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Medicine

अलगाव और कुत्ते धमनियों और नसों से प्राथमिक endothelial कोशिकाओं की संस्कृति

Published: November 18, 2016 doi: 10.3791/54786
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Clinical Sciences of Companion Animals, Faculty of Veterinary Medicine, Utrecht University

Introduction

कुत्तों हृदय रोग अनुसंधान के लिए बड़े जानवर मॉडल के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं और यह भी सहज (जेनेटिक) संवहनी असामान्यताएं 1, 2 से ग्रस्त कर सकते हैं। इन रोगों वाणिज्यिक endothelial सेल लाइनों अक्सर endothelial सेल (ईसी) की कार्यक्षमता का आकलन करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं अध्ययन करने के लिए। कुत्तों के लिए वहाँ एक वाणिज्यिक endothelial सेल लाइन उपलब्ध है (CnAOEC), कुत्ते महाधमनी से प्राप्त होता है। यह सेल लाइन ज्यादातर के रूप में नियंत्रण सामान्य ईसीएस 3-5 अध्ययन में प्रयोग किया जाता है। मानव हृदय अनुसंधान के क्षेत्र में सबसे अधिक इस्तेमाल किया endothelial सेल लाइनों मानव नाल की शिरा endothelial कोशिकाओं (HUVECs) और मानव नाल धमनी endothelial कोशिकाओं (HUAECs) मानव गर्भनाल शिरा और धमनी, क्रमशः से निकाली गई है। HUVECs 1980 के दशक के बाद से 6 संवहनी अनुसंधान के क्षेत्र में स्वर्ण मानक के रूप में इस्तेमाल किया गया है। वे endothelial समारोह और रोग अनुकूलन अध्ययन करने के लिए क्लासिक मॉडल प्रणाली माना जाता है। विभिन्न रक्त वाहिकाओं से अलग endothelial कोशिकाओं appearanc में भिन्नताई और आनुवंशिक पृष्ठभूमि और microenvironment 7 के लिए जोखिम के कारण कार्यक्षमता। इसके अलावा, HUVECs और HUAECs, गर्भनाल से प्राप्त कर रहे हैं एक विकासात्मक संवहनी संरचना है कि शर्तों के संबंध में पूरी तरह से नकल वयस्क रक्त वाहिकाओं वे करने के लिए और रोग के जवाब सामने आ रहे हैं नहीं हो सकता है। इसलिए, सामान्य रूप में हृदय रोग के लिए HUVECs में पाया परिणाम और HUAECs अनुवाद अपर्याप्त है।

जब अनुकूलन और वयस्क ईसीएस के व्यवहार का अध्ययन, ब्याज की पोत से प्राथमिक ईसीएस एक और अधिक प्रत्यक्ष दृष्टिकोण के रूप में इस्तेमाल किया जाना चाहिए। इन कोशिकाओं को अलग करने के लिए, कई तरीकों की जानकारी मिली है। एक व्यापक रूप से वर्णित विधि है, जो भी HUVECs के लिए प्रयोग किया जाता है, एक enzymatic पाचन समाधान 8 के साथ पोत निस्तब्धता है। इस बार इस तरह की चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं और fibroblasts 9 के रूप में गैर-ईसीएस के साथ संदूषण में परिणाम है। अलगाव के लिए एक और अक्सर इस्तेमाल किया विधि कीमा पोत ऊतक के enzymatic पाचन fluorescence- द्वारा पीछा किया हैसक्रिय सेल छँटाई (FACS) और भेदभाव (सीडी) 31 7, 8। FACS छँटाई के endothelial सेल मार्कर क्लस्टर बाद सेल संस्कृति के आधार पर कोशिकाओं की अपेक्षाकृत बड़ी मात्रा की आवश्यकता है और इसलिए छोटे रक्त वाहिकाओं से endothelium के अलगाव के लिए उपयुक्त नहीं है। इसलिए हम उच्च शुद्धता के साथ विभिन्न कुत्ते रक्त वाहिकाओं से एक शुद्ध endothelial सेल आबादी को अलग-थलग करने के लिए एक नया मजबूत विधि को विकसित करने के उद्देश्य से। नई अलगाव विधि की क्षमता का परीक्षण करने के लिए, हम अलग अलग और कुत्ते धमनियों और नसों, दोनों बड़े और छोटे से शुद्ध कुत्ते प्राथमिक Endothelial सेल (CaPEC) संस्कृतियों प्राप्त की। इस विधि को भी इस तरह के सहज अंतर या अतिरिक्त यकृत portosystemic शंट, कुत्तों 2 में एक आम बीमारी के रूप में रोगग्रस्त और / या न्यायपालिका जहाजों से होने वाले endothelial कोशिकाओं की संस्कृति सक्षम बनाता है। पोत के बाद से सबसे int रहता विधि ऐसे संवहनी चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं के रूप में ही पोत के अतिरिक्त प्रासंगिक प्रकार की कोशिकाओं के अलगाव की अनुमति देता हैप्रक्रिया के दौरान काम करते हैं।

