Summary
Denne protokol udgør en metode til den morfologiske genopretning af neuroner lappet under elektrofysiologiske optagelser med biocytin påfyldning og efterfølgende immunhistokemisk efterbehandle. Vi viser, at tykke biocytin fyldt sektioner, der blev farves og dækglas kan restained med en anden primær antistof dage eller måneder senere.
Abstract
Elektrofysiologiske optagelser af celler under anvendelse af patch clamp-teknikken har gjort det muligt at identificere forskellige neuronale typer baseret på fyring mønstre. Inddragelsen af biocytin / neurobiotin i optagelsen elektrode tillader post-hoc inddrivelse af morfologiske detaljer, som er nødvendige for at fastslå den dendritiske arborization og regionerne er omfattet af axoner af de optagne neuroner. Men i betragtning af tilstedeværelsen af morfologisk lignende neuroner med forskellige neurokemiske identiteter og funktioner, immunhistokemisk farvning for celle-typespecifikke proteiner er afgørende for endeligt identificere neuroner. For at opretholde netværksforbindelsen, er hjernen sektioner for fysiologiske optagelser forberedt i en tykkelse på 300 um eller derover. Men denne tykkelse ofte hindrer immunhistologisk efterbehandling på grund af problemer med antistof penetration, nødvendiggør resektion af vævet. Resektion af skiver er en udfordrende kunst, ofte resulTing i tab af væv og morfologi af cellerne fra som blev opnået elektrofysiologisk data, gengive data ubrugelige. Da inddrivelse af morfologi vil begrænse tab af data og vejledning i valget af neuronale markører, har vi vedtaget en strategi for at inddrive cellemorfologi først, efterfulgt af sekundær immunfarvning. Vi introducerer en praktisk tilgang til biocytin påfyldning under fysiologiske optagelser og efterfølgende serielle immunfarvning for inddrivelse af morfologi, efterfulgt af restaining af afsnit for at bestemme den neurokemiske identitet. Vi rapporterer, at sektioner, der var fyldt med biocytin, fast med paraformaldehyd (PFA), farves, og dækglas kan fjernes og restained med en anden primær antistof dage senere. Denne restaining omfatter fjernelse af dækglasset, vask af sektioner i en pufferopløsning, og inkubationen af primære og sekundære antistoffer til at afsløre den neurokemiske identitet. Fremgangsmåden er fordelagtig til at fjerne datet tab på grund af en manglende evne til at komme sig morfologi og for at indsnævre de neurokemiske markører, der skal testes baseret på morfologi.
Introduction
Hjernen er kendt for mangfoldighed i de strukturelle og funktionelle egenskaber de enkelte neuronale elementer. Forståelse af roller forskellige neuronale typer i hjernens funktion og patologi kræver karakterisering og entydig identifikation af neuroner. Strukturelt morfologiske træk defineret af somato-dendritisk placering bestemme de potentielle indgange, at en given neuron modtager, mens mønstret af axonal arborization identificerer potentielle postsynaptiske mål. Den strukturelle mangfoldighed af neuroner er blevet værdsat siden de dage i Ramón y Cajal s skelsættende histologiske undersøgelser 1. Fremkomsten af encellede optagelse teknikker viste, at strukturelt forskellige neuroner viser også forskelle i fyring mønstre og synaptiske karakteristika. Mangfoldigheden i struktur og fysiologi er særligt tydeligt i GABAerge hæmmende neuroner 2,3. Desuden er det blevet mere og mere tydeligt, at structurally lignende neuroner kan udtrykke forskellige neurokemiske markører og show tilsvarende funktionelle 4 forskelle. Tilsvarende kan neuroner med de samme neurokemiske markører har distinkte strukturer og funktioner 5-10. Således i praksis, analysen af de funktionelle egenskaber af neuroner og deres rolle i netværket indebærer at definere både morfologiske og neurokemiske identiteter. Selv med fremkomsten af reporter muselinjer rettet mod specifikke neurokemiske markører, er det ofte nødvendigt at bestemme morfologien og subtype identitet baseret på immunhistologi 11.
Standarden metode anvendt til at karakterisere celler optaget i akutte hjernen skiver er at fylde dem med biocytin eller neurobiotin under optagelsen, fastsætte afsnittene i paraformaldehyd (PFA) efter optagelserne, og bruge immunhistokemi at afsløre morfologi og neurokemi. Da tykkelsen af sektioner for skive fysiologi er typisk 300 umeller mere, og fordi de fleste antistoffer undlader at trænge hele vejen gennem denne dybde, skal re-delt til 60 pm eller mindre skiverne for at muliggøre samtidig immunfarvning for biocytin og neurokemiske markører 12-14. Desværre resektion er besværlig; risikerer tab af væv under sektionering; og kan føre til differential væv krympning, komplicerer morfologiske rekonstruktioner. Derudover kunne forudgående kendskab til morfologi hjælpe med at indsnævre ansøgerlandene markører, der sandsynligvis vil blive udtrykt af cellerne. Vi har ændret standard biocytin immunhistologi protokoller til at tillade seriel behandling af sektioner første til genopretning af morfologi og derefter til identifikation af potentielle neurokemiske markører.
