Summary
Dit protocol geeft een werkwijze voor de morfologische herstel van neuronen patched tijdens elektrofysiologische opnames via biocytine vullen en immunohistochemische latere nabewerking. We laten zien dat dikke-biocytine gevuld secties die werden gekleurd en afgedekt kunnen worden restained met een tweede primair antilichaam dagen of maanden later.
Abstract
Elektrofysiologische registraties van cellen met behulp van de patch clamp techniek hebben geleid tot de identificatie van verschillende neuronale types gebaseerd op afvuren patronen. De opname van biocytine / neurobiotin in de registratie-elektrode maakt post-hoc terugwinning van morfologische gegevens, die benodigd zijn om dendritische arborization en het doelwit van de axonen van de neuronen opgenomen gebieden bepalen. Echter, gezien de aanwezigheid van morfologisch vergelijkbaar met verschillende neuronen neurochemische identiteit en functie, immunohistochemische kleuring voor celtype-specifieke eiwitten essentieel definitief neuronen te identificeren. Netwerkverbindingen behouden worden hersensecties voor fysiologische opnames bereid bij een dikte van 300 urn of meer. Echter, deze dikte belemmert vaak immunohistologische postprocessing te wijten aan problemen met antilichaam penetratie, noodzakelijk de resectioning van het weefsel. Resectioning plakken is een uitdagende kunst, vaak resulting in het verlies van weefsel en morfologie van de cellen waaruit elektrofysiologische gegevens zijn verkregen, waardoor de gegevens onbruikbaar. Sinds het herstel van de morfologie zou het verlies van gegevens en gids bij de selectie van neuronale markers te beperken, hebben we een strategie voor het winnen van celmorfologie eerste plaats, gevolgd door secundaire immunokleuring aangenomen. We introduceren een praktische benadering van biocytine vullen tijdens fysiologische opnames en de daaropvolgende periodieke immunokleuring voor het herstel van de morfologie, gevolgd door het beitsen van secties om de neurochemische identiteit vast te stellen. Wij rapporteren dat delen die waren gevuld met biocytine, gefixeerd met paraformaldehyde (PFA), gekleurd en afgedekt kunnen worden verwijderd en restained met een tweede primair antilichaam dagen later. Dit beitsen is de verwijdering van het dekglaasje, het wassen van onderdelen in een bufferoplossing, en de incubatie van primaire en secundaire antilichamen tegen de neurochemische identiteit bekend. De werkwijze is voordelig voor het elimineren DATeen verlies als gevolg van een onvermogen om de morfologie te herstellen en voor het verkleinen van de neurochemische markers te testen op basis van de morfologie.
Introduction
De hersenen staat bekend om de diversiteit in de structurele en functionele kenmerken van de individuele neuronale elementen. Inzicht in de rollen van verschillende neuronale types in de hersenfunctie en pathologie vereist karakterisering en ondubbelzinnige identificatie van neuronen. Structureel, de morfologische kenmerken gedefinieerd door somato-dendritische locatie te bepalen de mogelijke ingangen die een bepaalde neuron ontvangt, terwijl het patroon van axonale arborization identificeert potentiële postsynaptische targets. De structurele diversiteit van neuronen is gewaardeerd sinds de dagen van Ramón y Cajal's rudimentaire histologische studies 1. De komst van single-cell opnametechnieken bleek dat structureel verschillende neuronen verschillen in afvuren patronen en synaptische kenmerken tonen ook. De diversiteit in de structuur en fysiologie is vooral duidelijk in GABAergic remmende neuronen 2,3. Bovendien, is het steeds duidelijker geworden dat structurally vergelijkbaar neuronen kunnen verschillende neurochemische merkers en tonen overeenkomstige functionele 4 verschillen uit te drukken. Ook neuronen met dezelfde neurochemische merkers kunnen verschillende structuren en functies 5-10 hebben. Dus in de praktijk, de analyse van de functionele eigenschappen van neuronen en hun rol in het netwerk vereist de definitie zowel de morfologische en neurochemische identiteiten. Zelfs met de komst van reporter muizenlijnen gericht op specifieke neurochemische markers, is het vaak noodzakelijk om de morfologie en subtype identiteit bepalen op basis van immunohistochemische 11.
De standaard methode gebruikt om cellen die in acute hersenen plakjes te karakteriseren is om ze te vullen met biocytine of neurobiotin tijdens de opname, de secties in paraformaldehyde (PFA) na de opnames vast te stellen, en het gebruik van immunohistochemie om de morfologie en neurochemie onthullen. Aangezien de dikte van de punten voor segment fysiologie typisch 300 urnof meer, en omdat de meeste antilichamen niet helemaal doordringen die diepte, moeten de segmenten opnieuw worden coupes te 60 micrometer om gelijktijdige immunokleuring voor biocytine en neurochemische merkers 12-14. Helaas, resectioning is bewerkelijk; riskeert het verlies van weefsel tijdens het snijden; en kan leiden tot differentiële weefsel krimp, complicerende morfologische reconstructies. Bovendien kan de voorkennis van de morfologie helpen beperken de kandidaat markers die waarschijnlijk door de cellen tot expressie te brengen zijn. We hebben de standaard biocytine immunohistologie protocollen aangepast om seriële verwerking van afdelingen mogelijk eerst voor het herstel van de morfologie en vervolgens voor de identificatie van mogelijke neurochemische markers.
