritt stål "fotolitografiskt mönstrade och våt-etsad för att bilda en rätlinjig matris av 3072 mikro-maskinbearbetade, 320 um diamete. r hål av 33 nl varje ^"2 Förkortningar för mål är följande: BCOR, hund andningscorona (betacoronavirus), BORD, Bordetella bronchiseptica CAV, hund adenovirus, CPIV, hundparainfluensavirus, CPNV, hund pneumovirus, Dista / B, hund distempervirus A och B; EADV1 / 2, equine adenovirus 02/01; EAV, equine arteritis virus; EHV1 / 4, ekvint herpesvirus typ 04/01; Erva / B, equine rinit virus A / B; IVM, influensa A matris; MCYNOS, Mycoplasma cynos, MS2, intern kontroll (MS2 RNA-fag), SEQU, Streptococcus equi.

Tabell 2. Plate överförings karta. En färgkodade plattöverförings karta för att använda en fast 8-kanals pipett för att överföra från 96 brunnar preamp plattan till 384-brunnar visas. Alternativt kan en justerbar pipett användas. Samma procedur utförs varje gång oberoende av h ow många prover är i plattan.

Kompletterande fil. En makroaktiverad kalkylbladsfil innehåller två makron för formatering resultat i en översiktstabell (som beskrivs i protokollet) tillhandahålls. Ett typiskt resultattabellen genereras av makron ingår i filen (under slutresultat). De två makron kommer att fylla i provnamnen i första kolumnen (upp till 48 prover) och genomsnittet av de tre Ct-värdena för varje mål för dem med positiva resultat; Observera att mål som inte förstärker verkar tom i denna tabell. Detta kan enkelt skrivas ut på ett pappersark och används som en referens för kontroll av rådata effektivt. På fliken slutresultaten är representativa resultat för 10 kliniska prover och 4 kontroller visas. Förkortningar för analys namnges i legenden i tabell 1.www.jove.com/files/ftp_upload/54781/supplemental_code_file_R1.xlsm "target =" _ blank "> Klicka här för att ladda ner filen.

Discussion

Detta förfarande har använts för rutintestning av respiratoriska patogener i vårt laboratorium under loppet av sex månader (2-3 gånger per vecka). Vi har också haft framgång med hjälp av samma procedur för enter patogen profilering i avföringsprov och bakterieisolat på en separat anpassad platta. När plattorna tillverkas, kan erfaren personal slutföra steg 2-7 i en standard arbetsdag. De mest kritiska stegen är korrekt tätning av förförstärkaren plattan, överföring av förförstärkta proverna mellan plattor (som måste göras snabbt för att förhindra avdunstning), och sluttäckning av förstärkningen plattan. Användning av makro kalkylblad som en guide för resultatanalys (kontroll kurvor för prover och kontroller) var också kritisk eftersom det kraftigt minskade tid och pappersarbete som krävs för denna process. Den angivna makro kalkylblad är ett exempel; det skulle behöva ändras eller återskapas för plattor med olika konfigurationer. Detta kan lätt bli performed av någon med grundläggande kalkyl kunskap.

På grund av den mycket lilla mängden av provet laddades på förstärkningsplattan (33 nl), är pre-amplifiering erfordras. I optimeringen av detta protokoll (icke visad), jämförde vi ett antal förförstärkning parametrar inklusive master mix, tillsats av slumpmässiga primrar, antal cykler, glödgningstid, och spädning före amplifiering. Varje mål hade sina egna optimala förhållanden, och de som beskrivs här representerar de som gav den bästa detektionsgränsen övergripande för vår panel. Denna panel täcker ett brett spektrum av patogena mål och provtyper som påträffas i rutin veterinär diagnostisk testning, men modifieringar av förförstärkning procedurer kan vara nödvändiga för olika paneler. Tillverkaren optimerade amplifieringsbetingelser är baserade på en standardsondbaserad realtids-PCR-protokoll med en 10 min vid 95 ° C enzymaktivering, följt av denaturering vid 95 ° C och annEaling / förlängning vid 60 ° C. Primrarna och prober är förtryckta på plattorna också använder tillverkarens-optimerade betingelser och därför inte kräver titrering. Kombinera de omvända-transkriptions- och pre-amplifieringsstegen för alla prover (oberoende av vilken typ av mål) var nödvändigt för att bibehålla effektivitet i arbetsflödet. Med alla prover transkriberades omvänt är också fördelaktigt för att maximera känsligheten. Vidare användning av en huvudblandning för förförstärkaren som är optimerad för att minimera hämmare tillåter mångsidighet i att kombinera olika provtyper på samma platta.