Immunhistokemi er studiet af antigen fordeling i væv eller celler og kan visualiseres under anvendelse af et enzym, fluorescerende mærker, radioaktive elementer eller guld kolloide partikler 15. Proceduren involves med primære antistoffer til specifikt at mærke og amplificere en eller flere specifikke antigener, efterfulgt af anvendelsen af fluorescerende sekundære antistoffer rettet mod det primære antistof til visualisering. På grund af nødvendigheden af at skelne fluorescensen spektre af hvert sekundært antistof uden overlap, kan kun et begrænset antal antigener skal undersøges samtidigt. Således kunne forudgående kendskab til morfologi være nyttige i at vælge antallet af kandidat neurokemiske markører for celle klassificering. Begrebsmæssigt er rationalet bag seriel behandling af allerede farvede sektioner baseret på den forudsætning, at immunolabeling for en protein eller peptid bør ikke gribe ind antigenicitet og efterfølgende immunolabeling for et strukturelt uafhængig peptid 16. Denne mangel på interferens skyldes binding af antistoffer til et specifikt protein epitop på et antigen og derfor muliggør den samtidige farvning af multiple antigener i det samme væv. Antallet af antigener ved at afdækked ved immunfarvning er begrænset af behovet for ikke-overlappende spektre af de fluorescerende sekundære antistoffer og af behovet for at målrette individuelle antigener med antistoffer rejst i forskellige arter for at eliminere krydsreaktivitet 17,18. Mens dette er baggrunden serielle snarere end samtidig mærkning med to særskilte antistoffer, der kan interagere, så vidt vi ved, immunfarvning for et andet antigen er ikke blevet rapporteret efter afslutningen af immunolabeling for et eller flere antigener på monterede sektioner. Her beskriver vi en fremgangsmåde til seriel immunfarvning af tidligere farvede og monterede sektioner. Mens vi detalje denne proces for en seriel immunolabeling procedure for inddrivelse af morfologi efterfulgt af farvning for protein / peptid markører i tykke sektioner, kan de samme procedurer skal anvendes i standard, tynde histologiske snit så godt. Desuden beskriver vi en praktisk tilgang til at fylde optagede neuroner med biocytin og processen at fordriveelektrode fra cellen ved afslutningen af optagelser for at optimere fyldning af axonale og dendritiske dorne af neuroner, som præsenteres i vores seneste arbejde 6,8.
Det mest afgørende fordel ved den her beskrevne procedure er, at morfologien af den optagne celle kan fuldt udvindes og afbildes inden du forsøger at resektion eller immunofarvningsprocedure skiverne. Selv problemer med indtrængning af visse antistoffer kan gøre det nødvendigt at resektion udsnit til sekundær immunfarvning, ville de procedurer, der er beskrevet her, fjerne behovet for at rekonstruere komplekse neuroner fra flere sektioner og ville undgå problemer på grund af tab af væv og differentieret krympning, hvilket kan kompromittere genopbygning efter resektion. En ekstra fordel er, at processen vil reducere omkostninger, tid, kræfter og dyre antistoffer ved at begrænse immunfarvning og re-sektionering til skiver, hvor biocytin fyldt neuroner inddrevet. Den mest praktiske aspekt er annoncennelle immunfarvning, der kan udføres på sektioner farvede måneder, før du bruger den førnævnte teknik. Især vil genvinding af morfologi klart svække at fysiologiske data fra cellerne kasseres på grund af en manglende evne til at opnå en grundlæggende morfologisk karakterisering af celletypen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. biocytin Påfyldning under Elektrofysiologi
BEMÆRK: Læserne kan henvise til alternative kilder til grundlæggende patch-clamp optagelse teknikker og instrumentering 19-22, som ikke udarbejdet på her. Trinene beskrevet her antager, at udstyr og procedurer til patch-clamp optagelser allerede er etableret, og beskrivelsen vil være begrænset til detaljer i forbindelse med biocytin-fyldning og post-hoc immunfarvning. Alle forsøg er skitseret i dette manuskript blev udført på rotter.
- Ved hjælp af en vibratom, forberede levende hjerneudsnit fra det ønskede område ved en tykkelse på 300 - 350 um 23.
- Forbered en intern opløsning indeholdende 0,2% biocytin ved tilsætning af 2 mg biocytin til 1 ml intern opløsning 6. For de bedste resultater, sonikeres den interne løsning for 10 - 15 minutter, indtil biocytin opløses fuldstændigt. Dernæst indlæse den interne opløsning i en 1 ml sprøjte udstyret med en 0,2 &# 160; um porestørrelse polypropylen filter spids fastgjort til en microloader. Holde dette loading sprøjte på en kold pack til at opretholde stabiliteten af Mg-ATP og Na-GTP i det indre opløsning.
BEMÆRK: En intern opløsning indeholdende kalium gluconat (126 mM K-gluconat, 4 mM KCl, 10 mM HEPES, 4 mM Mg-ATP, 0,3 mM Na-GTP, og 10 mM phosphocreatin) er optimal for inddrivelse af visse neurokemiske markører, herunder parvalbumin, under immunolabeling. Det er vores erfaring, at bruge cesium- og klorid-baserede interne løsninger reducerer evnen til at inddrive immunfarvning for visse neurokemiske markører. Neurobiotin eller en celle-impermeabel, fixable, polær sporstof kombinerer en Alexa fluorophor med biocytin kan anvendes som et alternativ til biocytin. - Under infrarød differentiel interferens kontrast, visualisere den passende celle til optagelse. For at minimere enhver forstyrrelse af Axon, nærmer cellelegemet ved at sænke pipetten langs sin akse ved hjælp af "approach" fSalvelse tilgængelig i de fleste mikromanipulatorer. Etablere hel-celle optagelser under infrarød forskellen interferens kontrast hjælp patch-clamp fysiologi protokoller 19-22.