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Protocol

आचार बयान: रक्त वाहिकाओं इस अध्ययन में इस्तेमाल ताजा कुत्ते शवों से प्राप्त अधिशेष सामग्री के रूप में काटा गया (एन = 4) स्वस्थ कुत्तों अन्य असंबंधित अनुसंधान (विश्वविद्यालय 3R नीति) के लिए euthanized से। न्यायपालिका रक्त वाहिकाओं (अंतर और extrahepatic portosystemic शंट, एन = 1 प्रत्येक) एम्सटर्डम विश्वविद्यालय के साथी जानवरों के लिए विश्वविद्यालय क्लिनिक के समक्ष प्रस्तुत कुत्तों से मालिकों की सूचित सहमति के बाद पोस्टमार्टम काटा गया।

1. अलगाव और प्राथमिक कुत्ते endothelial कोशिकाओं की संस्कृति

  1. प्री-कोट 2 मिलीग्राम / अच्छी तरह से 0.5% w / v जिलेटिन और साथ 6 अच्छी तरह प्लेटें 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ 2 के एक humidified वातावरण के साथ एक मशीन में 2 घंटे के लिए छोड़ दें। प्राथमिक कोशिकाओं बोने से पहले अतिरिक्त जिलेटिन समाधान निकालें।
  2. Aseptically एक ताजा कुत्ते शव (चित्रा 1 ए) से रक्त वाहिका (s) ब्याज की (जैसे, महाधमनी, रग कावा, रग Porta) को हटा दें। पोत प्रणाली का शरीर रचना विज्ञान बनाए रखेंब्याज की पोत के दोनों सिरों पर सीधे संदंश रखकर। endothelial कोशिकाओं को नुकसान को रोकने के लिए संदंश के साथ ऊतक के अनावश्यक हेरफेर से बचें।
    1. शल्य कैंची के साथ दोनों सिरों पर clamped पोत कट और शव से हटा दें। हांक बैलेंस्ड नमक समाधान (HBSS) बर्फ पर परिवहन में।
      नोट: लगभग 5 सेमी की एक पोत की लंबाई इस प्रक्रिया के लिए पसंद किया जाता है, लेकिन उन है कि 1 सेमी को मापने भी संस्कृति के लिए पर्याप्त कोशिकाओं को प्रदान करेगा।
  3. ठंडा HBSS के साथ भरा एक पेट्री डिश के लिए रक्त वाहिका स्थानांतरण। शल्य कैंची का प्रयोग, पोत के बाहर से किसी भी पक्षपाती ऊतक और वसा को हटाने, पोत खुद को बरकरार (चित्रा 1 बी) रखे हुए हैं। एक दबाना या इष्टतम देखने के लिए संदंश के साथ एक तरफ खींचने के आसपास के ऊतकों: सुनिश्चित करें कि पोत पर हर समय स्पष्ट रूप से दिख रहा है जब काटने बनाओ।
    1. संयुक्ताक्षर के साथ पोत के किसी भी शाखाओं को बंद (जैसे, polyglactin 3-0) और बाद में उन्हें हटाने के लिएशल्य कैंची या एक छुरी के साथ।
  4. ध्यान से, एक घुमावदार Halsted मच्छर संदंश के साथ एक पोत अंत में प्रवेश पोत के दूसरे छोर पर संदंश की नोक दबाना और फिर वापस लेना, धीरे धीरे पोत inverting जब तक यह पूरी तरह से अंदर बाहर (चित्रा 1 सी-जी) है। बाहर अब endothelial सेल परत के होते हैं। किसी भी कठिनाई का सामना करना पड़ा पोत inverting पर है, तो फिर HBSS में डूब घर्षण को कम करने के लिए।
