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Immunology and Infection

नेनो पीसीआर द्वारा पशु नमूनों में श्वसन रोगज़नक़ों के उच्च throughput जांच

Published: November 28, 2016 doi: 10.3791/54781
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Population Medicine and Diagnostic Sciences, Cornell University Animal Health Diagnostic Center, 2Thermo Fisher Scientific Inc.

Summary

nanoscale पीसीआर द्वारा डीएनए और आरएनए आधारित रोगाणुओं की उच्च throughput परीक्षण एक स्यन्द्रोमिक कुत्ते और घोड़े सांस की पीसीआर पैनल का उपयोग वर्णित है।

Abstract

Nanoliter पैमाने वास्तविक समय पीसीआर कई assays प्रतिक्रियाओं के साथ संयोजन के विशिष्ट कमियां के बिना एक ही थाली पर समानांतर में चलाने के लिए अनुमति देने के लिए स्थानिक बहुसंकेतन उपयोग करता है। हम डिजाइन और एक पैनल इस सिद्धांत के आधार पर तेजी से कुत्तों और तीव्र श्वसन बीमारी के साथ घोड़ों में आम बीमारी एजेंटों की उपस्थिति की पहचान करने के लिए मूल्यांकन किया है। यह पांडुलिपि नमूना तैयार करने, प्रवर्धन, और लक्ष्य रोगज़नक़ दृश्यों के विश्लेषण के लिए एक nanoscale नैदानिक ​​पीसीआर कार्यप्रवाह का वर्णन करता है, प्रक्रियाओं है कि microliter पैमाने प्रतिक्रियाओं से अलग कर रहे हैं पर ध्यान दे। प्रस्तुत श्वसन पैनल में, 18 assays प्रत्येक तीन प्रतियों में स्थापित किए गए थे, प्रति प्लेट 48 नमूनों को समायोजित। एक सार्वभौमिक निकासी और पूर्व प्रवर्धन कार्यप्रवाह उच्च throughput नमूना तैयार करने के लिए अनुकूलित किया गया था कई matrices और डीएनए और आरएनए आधारित रोगजनकों समायोजित करने के लिए। प्रतिनिधि डेटा एक आरएनए लक्ष्य (इन्फ्लूएंजा एक मैट्रिक्स) और एक डीएनए लक्ष्य (घोड़े का herpesvirus के लिए प्रस्तुत कर रहे हैं1)। जल्दी और सही रोगाणुओं की एक व्यापक, सिंड्रोम आधारित समूह के लिए परीक्षण करने की क्षमता और दक्षता नैदानिक ​​परीक्षण के ergonomics में सुधार के लिए और तीव्र श्वसन रोग निदान और प्रबंधन के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण है।

Introduction

मनुष्यों और पशुओं के लिए नैदानिक ​​निदान में कई एजेंटों के तेजी से और व्यापक पता लगाने के लिए मांग के साथ, रोगज़नक़ पता लगाने के लिए एकल जीव आणविक निदान विधियों भारी हैं, जब तक कि नमूनों की बड़ी संख्या के लिए इस्तेमाल एक ही बीमारी के लिए परीक्षण किया जा रहा है। पशु चिकित्सा संदर्भ में, उच्च throughput नैदानिक ​​तरीके प्रजातियों में से एक विस्तृत विविधता से रोगजनकों को कवर करने के लिए अतिरिक्त आवश्यकता के कारण विशेष रूप से महत्वपूर्ण हैं। OneHealth खाद्य जनित रोग के प्रबंधन और उभरते रोगज़नक़ निगरानी के लिए दृष्टिकोण के परीक्षण की जरूरत है कि बैक्टीरिया की एक संख्या शामिल के उदाहरण हैं, वायरस (डीएनए या आरएनए आधारित), परजीवी, और कवक। परीक्षण दक्षता में सुधार करने के क्रम में एक साथ कई analytes (बहुसंकेतन) के लिए परीक्षण के संयोजन के लिए चुनौती संवेदनशीलता का एक संभावित नुकसान और अनुकूलन और assays के सत्यापन के लिए एक बड़ा बोझ है।

Nanoliter पैमाने वास्तविक समय पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) एक बदल रहा हैबहुसंकेतन की प्रथा है कि कई अलग प्रतिक्रियाओं ही नमूना 1 पर एक साथ चलाने के लिए अनुमति देता है के मूल निवासी। OpenArray मंच इस सिद्धांत 2 का एक आवेदन पत्र है; इसके साथ वास्तविक समय पीसीआर माइक्रोएरे प्रौद्योगिकी को जोड़ती है। स्थानिक बहुसंकेतन की अवधारणा के आधार पर, हर नमूना एक बड़ा माध्यम से छेद अलग में लक्ष्य की संख्या के लिए परीक्षण किया है। इस मंच के शुरू में जाती आधारित डबल असहाय डीएनए बाध्यकारी रसायन शास्त्र 2 के साथ इस्तेमाल किया गया था और अंधेरे शमन जांच 3 का उपयोग कर जांच-आधारित रसायन शास्त्र के लिए अब उपलब्ध है। इस मंच मुख्य रूप से इंसानों और जानवरों 4 5 में आनुवंशिक रूपरेखा के लिए इस्तेमाल किया गया है। यह हाल ही में Grigorenko एट अल द्वारा रक्त जनित डीएनए और आरएनए रोगजनकों का पता लगाने के लिए 6 एक दो कदम रिवर्स प्रतिलेखन / पूर्व प्रवर्धन (preamp) प्रक्रिया का उपयोग कर अनुकूलित किया गया था।।

हम यहाँ श्वसन सेकंड में रोगाणुओं की दोनों प्रकार का पता लगाने के लिए एक एक कदम preamp आधारित प्रक्रिया का वर्णनretions और अन्य प्रकार नमूना है कि एक मानक कार्यदिवस में पूरी तरह से प्रदर्शन किया जा सकता है की एक किस्म है। एक कदम preamp के पूरा होने पर, नमूने 384 अच्छी तरह से थाली है, जो प्रारूप स्वचालित तरल हैंडलिंग प्रणाली है कि इस nanoscale पीसीआर मंच के साथ आता है द्वारा स्वीकार कर लिया है के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं। प्रणाली एक समय में मास्टर मिश्रण और 4 प्लेट (192 नमूने और नियंत्रण) की सतह भर नमूना खींचता है। इस लोड करने की प्रक्रिया के बाद, हम वर्णन कैसे नमूने प्रवर्धित और एक मैक्रो स्प्रेडशीट कि एक मेज है कि एक मुद्रित पृष्ठ पर फिट बैठता है में प्रत्येक नमूना / लक्ष्य संयोजन के लिए 3 तकनीकी प्रतिकृति की औसत का सार का उपयोग कर विश्लेषण कर रहे हैं।