BEMÆRK: Undgå nærmer cellen fra retningen af det formodede Axon, da det vil adskille Axon, visualiseret som et bleb ved den afskårne ende (grøn pil i figur 1). Også undgå at anvende højt positivt tryk til optagelsen pipette mens nærmer cellen at minimere udslippet af biocytin, hvilket vil resultere i høj baggrundsfarvning.
Figur 1. Foreslåede Plane for Nærmer celler for biocytin fyld. Billedet viser en Granule Cell (GC) fyldes med biocytin under optagelse, der er blevet behandlet til afsløre biocytin (i rødt under anvendelse 594 streptavidin). GC har sine dendritter orienteret i XY-planet. Bemærk den afhuggede granula celleAxon (grøn pil) på grund af pipette bevægelse langs XY-planet. Bemærk, at det er ideelt at nærme sig dette neuron langs XZ planet. Scale bar: 50 pm.
- I spænding clamp-konfiguration, fastlægge hel-celle kapacitans og serie modstand som reaktion på små (5 mV), korte (30 ms) spænding trin ved hjælp af hjælp af membranen test funktion i bad mode i en overtagelse elektrofysiologi data og analyse software. Dette vil sikre etableringen af hel-celle optageforhold at tillade biocytin-påfyldning.
- Gennemføre fysiologiske optagelser i enten strøm- eller spænding-clamp-tilstand efter behov. Et minimum optagetid på> 10 min ved 34 ° C er ideel.
BEMÆRK: Længere optagetider kan være behov for undersøgelser udført ved stuetemperatur. - Ved afslutningen af de fysiologiske optagelser, genetablere patch-clamp-konfiguration ved langsomt at bevæge optagelsen pipette i små trin, skiftevis opad (langs Z-aksen) ogudad (langs X-aksen) i spænding-clamp modus.
- Samtidig overvåge kapacitans og input modstand ved hjælp af funktionen "membran test" til at visualisere tabet af kapacitive transienter og sammenbruddet af de nuværende reaktioner på en lige linje, der angiver re-forsegling af cellen og etablering af en ekstern-out- lappe på pipettespidsen. Hold celle ad depolariseret potentiale (-40 mV) vil lette re-forsegling proces.
BEMÆRK: Denne procedure for fjernelse af en celle sikrer typisk fuldstændig genopretning af soma og dendritter. Påfør ikke positivt tryk til optagelsen pipetten under denne procedure eller mens frigørelse af cellen fra pipetten. Visualisering af soma af den optagne celle i udsnittet indikerer tilbagetrækningen lykkes. Tilstedeværelsen af cellerester eller en membran plaster ved afslutningen af den fritliggende spids indikerer typisk dislokation af soma og vil ikke give fuldstændig cellulær morfologi. - Aftis aftagning pipetten fra cellen, fastholde udsnittet i optagelsen kammer til stillingen 3 - 5 min for at sikre transporten af farvestoffet distale dendritiske og axonale processer.
- Overfør skiverne til en 24-brønds plade indeholdende 4% PFA for fiksering.
ADVARSEL: PFA er kræftfremkaldende, og egnede personlige værnemidler, herunder handsker og en ansigtsmaske, skal anvendes for at undgå hudirritation og indånding. PFA er brandfarligt og skal opbevares utilgængeligt for brand. PFA er aldrig bortskaffes i afløbet og skal indsamles som kemikalieaffald. PFA fiksering skal isoleres fra områder anvendes til levende skive forberedelse for at undgå forurening af fysiologi setup, herunder overførselspipetter. - 24 - 48 timer efter PFA fiksering, overføre skiver til 0,1 M phosphatbufret saltvand (PBS) til opbevaring før immunfarvning.
BEMÆRK: Ideelt biocytin genopretning og immunfarvning er bedst, når udføres hurtigt efter fiksering, selv om farvning per dannet inden 7 d af fiksering udbytter gode resultater. Skiver kan opretholdes i PBS med 0,02 - 0,05% natriumazid til farvning udført op til og over 90 dage efter fiksering. Selv om fiksering natten over i PFA fungerer godt for de fleste antistoffer, er det muligt, at nogle antistoffer fungerer bedst, når varigheden af inkubationen i fiksativ reduceres. Fiksering i PFA i over 48 timer reducerer tilgængeligheden af antigener og mindsker chancerne for vellykket sekundær immunfarvning for neurokemiske markører.
ADVARSEL: Natriumazid er ekstremt farligt og irriterende ved kontakt med hud eller øjne eller ved indtagelse eller indånding. Alvorlig overeksponering kan resultere i dødsfald. Carcinogenicitet og mutagenicitet af forbindelsen, er ikke kendt. Brug egnede personlige værnemidler, herunder handsker, beskyttelsesbriller, en kittel og en støv respirator. Natriumazid aldrig bortskaffes i afløbet og skal indsamles som kemikalieaffald.
(Dag 1)
BEMÆRK: Følgende immunfarvning fremgangsmåde angår fritflydende sektioner og kræver kontinuerlig omrystning ved en lav hastighed (2 omdrejninger / minut, rpm) på et rysteapparat i alle inkubationstrin.
- Vask vævet 3x i 10 minutter hver i 0,1 M PBS (pH = 7,4).
BEMÆRK: 0,1 M PBS kan erhverves kommercielt eller fremstilles i laboratoriet på følgende måde (gør 1 I): 8 g NaCl, 0,2 g KCI, 1,44 g Na 2 HPO 4, og 0,24 g KH 2 PO 4 i 1 L af dH 2 0.