  5. पोत के दोनों सिरों पर पर्स-स्ट्रिंग टांके की जगह यह पूरी तरह से बंद करने के लिए और पाचन प्रक्रिया (चित्रा 1H) के लिए किसी भी गैर endothelial संवहनी ऊतक के प्रदर्शन को रोकने के। उल्टे पोत में हेरफेर करने के संयुक्ताक्षर सिरों का प्रयोग करें।
  6. अगर पाचन और संस्कृति बाद में किया जाता है, उल्टे पोत पाचन प्रोटोकॉल (1.7 कदम) के लिए पहले cryopreserve।
    1. एक cryovial में उलटा पोत की जगह और सेल संस्कृति ठंड माध्यम से भरना। -80 डिग्री सेल्सियस तक नीचे रुक एक ठंड सह का उपयोग करntainer। -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर यदि वाहिकाओं एक सप्ताह के भीतर इस्तेमाल हो रहे हैं। लंबी अवधि के भंडारण, -180 डिग्री सेल्सियस पर जगह cryovials लिए। जब चुनाव आयोग अलगाव प्रदर्शन, एक पानी के स्नान (37 डिग्री सेल्सियस) में तेजी से पिघलना cryovials और तुरंत ठंडा HBSS में जगह है। के रूप में 1.7 में संकेत आगे बढ़ें।
      नोट: खाता है कि अलगाव के बाद ईसीएस की कुल उपज जमने की प्रक्रिया के दौरान व्यवहार्यता की कमी की वजह से कम हो जाएगा में ले लो।
  7. एक 50 मिलीलीटर ट्यूब पोत स्थानांतरण और यह दो बार कुल्ला HBSS में (चित्रा 1 मैं) (विगलन के मामले में या अवशिष्ट ठंड माध्यम) एरिथ्रोसाइट्स हटा दें।
  8. एक 30 मिलीलीटर कोलैजिनेज़ प्रकार द्वितीय (0.15 यू / एमएल) और Dispase (0.15 यू / एमएल) के कुत्ते endothelial कोशिकाओं में मध्यम विकास (CECGM) 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर रुक-रुक कर कोमल के साथ समाधान के साथ एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में पोत डाइजेस्ट आंदोलन।
  9. ट्यूब से पोत निकालें और 250 पर 5 मिनट के लिए सेल निलंबन अपकेंद्रित्र x जी।
  10. CECGM एक में सेल गोली Resuspendएन डी बीज 2 मिलीलीटर सेल निलंबन अच्छी तरह से प्रति (1 - पोत के आकार पर निर्भर करता है 3 कुओं)। संस्कृति हवा में 5% सीओ 2 के साथ एक humidified वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं और एक सप्ताह में दो बार संस्कृति के माध्यम से बदल जाते हैं।
  11. पारित होने कोशिकाओं जब 70 वर्ष की एक confluency - 80% तक पहुँच जाता है।
    1. मृत या गैर जुड़ी कोशिकाओं को हटाने के लिए पूर्व गर्म HBSS के साथ कोशिकाओं को धो लें। अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए 200 μl पुनः संयोजक सेल-हदबंदी एंजाइम (1x) जोड़ें और 5 मिनट के लिए या जब तक सभी कोशिकाओं को अलग कर रहे हैं इनक्यूबेटर में वापस जगह है।
    2. एक 15 मिलीलीटर ट्यूब कोशिकाओं स्थानांतरण और 10 (CEGM) 10% भ्रूण बछड़ा सीरम (एफसीएस) सहित संस्कृति मीडिया के मिलीलीटर जोड़कर trypsinization बंद करो। 250 x जी पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र। एक जिलेटिन पूर्व लेपित प्लेट या कुप्पी में संस्कृति को जारी रखें।