Immunohistochemie is de studie van antigeen verdeling in weefsels en cellen en kan worden gevisualiseerd met behulp van een enzym, fluorescerende labels, radioactieve elementen of colloïdaal goud partikels 15. De procedure involves behulp primaire antilichamen specifiek amplificeren label en één of meer antigenen, gevolgd door het gebruik van fluorescente secundaire antilichamen gericht op het primaire antilichaam voor visualisatie. Vanwege de noodzaak om de fluorescentie spectra van elke secundaire antilichaam onderscheiden zonder overlap, kan slechts een beperkt aantal antigenen gelijktijdig worden onderzocht. Aldus kan voorkennis morfologie bruikbaar zijn bij het selecteren van de gegadigde neurochemische merkers voor cellulaire indeling zijn. Conceptueel is de ratio seriële verwerking van al-gekleurde coupes gebaseerd op de vooronderstelling dat immunokleuring voor één eiwit of peptide raakt niet aan antigeniciteit en daaropvolgende immunokleuring voor een structureel onafhankelijk peptide 16. Dit gebrek aan interferentie wordt veroorzaakt door de binding van de antilichamen tegen een specifiek eiwit epitoop op een antigeen en derhalve voorziet in de gelijktijdige kleuring van meerdere antigenen in hetzelfde weefsel. Het aantal antigenen revealed door immunokleuring wordt beperkt door de behoefte aan niet-overlappende spectra van fluorescente secundaire antilichamen en door de noodzaak om individuele antigenen met antilichamen opgewekt bij diverse soorten richten teneinde elimineren kruisreactiviteit 17,18. Hoewel dit de redenering achter seriële plaats gelijktijdige labeling met twee verschillende antilichamen die kunnen interageren, voorzover ons bekend, immunokleuring voor een tweede antigeen is niet gemeld na voltooiing van immunokleuring voor één of meer antigenen op gemonteerde profielen. Hier beschrijven we een werkwijze voor seriële immunokleuring van eerder bevlekt en gemonteerde profielen. Hoewel we detail het proces voor een seriële immunokleuring procedure voor het terugwinnen van morfologie, gevolgd door kleuring op eiwit / peptide markers in dikke gedeelten kunnen dezelfde procedures worden gebruikt in standaard, dunne coupes ook. Daarnaast beschrijven we een praktische benadering opgenomen neuronen met biocytine en het proces om het los te vullenelektrode van de cel na voltooiing van opnames voor het vullen van de axonale en dendritische assen van neuronen te optimaliseren, zoals beschreven in onze recente werk 6,8.
Het belangrijkste voordeel van de hier beschreven werkwijze is dat de morfologie van de cel opgenomen kan volledig worden hersteld en afgebeeld alvorens resectie of immunostain de segmenten. Hoewel problemen met de penetratie van bepaalde antilichamen het noodzakelijk om resectie plakken voor secundaire immunokleuring kunnen maken, zouden de procedures hier beschreven de noodzaak om complexe neuronen van meerdere secties te reconstrueren uitschakelen, zodat problemen als gevolg van weefsel verlies en differentiële krimp te vermijden, die de wederopbouw in gevaar kunnen brengen volgende resectioning. Een bijkomend voordeel is dat het proces kosten, tijd, inspanning en dure antilichamen zullen beperken doordat immunokleuring en opnieuw snijden plakjes waarin biocytine-gevulde neuronen worden teruggewonnen. De meest praktische aspect is de advertentiemende immunokleuring die kunnen worden uitgevoerd op secties gekleurd maanden voordat de bovengenoemde techniek. Met name zou het herstel van de morfologie aanzienlijk het potentieel dat fysiologische gegevens uit de cellen wordt verwijderd als gevolg van een onvermogen om een fundamentele morfologische karakterisering van het celtype te verkrijgen te verminderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. biocytine Vullen tijdens Electrofysiologie
NB: De lezers kunnen verwijzen naar alternatieve bronnen voor basis patch-clamp-opname technieken en instrumentatie 19-22, die niet zijn uitgewerkt hier. De stappen die hier beschreven veronderstellen dat de apparatuur en procedures voor de patch-clamp opnames al worden vastgesteld, en de beschrijving zal worden beperkt tot details met betrekking tot biocytine-vullen en post-hoc immunokleuring. Alle experimenten die in dit manuscript werden uitgevoerd op ratten.
- Met behulp van een vibratome, voorbereiden levende hersensecties van het gewenste gebied bij een dikte van 300-350 urn 23.
- Bereid een interne oplossing die 0,2% biocytine door toevoeging van 2 mg biocytine tot 1 ml interne standaardoplossing 6. Voor het beste resultaat, ultrasone trillingen de interne oplossing voor 10-15 min, totdat het biocytine volledig oplost. Vervolgens laadt de inwendige oplossing in een 1 ml injectiespuit uitgerust met een 0,2 &# 160; um poriegrootte polypropyleen filter tip bevestigd aan een microloader. Houd deze loading spuit op een coldpack de stabiliteit van de Mg-ATP en Na-GTP in het interne oplossing leidt.
Opmerking: Een interne oplossing die kalium gluconaat (126 mM K-gluconaat, 4 mM KCl, 10 mM HEPES, 4 mM Mg-ATP, 0,3 mM Na-GTP en 10 mM creatinefosfaat) optimaal is voor het herstel van bepaalde neurochemische merkers, waaronder parvalbumin, tijdens immunokleuring. In onze ervaring, met behulp van cesium- en chloride-gebaseerde interne oplossingen vermindert het vermogen om te herstellen immunokleuring voor bepaalde neurochemische markers. Neurobiotin of een cel-impermeant, montage, polaire tracer combinatie van een fluorofoor Alexa met biocytine kan worden gebruikt als alternatief voor biocytine. - Onder infrarood differentieel interferentie contrast, breng de betreffende cel voor opname. Een verstoring van het axon minimaliseren, benadert het cellichaam door verlaging van de pipet om zijn as met de "aanpak" fzalving beschikbaar in de meeste micromanipulators. Vestigen whole-cell opnames onder infrarood differentieel interferentie contrast met behulp van patch-clamp fysiologie protocollen 19-22.
OPMERKING: Vermijd nadert de cel de richting van de vermeende axon, zoals het axon, gevisualiseerd als een blaasje aan het uiteinde (groene pijl in figuur 1) zal scheiden. Vermijd ook die een hoge positieve druk om de opname pipet bij het naderen van de cel om de lekkage van biocytine, wat zal resulteren in hoge achtergrondkleuring minimaliseren.
Figuur 1. Voorgestelde Vliegtuig voor Approaching Cellen voor biocytine vult. Het beeld illustreert een Korrel Cell (GC) vullen biocytine tijdens opname die is verwerkt tot biocytine zichtbaar (rode middels 594-geconjugeerd streptavidine). De GC heeft zijn dendrieten georiënteerd in het XY-vlak. Let op de afgehakte korrel celaxon (groene pijl) als gevolg van pipet beweging langs het XY-vlak. Merk op dat het ideaal om deze neuron benaderen langs het XZ-vlak. Schaal bar: 50 pm.