BEMÆRK: Hvis den ønskede neurokemiske markør er kendt, farvning for et protein / kan udføres peptid samtidigt med biocytin farvning (trin 2,2-2,4). Hvis farvning for kun biocytin, fortsæt til trin 2.5. - EKSTRA: Blok med 10% blokeringsserum (BS; normalt gedeserum (NGS) fortyndet i 0,3% Triton X-100 i PBS i 1 time ved stuetemperatur).
BEMÆRK: Hver brønd børmodtage samme volumen af opløsningen; den anbefalede mængde er mellem 250-500 uL / brønd. Udvælgelsen af den blokerende serum er baseret på de arter, hvor de sekundære antistoffer rejst (f.eks er NGS anvendes til dye-konjugeret gede anti- (respektive primære antistof-arter)). Hvis behovet opstår at anvende sekundære antistoffer i forskellige arter til immunfarvning sektioner, omfatter 10% af hver normalt serum i blokerende trin (2) og 3% af hver normalt serum til de primære og sekundære antistof inkubationstrin. - (EKSTRA) Der inkuberes afsnittene i primært antistof, CB 1 R (polyklonale, marsvin) med 0,3% Triton X-100, og 3% BS i 0,1 M PBS ved RT O / N. CB 1 R anvendes til at identificere cannabinoid receptor type 1-ekspression.
BEMÆRK: Dette trin er valgfrit og ikke forpligtet til at afsløre biocytin påfyldning. Figur 2 illustrerer et snit mærket til biocytin og CB 1 R under den første farvning proces. O / N INCUbation ved stuetemperatur er tilstrækkelig for de fleste af de primære antistoffer; imidlertid visse primære antistoffer, herunder CB 1 R, kræve 3 - 5 d inkubation. Hvis inkubationen skal være længere end 1 d, anbefales det at inkubere ved 4 ° C, fordi Triton X-100 kan permeabilisere skiver og kan føre til opløsningen af vævet under forlænget inkubering ved stuetemperatur. Medtag en negativ kontrol mangler primært antistof i mindst én sektion for hver række eksperimenter som en kontrol for specificiteten af det sekundære antistof. For negative kontroller, er det primære antistof udeladt, men 0,3% Triton X-100 i 0,1 M PBS og BS tilsættes.
Figur 2. Vellykket CCK Farvning 1 uge Efter Inddrivelse af biocytin Farvning og C annabinoid receptor type 1 (CB 1 R) - <strong> mærkning. (A - C) Konfokal billeder med 60X viser biocytin fyldt neuron (A) og CB 1 R immunreaktivitet (B), indikeret ved pilehovedet. Det samme afsnit blev forarbejdet til CCK immunfarvning efter 1 uge (C). Den overlejring af billederne er vist i D. CCK immunreaktivitet blev afsløret under anvendelse af langt-rød og blev pseudo-farvet i cyan. (E) Morfologisk rekonstruktion af biocytin fyldt celle i A. Bemærk, at biocytin og CB 1 R-farvning er tydelige, selv efter den anden CCK immunfarvning. Bemærk også den forventede fordeling af CB 1 R og CCK Immunofarvning mønstre. (F - H) Forstørret billede af axon fra cellen, som i A, show tæt co-lokalisering af biocytin og CB 1 R i axoner (pilespidser). Scale bar: 50 pm (A - D), 100 um (E), og 10 um (
(Dag 2)
- Vask hjernen sektioner 3x i 10 minutter hver i 0,1 M PBS (pH = 7,4).
- Inkuber de afsnit på streptavidin rødt farvestof-konjugat (koncentration: 1: 1,000; excitation: 594 nm med emission i det synlige røde spektrum) med 0,3% Triton X-100 og 3% BS i 0,1 M PBS ved 4 ° CO / N i mørke (pakket ind i aluminiumfolie) til at afsløre biocytin. EKSTRA: Medtag et sekundært antistof, gede anti-marsvin (koncentration: 1: 500; excitation: 488 nm og emission i grønt), med ovenstående inkubation hvis efter den valgfri primære inkubation i trin 2.3.
BEMÆRK: Sekundært antistof vil være nødvendigt, hvis den valgfri primære antistof-farvning (trin 2.3) udføres. For at visualisere biocytin, en streptavidin-fluoroforen konjugat med en emission spektrum i rød anbefales, da det hjælper til at visualisere finere axoner i detaljer og med bedre kontrast (figur 1 - 3). Under dobbelt eller tredobbelt immunfarvning, for at undgå krydsreaktivitet af sekundære antistoffer med hinanden, tilføje sekundære antistoffer ene efter den anden i en seriel måde (2 timer intervallet mellem serielle tilsætninger af antistofferne er tilstrækkelig). Figur 3A viser en biocytin fyldt celle forarbejdet uden det valgfrie primære antistof-farvning og afbildes før resektion.
Figur 3. Vellykket Anden Immunfarvning efter Inddrivelse af biocytin morfologi og resektion. (A1) Konfokal billede af en 300 um skive viser genopretning af den dendritiske morfologi af en biocytin fyldt celle. (<strong> A2) Membran spænding spor af neuron i respons på +500 og -100 pA nuværende injektioner. (B) Inddrivelse af biocytin fyldte soma i en 50 um sektion opnået efter resektion af 300 um sektion (i A1) efter montering og billedbehandling. (B2) Efter immunfarvning af den tynde sektion afslørede colokalisering af biocytin fyldt soma (højre panel) med CCK (midterste panel). Det flettede billede er illustreret i det højre panel. Scale bar: 50 pm. Panel A2 er gengivet med tilladelse fra Yu et al. I pressen 25. Klik her for at se en større version af dette tal.