2. विशेषता

  1. संस्कृति कुत्ते महाधमनी endothelial कोशिकाओं (CnAOECs) और प्राथमिक और वाणिज्यिक सेल लाइनों में दो बार एक माइक्रोस्कोप के साथ साप्ताहिक की आकृति विज्ञान की तुलना करें।
    नोट: टीवह ठेठ पैच में ईसीएस के पैटर्न बढ़ रही है जब> 70% की एक confluency तक पहुँच जाता है सबसे अच्छा मनाया जा सकता है।
    1. एक 0.5% w / वी जिलेटिन पूर्व लेपित T75 कुप्पी पर CECGM में संस्कृति CnAOECs। एक सप्ताह में एक बार पारित होने कोशिकाओं confluency 70 है जब - 80%।
      1. passaging के लिए, पूर्व गर्म HBSS के साथ एक बार कोशिकाओं को धोने और 1 मिलीलीटर पुनः संयोजक सेल-हदबंदी एंजाइम (1x) जोड़ें। कुप्पी इनक्यूबेटर में वापस 5 मिनट के लिए या जब तक सभी कोशिकाओं को अलग कर रहे हैं रखें। 10% एफसीएस सहित 10 मिलीलीटर संस्कृति के माध्यम से (CEGM) जोड़कर trypsin निष्क्रिय। 250 XG पर 5 मिनट के लिए सेल निलंबन अपकेंद्रित्र, तैरनेवाला त्यागें और 1 मिलीलीटर संस्कृति के माध्यम में कोशिकाओं resuspend।
      2. सेल निलंबन के एक 10 μl विभाज्य लो और 1 पतला: 1 0.4% trypan नीले रंग के साथ। एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग कोशिकाओं की गणना, और एक नया T75 फ्लास्क में 4.0 x 10 5 व्यवहार्य कोशिकाओं बाहर थाली। 5% सीओ 2 के साथ एक humidified वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर फ्लास्क और संस्कृति के लिए पूर्व गर्म CECGM के 10 मिलीलीटर जोड़ें।
  2. सुसंस्कृत CaPECs और CnAOECs बीतने के 1 से अलग आरएनए।
    1. , एक गोली के रूप में कम से कम 1 एक्स 10 3 कोशिकाओं लीजिए नमूना तैयार अभिकर्मक (एसपीआर) के 20 μl जोड़ें और 1 मिनट के लिए सेते कोशिकाओं lyse करने के लिए। ऊष्मायन के बाद, ध्यान से -70 डिग्री सेल्सियस पर कुल शाही सेना और दुकान से युक्त सेल lysate इकट्ठा।
  3. एक सीडीएनए संश्लेषण किट (जैसे, iScript) निर्माता के निर्देशों का पालन करने के लिए का उपयोग सीडीएनए mRNA कन्वर्ट। qPCR प्रदर्शन करने के लिए तैयार है जब तक लंबी अवधि के लिए 4 डिग्री सेल्सियस एक सप्ताह तक, या -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर सीडीएनए।
  4. endothelial मार्कर CD31 के जीन की अभिव्यक्ति को मापने endothelial सेल मूल पुष्टि करने के लिए। प्रयोगात्मक सेटअप और मात्रा का ठहराव MiQE संक्षिप्त दिशा निर्देशों 10 का उपयोग कर प्रदर्शन करना। सामान्य बनाने के लिए, संदर्भ जीन GAPDH, RPS19, और B2MG 11 की अभिव्यक्ति को मापने।
    1. nuclease मुफ्त पानी में प्राप्त सीडीएनए की एक 10 गुना कमजोर पड़ने को तैयार है।
    2. तैयार करनामानक लाइन के लिए जमा सीडीएनए नमूनों से एक 4 गुना कमजोर पड़ने और एक गैर टेम्पलेट नियंत्रण के रूप में nuclease मुफ्त पानी का उपयोग करें। नमूने पांच गुना पतला qPCR प्रतिक्रियाओं के लिए एक 50 गुना कमजोर पड़ने की कुल तक पहुँचने के लिए। एक 384 अच्छी तरह प्रारूप 4 μl सीडीएनए और fluorophore रिवर्स और आगे प्राइमर (तालिका 1) के 20 pmol के साथ मिश्रित के 6 μl का उपयोग करने में दो प्रतियों में पिपेट 10 μl प्रतिक्रियाओं।
    3. विकृतीकरण के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर Taq पोलीमरेज़ क्रियान्वयन के लिए 5 मिनट, 10 सेकंड के 39 चक्र द्वारा पीछा किया, और annealing और बढ़ाव के लिए टीएम पर 30 सेकंड के लिए 95 डिग्री सेल्सियस के लिए कार्यक्रम निर्धारित किया है। प्रत्येक प्राइमर सेट के लिए टीएम तालिका 1 में दिखाया गया है।
    4. निष्पादित करें पिघलने वक्र हर चलाने के बाद केवल एक ही उत्पाद को सुनिश्चित करने परिलक्षित होता है विश्लेषण करती है। संदर्भ जीन की औसत रिश्तेदार राशि का उपयोग कर नमूने की अभिव्यक्ति के स्तर मानक के अनुसार, और ΔCt की गणना करता है, तो प्रतिक्रिया दक्षता 95% और 105% के बीच है।
  5. एक angi के साथ चुनाव आयोग कार्यक्षमता का आकलनogenesis परख।
    1. एक पूर्व ठंडा angiogenesis स्लाइड के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए बाह्य मैट्रिक्स के 10 μl जोड़ें और अच्छी तरह से की सतह को कवर करने के लिए एक विंदुक टिप के साथ फैल गया। बर्फ पर बाह्य मैट्रिक्स रखें और जेल में हवा के बुलबुले की शुरूआत करने से बचें। स्लाइड एक पेट्री डिश में पानी लथपथ कागज तौलिये के साथ एक मशीन में 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ 2 के साथ 30 मिनट के लिए रखकर जेल जमना।
    2. 1.0 x 10 4 प्राथमिक जोड़े ईसीएस में 50 μl Endothelial मध्यम विकास अच्छी तरह से प्रति। 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 6 घंटे के लिए स्लाइड सेते हैं।
    3. 6 घंटे के बाद एक 20X बढ़ाई के साथ तस्वीरें लेने के लिए, छवि में पूरे अच्छी तरह से शामिल करने के लिए सुनिश्चित कर रही है।

