Introduction
I cani vengono utilizzati come grande modello animale per la ricerca sulle malattie cardiovascolari e possono anche soffrire di innata (genetici) anomalie vascolari 1, 2. Per studiare queste malattie linee di cellule endoteliali commerciali sono spesso utilizzati per valutare la funzionalità delle cellule endoteliali (CE). Per i cani c'è una linea commerciale delle cellule endoteliali a disposizione (CnAOEC), derivato da dell'aorta canino. Questa linea cellulare è usato soprattutto in studi come normale controllo EC 3-5. Nella ricerca cardiovascolare umano linee di cellule endoteliali più comunemente usati sono cellule ombelicale Vena endoteliali (HUVEC) e ombelicale umano Arteria cellule endoteliali (HUAECs) derivate dalla vena umana cordone ombelicale e delle arterie, rispettivamente. HUVECs sono stati usati come il golden standard nel campo della ricerca vascolare dal 1980 6. Essi sono considerati essere il sistema modello classico per studiare la funzione endoteliale e adattamento malattia. Le cellule endoteliali isolate da diversi vasi sanguigni variano in appearancE e funzionalità a causa di background genetico e l'esposizione al microambiente 7. Inoltre, HUVEC e HUAECs derivano dal cordone ombelicale, una struttura vascolare sviluppo che potrebbero non pienamente mimici vasi sanguigni adulto rispetto alle condizioni a cui sono esposti e la risposta alla malattia. Quindi, traducendo Risultati trovati in HUVECs e HUAECs per le malattie cardiovascolari, in generale, è inadeguata.
Quando si studia l'adattamento e il comportamento degli adulti EC, EC primari dal vaso di interesse dovrebbero essere usati come un approccio più diretto. Per isolare queste cellule, sono stati riportati diversi metodi. Un metodo ampiamente descritto, che è anche usato per HUVEC, sta eliminando il recipiente con una soluzione digestione enzimatica 8. Questo si traduce spesso in contaminazione con non-EC come le cellule muscolari lisce e fibroblasti 9. Un altro metodo frequentemente utilizzato per l'isolamento è la digestione enzimatica del tessuto nave tritato seguito da fluorescence-cellule attivate (FACS) basato su endoteliali Cluster indicatore di cella di differenziazione (CD) 31 7, 8. FACS ordinamento e successiva coltura cellulare richiede quantità relativamente elevate di cellule e non è quindi adatto per l'isolamento di endotelio da piccoli vasi sanguigni. Abbiamo quindi finalizzata allo sviluppo di un nuovo metodo robusto per isolare una popolazione di cellule endoteliali puro da vari vasi sanguigni canine con elevata purezza. Per verificare l'efficacia del nuovo metodo di isolamento, abbiamo isolato e ottenuto colture pure Canine endoteliali primarie cellulare (CAPEC) da diverse arterie e vene canini, grandi e piccoli. Questo metodo consente anche la cultura di cellule endoteliali provenienti da malati e / o vasi aberranti come innate shunt porto intra o extra-epatiche, una malattia comune nei cani 2. Il metodo permette l'isolamento di altri tipi di cellule competenti della stessa nave, come le cellule muscolari lisce vascolari poiché la maggior parte della nave rimane intagire durante la procedura.
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Protocol
Etica dichiarazione: I vasi sanguigni utilizzati in questo studio sono state raccolte come materiale in eccesso ottenuti da cadaveri freschi canino (n = 4) da cani sani eutanasia per altre ricerche non correlate (politica Università 3R). vasi sanguigni aberranti (shunt porto intra- e extra-epatiche, n = 1 ciascuno) sono state raccolte post mortem dopo consenso informato dei proprietari di cani presentati alla clinica universitaria per Animali da Compagnia di Università di Utrecht.
1. Isolamento e la coltura di cellule primarie Canine endoteliali
- Pre-coat 6 pozzetti con 2 ml / pozzetto 0,5% w / v di gelatina e lasciare per 2 ore in un incubatore con atmosfera umidificata al 5% di CO 2 a 37 ° C. Rimuovere soluzione di gelatina in eccesso prima semina delle cellule primarie.
- Asetticamente rimuovere il vaso sanguigno (s) di interesse (ad esempio, aorta, vena cava, vena porta) a partire da un fresco canino cadavere (Figura 1A). Mantenere l'anatomia del sistema naveponendo pinze diritte su entrambe le estremità del vaso di interesse. Evitare manipolazioni inutili del tessuto con una pinza per evitare danni alle cellule endoteliali.
