Høy throughput Påvisning av respiratoriske patogener i dyr eksemplarer av nanoskala PCR

Summary

Høy gjennomstrømming testing av DNA og RNA baserte patogener av nanoskala PCR er beskrevet ved hjelp av et syndrom hund og hest luft PCR panel.

Abstract

Nanoliter skala real-time PCR benytter romlige multipleksing for å tillate flere analyser som skal kjøres i parallell på en enkelt plate uten de typiske ulemper ved å kombinere reaksjonene sammen. Vi utviklet og evaluert et panel basert på dette prinsippet for å raskt identifisere tilstedeværelsen av felles smittestoffer hos hunder og hester med akutt luftveissykdom. Dette manuskriptet beskriver en nanoskala diagnostisk PCR arbeidsflyt for prøveopparbeidelse, forsterkning, og analyse av målpatogenet sekvenser, med fokus på prosedyrer som er forskjellige fra mikroliter skala reaksjoner. I luftpanelet presentert, ble 18-analyser hvert satt opp i tre eksemplarer, med plass til 48 prøver per plate. En universell utvinning og pre-forsterkning arbeidsflyt var optimalisert for høy gjennomstrømming prøveopparbeidelse for å romme flere matriser og DNA og RNA baserte patogener. Representative data presenteres for en RNA mål (Influensa A matrisen) og en DNA-mål (equine herpesvirus1). Evnen til å raskt og nøyaktig test for en omfattende, syndrom-baserte gruppen av patogener er et verdifullt verktøy for effektivisering og ergonomi diagnostisk testing og for akutt luftveissykdom diagnostikk og behandling.

Introduction

Med behov for rask og omfattende påvisning av multiple midler i klinisk diagnostikk for mennesker og dyr, enkelt-organisme molekylære diagnostiske metoder for deteksjon av patogen er byrde med mindre det brukes for et stort antall prøver blir testet for en enkelt sykdom. I veterinærsammenheng, high-throughput diagnostiske metoder er spesielt viktig på grunn av den ytterligere behovet for å dekke patogener fra en rekke arter. OneHealth tilnærminger for håndtering av matbåren sykdom og nye patogen overvåking er eksempler på testing behov som inkluderer en rekke bakterier, virus (DNA eller RNA-basert), parasitter og sopp. Utfordringen for å kombinere tester for flere analytter sammen (multipleksing) for å forbedre effektiviteten testing er et mulig tap av følsomhet og en stor byrde for optimalisering og validering av analyser.

Nanoliter skala real-time polymerase chain reaction (PCR) er en alternative til praksisen med multipleksing som gjør at mange separate reaksjoner å kjøre samtidig på samme prøve ^en. Den OpenArray plattformen er en anvendelse av dette prinsippet ^to; den kombinerer mikromatriseteknologi med real-time PCR. Basert på konseptet av romlig multipleksing, hver testede prøve for et stort antall av mål i separate gjennomgående hull. Denne plattformen ble opprinnelig brukt med cyanin-baserte dobbeltkjedet DNA-bindende kjemi ² og er nå tilgjengelige for probe-basert kjemi ved hjelp av mørke slukke prober ^3. Denne plattformen har først og fremst blitt brukt til genetisk profilering hos mennesker ⁴ og dyr ^5. Det ble nylig tilpasset til å detektere blodbårne DNA- og RNA-patogener ved Grigorenko et al. ⁶ ved bruk ^av en to-trinns revers-transkripsjon / pre-amplifikasjon (forforsterker) prosedyre.

Vi beskriver her en ett-trinns preamp-basert prosedyre for deteksjon av begge typer patogener i luft sekretions og en rekke andre prøvetyper som kan utføres helt i en standard arbeidsdag. Ved fullføring av ett-trinns-forforsterker, blir prøver overført til en 384-brønners plate, som er formatet akseptert av automatisert væskehåndteringssystemet som følger med denne nanoskala PCR plattformen. Systemet tegner konsentrat-blanding og prøve over overflaten på opptil fire plater (192 prøver og kontroller) på en gang. Etter dette lasting prosessen, beskriver vi hvordan prøvene er forsterket og analysert ved hjelp av en makro regneark som oppsummerer gjennomsnittet av 3 tekniske replikater for hver prøve / target kombinasjon i en tabell som passer på en trykt side.