Den Center for Disease Control (CDC) influensamatris analysen beskriven av et al. Shu ⁷ och anpassas här för nanoliterskala reaktioner är ett universellt influensa A analys som är lämplig för testning av prover från människor och sällskapsdjur. Den var avsedd för universell detektering av matrisen genen av alla influensa A-virus med hjälp av mikroliter skala reaTGÄRDER. Det har använts runt om i världen som en del av en CDC Human influensavirus panelen och en CDC svininfluensa Panelen. EHV-1-analys ⁸ anpassas här upptäcker en viktig andnings patogen av hästar som kan orsaka aborter och neurologiska sjukdomar (granskats av Pusterla och Hussey ^10). Betydelsen av anpassning av dessa tester för att en hög genomströmning plattform med en art-oberoende intern kontroll är att de kan ingå i ett OneHealth övervakning tillvägagångssätt. Med båda dessa analyser på en hög genomströmning testning plattform underlättar beredskap för kliniska faciliteter, vindskydd och prestanda händelser.

De ovan beskrivna resultaten var representativa för alla målen på plattan med undantag av Mycoplasma cynos, som visade betydligt mer variation i analytisk prestanda. Detta var troligen på grund av den sub-optimala smälttemperaturen _(Tm) av primrarna, som i idealfallet bör vara 58-60 &# 176; C (den ideala sonden Tm är 68-70 ° C). En begränsning av denna plattform är att det tar längre tid att konstruera och tillverka plattorna än för beställning individuella prober, vilket begränsar möjligheten att snabbt ändra sekvenser. En annan begränsning av realtids-PCR i allmänhet är oförmågan att detektera nya eller oväntade patogener. Detta kan övervinnas i viss utsträckning genom att utforma analyser som matchar sekvenser i flera arter, men objektiva hela genomet sekvensebaserade metoder är mer lämpade för upptäckten av nya medel. ^11,12

Nanoskala realtids-PCR tillåter ett nytt paradigm för syndrom baserade snarare än arter baserad testning, vilket är användbart för att minska reagens och lönekostnader i hög genomströmning molekylär diagnostik. Storskalig panel testning med denna metod kan underlätta OneHealth övervakningsinsatser såsom de som beskrivs av Dunne och Gurfield ¹³ och Moutailler et al. ^14. Insamling av pinnprov tidigt,i allmänhet inom 3 dagar kliniska utbrott, ger den bästa möjligheten att identifiera närvaron av luftvägspatogener. Infectious sjukdom uppkomst är ofta oförutsägbara, och tester som kan utföras på olika arter utan behov av modifiering av reagens är idealiska för beredskap. Framtida tillämpningar av denna teknik kommer sannolikt att vara i pathotyping, antibiotikaresistens profilering, och ytterligare syndrom baserade kliniska diagnostiska paneler. Nanoskala realtids-PCR är mest användbar för snabb, high-throughput screening av flera prov och patogena typer och skulle kompletteras med objektiva eller delvis förspända sekvensbaserade metoder för att identifiera nya och framväxande patogener.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zap-OGlobin II lytic reagent	Beckman Coulter	7546138	Optional reagent for preparing blood samples.
Extraction kit (MagMAX Total Nucleic Acid Isolation Kit)	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	AM1840	Other extraction kits appropriate for the desired sample types may be substituted. This kit comes with PBS, lysis buffer, and wash buffer.
2x One-Step RT-qPCR mix (qScript XLT One-Step RT-qPCR ToughMix)	Quanta Biosciences	95134-500
Gene-specific primer pool	IDT	custom order	Can be generated by the user or purchased with the amplification plates.
Random primer mix	New England Biolabs	S1330S
Standard 96-well plate	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	N8010560	This can be any plate that fits into the conventional PCR machine used.
Amplification master mix (OpenArray master mix)	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4462164
Clear adhesive seal	Thermo-Fisher	430611
Foil seal	Excel Scientific	AF-100
384-well plate	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4482221
Amplification plate (QuantStudio 12K Flex OpenArray plate)	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4470813	Can be customized with any assays conforming to standard TaqMan conditions.
Accessories kit	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4469576	Contains the case lids, plugs, and immersion fluid.
AccuFill tips	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4457246
Amplification machine (QuantStudio 12K Flex Real-Time PCR System)	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4471090
Liquid handler (OpenArray AccuFill System)	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4457243	This is purchased with the amplification machine.
Primer design software (Primer Express)	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4363991	See manufacturer's instructions for detailed primer and probe specifications.
Image analysis program (ImageJ)	NIH		Available at http://imagej.nih.gov/ij/
Spreadsheet program (Excel)	Microsoft		Available at https://products.office.com/en-us/excel
DMEM	Thermo-Fisher/Gibco	11965-092
Tissue disruptor (TissueLyser II)	Qiagen	85300
Conventional thermal cycler (Veriti)	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4375786	Any conventional thermal cycler with a heated lid can be used.
PCR plate spinner	VWR	89184-608	This device has only one speed (2,500 rpm); the rotor starts when the lid is closed and stops when the button is pushed.
TE buffer	Millipore	8890-100ML	10 mM Tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride, 1 mM Ethylenediaminetetraacetic acid, pH 8.0