इस मंच का उपयोग कर नमूने से निकाले गए डीएनए और / या आरएनए का विश्लेषण करने के लिए एक समान विधि स्थापित किया गया था। नमूने का एक व्यापक विविधता, निकाले गए थे रिवर्स लिखित, और एक 96 अच्छी तरह प्रारूप में पूर्व प्रवर्धित, त्रुटियों के लिए संभावित कम से कम। श्वसन नमूनों का परीक्षण नाक swabs, गहरी ग्रसनी swabs शामिल है,ट्रांस-सांस की नली washes, ब्रोन्कोएल्वियोलर पानी से धोना, और फेफड़े के ऊतकों। एजेंटों का परीक्षण भी परिधीय रक्त या मल में मौजूद हो सकता है कुछ के बाद से, हम प्रक्रिया में नमूने के उन प्रकारों को शामिल किया। इस सुव्यवस्थित कार्यप्रवाह अलग-अलग परीक्षण के स्थान पर पैनल आधारित रोगज़नक़ और विष जीन का पता लगाने के माध्यम से कुशल परीक्षण को सक्षम करने से कई प्लेटों में प्रयोगों चल रहा है की तुलना में समय और संसाधनों को बचाने में मदद करता है। श्वसन यहां प्रदर्शन पैनल 18 assays के प्रत्येक छेद के माध्यम से तीन प्रतियों में मुद्रित, प्रति प्लेट 48 नमूनों को समायोजित करने के लिए किया था। घोड़े का पता लगाया रोगजनकों घोड़े का एडीनोवायरस 1 और 2, घोड़े आर्टेराईटिस वायरस, घोड़े rhinitis वायरस ए और बी, घोड़े herpesvirus (EHV) प्रकार 1 और 4, और स्ट्रेप्टोकोकस सम शामिल थे। कुत्ते रोगजनकों कुत्ते सांस कोरोना (betacoronavirus), कुत्ते व्यथा वायरस, कुत्ते adenovirus, कुत्ते पैराइन्फ्लुएंज़ा वायरस, कुत्ते pneumovirus, Bordetella bronchiseptica, और माइकोप्लाज्मा cynos शामिल थे। एयूनिवर्सल इन्फ्लूएंजा एक परख और एक आंतरिक नियंत्रण (MS2 आरएनए फेज) भी शामिल थे।

Protocol

कोई मानव विषयों या प्रायोगिक पशुओं इस प्रोटोकॉल के विकास के लिए इस्तेमाल किया गया। नियंत्रण अनुक्रम की पुष्टि की amplicons की शुद्धि के द्वारा और आरएनए लक्ष्यों के लिए इन विट्रो प्रतिलेखन में उत्पन्न किया गया। नैदानिक ​​नमूनों कॉर्नेल पशु स्वास्थ्य डायग्नोस्टिक सेंटर के लिए नियमित नैदानिक ​​परीक्षण के लिए प्रस्तुत किया गया।

1. प्लेट डिजाइन

  1. कि प्रत्येक परख 60 डिग्री सेल्सियस annealing के साथ मानक की जांच के आधार पर वास्तविक समय पीसीआर साइकिल चालन की स्थिति प्राइमर जांच परीक्षण उपकरण का उपयोग करने के लिए अनुरूप सत्यापित करने के लिए प्राइमर डिजाइन सॉफ्टवेयर का उपयोग करें (मात्रा का ठहराव जांच तयशुदा मापदंडों के साथ सेटिंग का चयन करें)।
    नोट:। इस्तेमाल किया प्रतिनिधि आरएनए लक्ष्य सार्वभौमिक इन्फ्लूएंजा शू एट अल द्वारा प्रकाशित एक मैट्रिक्स लक्षित परख 7 से अनुकूलित किया गया था। प्राइमरों और जांच इस प्रकार हैं: आगे प्राइमर: AGGGCATTYTGGACAAAKCGTCTA, जांच: Fam-TGCAGTCCTCGCTCACTGGGCACG-QSY GACCRATCCTGTCACCTCTGAC, प्राइमर उल्टा। प्रतिनिधि डीएनए यहां इस्तेमाल किया परख इधर-उधर अनुकूलित किया गया थाघोड़े का herpesvirus टाइप 1 (EHV-1) का पता लगाने एलिया एट अल द्वारा प्रकाशित विधि हूँ। 8। प्राइमरों और जांच इस प्रकार हैं: आगे प्राइमर: GCTCTCAGGTTTTACGACATC, रिवर्स प्राइमर: CTTTACCCAGGCCCTTGAAA, जांच: Fam-TCAACGTGGACAATACCGCAGTGATTAT-QSY।
  2. वांछित विन्यास में nanoscale पीसीआर प्रवर्धन प्लेटों आदेश।
    नोट: इस अध्ययन के लिए, 18x3 जीन अभिव्यक्ति प्रारूप का इस्तेमाल किया गया था (1 टेबल)। निर्माता के लिए प्रत्येक लक्ष्य के लिए सभी प्राइमरों और जांच (या inventoried परख आईडी के) के लिए दृश्यों प्रदान करें।

2. न्यूक्लिक एसिड निकासी

  1. किसी भी वांछित विधि द्वारा कुल न्यूक्लिक एसिड (डीएनए और आरएनए) निकालें।
    नोट: एक स्वचालित चुंबकीय मनका आधारित निकासी किट यहां इस्तेमाल किया गया था निर्माता के निर्देशों के अनुसार (अधिक जानकारी के लिए सामग्री तालिका देखें)।
  2. इस प्रकार के रूप में नमूने तैयार:
    1. 10% ब्लीच और अच्छी तरह से सूखे के साथ प्रत्येक नमूना कंटेनर के बाहर साफ करें। साफ कर लें दस्ताने चपार प्रदूषण को रोकने के लिए नमूने के बीच 10% ब्लीच के साथ Inger टिप्स।
    2. प्लेस नाक या गहरी ग्रसनी खारा के कई बूंदों के साथ (जैसे एक लाल शीर्ष रक्त संग्रह ट्यूब के रूप में) किसी भी बाँझ, सील शीशी में swabs सुखाना प्रसंस्करण करने से पहले रोकने के लिए कहा।
      नोट: कपास, प्लास्टिक, लकड़ी से संभाला, और Dacron और अन्य सिंथेटिक swabs सब स्वीकार्य हैं, लेकिन कैल्शियम alginate के फाहे से बचें।
    3. swabs और सांस की नली washes के लिए, Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) जोड़ने इतना है कि वहाँ तरल के कम से कम 1-2 मिलीलीटर। ट्यूब में सख्ती झाड़ू और DMEM भंवर। फिर, एक नया ट्यूब करने के लिए मीडिया के लगभग 1 मिलीलीटर हस्तांतरण करने के लिए एक पिपेट का उपयोग करें।
    4. यंत्रवत् lyse ऊतकों (DMEM के 1 मिलीलीटर में 100-200 मिलीग्राम) में 825 x जी 3 मिनट के लिए centrifugation द्वारा पीछा निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक ऊतक disruptor का उपयोग कर। एक नया ट्यूब सतह पर तैरनेवाला के 500 μl स्थानांतरण।
    5. मल के लिए, 1x फॉस्फेट बफर एसए के 800 μl के साथ मल के 400 मिलीग्राम गठबंधनलाइन 7.4 पीएच (पीबीएस)। 1 मिनट या उससे अधिक समय के लिए निलंबन भंवर जब तक नमूना homogenized या पूरी तरह से निलंबित कर दिया है। एक बार जब homogenized, 18,000 XG पर 10 मिनट के लिए निलंबन अपकेंद्रित्र, तो एक नया ट्यूब 400 μl हस्तांतरण।
    6. पूरे uncoagulated रक्त के लिए, नमूना भंवर और एक 250 μl विभाज्य हैं। अपघट्य अभिकर्मक और भंवर के छह बूँदें मिश्रण करने के लिए जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए सेते हैं।
  3. निर्माता के निर्देशों के अनुसार सेल और धोने बफ़र्स तैयार करें। MS2 फेज या एक आंतरिक सकारात्मक निकासी नियंत्रण 9 के रूप में lysis बफर के लिए पसंद की एक आंतरिक नियंत्रण जोड़ें।
  4. प्रत्येक मनका ट्यूब के लिए lysis बफर के 235 μl और नमूना (या नकारात्मक नियंत्रण के लिए पीबीएस) के 175 μl जोड़ें। निर्माता प्रोटोकॉल के साथ आगे बढ़ें।
    नोट: शुद्ध कुल न्यूक्लिक एसिड 90 μl में यहाँ eluted था।

3. रिवर्स प्रतिलेखन / प्री-प्रवर्धन (preamp)