- In voltage clamp configuratie, bepalen de whole-cell capaciteit en serie weerstand in reactie op kleine (5 mV), korte (30 ms) spanning stappen met behulp van de met behulp van het membraan testfunctie in bad mode in een elektrofysiologie data-acquisitie en analyse software. Dit zal zorgen voor de oprichting van whole-cell opname-omstandigheden mogelijk te maken voor biocytine-vulling.
- Gedrag fysiologische opnames in zowel stroom- of spanning-clamp-modus als nodig is. Een minimale opnametijd van> 10 minuten bij 34 ° C is ideaal.
OPMERKING: langere opnametijden mogelijk nodig voor studies uitgevoerd bij kamertemperatuur. - Na voltooiing van de fysiologische opnames, herstel van de patch-clamp configuratie door langzaam de opname pipet in kleine stappen, afwisselend omhoog (langs de Z-as) enbuiten (langs de X-as) in voltage-clamp modus.
- Tegelijkertijd toezicht op de capaciteit en input weerstand met de functie "membraan test" om het verlies van capacitieve transiënten en de ineenstorting van de huidige reacties op een rechte lijn te visualiseren, met vermelding van de re-afdichting van de cel en de oprichting van een buiten-out- patch op de pipetpunt. Die de cel bij een gedepolariseerd potentiaal (-40 mV) wordt het opnieuw afdichten te vergemakkelijken.
OPMERKING: Deze procedure voor het verwijderen van een cel zorgt voor typisch het volledige herstel van de soma en dendrieten. Mis positieve druk toe op de opname pipet tijdens de procedure of tijdens het verwijderen van de cellen van de pipet. Visualisatie van de soma van de opgenomen cel in het segment geeft een succesvolle terugtrekking. De aanwezigheid van cellulair afval of membraanplaat aan het einde van de vrijstaande tip geeft typisch dislocatie van de soma en doen dat niet volledig celmorfologie. - achteruiter losmaken van de pipet uit de cel behouden segment in de opname kamer gedurende 3-5 minuten om het transport van de kleurstof distaal dendritische en axonale processen te waarborgen.
- Breng de segmenten een 24-well plaat met 4% PFA voor bevestiging.
LET OP: PFA is kankerverwekkend en geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen, inclusief handschoenen en een gezichtsmasker, moeten worden gebruikt om irritatie en inhalatie de huid te voorkomen. PFA is brandbaar en moet buiten het bereik van vuur worden gehouden. PFA is nooit geplaatst in de afvoer en moeten worden verzameld als chemisch afval. PFA fixatie worden gescheiden van gebieden gebruikt voor levende slice voorbereiding om verontreiniging van de fysiologie installatie te voorkomen, zoals transferpipetten. - 24 - 48 uur na PFA fixatie, overdracht van de plakken tot 0,1 M fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) voor opslag voorafgaand aan immunokleuring.
LET OP: In het ideale geval biocytine herstel en immunokleuring zijn best wanneer uitgevoerd kort na fixatie, hoewel kleuring per gevormd binnen 7 dagen van fixatie levert goede resultaten. Segmenten kunnen in PBS onderhouden met 0,02-0,05% natriumazide voor kleuring uitgevoerd tot en meer dan 90 dagen na fixatie. Hoewel overnacht fixatie in PFA werkt goed voor de meeste antilichamen, is het mogelijk dat sommige antilichamen beste wanneer de duur van de incubatie in fixatief wordt verminderd. Fixatie in PFA voor meer dan 48 uur vermindert de beschikbaarheid van antigenen en vermindert de kans op een succesvolle secundaire immunokleuring voor neurochemische markers.
LET OP: Natriumazide is zeer gevaarlijk en een irriterend bij contact met de huid of ogen of bij inslikken of inademen. Ernstige overmatige blootstelling kan leiden tot de dood. Het carcinogeen en mutageen effect van de verbinding zijn niet bekend. Gebruik geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen zoals handschoenen, een veiligheidsbril, een laboratoriumjas en een stofmasker. Natriumazide is nooit geplaatst in de afvoer en moeten worden verzameld als chemisch afval.
(Dag 1)
OPMERKING: De volgende procedure voor immunokleuring vrij zwevende gedeelten en vereist continu schudden bij een lage snelheid (2 omwentelingen / min, rpm) op een schudinrichting alle incubatiestappen.
- Was 3x het weefsel voor 10 min elk in 0,1 M PBS (pH = 7,4).
OPMERKING: 0,1 M PBS kunnen commercieel worden gekocht of gemaakt in het laboratorium als volgt (voor 1 L): 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na 2 HPO 4 en 0,24 g KH 2PO 4 in 1 L van dH 2 0.
LET OP: Als de gewenste neurochemische marker bekend is, kleuren voor een eiwit / peptide kan gelijktijdig worden uitgevoerd met biocytine kleuring (stappen 2,2-2,4). Als kleuring voor slechts biocytine, ga dan naar stap 2.5. - OPTIONEEL: Blok met 10% Blocking serum (BS, normaal geitenserum (NGS) verdund in 0,3% Triton X-100 in PBS gedurende 1 uur bij kamertemperatuur).
OPMERKING: Elk goed moetontvangen hetzelfde volume van de oplossing; het aanbevolen volume tussen 250-500 ul / putje. De selectie van de blokkerende serum is gebaseerd op de soorten waarbij de secundaire antilichamen zijn opgewekt (bijvoorbeeld wordt gebruikt NGS kleurstof-geconjugeerd geit anti- (respectievelijke primaire antilichaam species)). Indien nodig secundaire antilichamen die verschillende soorten secties immunostain gebruiken, neemt 10% van elk normaal serum in blokkeerbuffer stap (2) en 3% van elk normaal serum voor de primaire en secundaire antilichaam incubatiestappen. - (OPTIONEEL) Incubeer de secties primaire antilichaam, CB 1 R (polyklonaal, cavia) met 0,3% Triton X-100 en 3% BS in 0,1 M PBS bij kamertemperatuur O / N. CB 1 R wordt gebruikt voor het identificeren cannabinoïde receptor type 1 expressie.