- Tagliare la nave bloccato su entrambe le estremità con le forbici chirurgiche e togliere dal cadavere. Trasporti in soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) su ghiaccio.
NOTA: Una lunghezza imbarcazione di circa 5 cm è preferito per questa procedura, ma quelli che misurano 1 cm fornirà anche abbastanza cellule per la cultura.
- Tagliare la nave bloccato su entrambe le estremità con le forbici chirurgiche e togliere dal cadavere. Trasporti in soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) su ghiaccio.
- Trasferire il vaso sanguigno di una capsula di Petri riempite con HBSS ghiacciata. Utilizzando le forbici chirurgiche, rimuovere eventuali tessuti aderenti e grasso dall'esterno del recipiente, mantenendo il recipiente stesso intatta (Figura 1B). Assicurarsi che il vaso è ben visibile in ogni momento durante il taglio: tirare a parte il tessuto circostante con un morsetto o pinze per la visualizzazione ottimale.
- Chiudere tutti i rami della nave con legature (ad esempio, Polyglactin 3-0) e, successivamente, rimuoverlicon le forbici chirurgiche o un bisturi.
- Immettere cautela un'estremità recipiente con curve pinza zanzara Halsted, bloccare la punta della pinza all'altra estremità della nave e quindi ritrarre, invertendo lentamente il serbatoio finché è completamente esterno (Figura 1C-G). L'esterno ora consiste dello strato di cellule endoteliali. Se si incontra difficoltà sulla invertendo il vaso, immergerlo in HBSS nuovamente per ridurre l'attrito.
- Posizionare suture a borsa di entrambe le estremità della nave per chiuderla completamente e per evitare l'esposizione di qualsiasi tessuto vascolare non-endoteliale alla procedura di digestione (Figura 1H). Utilizzare le estremità legatura di manipolare la nave rovesciata.
- Se la digestione e la cultura viene eseguita in seguito, cryopreserve la nave rovesciata prima del protocollo di digestione (passo 1,7).
- Posizionare il vaso rovesciato in una provetta Microbank ™ e riempire con colture cellulari congelamento media. Antigelo fino a -80 ° C con una co congelamentontainer. Conservare a -80 ° C se i vasi devono essere utilizzati entro una settimana. Per la conservazione a lungo termine, luogo cryovials a -180 ° C. Quando si esegue l'isolamento CE, scongelare i cryovials rapidamente in un bagno d'acqua (37 ° C) e collocare immediatamente in ghiaccio freddo HBSS. Procedere come indicato in 1.7.
NOTA: Prendere in considerazione che la resa totale di EC dopo l'isolamento sarà inferiore a causa della perdita di vitalità durante il processo di congelamento.
- Posizionare il vaso rovesciato in una provetta Microbank ™ e riempire con colture cellulari congelamento media. Antigelo fino a -80 ° C con una co congelamentontainer. Conservare a -80 ° C se i vasi devono essere utilizzati entro una settimana. Per la conservazione a lungo termine, luogo cryovials a -180 ° C. Quando si esegue l'isolamento CE, scongelare i cryovials rapidamente in un bagno d'acqua (37 ° C) e collocare immediatamente in ghiaccio freddo HBSS. Procedere come indicato in 1.7.
- Trasferire la nave verso un tubo da 50 ml e lavare due volte in HBSS per rimuovere gli eritrociti (o medio congelamento residua in caso di scongelamento) (Figura 1I).
- Digerire il vaso in un tubo da 50 ml con una soluzione di 30 ml di collagenasi di tipo II (0,15 U / ml) e dispasi (0,15 U / ml) in cellule Canine endoteliali Growth Medium (CECGM) per 1 ora a 37 ° C con intermittente delicato agitazione.
- Rimuovere il recipiente dal tubo e centrifugare la sospensione cellulare per 5 minuti a 250 x g.
- Risospendere il pellet di cellule in un CECGMND seme 2 sospensione cellulare ml per bene (1 - 3 pozzi a seconda delle dimensioni nave). Coltivare le cellule a 37 ° C in atmosfera umidificata con 5% di CO 2 in aria e cambiare il terreno di coltura due volte a settimana.
- Passaggio delle cellule quando una confluenza di 70 - si raggiunge l'80%.
- Lavare le cellule con HBSS preriscaldata per rimuovere le cellule morte o non iscritti. Aggiungere 200 ml ricombinante enzima cellulare-dissociazione (1x) per ciascun bene e mettere di nuovo in incubatrice per 5 minuti o fino a quando tutte le cellule sono staccati.