(Dag 3)
- Vask hjernesnit 3 x i 10 minutter hver i 0,1 M PBS (pH = 7,4).
- For at beskytte fluorescensen og lette re-farvning i fremtiden, montere seconer i et vandbaseret montering medium og forsegle kanterne af dækglasset med klar neglelak.
BEMÆRK: Det er bedst at restain sektioner så tidligt som muligt at undgå vanskeligheder i at fjerne neglelak fra slide, støber skadedyrsangreb, og dehydrering af væv som følge af lækage af montagerammen medium fra objektglasset. Mikrobiel kontaminering kan forebygges ved anvendelse af 0,02% natriumazid i PBS.
ADVARSEL: Natriumazid er meget giftigt og brandfarligt når det er i kontakt med vand. Der henvises til standardprocedurer for håndtering og bortskaffelse af farlige kemikalier.
(Dag 4 - 7) - Udfør konfokal billeddannelse med excitation ved 594 og 488 nm og ved en forstørrelse på 20X eller 40X at afsløre biocytin fyldt neuroner i røde og neurokemiske markører (CB 1 R) grønt. Vurdere colabeling (figur 2).
- Indstil eksponeringen kamera til mindre end 100 ms for at undgå fotoblegning og SKAFFESi konfokale billedstakke af axonale og dendritiske dorne i hele neuron. Brug konfokale billede stakke og neuron opsporing softwarepakker at rekonstruere den neuronal morfologi.
3. Farvning af Anden Primary Antibody
BEMÆRK: Mens den anden immunfarvning kan udføres 90 d efter den første farvning, er optimal farvning opnås, hvis det andet primære antistof farvning udføres inden 7-10 d.
(Efter 7-90 d)
- Påfør acetone til en vatpind og fratage neglelak ud af objektglasset.
- Fjern dækglasset forsigtigt med fint-tip pincet og sætte et par dråber af 0,1 M PBS på afsnittene.
- Fjern forsigtigt afsnittene fra dias med en fin pensel og vaske dem i 0,1 M PBS i 24 - 48 h på en shaker dækket i aluminiumsfolie i svagt lys ved 4 ° C.
BEMÆRK: Det er afgørende at dække sektioner med etluminum folie for at undgå fotoblegning. - At sikre fuldstændig fjernelse af monteringselementet medium, vaske sektionerne 1 - 2x den følgende dag i 0,1 M PBS i 10 minutter hver.
- Fortsæt med inkubering i det andet primære antistof (f.eks cholecystokinin, et neuropeptid findes i visse GABAerge interneuroner (CCK; koncentration: 1: 1,000; monoklonalt museantistof)) i 1 d (figur 2).
BEMÆRK: Denne procedure svarer til trin 2.3, men bruger en anden antistof. Derudover er det blokerende trin udelades under re-farvning. - Vask hjernesektioner tre gange i 10 min hver i 0,1 M PBS (pH = 7,4).
- Pletten med fluoroforen-konjugeret sekundært antistof gede-anti-muse (koncentration: 1: 500; excitationsbølgelængde: 647 nm), at sikre, at excitation-emission spektre af det sekundære antistof ikke overlapper streptavidin (koncentration: 1: 1,000; excitationsbølgelængde: 594 nm) og forudgående immunofluorescenspletter.
- Monter afsnittene i vandig monteringsmedium og forsegle kanterne af dækglasset med klar neglelak.
BEMÆRK: Opbevar afsnittene ved 4 ° C i en uigennemsigtig opbevaringsboks til at beskytte fluorescensen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter en vellykket afslutning, sektionerne bevarer biocytin fyld og immunolabeling udført i trin 2, og kan afbildes ved anvendelse af konfokal eller epifluorescensmikroskopi. Desuden vil de bearbejdede sektioner også vise immunfarvning for antigenet mærkes under den efterfølgende bearbejdning i trin 3. I afsnittet illustreret i figur 2, blev morfologien af en biocytin fyldt neuron i en tyk sektion (300 pm) afslørede anvendelse af streptavidin visualiseret med rødt og den første primære (CB 1 R) visualiseret med grønt. Den første immunfarvning blev udført inden for 7 d PFA fiksering. Den skive blev monteret i et vandigt monteringsmedium, filmede med en konfokal mikroskop, og opbevares i en periode på to måneder, inden en ny farvning for CCK antistof. Bemærk morfologien af det optagede neuron, herunder axonale dorne (figur 2E), blev rekonstrueret fra det konfokale billeder obtained efter den første farvningsprocedure. Colokalisering af axon med CB 1 R immunreaktivitet (figur 2 F - H) var forventet, baseret på fysiologiske undersøgelser. Den anden farvning for CCK blev udført på snit to måneder efter den første farvningsprocedure. CCK blev afbildet i langt-rød og blev pseudo-farvet i cyan til visualisering. Ligeledes Figur 3 illustrerer et eksempel på en celle, hvori biocytin-mærkning blev afsløret og afbildes i en tyk sektion (fig 3A1). Den iboende fysiologi neuron er illustreret i figur 3A2. Den skive blev re-delt på 50 um, og selv om nogle afsnit, der indeholder dendritiske processer gik tabt, det afsnit, der indeholder soma inddrives (Figur 3B1). Efterfølgende CCK immunfarvning af den tynde afsnit viste CCK ekspression i grønt i biocytin-mærkede soma. Montering af tykke skive i et vandigt medium forhindrer everforbrug væv krympning. I gennemsnit 300-um snit monteret ved hjælp af den vandige medium falde med ca. 25,67 ± 3,14% (n = 5 skiver) når målt en uge efter montering. Således er de tykke sektioner monteres ved hjælp det vandige medium er ~ 225 um, der giver mulighed for resektion. I flere kontrol-undersøgelser blev det bekræftet, at processen med immunolabeling for anden gang ikke førte til ikke-specifik mærkning af antistoffet. For eksempel er det kendt, at parvalbumin (PV) og CCK immunreaktivitet er gensidigt udelukkende i hippocampale neuroner. Kontrol, hvor det første immunolabeling trin (2) for biocytin (rød) og CCK (grøn) blev efterfulgt af den anden mærkning for parvalbumin (med excitation ved 405 nm og emission med blåt) viste ikke-overlappende ekspressionsmønstre (figur 4). Derudover særprægede laminar axonal farvede mønstre af neuronerne, der udtrykker specifikke neurokemiske markører (PV, CCK, CB 1 R) blev ikke ændret ved den serial re-farvningsprocedurer (figur 2 - 4). Desuden sekundær farvning konsekvent afsløret co-mærkning af de biocytin-fyldte neuroner med de neurokemiske markører forventes på grundlag af de fysiologiske optagelser. Således er vi overbeviste om, at restaining procedure ikke fører til tab af specificitet i mærkningen.