OPMERKING: Deze stap is optioneel en niet nodig is om de biocytine vulling te onthullen. Figuur 2 toont een doorsnede gelabeld voor biocytine en CB 1 R in de eerste kleurproces. O / N Incubation bij kamertemperatuur is voldoende voor de meeste van de primaire antilichamen; Bepaalde primaire antilichamen, waaronder CB 1 R, vereisen 3-5 d incubatie. Wanneer de incubatie moet langer dan 1 d zijn, wordt aanbevolen incuberen bij 4 ° C omdat Triton X-100 segmenten kan doorlaatbaar en kan leiden tot het uiteenvallen van het weefsel tijdens langdurige incubatie bij kamertemperatuur. Neem een negatieve controle ontbreekt primair antilichaam in ten minste één deel voor iedere serie experimenten als controle voor de specificiteit van het secundaire antilichaam. Voor negatieve controles, wordt het primaire antilichaam weggelaten, maar het 0,3% Triton X-100 in 0,1 M PBS en BS worden toegevoegd.
Figuur 2. Succesvolle CCK kleuring 1 week na het herstel van biocytine kleuring en C annabinoid Receptor Type 1 (CB 1 R) - <strong> labeling. (A - C) confocale beelden van 60X die de biocytine-gevulde neuron (A) en CB 1 R immunoreactiviteit (B), aangegeven door de pijlpunt. Dezelfde sectie werd bewerkt voor CCK immunokleuring na 1 week (C). De overlay van beelden wordt getoond in D. CCK immunoreactiviteit werd onthuld met behulp van ver-rood en werd pseudo-gekleurd in cyaan. (E) morfologische wederopbouw van de door biocytine gevulde cel in A. Merk op dat de biocytine en CB 1 R vlekken zijn duidelijk, zelfs na de tweede CCK immunokleuring. Let ook op de verwachte verdeling van de CB 1 R en CCK immunokleuring patronen. (F - H) vergroot beeld van de axon uit de cel, zoals in A, tonen nauwe co-lokalisatie van biocytine en CB 1 R in axonen (pijlpunten). Schaal bar: 50 micrometer (A - D), 100 um (E) en 10 urn (
(Dag 2)
- Was de hersensecties 3x gedurende 10 min elk in 0,1 M PBS (pH = 7,4).
- Incubeer de secties streptavidine rode kleurstof-conjugaat (concentratie: 1: 1000; excitatie: 594 nm met emissie in het zichtbare rode spectrum) met 0,3% Triton X-100 en 3% BS in 0,1 M PBS bij 4 ° CO / N in het donker (verpakt in aluminiumfolie) aan de biocytine onthullen. OPTIONEEL: Voeg een tweede antilichaam, geit anti-cavia (concentratie: 1: 500; excitatie: 488 nm en emissie in groen), met de bovengenoemde incubatie of na de optionele primaire incubatie in stap 2,3.
OPMERKING: Secundaire antilichamen is nodig indien de optionele primaire antilichaam kleuring (stap 2.3) wordt uitgevoerd. Om biocytine visualiseren, een streptavidin-fluorofoor conjugaat met een emissiespectrum in het rood is aan te bevelen, omdat het helpt bij fijnere axonen visualiseren in detail en met een beter contrast (figuren 1-3). Tijdens dubbele of driedubbele immunokleuring om kruisreactiviteit van secundaire antilichamen met elkaar voorkomen, voeg secundaire antilichamen na elkaar op seriële wijze (2 h interval tussen periodieke toevoegingen van de antilichamen voldoende is). Figuur 3A illustreert een biocytine-gevulde cel verwerkt zonder de optionele primaire antilichaam kleuring en afgebeeld voorafgaand aan resectioning.
Figuur 3. Succesvolle Tweede Immunokleuring na het herstel van biocytine morfologie en Resectioning. (A1) confocale afbeelding van een 300 urn schijfje met de terugwinning van de dendritische morfologie van een biocytine gevulde cel. (<strong> A2) Membraan spanning sporen van de neuron in responsie op 500 en -100 pA huidige injecties. (B) Herstel van de-biocytine gevulde soma in een sectie 50 pm verkregen na resectioning de sectie 300 micrometer (in A1), na montage en beeldvorming. (B2) Na immunokleuring van de dunne deel onthulde colocalization van de biocytine gevulde soma (rechter paneel) met CCK (middelste paneel). De samengevoegde afbeelding wordt weergegeven in het rechter paneel. Schaal bar: 50 pm. Panel A2 wordt gereproduceerd met toestemming van Yu et al. , In de pers 25. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
(Dag 3)
- Wassen hersenplakjes 3x gedurende 10 min elk in 0,1 M PBS (pH = 7,4).
- Om de fluorescentie te beschermen en re-kleuring in de toekomst te vergemakkelijken, monteer de secties in een op water gebaseerde montage medium en sluit de randen van het dekglaasje met heldere nagellak.
LET OP: Het is het beste om te delen zo vroeg mogelijk inklemmen tot moeilijkheden bij het verwijderen van de nagellak van de glijbaan, schimmel besmetting, en uitdroging van het weefsel als gevolg van lekkage van de montage medium uit het glaasje te vermijden. Microbiële verontreiniging kan voorkomen worden door 0,02% natriumazide in PBS.
VOORZICHTIG: Natriumazide is zeer giftig en brandbaar wanneer het in contact met water. Raadpleeg de standard operating procedures voor de behandeling en verwijdering van gevaarlijke chemische stoffen.
(Dagen 4-7) - Voer confocale beeldvorming met excitatie bij 594 en 488 nm en bij een vergroting van 20X en 40X tot biocytine gevulde neuronen in rood en neurochemische merkers (CB 1 R) groen onthullen. Beoordelen colabeling (figuur 2).
- Zet de camera blootstelling aan minder dan 100 ms aan fotobleken en OBTA voorkomenin confocale beeld stapels van de axonale en dendritische priëlen van de gehele neuron. Gebruik confocale image stacks en neuron tracing software pakketten om de neuronale morfologie reconstrueren.
3. kleuring van de Tweede Primary Antibody
OPMERKING: Terwijl de tweede immuunkleuren kan worden uitgevoerd 90 d na de eerste kleuring wordt optimale kleuring bereikt als de tweede primaire antilichaam kleuring wordt uitgevoerd binnen 7-10 d.
(Na 7-90 d)
- Solliciteer aceton om een wattenstaafje en strip de nagellak af van het glaasje.