En enhetlig fremgangsmåte for analyse av ekstraherte DNA og / eller RNA fra prøver ved å bruke denne plattformen ble etablert. Et bredt utvalg av prøver ble ekstrahert, revers transkribert, og pre-amplifisert i en 96-brønners-formatet, noe som minsker mulighetene for feil. Luftveis prøvene testet inkludert nasale vattpinner, dype svelg vattpinner,trans-tracheal vasker, bronchoalveolar kylling og lungevev. Siden noen av de testede midler kan også være tilstede i perifert blod eller avføring, innlemmet vi de typer av prøvene inn i prosedyren. Denne strømlinjeformet arbeidsflyt sparer tid og ressurser i forhold til å kjøre eksperimenter i flere plater ved å muliggjøre effektiv testing gjennom patogen og toksin genetisk testing panel-basert i stedet for individuell testing. Det luft panel demonstrert her hadde 18 analyser hvert trykt i tre eksemplarer gjennom-hull, med plass til 48 prøver per plate. Equine patogener oppdages inkludert hest adenovirus 1 og 2, hestearteritt-virus, hest rhinitt virus A og B, equine herpesvirus (EHV) type 1 og 4, og Streptococcus equi. Canine patogener inkludert canine respiratorisk corona (betacoronavirus), valpesykevirus, adenovirus, canine parainfluensavirus, canine pneumovirus, Bordetella bronchiseptica, og Mycoplasma cynos. ENuniversell influensa A-analyse og en intern kontroll (MS2 RNA-fag) ble også inkludert.

Protocol

Ingen mennesker eller forsøksdyr ble brukt for utvikling av denne protokollen. Kontroller ble generert ved rensing av sekvens bekreftet amplikonene og in vitro-transkripsjon av RNA-mål. Kliniske prøver ble sendt inn for rutinemessig diagnostisk testing til Cornell Animal Health Diagnostic Center.

1. Plate Design

1. Bruk primer design programvare for å kontrollere at hver analyse i samsvar med standard probe-basert real-time PCR sykkelforholdene med 60 ° C annealing ved hjelp av primer probe testverktøy (velg kvantifisering sonde innstillingen med standard parametere).
   MERK: Representanten RNA målet brukt var tilpasset fra den universelle influensa A matrise målrettet analyse publisert av Shu et al ^7.. De primere og probe er som følger: Spiss primer: GACCRATCCTGTCACCTCTGAC, Omvendt Primer: AGGGCATTYTGGACAAAKCGTCTA, Probe: Fam-TGCAGTCCTCGCTCACTGGGCACG-QSY. Representanten DNA-analysen er brukt her var tilpasset from hestens herpesvirus type 1 (EHV-1) påvisningsmetoden utgitt av Elia et al. ^8. De primere og probe er som følger: Spiss primer: GCTCTCAGGTTTTACGACATC, Omvendt Primer: CTTTACCCAGGCCCTTGAAA, Probe: FAM-TCAACGTGGACAATACCGCAGTGATTAT-QSY.
2. Bestill nanoskala PCR forsterkningsplater i ønsket konfigurasjon.
   MERK: For denne studien ble 18x3 genuttrykk formatet som brukes (tabell 1). Gi sekvenser for alle primere og prober (eller utvikles analyse IDer) for hvert mål til produsenten.

2. Nucleic Acid Utvinning

1. Ekstrahere total nukleinsyre (DNA og RNA) ved en hvilken som helst ønsket metode.
   MERK: En automatisert magnetiske kuler basert utvinning kit ble brukt her i henhold til produsentens instruksjoner (se materialer tabell for mer informasjon).
2. Forbered prøver som følger:
   1. Rengjør utsiden av hver prøve container med 10% blekemiddel og tørk grundig. Tørk hansker fInger tips med 10% blekemiddel mellom prøver å hindre kryssforurensning.
   2. Place nasal eller dype svelg vattpinner noe sterilt, forseglet rør (for eksempel en rød topp blod samling rør) med flere dråper saltvann tilsatt for å hindre uttørking før behandling.
      MERK: Bomull, plast, tre-håndteres, og Dacron og andre syntetiske spinner er alle akseptable, men unngå kalsium alginat vattpinner.
   3. For kompresser og tracheal vaskinger legger Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM), slik at det er minst 1-2 ml væske. Vortex pinnen og DMEM kraftig i røret. Deretter bruker en pipette til å overføre ca 1 ml av media til et nytt rør.
   4. Mekanisk lyse vev (100-200 mg i 1 ml DMEM) ved hjelp av et vev disruptor i henhold til produsentens instruksjoner, etterfulgt av sentrifugering i 3 minutter ved 825 x g. Overfør 500 ul av supernatanten til et nytt rør.
   5. For avføring, kombinere 400 mg av avføring med 800 mL av 1x fosfatbufret salinje pH 7,4 (PBS). Vortex suspensjonen i 1 min eller lengre tid inntil prøven er homogenisert eller fullstendig suspendert. Når homogenisert, sentrifuger suspensjonen i 10 minutter ved 18 000 x g, og deretter overføre 400 ul i et nytt rør.
   6. For hele ukoagulert blod, Vortex prøven og gjøre en 250 mL delmengde. Legg seks dråper lytisk reagens og virvle å blande. Inkuber 15 min ved 37 ° C.
3. Forbered lysis og vask buffere i henhold til produsentens instruksjoner. Legg MS2 fag eller en intern kontroll av valget til lysis buffer som en intern positiv utvinning kontroll ^ni.
4. Legg 235 ul lyseringsbuffer og 175 pl prøve (eller PBS for negativ kontroll) til hver perle rør. Fortsett med produsentens protokoll.
   MERK: Renset total nukleinsyre ble eluert her i 90 mL.