नोट: सभी अभिकर्मकों और नमूने में इस्तेमाल रखेंसभी समय पर बर्फ पर preamp प्रतिक्रिया। preamp के बाद, कमरे के तापमान पर सभी अभिकर्मकों रहते हैं।

  1. eluted डीएनए और / या आरएनए, पीसीआर प्रतिक्रिया मिश्रण, nuclease मुक्त पानी एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में, और सकारात्मक प्रवर्धन नियंत्रण के लिए जमा मानकों इकट्ठा करो।
    नोट: ऊपर 48 नमूने के नियंत्रण सहित एक प्रवर्धन प्लेट पर चलाया जा सकता है (प्रत्येक निकासी की थाली से जो नमूने खींचा जा रहे हैं के लिए कम से कम एक नकारात्मक निकासी नियंत्रण शामिल हैं)।
  2. बाहर प्रिंट एक नमूना नक्शा। एक दूसरे व्यक्ति की जांच है कि नक्शे और नमूना लेआउट मैच है।
  3. एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में, preamp मास्टर मिश्रण तैयार करने के लिए निम्न जोड़ें।
    नोट: 14 μl के अंतिम मात्रा यहां इस्तेमाल किया गया था।
    1. प्रत्येक लक्ष्य से premixed प्राइमरों का एक पूल मे ऐसी है कि प्रत्येक प्राइमर के अंतिम एकाग्रता 900 एनएम है।
      नोट: यहां इस्तेमाल किया पूल एक 10x एकाग्रता में तैयार किया गया था, और 1.4 μl प्रतिक्रिया प्रति जोड़ा।
    2. 600 एनएम या 0.1x के अंतिम एकाग्रता के लिए यादृच्छिक प्राइमरों जोड़ें। (7 μl यहाँ) अंतिम मात्रा का आधा करने के लिए 2x RT-qPCR मिश्रण जोड़ें।
    3. मास्टर मिश्रण घटकों धीरे vortexing और नीचे कताई द्वारा एक साथ मिश्रण।
  4. प्लेट केवल (स्तंभों 1-6) की बाईं ओर का उपयोग कर एक मानक 96 अच्छी तरह से थाली में preamp प्रदर्शन करना।
  5. अच्छी तरह से preamp मास्टर मिश्रण के 8.5 μl और प्रत्येक के लिए डीएनए / आरएनए नमूने के 5.5 μl जोड़ें।
  6. सभी अभिकर्मकों (नमूने, सकारात्मक नियंत्रण और preamp मिश्रण के साथ नकारात्मक नियंत्रण) के संयोजन के बाद, अच्छी तरह से एक स्पष्ट चिपकने वाला सील के साथ मानक 96 अच्छी तरह से थाली सील। साइकिल चालन के दौरान सील अंतराल के गठन को रोकने के लिए एक रेजर ब्लेड का उपयोग कर किसी भी अतिरिक्त मुहर निकालें। एक पीसीआर प्लेट स्पिनर का उपयोग कर 20 सेकंड के लिए बंद थाली अपकेंद्रित्र। यह सुनिश्चित करने के लिए सभी अभिकर्मकों प्लेट कुओं के तल में संयुक्त रहे हैं की जाँच करें।
  7. निम्नलिखित परिस्थितियों में एक पारंपरिक thermocycler पर preamp परख चलाएँ: 50 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट; 95 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट; 95 डिग्री सेल्सियस, तो 2 मिनट में 60 डिग्री सेल्सियस पर 15 सेकंड के 20 चक्र; 99.9 & #176; 10 मिनट के लिए सी; 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़। कार्यक्रम के लिए इन शर्तों के शुरू करने से पहले।
  8. पारंपरिक thermocycler चालू करें, preamp साइकिल कार्यक्रम का चयन और कार्यक्रम शुरू करते हैं। thermocycler में 96 अच्छी तरह से थाली की जगह केवल जब thermocycler (नहीं) को कवर के नीचे के हिस्से तापमान तापमान स्क्रीन पर पढ़ने की निगरानी के द्वारा सीडीएनए उत्पादन (50 डिग्री सेल्सियस) के लिए आवश्यक तक पहुँचता है। इससे पहले, झूठी सकारात्मक परिणामों के उत्पादन के जोखिम को कम करने के लिए प्लेट ठंडा रखें।
  9. एक बार जब preamp रन पूरा हो गया है, तो सत्यापित करें कि प्लेट को सील कर रह गया है।
  10. तुरंत आगे बढ़ें कदम करने के लिए 4.1। इस प्लेट रात भर स्टोर करने के लिए, 4.2 से 4.5 चरणों में वर्णित के रूप में शिथिल प्लेट को कवर करने के बजाय छोड़कर, कमजोर पड़ने प्रदर्शन, एक स्पष्ट चिपकने वाला सील और एक ज़िप ताला बैग के अंदर जगह, 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत के साथ थाली सील।

4. Preamp प्लेट के कमजोर पड़ने

  1. प्रवर्धन प्लेटों की उपयुक्त संख्या में इधर-उधर हटायेफ्रीजर (4 अप करने के लिए एक बार में चलाया जा सकता है) एम। पैकेजिंग मत खोलना। प्लेट कमरे के तापमान पर कम से कम 15 मिनट के लिए गर्म करने के लिए अनुमति दें। थाली के सीरियल नंबर और बहुत संख्या रिकॉर्ड।
    नोट: बंद प्लेटों 24 घंटा तक के लिए कमरे के तापमान पर रह सकते हैं, लेकिन सबसे अच्छा अभ्यास के लिए, फ्रीजर से पहले की जरूरत से अधिक नहीं 30 मिनट से इन हटा दें।
  2. पीसीआर थाली स्पिनर का उपयोग कर 20 सेकंड के लिए पूरा preamp थाली अपकेंद्रित्र। प्रवर्धन मशीन और कंप्यूटर को चालू करें और जुड़े कार्यक्रम शुरू करते हैं।
  3. एक पीसीआर सेटअप क्षेत्र से सभी अनावश्यक वस्तुओं निकालें। डबल दस्ताने और आस्तीन कवर पर डाल दिया।
  4. preamp थाली से मुहर निकालें और ध्यान से निकालें और बाहरी दस्ताने त्यागें। ऊपर और नीचे pipetting द्वारा कॉलम 96 अच्छी तरह से थाली के preamp 1-6 और मिश्रण के प्रत्येक अच्छी तरह से ते बफर के 56 μl जोड़कर 5: 1 पर preamp उत्पादों पतला। केवल पिपेट का पहला पड़ाव के पास जाओ, नीचे से श्वास और उच्च ऊपर वितरण लेकिन पैदा नहींबुलबुले। अप्रयुक्त कुओं की परवाह किए बिना सभी 6 स्तंभों के लिए ते बफर जोड़ें।
  5. या तो एक स्पष्ट चिपकने वाला या पन्नी सील के साथ थाली reseal, और पीसीआर प्लेट स्पिनर का उपयोग कर 20 सेकंड के लिए यह अपकेंद्रित्र। इस प्लेट अलग सेट (शिथिल कवर) तक कदम 6.1 पूर्ण है। शेष दस्ताने और आस्तीन कवर त्यागें।