- Verwijder de dekglaasje voorzichtig met fine-tip pincet en doe er een paar druppels van 0,1 M PBS op de secties.
- Haal de delen van de glijbaan met een fijn penseel en was ze in 0,1 M PBS voor 24 - 48 uur op een shaker bedekt met aluminiumfolie bij weinig licht bij 4 ° C.
NB: Het is cruciaal om te delen met een dekkingluminum folie om te voorkomen dat fotobleken. - Om volledige verwijdering van het fixeermiddel garanderen, was de secties 1 - 2x op de volgende dag in 0,1 M PBS gedurende 10 minuten elk.
- Ga door incubatie in de tweede primaire antilichaam (bijvoorbeeld cholecystokinine, een neuropeptide gevonden in bepaalde GABAerge interneuronen (CCK; concentratie: 1: 1000, muis monoklonaal antilichaam)) gedurende 1 d (figuur 2).
OPMERKING: Deze procedure is vergelijkbaar met stap 2.3, maar maakt gebruik van een ander antilichaam. Bovendien wordt de blokkerende stap overgeslagen tijdens re-kleuring. - Was de hersensecties drie keer gedurende 10 min elk in 0,1 M PBS (pH = 7,4).
- Vlek met de fluorofoor-geconjugeerde tweede antilichaam geit anti-muis (concentratie: 1: 500; excitatiegolflengte: 647 nm), om ervoor te zorgen dat de excitatie-emissie spectra van het secundaire antilichaam niet overlappen met streptavidine (concentratie: 1: 1000; excitatiegolflengte: 594 nm) en voorafgaande immunofluorescentievlekken.
- Monteer de secties in waterige montage medium en sluit de randen van het deksel slip met heldere nagellak.
OPMERKING: Bewaar de secties bij 4 ° C in een ondoorzichtige opbergdoos de fluorescentie beschermen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Na succesvolle afronding, de afdelingen behouden biocytine vulling en de immunokleuring uitgevoerd in stap 2 en kan worden afgebeeld met behulp van confocale of epifluorescentie microscopie. Bovendien, het bewerkte secties ook immunokleuring voor het antigeen gelabelde tijdens de verdere verwerking in stap 3. In het deel weergegeven in figuur 2 tonen, werd de morfologie van een biocytine gevulde neuron in een dikke gedeelte (300 pm) geopenbaard via streptavidine gevisualiseerd in rood en de eerste primaire (CB 1 R) gevisualiseerd in groen. De eerste immunokleuring werd uitgevoerd binnen 7 dagen van PFA fixatie. De plak werd gemonteerd in een waterig fixeermiddel, afgebeeld met behulp van een confocale microscoop, en opgeslagen gedurende twee maanden vóór het opnieuw kleuring voor de CCK antilichaam. Let op de morfologie van de opgenomen neuron, waaronder axonale assen (figuur 2E) werd gereconstrueerd uit de confocale beelden obtained na de eerste kleuring procedure. Colocalization van het axon met CB 1 R immunoreactiviteit (Figuur 2 F - H) zou gebaseerd op fysiologische studies. De tweede aankleuring voor CCK werd uitgevoerd op artikels twee maanden na de eerste kleuring procedure. CCK werd in beeld gebracht in ver-rood en werd pseudo-gekleurd in cyaan voor visualisatie. Evenzo Figuur 3 toont een voorbeeld van een cel waarin biocytine-labeling werd geopenbaard en afgebeeld in een dikke gedeelte (figuur 3A1). De intrinsieke fysiologie van het neuron wordt geïllustreerd in figuur 3A2. Het schijfje werd opnieuw doorgesneden bij 50 pm en, hoewel sommige gedeelten met dendritische processen werden verloren, het gedeelte met de soma teruggewonnen (Figuur 3B1). Latere CCK immunokleuring van de dunne gedeelte bleek CCK uitdrukking in het groen in de biocytine gelabelde soma. Montage van de dikke snee in een waterig medium voorkomt excessive weefsel krimp. Gemiddeld 300-um secties gemonteerd met het waterige medium hierbij tot 25,67 ± 3,14% (n = 5 segmenten) gemeten één week na montage. Zo is de dikke secties gemonteerd met het waterige medium zijn ~ 225 micrometer, waardoor resectioning. In verschillende controleonderzoek werd bevestigd dat het proces van immunokleuring tweede wijziging niet leiden tot niet-specifieke labeling van het antilichaam. Zo is het bekend dat parvalbumin (PV) en CCK-immunoreactiviteit elkaar uitsluiten in hippocampale neuronen. Controles waarbij de eerste immunokleuring stap (2) voor biocytine (rood) en CCK (groen) werd gevolgd door de tweede labeling voor parvalbumine (met excitatie bij 405 nm en emissie van blauw) vertoonden een niet-overlappende expressiepatronen (figuur 4). Daarnaast is de karakteristieke laminaire axonale kleurpatronen van de neuronen met expressie van specifieke neurochemische markers (PV, CCK, CB 1 R) werden niet veranderd door de serial re-kleuringen (figuren 2-4). Bovendien secundaire kleuring consistent bleek co-labeling van de neuronen biocytine gevuld met neurochemische merkers verwacht op basis van de fysiologische opnames. Zo, we zijn ervan overtuigd dat de restaining procedure niet leidt tot verlies van specificiteit in de etikettering.