3. Revers-transkripsjon / Pre-forsterkning (preamp)

MERK: Hold alle reagenser og prøver som brukes ipreamp reaksjon på is til alle tider. Etter preamp, holde alle reagenser ved romtemperatur.

1. Montere eluerte DNA og / eller RNA, PCR Reaksjons- blanding, nuklease-fri vann som en negativ kontroll, og sammenslåtte standarder for positiv forsterkning kontroll.
   MERK: Opp til 48 prøver kan kjøres på en forsterkningsplate inkludert kontrollene (inkludere minst en negativ ekstraksjon kontroll for hver uttrekkingsplaten fra hvilken prøvene skal trekkes).
2. Skriv ut en prøve kartet. Ha en andre person sjekk at kartet og prøven layout kamp.
3. I et 1,5 ml tube, legger du til følgende for å klargjøre preamp mester mix.
   MERK: En sluttvolum på 14 ul ble anvendt her.
   1. Legg til en pool av forhåndsblandede primere fra hver skive, slik at sluttkonsentrasjonen av hver primer er 900 nM.
      MERK: Bassenget er brukt her var forberedt på en 10x konsentrasjon, og 1,4 mL tilsatt per reaksjon.
   2. Legg tilfeldige primere til en sluttkonsentrasjon på 600 nM eller 0.1x. Legg 2x RT-qPCR blandingen til halvparten av det endelige volum (7 ul her).
   3. Bland master mix komponentene sammen ved forsiktig virvling og spinne ned.
4. Utfør forforsterker i en standard 96-brønns plate ved hjelp av den venstre siden av platen bare (kolonnene 1-6).
5. Legg 8,5 mL av forforsterkeren konsentrat-blanding og 5,5 ul av DNA / RNA-prøve til hver brønn.
6. Etter å kombinere alle reagenser (prøver, positive kontroller og negative kontroller med preamp mix), grundig forsegle standard 96-brønns plate med en klar tape forsegling. Fjern overflødig forseglingen ved hjelp av et barberblad for å hindre dannelse av sel hull under sykling. Sentrifuger den forseglede platen i 20 sekunder ved anvendelse av en PCR-plate spinner. Sjekk for å sikre at alle reagenser er kombinert i bunnen av platebrønner.
7. Kjør preamp analysen på en konvensjonell termo under følgende betingelser: 15 minutter ved 50 ° C; 1 min ved 95 ° C; 20 sykluser med 15 sek ved 95 ° C, deretter 2 minutter ved 60 ° C; 99.9 & #176 C i 10 min; hold ved 4 ° C. Program disse forholdene før du starter.
8. Slå på den konvensjonelle termo, velg preamp sykkel program og starte programmet. Plasser 96-brønners plate i den thermocycler bare når den nedre delen av thermocycler (ikke dekselet) når den temperatur som er nødvendig for cDNA-produksjon (50 ° C) ved å overvåke temperaturavlesningen på skjermen. Før dette, holde platen kaldt for å minimere risikoen for å produsere falske positive resultater.
9. Når preamp løp er fullført, må du kontrollere at platen har forble forseglet.
10. Fortsett umiddelbart til trinn 4.1. For å lagre denne plate over natten, utfører fortynningen som beskrevet i trinn 4.2 til 4.5, med unntak av stedet for løst å dekke platen, forsegle plate med en klar tape forsegling og sted inne i en glidelås-lås pose, lagret ved 4 ° C.

4. Fortynning av Preamp Plate

1. Fjern riktig antall forsterkningsplater from fryseren (opp til 4 kan kjøres på en gang). Ikke åpne emballasjen. La maskinen for å varme opp i minst 15 minutter ved romtemperatur. Noter serienummer og partinummer av platen.
   MERK: Uåpnede plater kan oppbevares ved romtemperatur i opptil 24 timer, men for beste praksis, fjerne disse fra fryseren ikke mer enn 30 min før det trengs.
2. Sentrifuger det ferdige forforsterker platen i 20 sekunder ved å bruke PCR-platen spinner. Slå på forsterkning maskinen og datamaskinen og starte den tilknyttede programmet.
3. Fjern alle unødvendige elementer fra en PCR oppsett område. Ta på doble hansker og ermet deksler.
4. Fjern forseglingen fra preamp platen og fjern og kast de ytre hansker. Fortynn de pre-amp produktene til 1: 5 ved tilsetning av 56 ul TE-buffer til hver brønn av kolonnene 1-6 i 96-brønns plate forforsterker og blanding ved å pipettere opp og ned. Gå bare til første stopp av pipetten, aspirere fra bunnen og utlevering høyere opp, men ikke skapebobler. Legg TE-buffer til alle 6 kolonner uavhengig av ubrukte brønner.
5. Tett plate med enten en klar tape eller folie forsegling, og sentrifuger det i 20 sekunder ved å bruke PCR-platen spinner. Sett denne platen til side (løst dekket) til trinn 6.1 er fullført. Kast gjenværende hansker og ermet deksler.