Figur 4. Manglende Overlap mellem gensidigt udelukkende Markers på Second Immunfarvning efter forudgående Immunfarvning og montering af §§. (A - C) Konfokal billeder med 10X viser en biocytin fyldt neuron (A) i rød, angivet ved en pilespids, og CCK immunreaktivitet i grøn (B), indikeret med pilen. Bemærk den manglende overlapning. Det samme sektion blev behandlet for parvalbumin (PV) immunfarvning i blå efter mere end 2 måneder (C). Den overlay af billeder vises i D. Bemærk, at PV axoner er fordelt i granula cellelag, med CCK i det molekylære lag i den forventede ikke-overlappende mønster. Bemærk også den manglende en lokalisering af de to markører i neuronal somata. Det forstørrede billeder til højre illustrerer, at biocytin-mærkede neuron udtrykker PV (pilespids) og ikke CCK (pil). Scale bar: 100 um (A - D), 20 um (paneler til højre). Klik her for at se en større version af dette tal.
En almindelig årsag til suboptimal biocytin fylder er utilsigtet afbrydelse af de neuronale processer med optagelsen pipette, mens nærmer cellen. En tabt vedhæng til cellen vises som en bleb af biocytin ved slutningen af en axon, som illustreret i figur 1 (grøn pil). Axonal blærer enre ofte visualiseres når patching overfladiske celler, hvis axoner kan udskilles under udskæring procedurer. optimering af planet af udskæring og kendskab til axonal fordelingsmønster af det målrettede celle klasse, kan imidlertid hjælpe til at undgå nærmer soma fra retningen af det formodede Axon, som også kan adskille Axon, hvilket resulterer i fremkomsten af en axonal bleb . I de fleste celletyper, er det foretrukket at nærme cellelegemet langs Z-aksen (hvid pil med mærket). Et andet spørgsmål vedrører anvendelsen af overdreven overtryk til pipetten mens nærmer cellen. Dette kan ikke kun skade cellen og dens forbindelser men også forårsager indre opløsning indeholdende biocytin at spilde omkring cellen, hvilket fører til høj baggrundsfluorescens. Baggrundsfarvning øger også når den tid det tager at nærme cellen er forlænget eller når slice kvalitet ikke er optimal, hvilket kan nedsætte evnen til at definere cellulær morfologi (figur 5A). Det er muligt at trække soma ud, mens løsne pipetten. Dette vil resultere i en mangel på somatisk morfologi (figur 5B). For at undgå at trække cellen, flytte pipetten op og ud i små trin ved hjælp af "fine" bevægelse indstillinger manipulator. Hvis cellen ser ud til at være knyttet til pipetten gennem en lang membran udvidelse, tap / svirp manipulatoren forsigtigt at fjerne pipetten fra cellen. Undgå at bruge de grove manipulator indstillingerne, indtil cellen er fuldt løsnet.
Figur 5. Billeder Illustrere Mislykkede biocytin fyld. (A) billede, der viser høj baggrundsfluorescens grund af overdreven overtryk i optagelsen pipette, hvilket resulterer i dårlig celle synlighed. Finere strukturer af neuronale processer, herunder axoner, visualiseres ud over regionen the spill. Læg også mærke, at soma er blevet trukket ud. (B) En neuron med soma trukket ud under pipette løsrivelse. Pile viser succesfulde udfyldninger af Axon og dendritter, mens soma og vedhæng nærmest pilene ikke er udlignet. (C) En celle patched i en overfladisk lag af den pågældende del (<50 um fra overfladen) resulterer i fyldte celler, der udviser cut Axon og dendritter (pilespidser). Læg mærke til beading (pile) af granula celle dendritter, om et ringe celle sundhed (C). Scale bar: 50 pm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Endelig, for at genvinde komplet cellulær morfologi uden afskårne axoner eller dendritter, er det bedst at målcelle> 50 um dyb til udsnittet overflade. Overfladiske celler kan have processer, som harblevet skåret og kan mangle den normale komplement af synaptiske input.