Figuur 4. Gebrek aan Overlap tussen elkaar uitsluitende Markers op de Tweede Immunokleuring na voorafgaande Immunokleuring en montage van de afdelingen. (A - C) Confocale beelden op 10X toont een biocytine gevulde neuron (A) rood, aangeduid met een pijlpunt en CCK immunoreactiviteit in groen (B), aangeduid door de pijl. Let op het ontbreken van overlap. Dezelfde afdeling werd verwerkt voor parvalbumin (PV) immunokleuring in blauw na meer dan 2 maanden (C). de overlay beelden wordt getoond in D. Merk op dat de PV axonen verdeeld in de korrel cellaag, met CCK in de moleculaire laag het verwachte overlappende patroon. Let ook op het ontbreken van colokalisatie van de twee merkers in neuronale somata. De ingezoomde beelden naar de juiste illustreren dat de biocytine gelabelde neuron uitdrukt PV (pijlpunt) en niet CCK (pijl). Schaal bar: 100 urn (A - D), 20 urn (panelen naar rechts). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Een veel voorkomende oorzaak van suboptimale biocytine vult is het per ongeluk verbreken van de neuronale processen met de opname pipet, terwijl het naderen van de cel. Een verloren aanhangsel van de cel weergegeven als een blaar van biocytine aan het einde van een axon, zie figuur 1 (groene pijl). Axonal blebs eenre vaak gevisualiseerd als het patchen van oppervlakkige cellen, waarvan de axonen, kunnen worden gescheiden tijdens het snijden procedures. Echter, kan optimalisering van het vlak van snijden en kennis van de axonale verdelingspatroon van de beoogde klasse cellen helpen bij het voorkomen benaderen de soma van de richting van de vermeende axon, die ook de axon kan verbreken, waardoor het uiterlijk van een axonale bleb . In de meeste celtypen, het de voorkeur het cellichaam benaderen langs de Z-as (witte pijl met markering). Een tweede probleem betreft de toepassing van buitensporige positieve druk om de pipet, terwijl het naderen van de cel. Dit kan niet alleen schade aan de cel en de verbindingen maar veroorzaakt ook intern oplossing die biocytine morsen rond de cel, wat leidt tot hoge achtergrondfluorescentie. Achtergrondkleuring verhoogt ook wanneer de tijd genomen om de cel te benaderen wordt verlengd of wanneer slice kwaliteit niet optimaal, die het vermogen om cellulaire morfologie (figuur 5A definiëren kunnen compromitteren). Het is mogelijk om de soma te trekken, terwijl loskomen van de pipet. Dit zal resulteren in een gebrek aan somatische morfologie (figuur 5B). Om te voorkomen dat het uittrekken van de cel, zet de pipet omhoog en in kleine stappen met de "fijne" beweging instellingen van de manipulator. Als de cel lijkt te zijn om de pipet door een lange membraan extensie, tik / flick de manipulator worden bevestigd zachtjes aan de pipet uit de cel te verwijderen. Vermijd het gebruik van de grove manipulator instellingen totdat de cel volledig is verdreven.
Figuur 5. Afbeeldingen Illustreren Mislukte biocytine Fills. (A) Beeld dat hoge achtergrondfluorescentie door overmatige overdruk in de opname pipet, wat resulteert in slechte mobiele zicht. Fijnere structuren van neuronale processen, waaronder axonen, gevisualiseerd buiten het gebied vae spill. Merk ook op dat soma is uitgetrokken. (B) Een neuron met de soma uitgetrokken tijdens pipet onthechting. Pijlen geven succesvolle vullingen van de axon en dendrieten, terwijl de soma en appendages proximale de pijlen niet zijn hersteld. (C) Een cel patched in een oppervlaktelaag van het deel (<50 urn van het oppervlak) leidt gevulde cellen vertonen gesneden axon en dendrieten (pijlpunten). Let op de kralen (pijlen) van granulaat cel dendrieten, met vermelding van een slechte gezondheid van de cellen (C). Schaal bar: 50 pm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tenslotte, om volledig celmorfologie herstellen zonder doorgesneden axons en dendrieten, het beste doelcel> 50 urn diep om de slice oppervlak. Oppervlakkige cellen kunnen processen die moeten hebbengesneden en kunnen de normale complement van synaptische inputs ontbreken.
De meest gebruikelijke valkuilen in de restaining procedures in verband met de verwijdering van het dekglaasje en het herstel van het deel zonder het weefsel te beschadigen. Een tweede probleem betreft antilichaam penetratie in dichte weefsel, vooral als gedurende de nacht. In enkele gevallen heeft betere penetratie bereikt door incubatie in het primaire antilichaam gedurende maximaal 72 uur bij 4 ° C op een schudapparaat geplaatst in een koude ruimte. Hoewel opnieuw snijden het weefsel is de meest doeltreffende procedure antilichaam penetratie te waarborgen, verlenging van de duur van de incubatie in primair antilichaam of verhogen van detergens concentratie 0,5-1% Triton-X100 kan ook helpen antilichaam penetratie 24. Aangezien de meeste opgenomen neuronen bevinden zich binnen 50 - 100 urn van het oppervlak van de sectie, vinden we dat de kleuring van de dikke gedeelten voldoende labelen biocytine-gevulde Somata of processen op dit niveau. Echter, is het raadzaam dat de omvang van de etikettering antilichaam wordt gecontroleerd op elke sectie voor de interpretatie van negatieve co-lokalisatie resultaten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritische stappen in het protocol
Het vullen van de gepatchte cel met biocytine is de meest cruciale stap om het volledige herstel van de morfologie te waarborgen. Voor volledig herstel van de cel, is het essentieel om een optimale segment oriëntatie selecteren om het verbreken van zo laag mogelijk houden tijdens het snijden. Deze oriëntatie kan verschillen op basis van het circuit en celtype in behandeling. Vervolgens is het noodzakelijk om voldoende de biocytine te diffunderen naar de dendrieten en axonen mogelijk. Sommige kleurstoffen, zoals neurobiotin kan ook neuronen gekoppeld aan de cel opgenomen door middel van gap junctions dringen. De grootte van de pipetpunt moet ook worden geoptimaliseerd, aangezien de soma vaak wordt uitgetrokken wanneer de opening groot en biocytine belading gevaar wanneer de pipetpunt te klein. Bovendien, de juiste procedures tijdens het ontkoppelen van whole-cell-modus zijn essentieel voor de soma te herstellen. Na opname voor 24 uur, de daaropvolgende incubatievan de segmenten in 4% PFA gevolgd door PBS zodat de verknoping van het weefsel wordt gereduceerd, hetgeen essentieel is voor immunohistochemie. Opslag van de schijfjes bij 4 ° C is ook essentieel voor het handhaven van de integriteit segment. Echter, langdurige opslag in PFA vermindert uiteindelijke succes met procedures antilichaam-labeling. Het optimaliseren van de concentratie en de duur van het primaire antilichaam incubatie is belangrijk, omdat deze verschillen afzonderlijke antilichamen en sommige antilichamen kunnen eisen 3-5 d incubatie voor optimale penetratie in dichte weefsel. Opdat de schijfjes onbeschadigd voordat de secundaire primaire antilichaam kleuring is adequate zorg nodig is tijdens het verwijderen van het dekglas.