5. Forberedelse til 384-brønnen Transfer til Amplification Plate

1. Sett opp materialer som trengs for å dekke og forsegle forsterkning plate: lokk, plug, sprøyte av nedsenking væske, plate trykker, etanol sprute flaske, og lofri laboratorie våtservietter. Fjern sprøytehetten og låse en liten plastspiss på sprøyten (krever kraft). Ta ut en liten mengde av nedsenking væske på et papirhåndkle for å fjerne luft buildup (det er ok hvis noen små luftbobler forbli i spissen). Bruk nedsenking væske i 60 min for å fjerne sprøyten fra vakuum forseglet aluminiumsposen. Når en sprøyte er åpnet, ikke feste hetten for senere bruk.
2. Kryss avat avfallsbøtte av platen lasting væskebehandler er tom og åpne esken av tips. Skriv utløpsdatoen for tips om spissen boksdekselet når en ny boks er åpnet, og sørge for at tips ikke er utløpt. Slå på væskebehandling og datamaskinen og åpne væskebehandler programvare, som vil utføre en selvtest.
3. Klikk "Setup og Load". Klikk på "Browse" for å velge csv fil opprettet fra Sample Tracker programvare. Hvis filen ikke vises, går du til "instrument / Rediger Innstillinger" og klikk "Change" med "Sample Plate File Folder". Velg mappen der csv filen er lagret. Klikk deretter på "Setup og Load", deretter "Browse" og velg filen.
4. Deretter klikker du på "Browse" ved siden av "Plate Holder posisjon 1" og velg TPF filen (gitt av produsenten) som har samme serienummer som platen.

6. Flytende Handler Transfer

Merk: Ikke start fidu fyller 384-brønns plate til alle de ovennevnte trinnene er fullført. Fordampning er en bekymring med små volumer - ikke la den 384-brønns plate sitte avdekket med væske inni.

1. Når alle de ovennevnte trinnene er fullført satt på nye, godt utstyrt doble hansker og ermet dekker. Deretter legger 2,5 mL av forsterkning Master Mix til et 384-brønners plate.
2. Overfør 2,5 ul av fortynnet forforsterker produktet til 384-brønners plate i henhold til kartet i tabell 2 og umiddelbart dekke platen tett med en folie tetning. Kast ytre hansker og ermet deksler.
3. Sentrifuger 384-brønners plate i 20 sekunder i PCR-platen spinner.
4. Ikke fjern folien segl, men plasserer den 384-brønners plate i væsken behandleren.
5. Åpne pakken som inneholder en innkapslet forsterkning plate og legg den forsiktig i væsken handler i det første sporet med serienummeret på høyre - hold saken i kantene uten å berøre overflaten of platen. Bruk uåpnende plater innen en time etter åpning.
   Merk: Formålet med saken er å beskytte platen blir berørt, siden dette kan forstyrre de små mengder av primere og prober inne i gjennomgående hull.
6. Fjern folien segl fra 384-brønners plate inne i væskebehandler når alt er på plass. Klikk på Neste og deretter sjekke alle boksene som hvert trinn er fullført. Klikk OK for å starte kjøringen.
7. Lukk døren til væskebehandling og umiddelbart starte påfyllingen. Bo ved siden av flytende handler og umiddelbart videre til neste trinn når platen er fylt.
8. Mens flytende behandleren kjører, fjerne den beskyttende filmen fra bunnen av en sak lokk.
   MERK: Limet i bunnen av kabinettet lokket er dekket av en rød bånd og en beskyttende film. Filmen må fjernes først for å få tilgang til det røde båndet.
   1. La den øverste filmen på plass til trinn 6.15. Prime byråkrati ved å trekke litt til release den fra limet.
9. Fjern lastet (fylt) forsterkning plate fra væsken handler og forsiktig plassere den i platepresse med serienummeret til høyre.
10. Sett lokket på toppen av platen med hakket på høyre og lim på bunnen (peker mot platen).
11. Trekk ned på tallerkenen trykker spaken forsiktig lukke det; lyset blinker i 20 sekunder. Ikke berør platepresse i løpet av denne tiden. Når lyset blir grønt, løft opp spaken forsiktig og fjern den forseglede platen forsiktig ved å holde den på kantene.
12. Ved å holde i forseglede forsterkning platen vertikalt ved kantene av tilfellet, straks setter sprøytespissen inn i lastehavn ved enden av saken, da avgi nedsenking fluidet sakte i en myk sammenhengende bevegelse for å fylle rommet mellom platen og den lokk. La en liten luftboble i hjørnet når platen er nedsenket.
13. Mens man fortsetter til hgamle platen vertikalt i kantene, forsegle lastehavn ved å sette støpselet inn i porten og vri pluggen med klokken, påføre tilstrekkelig trykk inntil håndtaket bryter av. Gripe kantene av saken fast, slik at styrken av håndtaket brudd forårsaker ikke er tilfelle å slippe. Hvis en plate blir droppet, kast den.
14. Rengjør tilfelle med en lofri tørke som har blitt grundig sprayet med etanol. Å tørke saken, tørk saken nedover med en ren tørke. håndtere saken forsiktig; være sikker på å ikke legge press på glasset over brønnene.
15. Bringe den forseglede platen til forsterkning maskinen. Under "Instrument" -fanen, velg "Instrument Console." Velg forsterkning maskin klikk deretter på "Åpen dør" -knappen.
16. Plasser forsterkning plate i den første sporet på platen adapter, sjekke at adapteren er riktig stilt opp med A1 i øvre venstre hjørne. Orientere plate med strekkode vendt opp og motfronten av instrumentet. Klikk på "Close Door" -knappen. Legg merke til at bruk av kortskuffen - det er en grense på 10 anvendelser.
17. Under kategorien Hjem nederst på skjermen, under Kjør-menyen, velg OpenArray. Klikk på «Få Plate IDer." De tomme boksene vil bli automatisk fylt ut med informasjon om platen. Til å begynne kjøringen, klikk "Start Run".
18. Lukk væskebehandler programvare og slå av væskebehandler. Plasser spissen dekselet over spissen rack. Kast tips fra avfallsbeholderen og rengjør den. Rengjør og rense alle elementer, inkludert arbeidsflaten, pipette, avfall bøtte, og tips bokser.
19. Tett preamp plate med en klar tape forsegling og oppbevares ved -20 ° C.