De mest almindelige faldgruber i restaining procedurerne er forbundet med fjernelsen af dækglasset og inddrivelse af afsnittet uden at beskadige vævet. Et andet spørgsmål vedrører antistof indtrængen i tykke væv, især når inkuberet natten. I flere tilfælde har bedre indtrængning er opnået ved inkubering i det primære antistof i op til 72 timer ved 4 ° C på en orbitalryster anbringes i et kølerum. Selvom re-sektionering vævet er den mest effektive fremgangsmåde til at sikre antistof penetration, hvilket forlænger varigheden af inkubationen i primært antistof eller øge koncentrationen af detergent til 0,5 - 1% Triton-X100 kan også hjælpe antistof indtrængning 24. Da de fleste optagne neuroner er placeret inden for 50 - 100 um fra overfladen af sektionen, finder vi, at farvningen af tykke sektioner er tilstrækkelig til at mærke biocytin-filled somata eller processer på dette niveau. Det anbefales dog, at omfanget af antistof mærkning kontrolleres på hver sektion, før fortolke negative co-lokalisering resultater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritiske trin i protokollen
Fyldning af lappet celle med biocytin er det mest afgørende skridt for at sikre fuld genopretning af morfologi. For fuld genopretning af cellen, er det vigtigt at vælge en optimal skive orientering for at minimere afbrydelse af processer under udskæring. Denne orientering kan variere baseret på kredsløbet og celletype, der undersøges. Dernæst er det vigtigt at give tilstrækkelig tid til biocytin at diffundere til dendritter og axoner. Nogle farvestoffer, såsom neurobiotin, kan også trænge neuroner koblet til indspillede cellen gennem gap junctions. Størrelsen af pipettespidsen skal også optimeres, da soma tendens til at blive trukket ud, når åbningen er stor og biocytin loading kompromitteres, når pipettespidsen er for lille. Derudover passende procedurer samtidig udkobling fra hel-celle-funktion er afgørende for at inddrive soma. Efter optagelsen i 24 timer, den efterfølgende inkubationaf skiverne i 4% PFA efterfulgt af PBS sikrer, at tværbindingen af vævene er reduceret, hvilket er kritisk for immunhistokemi. Opbevaring af skiverne ved 4 ° C er også afgørende for at opretholde skive integritet. Men langvarig opbevaring i PFA reducerer eventuel succes med procedurer antistof-mærkning. Optimering af koncentrationen og varigheden af det primære antistof inkubation er vigtig, da disse vil variere for de enkelte antistoffer, og nogle antistoffer kan kræve 3-5 d inkubation for optimal penetration i tykt væv. For at sikre at skiverne er ubeskadigede, før det sekundære primære antistof-farvning, kræves der tilstrækkelig omhu under fjernelsen af dækglasset.
Ændringer og fejlfinding
Vi har observeret, at der er ingen fast varighed mellem den første og anden farve. Sektioner er blevet re-farvede måneder senere samme væv og med mere end en plet. Ivores seneste værker, vi sammenlignet sektioner behandles ved hjælp af re-farvning metoden med disse ved hjælp af standard Immunofarvning protokoller og finde nogen indlysende forskel i farvning mønstre eller robustheden af biocytin fylder 6,9,25,26.
Mens det stadig skal testes, er det muligt, at re-farvning kan udføres mere end én gang, med vævsintegritet være en begrænsende faktor for gentagen håndtering. Tilgængeligheden af diskrete fluoroforer udgør også en grænse for antallet af antigener, der kan visualiseres. Derfor er omhyggelig håndtering af vævet tilrådes. En yderligere proces, der er tilbage, der skal testes restaining hjælp antigen recovery protokoller (for overfladereceptorer). Siden integriteten af vævet bevares efter fjernelse fra dækglasset, forventer vi, at proceduren også bør arbejde farvning protokoller, der anbefaler antigen-opsving. I denne henseende fysiologiske optagelser ofte give celler med ingen kendte neurokemiske markører
Begrænsninger af teknikken
En begrænsning forbundet med at udføre immunhistokemisk farvning på tykke snit er den utilstrækkelige indtrængning af antistoffet gennem hele tykkelsen af sektionen, især med standard inkubation natten i det primære antistof. Desuden forskellige antistoffer og streptavidin, der anvendes til at afsløre biocytin, kan have differentieret væv penetration. Det anbefales derfor, at prøvekørsler udføres for at vurdere dybden af antistof penetration og at modificere inkubationstider, temperaturer, og antistof og Triton & #160; X-100-koncentrationer for at opnå optimal skive penetration og farvning for hvert antistof. Det skal også bemærkes, at en vellykket mærkning med et antistof eller med streptavidin-biocytin ikke indebærer, at et andet antistof vil trænge igennem til den samme dybde af afsnittet. Derfor skal man sørge for at kontrollere indtrængen af hvert antistof til det niveau, hvor biocytin-mærket celleprocesser undersøges for co-lokalisering med neurokemiske markør. Hvis penetration er utilstrækkelige, skive kan re-delt på <60 um for immunfarvning. Bemærk dog, at eftersom skiverne allerede blev forarbejdet til biocytin, kan morfologien af cellen indfanges ved konfokal billeddannelse for at eliminere det mulige tab af anatomiske data under re-sektionering og lette neuronal genopbygning. Mens det er muligt, at alder og dyrearter kan ændre graden af antistof penetration, har vi med succes anvendt disse procedurer i rottevæv fra 30-dag- og over 60 dage gamle rotter og mus.