- Trasferire le cellule in una provetta da 15 ml e fermare tripsinizzazione con l'aggiunta di 10 ml di terreni di coltura (CEGM) di cui 10% siero fetale di vitello (FCS). Centrifugare per 5 min a 250 x g. Continuare la cultura in un piatto di gelatina pre-verniciato o pallone.
2. Caratterizzazione
- Culture cellule endoteliali aortiche Canine (CnAOECs) e confrontare la morfologia delle linee cellulari primarie e commerciale due volte alla settimana con un microscopio.
NOTA: Tegli tipico modello di crescita di cellule endoteliali in patch può essere meglio osservato quando viene raggiunta una confluenza di> 70%.- Culture CnAOECs in CECGM su una beuta T75 0,5% w / v di gelatina prerivestita. cellule Passage una volta alla settimana quando la confluenza è del 70 - 80%.
- Per passaging, lavare le cellule una volta con HBSS preriscaldata e aggiungere 1 ml ricombinante cella-dissociazione enzimatica (1x). Porre il pallone torna in incubatrice per 5 minuti o fino a quando tutte le cellule sono staccati. Inattivare tripsina con l'aggiunta di mezzo di coltura 10 ml (CEGM) incluso 10% FCS. Centrifugare la sospensione cellulare per 5 minuti a 250 xg, scartare il surnatante e risospendere le cellule in terreno di coltura 1 ml.
- Prendete una aliquota di 10 microlitri di sospensione cellulare e diluire 1: 1 con il 0,4% trypan blu. Contare le cellule utilizzando un contatore di cellule automatizzato, e piastra out 4.0 x 10 5 cellule vitali in un pallone nuovo T75. Aggiungere 10 ml di pre-riscaldato CECGM al pallone e coltura a 37 ° C in atmosfera umidificata con 5% di CO 2.
- Culture CnAOECs in CECGM su una beuta T75 0,5% w / v di gelatina prerivestita. cellule Passage una volta alla settimana quando la confluenza è del 70 - 80%.
- Isolare RNA dal passaggio 1 delle CaPECs coltivate e CnAOECs.
- Raccogliere almeno 1 x 10 3 cellule come pellet, aggiungere 20 ml di preparazione del campione reagente (SPR) e incubare per 1 min per lisare le cellule. Dopo l'incubazione, raccogliere con attenzione il lisato cellulare contenente RNA totale e conservare a -70 ° C.
- Convertire mRNA in cDNA utilizzando un kit di sintesi di cDNA (ad esempio, iScript) seguendo le istruzioni del produttore. Conservare cDNA a 4 ° C fino a una settimana, oa -20 ° C per il lungo termine fino al momento di eseguire la qPCR.
- Misurare l'espressione del gene del CD31 marcatore endoteliale per confermare l'origine delle cellule endoteliali. Eseguire l'impostazione sperimentale e quantificazione utilizzando le linee guida precis MIQE 10. Per la normalizzazione, misurare l'espressione di geni di riferimento GAPDH, RPS19, e B2MG 11.
- Preparare una diluizione di 10 volte del cDNA ottenuto in acqua priva di nucleasi.
- Preparareuna diluizione di 4 volte da campioni di cDNA pool per la linea standard e utilizzare l'acqua priva di nucleasi come un controllo non-modello. Diluire i campioni cinque volte per raggiungere una diluizione totale di 50 volte per le reazioni qPCR. Pipettare 10 microlitri reazioni in duplicato in un formato da 384 pozzetti con 4 ml di cDNA e 6 ml di fluoroforo mescolato con 20 pmol di retromarcia e primer forward (Tabella 1).
- Impostare il programma a 95 ° C per 5 minuti per l'attivazione polimerasi Taq, seguita da 39 cicli di 10 secondi a 95 ° C per la denaturazione, e 30 sec a Tm per la ricottura e l'allungamento. La Tm di ogni primer è mostrato nella Tabella 1.
- Eseguire la fusione curva di analisi eseguite dopo ogni corsa al fine di garantire un solo prodotto è amplificato. Normalizzare i livelli di espressione dei campioni con la quantità media relativa dei geni di riferimento, e calcolare il ΔCt se l'efficienza reazione è compresa tra il 95% e il 105%.
- Valutare la funzionalità CE con un Angisaggio ogenesis.