5. के लिए प्रवर्धन की थाली के लिए 384 अच्छी तरह से स्थानांतरण तैयारी

  1. ढक्कन, प्लग, विसर्जन तरल पदार्थ, प्लेट प्रेस, इथेनॉल धार बोतल, और प्रकार का वृक्ष मुक्त प्रयोगशाला पोंछे की सिरिंज: सामग्री को कवर किया और प्रवर्धन प्लेट को सील करने की जरूरत को निर्धारित करें। सिरिंज टोपी निकालें और (बल की आवश्यकता है) सिरिंज पर एक छोटे से प्लास्टिक टिप ताला। एक कागज तौलिया पर विसर्जन तरल पदार्थ की एक छोटी राशि बेदखल हवा buildup को दूर करने के लिए (यह ठीक है अगर कुछ छोटे हवाई बुलबुले को टिप में रहने)। वैक्यूम सील एल्यूमीनियम बैग से सिरिंज को हटाने के 60 मिनट के भीतर विसर्जन द्रव का प्रयोग करें। एक बार एक सिरिंज खोला जाता है, बाद में उपयोग के लिए टोपी पुनः अनुलग्न नहीं है।
  2. चेककि प्लेट लोड हो रहा तरल हैंडलर की बर्बादी बिन खाली है और सुझावों के बॉक्स खुला। टिप बॉक्स कवर जब एक नया बॉक्स खोला जाता है पर सुझाव की समाप्ति की तारीख लिखें, और सुनिश्चित करें कि सुझावों का नहीं समाप्त हो जाता है। तरल हैंडलर और कंप्यूटर पर बारी और तरल हैंडलर सॉफ्टवेयर है, जो एक आत्म परीक्षण प्रदर्शन करेंगे खुला।
  3. "सेटअप और लोड" पर क्लिक करें। नमूना ट्रैकर सॉफ्टवेयर से बनाया सीएसवी फ़ाइल चुनने के लिए "ब्राउज़" पर क्लिक करें। फ़ाइल नहीं दिखाया जाता है, के लिए "साधन / संपादित प्राथमिकताएं" के लिए जाना और फिर क्लिक करें "परिवर्तन" द्वारा "नमूना थाली फ़ाइल फ़ोल्डर"। जहां सीएसवी फ़ाइल को बचाया है फ़ोल्डर का चयन करें। फिर, "सेटअप और लोड" पर क्लिक करें और फिर "ब्राउज़ करें" और फ़ाइल का चयन करें।
  4. इसके बाद, क्लिक करें "ब्राउज़ करें" "थाली धारक 1 स्थिति" के आगे और TPF फ़ाइल (निर्माता द्वारा प्रदान की) थाली के रूप में एक ही सीरियल नंबर है कि चयन करें।

6. तरल हैंडलर स्थानांतरण

नोट: FI शुरू मत करो384 अच्छी तरह से थाली lling उपरोक्त कदम के सभी जब तक पूरा कर रहे हैं। वाष्पीकरण छोटे संस्करणों के साथ एक चिंता का विषय है - देना नहीं है 384 अच्छी तरह से थाली के अंदर तरल के साथ खुला बैठते हैं।

  1. एक बार सभी उपरोक्त कदम के नए, अच्छी तरह से फिट डबल दस्ताने पर डाल पूरा कर रहे हैं और आस्तीन शामिल किया गया है। फिर, एक 384 अच्छी तरह से थाली करने के लिए प्रवर्धन मास्टर मिश्रण के 2.5 μl जोड़ें।
  2. तालिका 2 में नक्शे के अनुसार 384 अच्छी तरह से थाली को पतला preamp उत्पाद के 2.5 μl स्थानांतरण और तुरंत एक पन्नी सील के साथ कसकर प्लेट को कवर किया। बाहरी दस्ताने और आस्तीन कवर त्यागें।
  3. अपकेंद्रित्र पीसीआर थाली स्पिनर में 20 सेकंड के लिए 384 अच्छी तरह से थाली।
  4. पन्नी सील दूर नहीं है, लेकिन तरल हैंडलर में 384 अच्छी तरह से थाली जगह है।
  5. पैकेज एक encased प्रवर्धन प्लेट युक्त खोलें और सही पर सीरियल नंबर के साथ पहले स्लॉट में तरल हैंडलर में ध्यान से यह जगह - सतह को छूने के बिना ओ किनारों से मामला पकड़प्लेट च। उद्घाटन के एक घंटे के भीतर unwrapped प्लेटों का प्रयोग करें।
    नोट: इस मामले के उद्देश्य से छुआ जा रहा प्लेट की रक्षा के लिए है, क्योंकि इस माध्यम से छेद के अंदर प्राइमरों और जांच की थोड़ी मात्रा को परेशान कर सकता है।
  6. 384 अच्छी तरह से थाली तरल हैंडलर अंदर से पन्नी सील हटाये एक बार सब कुछ जगह में है। अगला पर क्लिक करें और फिर सभी बक्से की जाँच के रूप में हर कदम पूरा हो गया है। रन शुरू करने के लिए ठीक क्लिक करें।
  7. तरल हैंडलर के लिए दरवाजा बंद किया और तुरंत भरने की प्रक्रिया शुरू करते हैं। तरल हैंडलर के बगल में रहने के लिए और एक बार प्लेट भर जाता है तुरंत अगले कदम के लिए आगे बढ़ें।
  8. तरल हैंडलर चल रहा है, वहीं एक मामले ढक्कन के नीचे से सुरक्षात्मक फिल्म को हटा दें।
    नोट: मामले ढक्कन के नीचे चिपकने वाला एक लालफीताशाही और एक सुरक्षात्मक फिल्म से आच्छादित है। फिल्म लालफीताशाही का उपयोग करने के पहले हटा दिया जाना चाहिए।
    1. कदम 6.15 तक जगह में शीर्ष फिल्म छोड़ दें। releas करने के लिए थोड़ा खींच कर प्रधानमंत्री लाल टेपचिपकने से यह ई।
  9. तरल हैंडलर से भरी हुई (भरा) प्रवर्धन थाली निकालें और धीरे सही पर सीरियल नंबर के साथ प्लेट प्रेस में जगह है।
  10. सही और नीचे (प्लेट की ओर इशारा करते हुए) पर चिपकने पर नोकदार अंत के साथ थाली के शीर्ष पर ढक्कन रखें।
  11. प्लेट प्रेस लीवर ध्यान से इसे बंद करने पर नीचे खींच; प्रकाश 20 सेकंड के लिए फ़्लैश जाएगा। इस समय के दौरान प्लेट प्रेस मत छुओ। एक बार जब प्रकाश ठोस हरे रंग बदल जाता है, ध्यान से लीवर उठा और ध्यान से किनारों पर इसे धारण द्वारा सील प्लेट हटा दें।
  12. मामले के किनारों द्वारा सील प्रवर्धन प्लेट धारण करते हुए खड़ी है, तुरंत मामले के अंत में लोडिंग बंदरगाह में सिरिंज टिप सम्मिलित करते हैं, तो एक कोमल निरंतर गति में विसर्जन द्रव बांटना धीरे धीरे थाली और बीच की जगह को भरने के लिए ढक्कन। कोने में एक छोटा सा हवा बुलबुला छोड़ दो एक बार प्लेट डूब जाता है।
  13. जबकि एच करने के लिए जारीपुराने प्लेट खड़ी किनारों से, पोर्ट में प्लग डालने और प्लग दक्षिणावर्त घुमा, पर्याप्त दबाव लागू करने के लिए जब तक संभाल से टूट जाता द्वारा लोडिंग बंदरगाह सील। पकड़ मामले के किनारों मजबूती से इतना है कि संभाल तोड़ने के बल मामले ड्रॉप करने के लिए कारण नहीं है। एक प्लेट गिरा दिया जाता है, यह त्यागें।
  14. के साथ एक प्रकार का वृक्ष मुक्त पोंछ कि अच्छी तरह से इथेनॉल के साथ छिड़काव किया गया है मामले को साफ करें। मामले को सुखाने के लिए, एक साफ साथ नीचे मामले पोंछ पोंछ। धीरे मामले को संभाल; कुओं से ऊपर कांच पर दबाव लागू नहीं करने के लिए सुनिश्चित हो।
  15. प्रवर्धन मशीन को सील कर दिया प्लेट ले आओ। "साधन" टैब के तहत, "साधन कंसोल चयन करें।" प्रवर्धन मशीन का चयन करें तो "ओपन डोर" बटन पर क्लिक करें।
  16. प्लेट एडाप्टर के पहले स्लॉट में प्रवर्धन थाली प्लेस, जाँच है कि एडाप्टर ठीक ऊपर बाएं कोने में ए 1 के साथ लाइन में खड़ा है। बारकोड के साथ थाली सामना करना पड़ रहा है और की ओर उन्मुखसाधन के सामने। "बंद दरवाजा" बटन पर क्लिक करें। नोट एडाप्टर ट्रे का उपयोग - 10 उपयोग करता है की एक सीमा होती है।
  17. स्क्रीन के नीचे होम टैब के अंतर्गत, भागो मेनू के तहत, OpenArray का चयन करें। "थाली आईडी के हो जाओ।" क्लिक करें खाली बक्से स्वत: प्लेट के बारे में जानकारी के साथ आबादी की जाएगी। रन शुरू करने के लिए, "प्रारंभ भागो" पर क्लिक करें।
  18. तरल हैंडलर सॉफ्टवेयर बंद करो और तरल हैंडलर बंद कर देते हैं। टिप टिप रैक के ऊपर कवर रखें। अपशिष्ट बिन से सुझाव त्यागें और यह साफ। स्वच्छ और काम की सतह, पिपेट, अपशिष्ट बाल्टी, और सुझाव बक्से सहित सभी आइटम शुद्ध करना।
  19. -20 डिग्री सेल्सियस पर एक स्पष्ट चिपकने वाला सील और दुकान के साथ preamp प्लेट reseal।