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Representative Results

अलग रक्त वाहिकाओं को सफलतापूर्वक वर्णित अलगाव प्रोटोकॉल (चित्रा 2) के अधीन थे। यह काटना और महाधमनी, रग कावा, रग Porta, और कोरोनरी धमनी स्वस्थ कुत्तों से पलटना संभव था (प्रत्येक कुत्ते से सभी जहाजों, एन = 4)। एक ही दृष्टिकोण ईसीएस दो जन्मजात portosystemic शंट (extrahepatic और intrahepatic, एन = 1 प्रत्येक) से अलग थे के साथ। हालांकि महाधमनी आसानी से उलटा था, वक्ष महाधमनी खंडों उदर महाधमनी से ज्यादा चुनौतीपूर्ण थे। वक्ष खंडों में महाधमनी कई पसलियों के बीच इसे से शाखाओं में बंटी धमनियों, जो पाचन समाधान करने के लिए सख्ती से endothelial प्रदर्शन को सुनिश्चित करने के लिए व्यक्तिगत रूप से ligated किए जाने की जरूरत है। दुम रग कावा की विच्छेदित खंड गुर्दे की नसों, जो उलटा पहले ligated किए जाने की आवश्यकता की शाखाओं में बंटी बिंदु शामिल थे। पोर्टल रग gastroduodenalis का योगदान शाखा नस के लिए रक्त वाहिका का उलटा पहले ligated था। coronar(- एक मध्यम आकार के कुत्ते में 2 मिमी व्यास लगभग 1), जिसमें से हम सिकमफ़्लक्स शाखा के एक खंड excised कुत्तों में वाई धमनी में एक बहुत छोटे रक्त वाहिका है। क्योंकि यह एक छोटे व्यास है, यह 1 सेमी की एक नहीं बल्कि छोटे खंड पलटना है क्योंकि मच्छर संदंश बहुत आगे नहीं डाला जा सकता है आसान साबित हुई।

एक दिन पोस्ट अलगाव पालन कोशिकाओं संस्कृति की थाली में दिखाई दे रहे थे। संस्कृति में, CaPECs एक polygonal आकार था और के रूप में 3 चित्र में दिखाया पैच में बढ़ने की प्रवृत्ति प्रदर्शित किया endothelial कोशिकाओं की कई कालोनियों 3 मनाया जा सकता है -। 6 दिन अलगाव के बाद। संस्कृति में लगभग 10 दिनों के बाद 80% की एक confluency तक पहुँच गया था और कोशिकाओं को पार किया जा सकता है। पर जो बात वे बढ़ती बंद कर दिया: औसत पर प्राथमिक endothelial संस्कृतियों 8 मार्ग की एक अधिकतम (4 एक बार 1 के एक विभाजन दर पर साप्ताहिक) के लिए बनाए रखा जा सकता है।

इसोलाटेड endothelial कोशिकाओं endothelial सेल मार्कर CD31 के रूप में qPCR (चित्रा 4) ने संकेत दिया व्यक्त किया। चार कुत्तों से महाधमनी, रग कावा, और रग Porta से निकाली गई endothelial कोशिकाओं में अभिव्यक्ति CnAOECs के एक नियंत्रण संस्कृति के साथ तुलना में किया गया था। सुसंस्कृत प्राथमिक कोशिकाओं नियंत्रण ईसीएस (Kruskall वालिस, पी = 0.856) के साथ एक तुलनीय CD31 अभिव्यक्ति थी।

के रूप में चित्रा 5 में दिखाया गया महाधमनी, रग रग कावा और पोर्टा से निकाली गई CaPECs के बाद angiogenesis स्लाइड पर 6 घंटा ऊष्मायन शाखाओं में पता चला।