7. Resultat Analyse

1. Når kjøringen er ferdig, lagre filen og klikk deretter på "X" på fanen med oppkjøringen navn nederst på skjermen for å lukke filen.
2. Klikk på "Open Door"Øverst på skjermen for å åpne døren. Fjern forsterkning plate, sjekket at ingen nedsenking væske har lekket ut. Klikk på" Close Door "på toppen av skjermen for å lukke døren.
3. Klikk "Open" og velg Kjør filen for å åpne den. Trykk på den grønne Analyser knappen øverst til høyre på skjermen. Klikk "Export" på venstre side av skjermen og deretter "Start Export" å eksportere resultater (som en .txt-fil). Minimer filen etter at den åpnes. Deretter klikker du "Export QC Images".
4. Gjennomgå QC bilder i bildeanalyseprogram etter følgende kriterier:
   1. Vurdere lasting kvalitet med PRE-READ_CHANNEL_4.tiff og POST-READ_CHANNEL_4.tiff, ved å sjekke at det ikke er noen mørke flekker eller flekker.
      MERK: Et fargestoff oppdaget av denne kanalen er lagt til av produsenten til primere og prober, som er utgitt i løsningen når reaksjonen er lastet. Lese i denne kanalen viser at reaksjonene var riktiglastet og at primerne og proben blandet med farvestoff var til stede.
   2. Sjekk for lekkasjer eller agitasjon til platen etter lasting ved hjelp S02_C001_t03_p001_m1_x2_e1_cp # _spotfind.tiff. Hvis bildet ser mørkt, øke lysstyrken (trykk Ctrl + Shift + C for å åpne kontroller) før hele platen er synlig. Sjekk at bildet ser uniform uten skygger, bobler, eller ford prøver.
   3. Vurdere lokk plassering og rusk under lokket (lyse flekker) med STAGE2_CYCLE1_CHANNEL_1.tiff og STAGE2_CYCLE40_CHANNEL_1.tiff.
5. Valgfritt: Åpne et regneark som inneholder resultater Macro (kode Supplemental fil). I den eksporterte datafilen, høyreklikker du på fanen nederst på skjermen og velg "Flytt eller Kopier". I "å bestille" -feltet, velg "Resultater Macro.xlsm". Klikk "Flytt til slutt" og merk "Lag kopi". Klikk deretter på OK.
   1. Hvis resultatene Macro alternativet ikke vises i "å bestille" -feltet, simply kopiere innholdet i den eksporterte datafilen regneark (klikk på cellen øverst til venstre for å markere alle celler og Ctrl-C) og lim den inn i en ny fane.
6. Slett den gamle "Export" -fanen og deretter endre navn på den nylig lagt kategorien som "Export".
7. Klikk "Alt-F8" (eller klikk på Vis deretter Makroer) og velg "Macro" og klikk "Kjør". Deretter gjentar dette for Makro2 ved å klikke på "Alt-F8" og deretter velge "Makro2" og klikke "Run".
8. Endre navn på resultater Macro filen ved hjelp av relevant informasjon (dato og serienummer), sette denne informasjonen over tabellen, og lagre som samme filnavn i den eksporterte resultater mappen. Til slutt, skrive ut makro-genererte resultater tabellen.
9. I forsterkning maskin programvare, sjekk kurvene for hver prøve og kontroll mot makro tabellen ved å velge Analyse / Amplification Plot på venstre side av skjermen. Deretter velger Sample kategorien, og klikk på hver prøve åbekrefte at det er 2 eller 3 positive forsterkningskurver for hver av de positive resultatene i tabellen.
10. Slå av forsterkning maskinen.