7. परिणाम का विश्लेषण

  1. एक बार चलाने पूरा कर लिया है, फाइल को बचाने के लिए और फिर स्क्रीन के नीचे रन नाम के साथ टैब पर "एक्स" पर क्लिक करें फ़ाइल बंद हुआ।
  2. "ओपन डोर पर क्लिक करें"दरवाजा खोलने के लिए स्क्रीन के शीर्ष पर। जाँच करें कि कोई विसर्जन तरल पदार्थ बाहर लीक हो गया है प्रवर्धन थाली निकालें। पर क्लिक करें" स्क्रीन के शीर्ष पर बंद दरवाजा "दरवाजा बंद करने के लिए।
  3. "ओपन" क्लिक करें और इसे खोलने के लिए रन फ़ाइल का चयन करें। हरे रंग की स्क्रीन के ऊपर सही में बटन का विश्लेषण करें दबाएँ। परिणामों को निर्यात करने के लिए (एक .txt फ़ाइल के रूप में) स्क्रीन के बाईं ओर और फिर "शुरू निर्यात" पर "निर्यात" पर क्लिक करें। फ़ाइल को कम से कम यह खोलता के बाद। फिर, क्लिक करें "निर्यात क्यूसी छवियाँ।"
  4. निम्नलिखित मानदंडों के अनुसार छवि विश्लेषण कार्यक्रम में क्यूसी छवियों की समीक्षा करें:
    1. पूर्व READ_CHANNEL_4.tiff और बाद READ_CHANNEL_4.tiff का उपयोग कर, जाँच के कोई काले धब्बे या smudges देखते हैं कि द्वारा लोडिंग गुणवत्ता का आकलन करें।
      नोट: इस चैनल द्वारा पता लगाया एक डाई प्राइमरों और जांच करने के लिए निर्माता, जब प्रतिक्रिया भरी हुई है जो समाधान में जारी किया जाता है के द्वारा जोड़ा जाता है। इस चैनल में पढ़ने इंगित करता है कि प्रतिक्रियाओं ठीक से थेभरी हुई है और प्राइमरों और जांच डाई के साथ मिश्रित उपस्थित थे।
    2. लीक या थाली करने के लिए आंदोलन लदान के बाद S02_C001_t03_p001_m1_x2_e1_cp # _spotfind.tiff प्रयोग करने के लिए जाँच करें। छवि अंधेरे लग रहा है, तो चमक (Ctrl + Shift + नियंत्रण को खोलने के लिए सी) जब तक पूरी थाली दिखाई दे रहा है वृद्धि हुई है। जाँच करें कि छवि की कोई छाया, बुलबुले, या विस्थापित नमूनों के साथ एक समान लग रहा है।
    3. ढक्कन के स्थान और ढक्कन (चमकीले धब्बों) के तहत मलबे STAGE2_CYCLE1_CHANNEL_1.tiff और STAGE2_CYCLE40_CHANNEL_1.tiff का उपयोग कर का आकलन करें।
  5. वैकल्पिक: एक स्प्रेडशीट परिणाम मैक्रो (पूरक कोड फ़ाइल) युक्त खोलें। निर्यात डेटा फ़ाइल में, सही स्क्रीन के नीचे टैब पर क्लिक करें और "ले जाएँ या प्रतिलिपि" का चयन करें। "बुक करने के लिए" क्षेत्र में, का चयन करें "परिणाम Macro.xlsm"। क्लिक करें और बॉक्स "प्रतिलिपि बनाएँ" जाँच "को समाप्त करने के लिए ले जाएँ"। तो फिर ठीक क्लिक करें।
    1. परिणाम मैक्रो विकल्प "बुक करने के लिए" क्षेत्र में प्रकट नहीं होता है, सिमप्लाई निर्यात डेटा फ़ाइल वर्कशीट की सामग्री की प्रतिलिपि (सभी कोशिकाओं को उजागर करने के लिए ऊपरी बाएँ कक्ष पर क्लिक करें और Ctrl-C) और यह एक नए टैब में पेस्ट करें।
  6. पुराने "निर्यात" टैब हटाएँ और तब के रूप में "निर्यात" नए जोड़े टैब का नाम बदलें।
  7. क्लिक करें "Alt-F8" (या तो मैक्रोज़ देखें क्लिक करें) फिर "मैक्रो" का चयन करें और "भागो" पर क्लिक करें। फिर "Alt-F8" फिर "Macro2" का चयन और "रन" पर क्लिक क्लिक करके Macro2 लिए इस दोहराएँ।
  8. परिणाम मैक्रो प्रासंगिक जानकारी (तारीख और सीरियल नंबर) का उपयोग कर फ़ाइल का नाम बदलें, टेबल के ऊपर यह जानकारी रख, और निर्यात परिणाम फ़ोल्डर में एक ही फाइल नाम के रूप में बचाने के लिए। अंत में, मैक्रो जनित परिणाम तालिका बाहर प्रिंट।
  9. प्रवर्धन मशीन सॉफ्टवेयर में, स्क्रीन के बाईं ओर पर विश्लेषण / प्रवर्धन साजिश का चयन करके प्रत्येक नमूना और मैक्रो मेज के खिलाफ नियंत्रण के लिए घटता की जाँच करें। फिर, नमूना टैब का चयन करें, और करने के लिए प्रत्येक नमूने पर क्लिक करेंइस बात की पुष्टि 2 या 3 तालिका में सकारात्मक परिणामों में से प्रत्येक के लिए सकारात्मक प्रवर्धन घटता देखते हैं कि।
  10. प्रवर्धन मशीन को बंद कर दें।