आकृति 1
चित्रा 1: विदारक और endothelial सेल अलगाव के लिए रक्त वाहिकाओं Inverting। ए) ब्याज की रक्त वाहिनियों aseptically एक ताजा कुत्ते शव। बी) के पक्षपाती ऊतक और / या पोत आसपास के remov होना चाहिए वसा से निकाल दिया जाता हैएड ध्यान से पोत ही (कुत्ते रग कावा, 5 सेमी की पेट खंड)। सी) एक घुमावदार Halsted मच्छर संदंश के साथ नुकसान पहुँचाए बिना शल्य कैंची के साथ, पोत endothelial परत perforating के बिना प्रवेश किया जा सकता है। डीजी) दूसरे पर संदंश सुरक्षित रक्त वाहिनियों के अंत और धीरे वापस लेना है, जिससे पूरी तरह से रक्त वाहिका inverting। Endothelial परत पोत। एच के बाहर पर अब है) पर्स-स्ट्रिंग टांके सिरों उल्टे पोत। मैं) रक्त वाहिका धोने के लिए एक 50 मिलीलीटर ट्यूब को सौंप दिया है की गैर endothelial सतह से बंद करने पर रखा जाता है और बाद में पाचन। स्केल सलाखों 2 सेमी संकेत मिलता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
बी) एक औंधा रग Porta (स्वस्थ कुत्ता)। सी) एक औंधा रग कावा खंड (स्वस्थ कुत्ता)। डी) एक औंधा कोरोनरी धमनी खंड (स्वस्थ कुत्ता)। ई) एक औंधा extrahepatic portosystemic अलग धकेलना एक स्तूप टेरियर (उम्र: 6 सप्ताह पुराने) से निकाली गई। एफ) एक औंधा intrahepatic portosystemic अलग धकेलना एक आयरिश wolfhound (उम्र से निकाली गई: 8 सप्ताह पुराने)। स्केल सलाखों 2 सेमी संकेत मिलता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3:।। सेल आकृति विज्ञान चित्र दो सप्ताह के जहाजों के पाचन के बाद लिया गया ए) ईसीएस निकाली गई frपारित होने 2. बी में ओम कुत्ते महाधमनी) ईसीएस पारित होने 2. सी में कुत्ते रग कावा से व्युत्पन्न) पारित होने 2. सभी चित्रों में कुत्ते रग Porta से निकाली गई ईसीएस 4X मूल बढ़ाई साथ लिया जाता है। स्केल सलाखों 500 माइक्रोन से संकेत मिलता है। सम्मिलित 10X बढ़ाई पता चलता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4: CD31 के जीन की अभिव्यक्ति। मार्ग 1 में endothelial कोशिकाओं महाधमनी, रग कावा, और रग Porta (एन = 4 कुत्तों) से व्युत्पन्न में CD31 की अभिव्यक्ति। कोई महत्वपूर्ण अभिव्यक्ति मतभेद CaPECs और CnAOECs के बीच मनाया गया। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।


चित्रा 5:। महाधमनी, रग कावा और बाद में एक angiogenesis स्लाइड (20x बढ़ाई) पर 6 घंटा ऊष्मायन रग Porta से CnAOECs और CaPECs की एंजियोजिनेसिस फोटो। शाखा के गठन दिखाई संस्कृति। ए) CnAOECs। बी) महाधमनी। सी से निकाली गई CaPECs) रग कावा। डी से निकाली गई CaPECs) CaPECs में 6 घंटे के बाद रग Porta से प्राप्त होता है। सभी कोशिकाओं को पारित होने में थे 3. स्केल सलाखों 1 मिमी से संकेत मिलता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

भारत सरकार दिशा 5'-अनुक्रम-3 ' टीएम annealing उत्पाद का आकार (बीपी) genebank नंबर
CD31 आगे GTTCTGCGTGTCAAGGTG 59 डिग्री सेल्सियस 85 XM_005624261.1
रिवर्स TGTCCTTCCCAAACTCCA
बीटा actin आगे GATATCGCTGCGCTTGTGGTC 58 डिग्री सेल्सियस 384 NM_001195845
रिवर्स GGCTGGGGTGTTGAAAGTCTC
RPS19 आगे CCTTCCTCAAAAAGTCTGGG 63 डिग्री सेल्सियस 95 XM_005616513
रिवर्स GTTCTCATCGTAGGGAGCAAG
B2MG आगे TCCTCATCCTCCTCGCT 63 डिग्री सेल्सियस 85 AB745507
रिवर्स TTCTCTGCTGGGTGTCG