Wijzigingen en problemen oplossen
We hebben vastgesteld dat er geen vaste duur tussen de eerste en tweede vlek. Secties re-gekleurd maanden later op hetzelfde weefsel en met meer dan één vlek geweest. Inonze recente werken, vergeleken we secties verwerkt met behulp van de re-kleuring methode met die met behulp van standaard immunokleuring protocollen en vinden geen duidelijke verschil in de kleurpatronen of de robuustheid van biocytine vult 6,9,25,26.
Hoewel nog worden getest, is het mogelijk dat opnieuw kleuring meerdere malen worden uitgevoerd, rechtschapen weefsel zijn een beperkende factor voor herhaalde behandeling. De beschikbaarheid van discrete fluoroforen vormt ook een limiet voor het aantal antigenen die kunnen worden gevisualiseerd. Daarom wordt een zorgvuldige behandeling van het weefsel geadviseerd. Een extra proces dat nog te beproeven restaining middels antigeen recovery protocollen (voor oppervlaktereceptoren). Aangezien de integriteit van het weefsel wordt gehandhaafd na verwijdering van het dekglas, verwachten wij dat de procedure ook dient samen kleuringsprotocollen dat antigeen-herstel aan. In dit verband fysiologische registraties leiden steeds cellen zonder bekende neurochemische merkers
Beperkingen van de Techniek
Een beperking geassocieerd met het uitvoeren van immunohistochemische kleuring op dik punten is onvoldoende penetratie van het antilichaam door de volledige dikte van de sectie, met name met standaard overnacht incubatie in het primaire antilichaam. Bovendien verschillende antilichamen en streptavidine, gebruikt biocytine openbaren, kan differentiële weefsel penetratie. Derhalve wordt aanbevolen dat proefdraaien worden uitgevoerd om de diepte van penetratie antilichaam beoordelen en de incubatietijden, temperatuur wijzigen en antilichaam en Triton & #160, X-100 concentratie om een optimale penetratie plak en vlekken voor elk antilichaam bereiken. Ook moet worden opgemerkt dat succesvolle labeling met één antilichaam of streptavidine- biocytine betekent niet dat een tweede antilichaam zal doordringen tot dezelfde hoogte van de sectie. Daarom moet ervoor worden gezorgd dat de penetratie van elk antilichaam, controleert het niveau waarop de biocytine-gemerkte celprocessen onderzocht op co-lokalisatie met neurochemische merker. Wanneer de penetratie onvoldoende is, kan de plak opnieuw coupes <60 urn voor immunokleuring. Merk echter op dat aangezien de plakken al biocytine verwerkt, de morfologie van de cel kan worden opgevangen door confocale beeldvorming om het mogelijke verlies van anatomische gegevens elimineren tijdens opnieuw snijden en neuronale reconstructie vergemakkelijken. Hoewel het mogelijk is dat de leeftijd en diersoorten de mate van penetratie antilichaam kan veranderen, hebben we met succes deze procedures in het weefsel van rat 30-dag- en meer dan 60 dagen oude ratten en muizen.
Een tweede beperking is dat biocytine niet inherent fluorescent en kan niet worden gebruikt voor live beeldvorming en direct morfologische karakterisering tijdens het opnemen. Alternatieve niet-geconjugeerd fluoroforen en Lucifer geel zijn gebruikt voor live-beeldvorming van de cellen 27. Ze zijn niet permanent en verliest fluorescentie bij fixatie, waardoor het onpraktisch voor post-hoc neurochemische identificatie van de opgenomen neuron. Onlangs hebben fluoroforen met biocytine geïntroduceerd om deze beperking te overwinnen en kan worden gebruikt voor levende imaging en voor post-hoc verwerking in dubbele of drievoudige labeling, zoals hier beschreven. Interessant is tot op heden biocytine vullingen hebben geleid tot een beter elektrisch en kleuring te gecombineerde elektrofysiologische en anatomische studies vergeleken met Lucifer geel 28.
Betekenis van de techniek met betrekking tot bestaande /alternatieve methoden
De belangrijkste voordelen van het protocol hier worden beschreven zijn die, anders dan resectioning, de biocytine-gevulde celstructuur en processen intact blijven en niet tot het permanent verlies van weefsel, noch een behoefte moeizame reconstructies uit meerdere secties. Aldus kan een eencellig fill gevolgd door immunocytochemie helpen bij het herstel en morfologische identificatie van specifieke neurochemische merkers.
Toekomstige toepassingen of richtingen na Mastering deze techniek
In alle, presenteren we een nieuwe praktische aanpak voor het herstel van de morfologie en post-hoc double en triple-immunokleuring van neuronen volgende elektrofysiologische opnames. De werkwijze is bijzonder voordelig voor het vinden van nieuwe markeerders als kennis evolueert, herijken neuronen die eerder waren gevuld, gevisualiseerd en afgebeeld. Het is bijzonder voordelig omdat thij kan immunohistochemie worden uitgevoerd weken of zelfs maanden later, het opslaan van weefsel en antilichamen. De methode vereist geen speciale chemicaliën nodig heeft en veilig kan worden uitgevoerd in een laboratorium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs willen graag de steun van NIH / NINDS R01 NS069861 en NJCBIR CBIR14IRG024 te erkennen VS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Sigma | S7653 | Immunostaining |
| KCl | Fluka | 60129 | Immunostaining |
| Na2HPO4 | Sigma | S7907 | Immunostaining |
| KH2PO4 | Sigma | 229806 | Immunostaining |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | Immunostaining |
| Guinea pig anti CB1 | Sigma | Af530-1 | Immunostaining |
| Mouse anti CCK | CURE, UCLA | courtesy of G. Ohning | Immunostaining |
| Rabbit anti Parvalbumin | Swant | PV27 | Immunostaining |
| Streptavidin, Alexa Fluor conjugate | Molecular Probes | S11227 | Immunostaining |
| Normal goat serum (NGS) | Sigma | G9023 | Immunostaining |
| Vectashield | Vector Labs | H-1000 | Immunostaining |
| Secondary Antibodies | Invitogen Molecular probes | Alexa Fluor conjugated dyes | Immunostaining |
| Labnet orbit low speed shaker | Bioexpress | S-2030-LS | Immunostaining |
| Forceps | Dumont | 11231-30 | Immunostaining |
| Slide folders | EMS | 71520 | Immunostaining |
| Vibratome VT 1200 S | Leica | 14048142066 | Electrophysiology |
| Multiclamp 700B amplifier | Molecular devices | Multiclamp 700B | Electrophysiology |
| pCLAMP 10 Software | Molecular devices | pCLAMP 10 | Electrophysiology |
| Digitizer | Molecular Devices | Digidata 1440 digitizer | Electrophysiology |
| Filter tips | Nalgene | 171-0020 | Electrophysiology |
| Sonicator | Fisher Scientific | 15-335-100 | Electrophysiology |
| Microloaders | Eppendorf | 930001007 | Electrophysiology |
| Biocytin | Sigma | B4261 | Electrophysiology |
References
- Garcia-Lopez, P., Garcia-Marin, V., Freire, M. The histological slides and drawings of cajal. Front Neuroanat. 4, 9 (2010).