Representative Results

परिणाम आंकड़े 1 और 2 के एक प्रतिनिधि आरएनए परख (इन्फ्लूएंजा मैट्रिक्स) और सकारात्मक नियंत्रण और नैदानिक नमूनों दिनचर्या नैदानिक परीक्षण के लिए प्रस्तुत की एक संयोजन के साथ डीएनए परख (EHV-1) के लिए में दिखाया जाता है। प्रतिदीप्ति संकेतों इस विशिष्ट प्रतिक्रिया के दौरान उत्सर्जित चित्रा 1, जो चक्र के अनुसार कच्चे प्रतिदीप्ति मूल्यों भूखंडों में दिखाए जाते हैं। सभी रिश्तेदार चक्र सीमा (सीटी) मान स्वचालित रूप से प्रवर्धन मशीन सॉफ्टवेयर द्वारा उत्पन्न किया गया। पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति सीटी मूल्यों की गणना करने से पहले प्रतिदीप्ति रीडिंग में इसे शामिल करने के बजाय गुणवत्ता लोडिंग के आकलन के लिए एक अलग मीट्रिक के रूप में इस्तेमाल किया गया था।

विश्लेषणात्मक का पता लगाने के प्रत्येक लक्ष्य के लिए (लोद) सीमा की गणना के लिए नियंत्रण का एक पूल में प्लस 95% का पता लगाने के स्तर पर सीटी मूल्यों 2 मानक विचलन के समग्र मतलब है पर आधारित थासभी लक्ष्यों। उच्चतम कमजोर पड़ने जहां प्रतिकृति के कम से कम 95% प्रतिनिधि assays के लिए सकारात्मक थे 50 प्रतियां था; 5 प्रतियां का पता लगाने प्रतिकृति के 50% में सफल रहा था। न तो परख नीचे एक कॉपी में खोजा गया था। आरएनए और डीएनए परख के लिए LODs 21.92 और 20.05 की सीटी मूल्यों पर गणना की गई। इन मूल्यों को रिपोर्टिंग मूल्यों बनाम संदिग्ध के रूप में सकारात्मक (संभावित नहीं repeatable) के लिए cutoffs माना जाता था।

लक्ष्य का विश्लेषणात्मक प्रदर्शन के अन्य पहलुओं जमा सकारात्मक तीन अलग-अलग दिन (चित्रा 2) पर चलाने के नियंत्रण के धारावाहिक dilutions का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया था। प्रतिनिधि आरएनए और डीएनए परीक्षणों की औसत क्षमता 101.1% और 106.6% थे; सभी लक्ष्यों के लिए समग्र मतलब दक्षता 101.3% थी। Assays भी अच्छा linearity (2 आर> 0.98) था। दोहराने के भीतर परिवर्तन के माध्यम से छेद आम तौर पर दोनों नैदानिक ​​नमूने के लिए 0.2 के मानक विचलन के भीतर था एकडी नियंत्रित करता है। लक्ष्य का किसी के बीच कोई पार जेट मनाया गया।

पूरक फ़ाइल में अंतिम परिणाम वर्कशीट 10 नैदानिक ​​नैदानिक ​​नमूने और 4 नियंत्रण के लिए प्रतिनिधि मात्रात्मक परिणाम दिखाता है। नैदानिक ​​नमूनों नमूने के प्रकार की एक सबसेट नियमित तौर पर नाक / oropharyngeal swabs, फेफड़े के ऊतकों, और मल के नमूने सहित परीक्षण कर रहे हैं। वन (घोड़े) इस सेट में मल का नमूना एक असफल MS2 आंतरिक नियंत्रण है, जो नमूने में अवरोधकों की उपस्थिति इंगित करता है पता चलता है। यह आमतौर पर eluted नमूना और / या फिर से निकासी के कमजोर पड़ने के द्वारा किया जाता है। यहां मामला है, नकारात्मक प्रवर्धन नियंत्रण सभी लक्ष्यों के लिए नकारात्मक होना चाहिए, और नकारात्मक निकासी नियंत्रण केवल आंतरिक नियंत्रण को शामिल करना चाहिए। नैदानिक सेट में, नमूने betacoronavirus, Bordetella bronchiseptica, कुत्ते व्यथा वायरस ए, कुत्ते पैराइन्फ्लुएंज़ा वायरस, कुत्ते pneumovirus, और इन्फ्लूएंजा के लिए सीटी मूल्यों का उत्पादनए।

आकृति 1
चित्रा 1. प्रवर्धन भूखंडों। प्रतिदीप्ति रीडिंग आरएनए परख (ए) और डीएनए परख (बी) के लिए प्रवर्धन चक्र के खिलाफ साजिश रची है। त्रिकोण सीटी मूल्यों denoting दिखाए जाते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. मानक घटता। तीन अलग अलग दिनों पर परीक्षण आरएनए और डीएनए परख से मानक घटता आदेश linearity और प्रवर्धन की सीमा सकारात्मक नियंत्रण का उपयोग कर प्रदर्शित करने के लिए साजिश रची है। साइकिल सीमा (सीटी) मान आरएनए (ए) या डीएनए की प्रतियों की संख्या का लॉग (10) (के खिलाफ साजिश रची है यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका एक
तालिका 1 प्रवर्धन की थाली और लक्ष्य स्थानों के योजनाबद्ध। इस मंच पर nanoscale वास्तविक समय पीसीआर परीक्षण के लिए इस्तेमाल प्लेटें हैं खुर्दबीन स्लाइड आकार और के माध्यम से छेद 3,072 की कुल के साथ के माध्यम से छेद 64 से 48 subarrays में व्यवस्थित कर रहे हैं, अलग-अलग प्रतिक्रियाओं के लिए। एक subarray यहां तीन प्रतियों में 18 लक्ष्य के साथ दिखाया गया है। प्रत्येक नमूना तरल हैंडलर द्वारा एक subarray में जोड़ा जाता है। प्लेट्स सतह तनाव के माध्यम से के माध्यम से छेद में अभिकर्मकों बनाए रखने के लिए हाइड्रोफिलिक और हाइड्रोफोबिक यौगिकों के साथ लेपित हैं। स्टेनलेस स्टील चिप "photolithographically नमूनों है और गीला नक्काशी 3,072 माइक्रो-मशीनीकृत, 320 माइक्रोन diamete का एक सीधा सरणी बनाने के लिए। आर लक्ष्यों के लिए 33 nl प्रत्येक "2 संकेताक्षर के छेद इस प्रकार हैं: BCOR, कुत्ते सांस कोरोना (betacoronavirus); BORD, Bordetella bronchiseptica CAV, कुत्ते adenovirus; CPIV, कुत्ते पैराइन्फ्लुएंज़ा वायरस; CPNV, कुत्ते pneumovirus; DISTA / बी, कुत्ते व्यथा वायरस ए और बी, EADV1 / 2, घोड़े एडीनोवायरस 1/2; EAV, घोड़े आर्टेराईटिस वायरस; EHV1 / 4, घोड़े herpesvirus प्रकार 1/4; erva / बी, घोड़े का rhinitis वायरस ए / बी, IVM, इन्फ्लूएंजा एक मैट्रिक्स; MCYNOS, माइकोप्लाज्मा cynos; MS2, आंतरिक नियंत्रण (MS2 आरएनए फेज); SEQU, स्ट्रेप्टोकोकस सम।

सारणी 2
तालिका 2 प्लेट हस्तांतरण नक्शा। 384 अच्छी तरह से थाली करने के लिए 96 अच्छी तरह से थाली से preamp हस्तांतरण करने के लिए एक निश्चित 8 चैनल पिपेट का उपयोग करने के लिए एक रंग कोडित प्लेट हस्तांतरण नक्शा दिखाया गया है। वैकल्पिक रूप से, एक समायोज्य पिपेट इस्तेमाल किया जा सकता है। एक ही प्रक्रिया घंटा की परवाह किए बिना हर बार किया जाता है ओउ कई नमूने की थाली में हैं।