तालिका 1: qPCR प्राइमर कुत्ते संदर्भ जीन और CD31 के लिए सेट qPCR प्राइमरों।।

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Discussion

कुत्ते ईसीएस पर ध्यान केंद्रित अध्ययन में CnAOEC प्राथमिक लाइन कुत्ता 3, 12, 13 के endothelial प्रजातियों मॉडल करने के लिए प्रयोग किया जाता है। मानव अध्ययन में, HUVEC संस्कृति अभी भी सोने के मानक माना जाता है। जाहिर है, गर्भनाल से प्राप्त होता ईसीएस पर ध्यान केंद्रित केवल हृदय अनुसंधान के क्षेत्र में एक फर्म प्रतिबंध नहीं है। Endothelial कोशिकाओं एक विशेष जीन अभिव्यक्ति पैटर्न धमनी विनिर्देश का निर्धारण करने के लिए है। आदेश में प्रसव के बाद वाहिकाओं में इन मतभेदों के लिए खाते में हम endothelial कोशिकाओं के विशिष्ट संरचनात्मक स्थान पर आधारित इस उपन्यास अलगाव तरीका मौजूद है। सामान्यतः तरीकों प्राथमिक चुनाव आयोग अलगाव के लिए इस्तेमाल एक एंजाइम समाधान के साथ पोत निस्तब्धता या पाचन से पहले पोत नख़रेबाज़ कर रहे हैं, दो तरीकों के दोनों गैर ईसीएस के साथ प्रदूषण का खतरा है। हम यह भी है कि छोटे जहाजों पर इस्तेमाल किया जा सकता संदूषण के एक कम मौका कुत्ते प्राथमिक endothelial कोशिकाओं के अलगाव (CaPECs) के लिए एक तकनीक की स्थापना की। इस अलगाव मीटरendothelial कोशिकाओं की ethod जहाज है, जो अन्य सभी प्रकार के पोत सेल के पाचन से बचा जाता है की उलटा पर आधारित है। यह महत्वपूर्ण है के रूप में चित्रा 1 ए में सचित्र aseptically वाहिकाओं को दूर करने, endothelial संस्कृतियों का बैक्टीरियल या फंगल संक्रमण को रोकने के लिए है। बैक्टीरिया विकास के मामले में एक अतिरिक्त रोगाणुरोधी एजेंट (जैसे, gentamycin) संस्कृति के माध्यम से जोड़ा जा सकता है। फंगल संक्रमण के उपचार के मामले में अक्सर हमारे अनुभव में सफल नहीं है।

उलटा सफल होने के लिए आदेश में, यह एक पोत लंबाई में लगभग 5 सेमी है कि प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है। रक्त वाहिनियों का उलटा की सुविधा के लिए एक दूसरा महत्वपूर्ण कदम किसी भी पक्षपाती ऊतक और शल्य कैंची के साथ वसा को हटाने की है। पोत inverting विपरीत अंत में संदंश clamping और धीरे धीरे पोत inverting द्वारा ध्यान किया जाता है। जब पर्स-स्ट्रिंग रखने टांके endothelial परत के रूप में संभव के रूप में छोटे से स्पर्श करने के लिए सुनिश्चित करें। दामाendothelium के जीई व्यवहार्य endothelial कोशिकाओं और अंतर्निहित ऊतकों को पाचन मीडिया की पहुँच के गरीब उपज हो सकती है। यह भी यदि पोत पूरी तरह से बंद नहीं है हो सकता है। पोत को आसानी से एक संयुक्ताक्षर के अंत में इसे उठा द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है।

विशेष मामलों में तकनीक के एक संशोधन लागू किया जा सकता है। एक छोटे व्यास के साथ रक्त वाहिकाओं में यह कभी कभी आदेश पोत पलटना में एक मच्छर संदंश डालने के लिए असंभव है। एक समाधान पोत के एक छोर पर रहने टांके जगह और संदंश का उपयोग रक्त वाहिका के माध्यम से अपने संयुक्ताक्षर धक्का है। दूसरे छोर पर वे फिर एक मच्छर संदंश के साथ सुरक्षित और खींच लिया, जिससे पोत inverting जा सकता है। कभी कभी पोत अतिरिक्त टांके का एक परिणाम के रूप में आंसू जाएगा, ताकि इस संशोधन पसंदीदा तरीका नहीं है। एक अन्य समस्या यह है कि पैदा कर सकते है जब कई एरिथ्रोसाइट्स प्राथमिक कोशिकाओं के बोने पर संस्कृति प्लेटों में मौजूद हैं। इस का नतीजा हो सकता हैरक्त वाहिका पाचन से पहले की अपर्याप्त धोने। जब ऐसा होता है, गर्म HBSS के साथ 2 दिन पर कुओं धोने अक्सर एरिथ्रोसाइट्स के बहुमत को दूर करने के लिए पर्याप्त है। किसी भी मामले में, एरिथ्रोसाइट्स संस्कृति में जारी रहती है नहीं होगा और CaPECs के passaging पर खो रहे हैं।