- Aggiungere 10 ml di matrice extracellulare a ciascun pozzetto di una slitta pre-raffreddata angiogenesi e diffondere con un puntale per coprire la superficie del pozzetto. Mantenere la matrice extracellulare su ghiaccio ed evitare l'introduzione di bolle d'aria nel gel. Solidificare il gel ponendo il vetrino in una capsula di Petri con acqua imbevuto asciugamani di carta in un incubatore a 37 ° C con 5% di CO 2 per 30 min.
- Aggiungere 1,0 x 10 4 primario EC in 50 microlitri Endothelial Growth medio per pozzetto. Incubare il vetrino per 6 ore a 37 ° C con 5% di CO 2.
- Dopo 6 ore scattare fotografie con un ingrandimento 20x, avendo cura di includere l'intera bene nell'immagine.
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Representative Results
Diversi vasi sanguigni sono stati sottoposti con successo al protocollo descritto isolamento (Figura 2). Era possibile sezionare e invertire aorta, vena cava, vena porta, e l'arteria coronaria da cani sani (tutte le navi da ciascun cane, n = 4). Con le stesse EC approccio sono stati isolati da due shunt porto congenite (extraepatica e intraepatica, n = 1 ciascuno). Anche se dell'aorta era facilmente invertita, segmenti dell'aorta toracica sono stati più impegnativo di aorta addominale. Nei segmenti toracici aorta ha molte arterie intercostali ramificano da esso, che devono essere ligati individualmente per garantire l'esposizione strettamente endoteliale alla soluzione di digestione. Il segmento sezionato della vena cava caudale incluso nel punto di diramazione delle vene renali, che dovevano essere legata prima inversione. Per la vena porta il ramo attivo della gastroduodenalis vena stato ligato prima inversione del vaso sanguigno. il coronary arteria nei cani è un vaso molto più piccola di sangue (circa 1 - 2 mm di diametro in un cane di medie dimensioni), da cui escisso un segmento del ramo circonflesso. Perché ha un diametro ridotto, si è rivelato essere più facile da invertire una piuttosto breve segmento di 1 cm, perché le pinze Mosquito non potevano essere inseriti molto più in là.
dopo di isolamento delle cellule aderito Un giorno erano visibili nella piastra di coltura. Nella cultura, CaPECs aveva una forma poligonale e visualizzata una tendenza a crescere in patch come mostrato nella figura 3 possono essere osservate numerose colonie di cellule endoteliali 3 -. 6 giorni dopo l'isolamento. Dopo circa 10 giorni di coltura una confluenza del 80% è stato raggiunto e cellule potrebbe essere superato. In media le colture endoteliali primarie potrebbero essere mantenuti per un massimo di 8 passaggi (una volta alla settimana ad un tasso di divisione di 1: 4) al punto che essi smesso di crescere.
Isolacellule endoteliali ted espressi endoteliali CD31 indicatore di cella come indicato da qPCR (Figura 4). L'espressione in cellule endoteliali derivate da aorta, vena cava e vena porta da quattro cani è stato confrontato con una coltura di controllo di CnAOECs. Le cellule primarie in coltura aveva un'espressione CD31 paragonabile con il controllo EC (Kruskall-Wallis, p = 0,856).
CaPECs derivati da aorta, vena cava e vena porta mostrato ramificazione dopo 6 ore di incubazione sulla diapositiva angiogenesi come mostrato in Figura 5.