पूरक फ़ाइल
पूरक फ़ाइल। एक मैक्रो-सक्षम स्प्रेडशीट एक सारांश तालिका में स्वरूपण परिणामों के लिए दो मैक्रोज़ युक्त फ़ाइल (प्रोटोकॉल में वर्णित) प्रदान की जाती है। मैक्रोज़ द्वारा उत्पन्न एक ठेठ परिणाम तालिका (के तहत अंतिम परिणाम) फ़ाइल में शामिल है। दो मैक्रोज़ नमूना नेम (48 नमूने तक) के पहले कॉलम में और सकारात्मक परिणाम के साथ उन लोगों के लिए प्रत्येक लक्ष्य के लिए तीन सीटी मूल्यों की औसत में भर जाएगा; ध्यान दें कि लक्ष्य है कि बढ़ाना नहीं था इस तालिका में खाली दिखाई देते हैं। यह आसानी से कागज के एक टुकड़े पर मुद्रित और कुशलता से कच्चे डेटा की जाँच के लिए एक संदर्भ के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। अंतिम परिणाम टैब में, 10 नैदानिक ​​नमूनों और 4 नियंत्रण के लिए प्रतिनिधि परिणाम दिखाए जाते हैं। परख नाम के लिए संकेताक्षर तालिका 1 की कथा में सूचीबद्ध हैं।www.jove.com/files/ftp_upload/54781/supplemental_code_file_R1.xlsm "लक्ष्य =" _blank "> इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

यह प्रक्रिया छह महीने (प्रति सप्ताह 2-3 बार) के पाठ्यक्रम पर हमारी प्रयोगशाला में श्वसन रोगाणुओं की नियमित परीक्षण के लिए इस्तेमाल किया गया है। हम भी एक अलग से अनुकूलित प्लेट पर मल के नमूने और बैक्टीरियल वियोजन में आंतों का रोगज़नक़ रूपरेखा के लिए एक ही प्रक्रिया का उपयोग कर सफलता मिली है। एक बार जब प्लेटों का उत्पादन कर रहे हैं, अनुभवी स्टाफ एक मानक कार्यदिवस के भीतर 2-7 चरणों को पूरा कर सकते हैं। सबसे महत्वपूर्ण कदम preamp प्लेट के समुचित सील, प्लेटों के बीच preamplified नमूने के हस्तांतरण (जो तेजी से किया जाना चाहिए वाष्पीकरण को रोकने के लिए), और प्रवर्धन की थाली के अंतिम कवर कर रहे हैं। परिणाम विश्लेषण (नमूने और नियंत्रण के लिए घटता जाँच) के लिए एक गाइड के रूप में मैक्रो स्प्रेडशीट का उपयोग के रूप में यह बहुत समय और कागजी कार्रवाई इस प्रक्रिया के लिए आवश्यक की मात्रा कम भी महत्वपूर्ण था। प्रदान की मैक्रो स्प्रेडशीट एक उदाहरण है; यह संशोधित किया जा करने के लिए या फिर से बनाया विभिन्न विन्यास के साथ प्लेटों के लिए की आवश्यकता होगी। यह आसानी से पीई हो सकता हैबुनियादी स्प्रेडशीट ज्ञान के साथ किसी के द्वारा rformed।

नमूने की बहुत छोटी राशि प्रवर्धन प्लेट (33 NL) पर लोड के कारण, पूर्व प्रवर्धन की आवश्यकता है। इस प्रोटोकॉल (नहीं दिखाया गया है) के अनुकूलन में, हम मास्टर मिश्रण, यादृच्छिक प्राइमरों के अलावा, चक्रों की संख्या, annealing समय है, और कमजोर पड़ने प्रवर्धन करने से पहले सहित preamplification मानकों के एक नंबर की तुलना में। प्रत्येक लक्ष्य के लिए अपने स्वयं इष्टतम स्थितियों था, और यहाँ वर्णित उन उन है कि हमारे पैनल के लिए पता लगाने का सबसे अच्छा समग्र सीमा नहीं झुकेंगे प्रतिनिधित्व करते हैं। इस पैनल रोगजनक लक्ष्य और नमूना प्रकार है कि दिनचर्या पशु चिकित्सा नैदानिक ​​परीक्षण में सामना कर रहे हैं की एक विस्तृत श्रृंखला को शामिल किया गया है, लेकिन preamplification प्रक्रियाओं के लिए संशोधन अलग पैनलों के लिए आवश्यक हो सकता है। निर्माता-अनुकूलित प्रवर्धन की स्थिति 95 डिग्री सेल्सियस और एन पर एक मानक की जांच के आधार पर वास्तविक समय पीसीआर एक 10 मिनट के साथ 95 डिग्री सेल्सियस एंजाइम सक्रियण पर प्रोटोकॉल विकृतीकरण के द्वारा पीछा के आधार पर कर रहे हैं60 डिग्री सेल्सियस पर ईलिंग / विस्तार। प्राइमरों और जांच पूर्व मुद्रित प्लेटों पर भी निर्माता-अनुकूलित शर्तों का उपयोग और इसलिए अनुमापन की आवश्यकता नहीं है। सभी नमूनों के लिए रिवर्स प्रतिलेखन और पूर्व प्रवर्धन कदम का मेल (चाहे लक्ष्य के प्रकार के) आदेश कार्यप्रवाह में दक्षता बनाए रखने के लिए जरूरी हो गया था। करने के बाद सभी नमूनों रिवर्स और लिखित भी संवेदनशीलता अधिकतम करने के लिए फायदेमंद है। इसके अलावा, preamp कि न्यूनतम करने अवरोधकों के लिए अनुकूलित है के लिए एक मास्टर मिश्रण का उपयोग एक ही थाली पर अलग नमूना प्रकार के संयोजन में बहुमुखी प्रतिभा की अनुमति देता है।

रोग नियंत्रण (सीडीसी) इन्फ्लूएंजा मैट्रिक्स परख nanoliter पैमाने प्रतिक्रियाओं के लिए शू एट अल। 7 से वर्णित है और यहाँ अनुकूलित के लिए केंद्र एक सार्वभौमिक इन्फ्लूएंजा एक परख है कि मनुष्य और साथी जानवरों से परीक्षण के लिए नमूने के लिए उपयुक्त है। यह सब इन्फ्लूएंजा वायरस के मैट्रिक्स जीन का पता लगाने के लिए सार्वभौमिक डिजाइन किया गया था microliter पैमाने वजह का उपयोग करctions। यह एक सीडीसी मानव इन्फ्लूएंजा वायरस पैनल और एक सीडीसी स्वाइन फ्लू पैनल के हिस्से के रूप में दुनिया भर में इस्तेमाल किया गया है। EHV-1 परख 8 यहाँ अनुकूलित घोड़ों कि गर्भपात और तंत्रिका संबंधी रोग (Pusterla और हसी 10 द्वारा समीक्षा) पैदा कर सकता का एक महत्वपूर्ण सांस रोगज़नक़ पता लगाता है। एक प्रजाति स्वतंत्र आंतरिक नियंत्रण के साथ एक उच्च throughput मंच करने के लिए इन परीक्षणों के अनुकूल ढालने का महत्व यह है कि वे एक OneHealth निगरानी दृष्टिकोण में शामिल किया जा सकता है। एक उच्च throughput परीक्षण मंच पर इन assays के दोनों होने नैदानिक ​​सुविधाओं, घरों में, और प्रदर्शन की घटनाओं के लिए आपातकालीन तैयारियों की सुविधा होगी।