Representative Results

Resultater er vist i figurene 1 og 2 for en representativ RNA-assay (influensa matrise) og DNA-analyse (EHV-1) med en kombinasjon av positive kontroller og kliniske prøver sendt inn for rutinemessig diagnostisk testing. Fluorescens-signalene som sendes ut i løpet av denne typisk reaksjon er vist i figur 1, som plotter rå fluorescens-verdier per syklus. Alle relative syklus terskel (CT) verdiene ble automatisk generert av forsterkningen maskinprogramvaren. Bakgrunnsfluorescens ble anvendt som en separat beregning for vurdering av lasting kvalitet i stedet for å innlemme det i fluorescens-målingene forut for beregning av Ct-verdier.

Den analytiske deteksjonsgrense (LOD) for hvert mål ble beregnet på grunnlag av den samlede gjennomsnittet av Ct-verdier på 95% deteksjonsnivå pluss 2 standardavvik i en pool av kontroller foralle mål. Den høyeste fortynningen hvor minst 95% av replika var positive for de representative analyser var 50 kopier; påvisning av 5 kopier var vellykket i 50% av replikater. Verken analysen ble oppdaget på under ett eksemplar. De Lods for RNA og DNA-analysen ble beregnet ved Ct-verdier på 21,92 og 20,05. Disse verdiene ble ansett å være den tidsavgrensninger for rapportering av verdier som positive vs. mistenkte (potensielt ikke gjentas).

Andre aspekter av analytiske resultater av målene ble vurdert ved hjelp av serielle fortynninger av sammenslåtte positive kontroller som er drevet på tre forskjellige dager (figur 2). De gjennomsnittlige effektiviteten av de representative RNA og DNA-analyser var 101,1% og 106,6%; total gjennomsnittseffektiviteten for alle mål var 101,3%. Analysene hadde også god linearitet ^(R2> 0,98). Variasjon innen replikere gjennomgående hull vanligvis var innenfor standardavvik på 0,2 for både kliniske prøver end kontroller. Ingen kryss-reaktivitet mellom en hvilken som helst av målene ble observert.

De endelige resultatene regneark i tilleggsfilen viser representative kvantitative resultater for 10 kliniske diagnostiske prøver og 4 kontroller. De kliniske prøver er en undergruppe av de typer prøver rutinemessig testet inkludert nasal / orofaryngeal vattpinner, lungevev, og fekale prøver. One (hest) avføringsprøve i dette settet viser en mislykket MS2 intern kontroll, noe som indikerer tilstedeværelse av inhibitorer i prøven. Dette blir vanligvis administrert ved fortynning av den eluerte prøve og / eller re-ekstraksjon. Som tilfellet er her, bør det negative kontroll forsterkningen være negativ for alle mål, og den negative kontrollen utvinning skal bare inneholde den interne kontrollen. I den kliniske sett, prøver produsert Ct-verdiene for betacoronavirus, Bordetella bronchiseptica, canine distemper virus A, canine parainfluensavirus, canine pneumovirus, og influensaEN.

Figur 1. Forsterkning plott. Fluorescens-avlesninger plottes mot amplifiseringscykluser for RNA-assay (A) og DNA-analyse (B). Trekanter er vist betegner Ct-verdier. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2. Standardkurver. Standardkurver fra RNA og DNA-assay testet på tre forskjellige dager er plottet, for å demonstrere den linearitet og utvalget av amplifikasjon ved anvendelse av positive kontroller. Syklus terskel (CT) verdier er plottet mot log (10) av det antall kopier av RNA (A) eller DNA ( Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Tabell 1. Skjematisk av forsterkerplate og mål-steder. Platene som brukes for nanoskala real-time PCR-testing på denne plattformen er objektglass størrelse og er anordnet i 48 undergrupper av 64 gjennomgående hull, med en total på 3072 gjennomgående hull for individuelle reaksjoner. En undergruppe er vist her, med 18 mål i tre eksemplarer. Hver prøve ble tilsatt til en undergruppe av væskebehandler. Platene er belagt med hydrofile og hydrofobe forbindelser for å holde reagensene i gjennomgående hull via overflatespenning. Den rustfrie brikken er "photolithographically mønstret og våt-etset for å danne en rettlinjet rekke 3072 mikro-maskinert, 320 mikrometer diamete. r hull på 33 nl hver ^"2 Forkortelser for målene er som følger: BCOR, canine respiratorisk corona (betacoronavirus); BORD, Bordetella bronchiseptica CAV, adenovirus, CPIV, canine parainfluensavirus, CPNV, canine pneumovirus; DISTA / B, hjørnetann distemper virus A og B; EADV1 / 2, hest adenovirus 1/2; EAV, hestearteritt-virus; EHV1 / 4, equine herpestypen 1/4; ERVA / B, heste rhinitt virus A / B; IVM, influensa A matrise; MCYNOS, Mycoplasma cynos, MS2, internkontroll (MS2 RNA-fag), SEQU, Streptococcus equi.