Figura 1: dissezione e Inversione vasi sanguigni per l'isolamento delle cellule endoteliali. A) Il vaso sanguigno di interesse è asetticamente rimosso da un cadavere canino fresco. B) tessuti aderenti e / o di grasso che circonda la nave dovrebbe essere REMOVEd attenzione con le forbici chirurgiche senza danneggiare la nave stessa (canino vena cava, segmento addominale 5 cm). C) con una curvi pinza Halsted Mosquito, la nave può essere inserito senza perforare lo strato endoteliale. DG) Fissare le pinze dall'altra fine del vaso sanguigno e delicatamente retrarre, così completamente invertendo il vaso sanguigno. Lo strato endoteliale è ora sulla parte esterna del recipiente. H) suture a borsa sono poste alle estremità di chiusura dalla superficie non-endoteliale del vaso invertita. I) Il vaso sanguigno viene trasferito in un tubo da 50 ml per il lavaggio e successiva digestione. Barre di scala indicano 2 cm. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3:.. La morfologia cellulare foto sono state scattate due settimane dopo la digestione dei vasi fr) EC derivatoom dell'aorta canino nel passaggio 2. B) EC derivato dal canino vena cava nel passaggio 2. C) EC derivati da canino vena porta nel passaggio 2. Tutte le immagini sono prese con 4X ingrandimento originale. Barre di scala indicano 500 micron. Inserire mostra 10X di ingrandimento. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Espressione genica di CD31. L'espressione di CD31 in cellule endoteliali in passaggio 1 derivati da aorta, vena cava e vena porta (n = 4 cani). Non sono state osservate significative differenze di espressione tra il CaPECs e la CnAOECs. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5: L'angiogenesi. Fotografie di CnAOECs e CaPECs da aorta, vena cava e vena porta, dopo 6 ore di incubazione su uno scivolo angiogenesi (20X di ingrandimento). Formazione Branch è visibile dopo 6 ore in B) CaPECs cultura. A) CnAOECs. Derivate da dell'aorta. C) CaPECs derivati dalla vena cava. D) CaPECs derivato da vena porta. Tutte le cellule erano in passaggio 3. Barre di scala indicano 1 mm. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
| GOI | Direzione | 5'-Sequence-3 ' | Tm ricottura | Dimensioni del prodotto (bp) | numero di banca genetica | |
| CD31 | Inoltrare | GTTCTGCGTGTCAAGGTG | 59 ° C | 85 | XM_005624261.1 | |
| Inverso | TGTCCTTCCCAAACTCCA | |||||
| beta-actina | Inoltrare | GATATCGCTGCGCTTGTGGTC | 58 ° C | 384 | NM_001195845 | |
| Inverso | GGCTGGGGTGTTGAAAGTCTC | |||||
| RPS19 | Inoltrare | CCTTCCTCAAAAAGTCTGGG | 63 ° C | 95 | XM_005616513 | |
| Inverso | GTTCTCATCGTAGGGAGCAAG | |||||
| B2MG | Inoltrare | TCCTCATCCTCCTCGCT | 63 ° C | 85 | AB745507 | |
| Inverso | TTCTCTGCTGGGTGTCG | |||||
Tabella 1: qPCR Primer Imposta primer qPCR per i geni di riferimento canini e CD31..
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Discussion
In studi incentrati sul canino EC linea primaria CnAOEC viene utilizzato per modellare le linee endoteliali del cane 3, 12, 13. Negli studi umani, la cultura HUVEC è ancora considerato il gold standard. Chiaramente, concentrandosi solo sulla EC derivate da cordone ombelicale è una restrizione fermo nella ricerca cardiovascolare. Le cellule endoteliali hanno una specifica pattern di espressione genica che determina le specifiche artero-venosa. Per tenere conto di queste differenze di vasi postnatale presentiamo questo metodo di isolamento romanzo base alla posizione anatomica specifica delle cellule endoteliali. I metodi comunemente usati per l'isolamento CE primaria sono il lavaggio del recipiente con una soluzione enzimatica o tritare la nave prima della digestione, due metodi che entrambi hanno un rischio di contaminazione con i non-EC. Abbiamo stabilito una tecnica per l'isolamento delle cellule endoteliali Canine primario (CaPECs) con minori possibilità di contaminazione che può essere utilizzato anche su piccole imbarcazioni. Questo isolamento metodo di cellule endoteliali si basa sull'inversione della nave, che evita la digestione di tutti gli altri tipi di cellule nave. È importante rimuovere i vasi asettico, come illustrato nella Figura 1A, per prevenire la contaminazione batterica o fungina delle culture endoteliali. In caso di crescita batterica un agente antimicrobico aggiuntivo (ad esempio, gentamicina) può essere aggiunto al mezzo di coltura. In caso di trattamento di infezione fungina non è spesso successo nella nostra esperienza.
Affinché l'inversione di successo, è fondamentale per ottenere un vaso che è di circa 5 cm di lunghezza. Un secondo passo importante per facilitare l'inversione del vaso sanguigno è la rimozione di qualsiasi tessuto aderente e il grasso con le forbici chirurgiche. Invertendo il recipiente è fatto con attenzione serrando la pinza all'estremità opposta e invertendo lentamente il vaso. Quando si posiziona la borsa-string suture assicurarsi di toccare lo strato endoteliale il meno possibile. Damage dell'endotelio può provocare scarsa resa di cellule endoteliali vitali e accesso dei mezzi di digestione al tessuto sottostante. Questo può succedere anche se la nave non è completamente chiuso. Il vaso può essere facilmente da raccoglierlo al termine di una legatura.