ऊपर वर्णित परिणाम माइकोप्लाज्मा cynos के अपवाद है, जो विश्लेषणात्मक प्रदर्शन में काफी अधिक विभिन्नता से पता चला है के साथ थाली पर सभी लक्ष्यों के प्रतिनिधि थे। इस उप इष्टतम पिघलने के तापमान (टी एम) प्राइमरों की है, जो आदर्श होना चाहिए 58-60 व के कारण होने की संभावना थी# 176; सी (आदर्श जांच टीएम 68-70 डिग्री सेल्सियस)। इस मंच की एक सीमा है कि यह लगता है अब अलग-अलग जांच, जो जल्दी से दृश्यों को संशोधित करने की क्षमता की सीमा से आदेश देने के लिए डिजाइन और प्लेटों का निर्माण है। सामान्य में वास्तविक समय पीसीआर की एक और सीमा उपन्यास या अप्रत्याशित रोगजनकों का पता लगाने में असमर्थता है। इस assays कि कई प्रजातियों में दृश्यों से मेल डिजाइनिंग से कुछ हद तक दूर कर सकते हो, लेकिन निष्पक्ष पूरे जीनोम अनुक्रमण आधारित तरीके उपन्यास एजेंटों की खोज के लिए अधिक अनुकूल हैं। 11,12

नेनो वास्तविक समय पीसीआर के लिए एक नए प्रतिमान की अनुमति देता है सिंड्रोम आधारित प्रजातियों आधारित परीक्षण है, जो उच्च throughput आणविक निदान में अभिकर्मक और श्रम लागत को कम करने के लिए उपयोगी है बजाय। इस दृष्टिकोण से बड़े पैमाने पर पैनल परीक्षण ऐसे ड्यूनी और Gurfield 13 और Moutailler एट अल। 14 द्वारा वर्णित उन लोगों के रूप OneHealth निगरानी के प्रयासों की सुविधा कर सकते हैं। झाड़ू के नमूनों का संग्रह जल्दी,आम तौर पर नैदानिक ​​शुरू होने के 3 दिन के भीतर, श्वसन रोगाणुओं की उपस्थिति की पहचान करने के लिए सबसे अच्छा मौका प्रदान करता है। संक्रामक रोग उद्भव अक्सर अप्रत्याशित है, और परीक्षण है कि अभिकर्मकों के संशोधन के लिए आवश्यकता के बिना विभिन्न प्रजातियों पर किया जा सकता तैयारियों के लिए आदर्श होते हैं। इस प्रौद्योगिकी के भविष्य के अनुप्रयोगों pathotyping, रोगाणुरोधी प्रतिरोध रूपरेखा, और आगे सिंड्रोम आधारित नैदानिक ​​नैदानिक ​​पैनल में होने की संभावना है। नेनो वास्तविक समय पीसीआर तेजी, कई नमूना और रोगज़नक़ प्रकार के उच्च throughput स्क्रीनिंग के लिए सबसे अधिक उपयोगी है, और नए और आकस्मिक रोगजनकों की पहचान करने के लिए निष्पक्ष या आंशिक रूप से पक्षपातपूर्ण अनुक्रमण आधारित दृष्टिकोण से पूरित किया जाएगा।

Disclosures

मेरिको स्लेटर और Elen Ortenberg थर्मो फिशर साइंटिफिक इंक कि अभिकर्मकों और इस लेख में इस्तेमाल का उत्पादन के कर्मचारी हैं।

Acknowledgments

यहाँ वर्णित श्वसन रोगज़नक़ assays पर काम कॉर्नेल पशु स्वास्थ्य डायग्नोस्टिक सेंटर के आंतरिक विकास निधियों द्वारा समर्थित किया गया। nanoscale पीसीआर कार्यप्रवाह और जुड़े गुणवत्ता आश्वासन प्रणाली का विकास आंशिक रूप से (FOA PA-13-244) वित्त पोषित है और अनुदान सं 1U18FD005144- के तहत खाद्य एवं औषधि प्रशासन के पशु चिकित्सा प्रयोगशाला जांच और उत्तर नेटवर्क (एफडीए डॉक्टर-LIRN) के सहयोग से प्रदर्शन किया गया था 01। प्रकाशन फीस VWR और क्वांटा बायोसाइंसेज द्वारा प्रायोजित किया गया। हम लिख रहे हैं और प्रोटोकॉल की समीक्षा करने के साथ उनकी सहायता के लिए गेबरियल Nickerson, रूपा वेणुगोपालन, Veldina Camo, Xiulin जांग, Jinzhi यू, Weihua वांग और कैटरीना वाकर धन्यवाद। हम लेखक साक्षात्कार फिल्माने के लिए माइक कैरोल धन्यवाद। हम अंत में उनके सहायक टिप्पणियों के लिए संपादक और तीन गुमनाम सहकर्मी समीक्षक धन्यवाद।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Zap-OGlobin II lytic reagent Beckman Coulter 7546138 Optional reagent for preparing blood samples.
Extraction kit (MagMAX Total Nucleic Acid Isolation Kit) Thermo-Fisher/Applied Biosystems AM1840 Other extraction kits appropriate for the desired sample types may be substituted. This kit comes with PBS, lysis buffer, and wash buffer.
2x One-Step RT-qPCR mix (qScript XLT One-Step RT-qPCR ToughMix) Quanta Biosciences 95134-500
Gene-specific primer pool IDT custom order Can be generated by the user or purchased with the amplification plates.
Random primer mix New England Biolabs S1330S
Standard 96-well plate Thermo-Fisher/Applied Biosystems N8010560 This can be any plate that fits into the conventional PCR machine used.
Amplification master mix (OpenArray master mix) Thermo-Fisher/Applied Biosystems 4462164
Clear adhesive seal Thermo-Fisher 430611
Foil seal Excel Scientific AF-100
384-well plate Thermo-Fisher/Applied Biosystems 4482221
Amplification plate (QuantStudio 12K Flex OpenArray plate) Thermo-Fisher/Applied Biosystems 4470813 Can be customized with any assays conforming to standard TaqMan conditions. 
Accessories kit Thermo-Fisher/Applied Biosystems 4469576 Contains the case lids, plugs, and immersion fluid.
AccuFill tips Thermo-Fisher/Applied Biosystems 4457246
Amplification machine (QuantStudio 12K Flex Real-Time PCR System) Thermo-Fisher/Applied Biosystems 4471090
Liquid handler (OpenArray AccuFill System) Thermo-Fisher/Applied Biosystems 4457243 This is purchased with the amplification machine.
Primer design software (Primer Express) Thermo-Fisher/Applied Biosystems 4363991 See manufacturer's instructions for detailed primer and probe specifications.
Image analysis program (ImageJ) NIH Available at http://imagej.nih.gov/ij/
Spreadsheet program (Excel) Microsoft Available at https://products.office.com/en-us/excel
DMEM Thermo-Fisher/Gibco 11965-092
Tissue disruptor (TissueLyser II) Qiagen 85300
Conventional thermal cycler (Veriti) Thermo-Fisher/Applied Biosystems 4375786 Any conventional thermal cycler with a heated lid can be used.
PCR plate spinner VWR 89184-608 This device has only one speed (2,500 rpm); the rotor starts when the lid is closed and stops when the button is pushed.
TE buffer Millipore 8890-100ML 10 mM Tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride, 1 mM Ethylenediaminetetraacetic acid, pH 8.0

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References

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संक्रमण अंक 117 नेनो पीसीआर आणविक निदान संक्रामक रोग स्वचालन पशु चिकित्सा निदान OneHealth इन्फ्लूएंजा निगरानी ​​वास्तविक समय पीसीआर
नेनो पीसीआर द्वारा पशु नमूनों में श्वसन रोगज़नक़ों के उच्च throughput जांच
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Goodman, L. B., Anderson, R. R.,… More

Goodman, L. B., Anderson, R. R., Slater, M., Ortenberg, E., Renshaw, R. W., Chilson, B. D., Laverack, M. A., Beeby, J. S., Dubovi, E. J., Glaser, A. L. High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR. J. Vis. Exp. (117), e54781, doi:10.3791/54781 (2016).

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