Tabell 2. Plate overføre kart. Et fargekodet kart for overføring plate ved hjelp av et fast 8-kanals pipette for å overføre fra den 96-brønns plate forforsterker til den 384-brønns plate er vist. Alternativt kan en justerbar pipette brukes. Den samme prosedyren blir utført hver gang uavhengig av h ow mange prøver er i platen.

Supplemental fil. En makroaktivert regneark-fil som inneholder to makroer for formatering resultatene i en sammendragstabell (som beskrevet i protokollen) er gitt. En typisk resultattabell som genereres av makroer er inkludert i filen (under Endelige resultater). De to makroer vil fylle ut prøvenavn i den første kolonnen (opp til 48 prøver) og gjennomsnittet av de tre Ct-verdier for hvert mål for de med positive resultater; oppmerksom på at målene som ikke forsterker vises blank i denne tabellen. Dette kan enkelt skrives ut på ett ark og brukes som en referanse for å sjekke rådata effektivt. I kategorien endelige resultatene er representative resultater for 10 kliniske prøver og 4 kontrollene som er vist. Forkortelser for analyse navn er oppført i forklaringen av tabell 1.www.jove.com/files/ftp_upload/54781/supplemental_code_file_R1.xlsm "target =" _ blank "> Klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

Denne prosedyren har vært brukt for rutinemessig testing av åndedretts patogener i vårt laboratorium i løpet av seks måneder (2-3 ganger per uke). Vi har også hatt suksess ved anvendelse av samme prosedyre for profilering enteriske patogen i fekale prøver og bakterieisolater på en særskilt tilpasset plate. Når platene er produsert, kan erfarne medarbeidere fullføre trinn 2-7 i løpet av en standard arbeidsdag. De mest kritiske trinn er et riktig tetning av forforsterkeren plate, overføring av preamplified prøver mellom platene (som må gjøres raskt for å forhindre fordampning), og den endelige dekning av forsterkningsplaten. Bruk av makroarket som en guide for resultatanalyse (sjekke kurvene for prøver og kontroller) var også kritisk som det sterkt redusert mengden av tid og papirene som trengs for denne prosessen. Den angitte makroarket er et eksempel; det må endres eller re-laget for plater med forskjellige konfigurasjoner. Dette kan lett bli performed av noen med grunnleggende regneark kunnskap.

På grunn av den meget lille mengden av prøven applisert på forsterkningsplaten (33 nl) blir pre-forsterkning kreves. Ved optimalisering av denne protokoll (ikke vist), sammenlignet vi en rekke parametere inkludert Preamplification den konsentrat-blanding, tilsetning av tilfeldige primere, antall sykluser, annealing tid, og fortynning før amplifikasjon. Hvert mål hadde sin egen optimale forhold, og de som er beskrevet her representerer de som ga det beste deteksjonsgrensen samlet for vårt panel. Dette panelet dekker et bredt spekter av sykdomsfremkallende mål og prøvetyper som er oppstått i rutine veterinær diagnostiske tester, men modifikasjoner på preamplification prosedyrer kan være nødvendig for forskjellige paneler. Produsenten-optimalisert amplifikasjonsbetingelser er basert på et standard sonde-baserte real-time PCR protokoll med en 10 min ved 95 ° C enzymaktivering, etterfulgt av denaturering ved 95 ° C og annealing / forlengelse ved 60 ° C. De primere og prober er forhåndstrykt på platene også bruker produsent optimalisert forhold og derfor ikke krever titrering. Ved å kombinere de revers-transkripsjon og pre-forsterkertrinn for alle prøver (uten hensyn til hvilken type mål) var nødvendig for å opprettholde effektiviteten i arbeidsflyten. Etter å ha alle prøvene reverstranskribert er også gunstig for å maksimere følsomheten. Videre gir bruk av en masterblanding for en forforsterker som er optimalisert for å minimalisere inhibitorer fleksibilitet i å kombinere forskjellige prøvetyper på samme plate.