In determinati casi una modifica della tecnica può essere applicata. In vasi sanguigni di piccolo diametro è talvolta impossibile inserire una pinza Mosquito per invertire il recipiente. Una soluzione consiste nel posizionare soggiorno suture su un'estremità del recipiente e spingere le legature attraverso il vaso sanguigno usando le pinze. All'altra estremità possono poi essere fissati con una pinza Mosquito e tirato, invertendo così la nave. A volte la nave strappare in conseguenza delle suture supplementari, quindi questa modifica non è l'approccio preferito. Un altro problema che può sorgere è quando molti eritrociti sono presenti nelle piastre di coltura su semina delle cellule primarie. Questo può essere il risultato diInsufficiente lavaggio del vaso sanguigno prima della digestione. Quando si verifica ciò, il lavaggio dei pozzetti giorno 2 con HBSS caldo è spesso sufficiente a rimuovere la maggior parte degli eritrociti. In ogni caso, gli eritrociti non persisteranno nella cultura e sono perso su passaging dei CaPECs.
I CaPECs isolato espressi CD31, indicando che la popolazione di cellule che è stato digerito dal vaso sanguigno è infatti di origine endoteliale. Come recentemente pubblicato, questo indicatore è anche espresso in cellule endoteliali dalla valvola mitrale canino 14. La formazione di colonie in coltura indica le culture partono sia da singole cellule o da piccoli gruppi di cellule. La rapida crescita su un supporto specifico endoteliale è anche indicativo del corretto tipo di cellula. Le cellule primarie possono essere coltivate da otto passaggi, dopo di che le culture cessano di espansione. Ciò è indice di senescenza e rende meno probabile che le cellule staminali / progenitrici sono coltivate presente protocol. In un saggio di angiogenesi, CaPECs da aorta, vena cava e vena porta ha mostrato ramificazione entro 6 ore. Questa funzionalità endoteliale fornisce la prova solida per la loro origine.
In base alla disponibilità unico materiale canino è stato studiato, ma il metodo di isolamento ha possibili applicazioni per l'isolamento delle cellule endoteliali primarie umane o cellule endoteliali da altri organismi. La tecnica è possibile anche per piccoli vasi (lunghezza 1 cm), ma produrrà cellule meno isolate. Per questo motivo CaPECs ottenuti da piccoli vasi richiederanno un passaggio aggiuntivo prima di aver raggiunto un numero sufficiente per esperimenti.
La possibilità di eseguire il metodo isolamento su piccoli vasi è un grande vantaggio per gli studi in malattia vascolare. EC potrebbe essere isolato dal vasi malati o aberranti come shunt porto. Questi sono vasi comunicanti vena porta e la circolazione sistemica che provoca sangue per bypassare il fegato 2 15, 16.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase type II | Life Technologies | 17101-015 | |
| Dispase | Life Technologies | 17105-041 | |
| DMEM (1x) + GlutaMAX | Life Technologies | 31966-021 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14025-050 | |
| Canine Endothelial Cells Growth Medium | Cell Applications | Cn211-500 | |
| CnAOECs | Cell Applications | Cn304-05 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | GE Healthcare | 16000-044 | |
| TrypLE Express | Life Technologies | 12604-013 | |
| SPR | Bio-Rad | 170-8898 | |
| iScript synthesis kit | Bio-Rad | 170-8891 | |
| SYBR green super mix | Bio-Rad | 170-8886 | |
| Recovery Cell Freezing Medium | Gibco/Life Technologies | 12648-010 | Keep on ice prior to use |
| Freezing container, Nalgene Mr. Frosty | Sigma-Aldrich | C1562 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Surgical scissors (Mayo or Metzenbaum) | B. Braun Medical | BC555R | |
| Mosquito forceps | B. Braun Medical | FB440R | |
| Mosquito forceps curved | B. Braun Medical | FB441R | |
| polyglactin 3-0 | Ethicon | VCP311H | |
| Trypan blue | Bio-Rad | 145-0013 | |
| Automated counting chamber | Bio-Rad | 145-0102 | |
| Counting Slides, Dual Chamber | Bio-Rad | 145-0011 | |
| Matrigel | BD Biosciences | BD356231 | Slowly thaw on ice |
| µ-Slide Angiogenesis | Ibidi | 81501 | |
| Endothelial Growth Medium | Lonza | CC-3156 | |
| EGM-2 SingleQuot Kit | Lonza | CC-4176 |
References
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