पृथक CaPECs CD31 व्यक्त की, यह दर्शाता है कि कोशिकाओं की आबादी है कि रक्त वाहिनियों से पचा गया था endothelial मूल के वास्तव में है। हाल ही में प्रकाशित किया है, इस मार्कर भी कुत्ते माइट्रल वाल्व 14 से endothelial कोशिकाओं में व्यक्त किया जाता है। संस्कृति में कालोनियों के गठन को इंगित करता है संस्कृतियों या तो एकल कक्षों से या छोटे सेल समूहों से शुरू करते हैं। endothelial विशिष्ट मीडिया पर तेजी से विकास भी सही सेल प्रकार का संकेत है। प्राथमिक कोशिकाओं आठ मार्ग है, जिसके बाद संस्कृतियों विस्तार संघर्ष के लिए संवर्धित किया जा सकता। इस वार्धक्य का एक संकेत है और यह कम संभावना है कि स्टेम / पूर्वज कोशिकाओं को इस आद्य साथ सुसंस्कृत हैंकर्नल। एक angiogenesis परख में, महाधमनी, रग रग कावा और पोर्टा से CaPECs 6 घंटा के भीतर शाखाओं में पता चला है। यह endothelial कार्यक्षमता उनकी उत्पत्ति के लिए ठोस सबूत उपलब्ध कराता है।

उपलब्धता के आधार पर ही कुत्ते सामग्री का अध्ययन किया गया था, लेकिन अलगाव विधि मानव प्राथमिक endothelial कोशिकाओं या अन्य जीवों से endothelial कोशिकाओं के अलगाव के लिए संभव आवेदन किया है। तकनीक बहुत ही छोटे जहाजों (1 सेमी लंबाई) के लिए भी संभव है, लेकिन कम अलग कक्षों निकलेगा। इससे पहले कि वे प्रयोगों के लिए पर्याप्त संख्या में पहुंच गया है इस कारण से छोटे जहाजों से प्राप्त CaPECs एक अतिरिक्त पारित होने की आवश्यकता होगी।

छोटे जहाजों पर अलगाव विधि प्रदर्शन करने की क्षमता रोग में अध्ययन के लिए एक महान लाभ है। ईसीएस portosystemic शंट जैसे कोढ़ या न्यायपालिका जहाजों से अलग किया जा सकता है। ये जोड़ने के पोर्टल शिरा और प्रणालीगत संचलन जो रक्त जिगर को बायपास करने का कारण बनता है वाहिकाओं हैं 2 15, 16 अध्ययन करने के लिए हो सकता है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Collagenase type II Life Technologies 17101-015
Dispase Life Technologies 17105-041
DMEM (1x) + GlutaMAX Life Technologies 31966-021
Hank's Balanced Salt Solution Life Technologies 14025-050
Canine Endothelial Cells Growth Medium  Cell Applications Cn211-500
CnAOECs Cell Applications Cn304-05
Fetal Calf Serum (FCS)  GE Healthcare 16000-044
TrypLE Express Life Technologies 12604-013
SPR Bio-Rad 170-8898
iScript synthesis kit Bio-Rad 170-8891
SYBR green super mix Bio-Rad 170-8886
Recovery Cell Freezing Medium Gibco/Life Technologies 12648-010 Keep on ice prior to use
Freezing container, Nalgene Mr. Frosty Sigma-Aldrich C1562
Gelatin Sigma-Aldrich G1890
Surgical scissors (Mayo or Metzenbaum) B. Braun Medical BC555R
Mosquito forceps  B. Braun Medical FB440R
Mosquito forceps curved B. Braun Medical FB441R
polyglactin 3-0 Ethicon VCP311H
Trypan blue Bio-Rad 145-0013
Automated counting chamber Bio-Rad 145-0102
Counting Slides, Dual Chamber Bio-Rad 145-0011
Matrigel BD Biosciences BD356231 Slowly thaw on ice
µ-Slide Angiogenesis Ibidi 81501
Endothelial Growth Medium Lonza CC-3156
EGM-2 SingleQuot Kit  Lonza CC-4176

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References

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चिकित्सा अंक 117 endothelial कोशिकाओं वाहिका अलगाव angiogenesis कुत्ते CD31
अलगाव और कुत्ते धमनियों और नसों से प्राथमिक endothelial कोशिकाओं की संस्कृति
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Oosterhoff, L. A., Kruitwagen, H.… More

Oosterhoff, L. A., Kruitwagen, H. S., Spee, B., van Steenbeek, F. G. Isolation and Culture of Primary Endothelial Cells from Canine Arteries and Veins. J. Vis. Exp. (117), e54786, doi:10.3791/54786 (2016).

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