- Klausberger, T., Somogyi, P. Neuronal diversity and temporal dynamics: the unity of hippocampal circuit operations. Science. 321 (5885), 53-57 (2008).
- Petilla Interneuron Nomenclature, G., et al. Petilla terminology: nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex. Nat Rev Neurosci. 9 (7), 557-568 (2008).
- Armstrong, C., Soltesz, I. Basket cell dichotomy in microcircuit function. J Physiol. 590 (4), 683-694 (2012).
- Povysheva, N. V., Zaitsev, A. V., Gonzalez-Burgos, G., Lewis, D. A. Electrophysiological heterogeneity of fast-spiking interneurons: chandelier versus basket cells. PLoS One. 8 (8), e70553 (2013).
- Gupta, A., Elgammal, F. S., Proddutur, A., Shah, S., Santhakumar, V. Decrease in tonic inhibition contributes to increase in dentate semilunar granule cell excitability after brain injury. J Neurosci. 32 (7), 2523-2537 (2012).
- Fish, K. N., Hoftman, G. D., Sheikh, W., Kitchens, M., Lewis, D. A. Parvalbumin-containing chandelier and basket cell boutons have distinctive modes of maturation in monkey prefrontal cortex. J Neurosci. 33 (19), 8352-8358 (2013).
- Yu, J., Swietek, B., Proddutur, A., Santhakumar, V. Dentate cannabinoid-sensitive interneurons undergo unique and selective strengthening of mutual synaptic inhibition in experimental epilepsy. Neurobiol Dis. 89, 23-35 (2016).
- Yu, J., Swietek, B., Proddutur, A., Santhakumar, V. Dentate total molecular layer interneurons mediate cannabinoid-sensitive inhibition. Hippocampus. 25 (8), 884-889 (2015).
- Varga, C., et al. Functional fission of parvalbumin interneuron classes during fast network events. Elife. 3, (2014).
- Kawashima, T., Okuno, H., Bito, H. A new era for functional labeling of neurons: activity-dependent promoters have come of age. Neural Circuits Revealed. , 109 (2015).
- Krook-Magnuson, E., Luu, L., Lee, S. H., Varga, C., Soltesz, I. Ivy and neurogliaform interneurons are a major target of mu-opioid receptor modulation. J Neurosci. 31 (42), 14861-14870 (2011).
- Szabadics, J., Soltesz, I. Functional specificity of mossy fiber innervation of GABAergic cells in the hippocampus. J Neurosci. 29 (13), 4239-4251 (2009).
- Iball, J., Ali, A. B. Endocannabinoid Release Modulates Electrical Coupling between CCK Cells Connected via Chemical and Electrical Synapses in CA1. Front Neural Circuits. 5, 17 (2011).
- Chen, X., Cho, D. -B., Yang, P. -C.
- Ranjan, A. K., et al. Cellular detection of multiple antigens at single cell resolution using antibodies generated from the same species. Journal of immunological. 379 (1), 42-47 (2012).
- Fuccillo, D. A., Sever, J. L. Concepts in Viral Pathogenesis II. , Springer. 324-330 (1986).
- Buchwalow, I. B., Minin, E. A., Boecker, W. A multicolor fluorescence immunostaining technique for simultaneous antigen targeting. Acta Histochem. 107 (2), 143-148 (2005).
- Qi, G., Radnikow, G., Feldmeyer, D. Electrophysiological and morphological characterization of neuronal microcircuits in acute brain slices using paired patch-clamp recordings. JoVE (Journal of Visualized Experiments. (95), e52358 (2015).
- Walz, W. Patch-clamp analysis : advanced techniques. 2nd edn. , Humana Press. (2007).
- Molnar, P. Patch-clamp methods and protocols. 403, Springer Science & Business Media. (2007).
- Martina, M., Taverna, S. Patch-clamp methods and protocols. , Humana Press. (2014).
- Booker, S. A., Song, J., Vida, I. Whole-cell patch-clamp recordings from morphologically- and neurochemically-identified hippocampal interneurons). J Vis Exp. (91), e51706 (2014).
- Jinno, S., Kosaka, T. Immunocytochemical characterization of hippocamposeptal projecting GABAergic nonprincipal neurons in the mouse brain: a retrograde labeling study. Brain research. 945 (2), 219-231 (2002).
- Yu, J., Proddutur, A., Swietek, B., Elgammal, F. S., Santhakumar, V. Functional Reduction in Cannabinoid-Sensitive Heterotypic Inhibition of Dentate Basket Cells in Epilepsy: Impact on Network Rhythms. Cereb Cortex. , (2015).
- Proddutur, A., Yu, J., Elgammal, F. S., Santhakumar, V. Seizure-induced alterations in fast-spiking basket cell GABA currents modulate frequency and coherence of gamma oscillation in network simulations. Chaos. 23 (4), 046109 (2013).
- Scharfman, H. E. Differentiation of rat dentate neurons by morphology and electrophysiology in hippocampal slices: granule cells, spiny hilar cells and aspiny 'fast-spiking' cells. Epilepsy Res Suppl. 7, 93-109 (1992).
- Tasker, J. G., Hoffman, N. W., Dudek, F. E. Comparison of three intracellular markers for combined electrophysiological, morphological and immunohistochemical analyses. J Neurosci Methods. 38 (2-3), 129-143 (1991).