The Center for Disease Control (CDC) influensa matrise analysen beskrevet av Shu et al. ⁷ og tilpasset her for nanoliter skala reaksjoner er en universell influensa A-analysen som er egnet for testing prøver fra mennesker og selskapsdyr. Det er designet for universell deteksjon av matrisen genet av alle influensa A-virus ved hjelp av mikroliter skala reactions. Det har blitt brukt over hele verden som en del av en CDC menneskelig influensavirus Panel og en CDC Swine Flu Panel. Den EHV-1-analysen ^åtte tilpasset her oppdager en viktig respirasjonspatogenet av hester som kan forårsake aborter og nevrologisk sykdom (gjennomgått av Pusterla og Hussey ^10). Betydningen av å tilpasse disse testene til en high-throughput-plattform med et arts uavhengig intern kontroll er at de kan bli inkorporert i en OneHealth overvåking tilnærming. Å ha begge disse analysene på en høy gjennomstrømming testing plattform vil lette beredskap for kliniske anlegg, tilfluktsrom og performance events.

Resultatene som er beskrevet ovenfor var representative for alle målene på plate med unntak av Mycoplasma cynos, som viste betydelig mer variasjon i analytiske resultater. Dette var sannsynligvis på grunn av sub-optimale smeltetemperatur (T _m) av primerne, som bør ideelt sett være 58-60 &# 176, C (ideelt sonde Tm er 68-70 ° C). En begrensning av denne plattformen er at det tar lengre tid å designe og produsere platene enn for bestilling av individuelle sonder, som begrenser muligheten til å raskt endre sekvenser. En annen begrensning av real-time PCR generelt er manglende evne til å oppdage nye eller uventede patogener. Dette kan overvinnes i en viss utstrekning ved å utforme analyser som svarer til sekvenser i flere arter, men objektive hele genomet sekvense baserte metoder er mer egnet for oppdagelse av nye midler. ^11,12

Nanoskala real-time PCR gjør et nytt paradigme for syndrom basert snarere enn artsbasert testing, noe som er nyttig for å redusere reagenvolumer og lønnskostnadene i high-throughput molekylær diagnostikk. Storskala panel testing av denne tilnærming kan lette OneHealth overvåkings forsøk slik som de som er beskrevet av Dunne og Gurfield ¹³ og Moutailler et al., ^14. Innsamling av penselprøver tidlig,vanligvis innen 3 dager etter klinisk utbruddet, gir den beste muligheten for å identifisere tilstedeværelsen av respiratoriske patogener. Infeksjonssykdom veksten er ofte uforutsigbar, og tester som kan utføres på forskjellige arter uten behov for endring av reagenser er ideelle for beredskap. Fremtidige anvendelser av denne teknologi er sannsynlig å være i pathotyping, antibiotikaresistens profilering, og ytterligere syndrom-baserte diagnostiske paneler. Nanoskala real-time PCR er mest nyttig for rask, high-throughput screening av flere prøve og patogen typer, og vil bli supplert med deg eller delvis partisk sekvensebaserte tilnærminger for å identifisere nye og emergent patogener.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zap-OGlobin II lytic reagent	Beckman Coulter	7546138	Optional reagent for preparing blood samples.
Extraction kit (MagMAX Total Nucleic Acid Isolation Kit)	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	AM1840	Other extraction kits appropriate for the desired sample types may be substituted. This kit comes with PBS, lysis buffer, and wash buffer.
2x One-Step RT-qPCR mix (qScript XLT One-Step RT-qPCR ToughMix)	Quanta Biosciences	95134-500
Gene-specific primer pool	IDT	custom order	Can be generated by the user or purchased with the amplification plates.
Random primer mix	New England Biolabs	S1330S
Standard 96-well plate	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	N8010560	This can be any plate that fits into the conventional PCR machine used.
Amplification master mix (OpenArray master mix)	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4462164
Clear adhesive seal	Thermo-Fisher	430611
Foil seal	Excel Scientific	AF-100
384-well plate	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4482221
Amplification plate (QuantStudio 12K Flex OpenArray plate)	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4470813	Can be customized with any assays conforming to standard TaqMan conditions.
Accessories kit	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4469576	Contains the case lids, plugs, and immersion fluid.
AccuFill tips	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4457246
Amplification machine (QuantStudio 12K Flex Real-Time PCR System)	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4471090
Liquid handler (OpenArray AccuFill System)	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4457243	This is purchased with the amplification machine.
Primer design software (Primer Express)	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4363991	See manufacturer's instructions for detailed primer and probe specifications.
Image analysis program (ImageJ)	NIH		Available at http://imagej.nih.gov/ij/
Spreadsheet program (Excel)	Microsoft		Available at https://products.office.com/en-us/excel
DMEM	Thermo-Fisher/Gibco	11965-092
Tissue disruptor (TissueLyser II)	Qiagen	85300
Conventional thermal cycler (Veriti)	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4375786	Any conventional thermal cycler with a heated lid can be used.
PCR plate spinner	VWR	89184-608	This device has only one speed (2,500 rpm); the rotor starts when the lid is closed and stops when the button is pushed.
TE buffer	Millipore	8890-100ML	10 mM Tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride, 1 mM Ethylenediaminetetraacetic acid, pH 8.0