En anden begrænsning er, at biocytin er ikke i sig selv fluorescerende og kan ikke anvendes til direkte billedvisning og tidstro morfologiske karakterisering under optagelse. Alternative ukonjugerede fluoroforer og Lucifer gul er blevet brugt til levende billeddannelse af cellerne 27. De er ikke permanent og miste fluorescens ved fiksering, hvilket gør det upraktisk for post-hoc neurokemiske identifikation af den registrerede neuron. For nylig har fluoroforer med biocytin blevet indført for at overvinde denne begrænsning og kan anvendes til billeddannelse såvel som til post-hoc forarbejdning i dobbelt- eller tredobbelt-mærkning, som beskrevet her. Interessant, til dato har biocytin fylder resulteret i bedre elektriske og farvningsegenskaber for kombinerede elektrofysiologiske og anatomiske undersøgelser sammenlignet med Lucifer yellow 28.
Betydningen af Teknik med Respekt til eksisterende /Alternative Metoder
De store fordele ved at bruge protokollen beskrevet her, er, at i modsætning resektion, den biocytin fyldt cellestruktur og processer forbliver intakt og ikke fører til permanent tab af væv, eller et behov for besværlige rekonstruktioner fra flere sektioner. Således kan en enkelt-celle fyld efterfulgt af immuncytokemi hjælpe i den morfologiske genopbygning og identifikation af specifikke neurokemiske markører.
Fremtidige Programmer eller vejvisning efter Mastering Denne teknik
I alt præsenterer vi en ny praktisk tilgang til genopretning af morfologi og post-hoc dobbelt- og triple-immunolabeling af neuroner efter elektrofysiologiske optagelser. Processen er især fordelagtig for at finde nye markører som viden udvikler sig, re-evaluering af neuroner, der tidligere var fyldt, visualiseret, og afbildet. Det er særligt fordelagtigt, fordi than kan immunhistokemi udføres uger eller endda måneder senere, sparer væv og antistoffer. Metoden kræver ingen specielle kemikalier og kan sikkert udføres i alle laboratorier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne anerkende den støtte fra NIH / NINDS R01 NS069861 og NJCBIR CBIR14IRG024 til VS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Sigma | S7653 | Immunostaining |
| KCl | Fluka | 60129 | Immunostaining |
| Na2HPO4 | Sigma | S7907 | Immunostaining |
| KH2PO4 | Sigma | 229806 | Immunostaining |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | Immunostaining |
| Guinea pig anti CB1 | Sigma | Af530-1 | Immunostaining |
| Mouse anti CCK | CURE, UCLA | courtesy of G. Ohning | Immunostaining |
| Rabbit anti Parvalbumin | Swant | PV27 | Immunostaining |
| Streptavidin, Alexa Fluor conjugate | Molecular Probes | S11227 | Immunostaining |
| Normal goat serum (NGS) | Sigma | G9023 | Immunostaining |
| Vectashield | Vector Labs | H-1000 | Immunostaining |
| Secondary Antibodies | Invitogen Molecular probes | Alexa Fluor conjugated dyes | Immunostaining |
| Labnet orbit low speed shaker | Bioexpress | S-2030-LS | Immunostaining |
| Forceps | Dumont | 11231-30 | Immunostaining |
| Slide folders | EMS | 71520 | Immunostaining |
| Vibratome VT 1200 S | Leica | 14048142066 | Electrophysiology |
| Multiclamp 700B amplifier | Molecular devices | Multiclamp 700B | Electrophysiology |
| pCLAMP 10 Software | Molecular devices | pCLAMP 10 | Electrophysiology |
| Digitizer | Molecular Devices | Digidata 1440 digitizer | Electrophysiology |
| Filter tips | Nalgene | 171-0020 | Electrophysiology |
| Sonicator | Fisher Scientific | 15-335-100 | Electrophysiology |
| Microloaders | Eppendorf | 930001007 | Electrophysiology |
| Biocytin | Sigma | B4261 | Electrophysiology |
References
- Garcia-Lopez, P., Garcia-Marin, V., Freire, M. The histological slides and drawings of cajal. Front Neuroanat. 4, 9 (2010).
- Klausberger, T., Somogyi, P. Neuronal diversity and temporal dynamics: the unity of hippocampal circuit operations. Science. 321 (5885), 53-57 (2008).
- Petilla Interneuron Nomenclature, G., et al. Petilla terminology: nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex. Nat Rev Neurosci. 9 (7), 557-568 (2008).
- Armstrong, C., Soltesz, I. Basket cell dichotomy in microcircuit function. J Physiol. 590 (4), 683-694 (2012).
- Povysheva, N. V., Zaitsev, A. V., Gonzalez-Burgos, G., Lewis, D. A. Electrophysiological heterogeneity of fast-spiking interneurons: chandelier versus basket cells. PLoS One. 8 (8), e70553 (2013).
- Gupta, A., Elgammal, F. S., Proddutur, A., Shah, S., Santhakumar, V. Decrease in tonic inhibition contributes to increase in dentate semilunar granule cell excitability after brain injury. J Neurosci. 32 (7), 2523-2537 (2012).
- Fish, K. N., Hoftman, G. D., Sheikh, W., Kitchens, M., Lewis, D. A. Parvalbumin-containing chandelier and basket cell boutons have distinctive modes of maturation in monkey prefrontal cortex. J Neurosci. 33 (19), 8352-8358 (2013).
- Yu, J., Swietek, B., Proddutur, A., Santhakumar, V. Dentate cannabinoid-sensitive interneurons undergo unique and selective strengthening of mutual synaptic inhibition in experimental epilepsy. Neurobiol Dis. 89, 23-35 (2016).
- Yu, J., Swietek, B., Proddutur, A., Santhakumar, V. Dentate total molecular layer interneurons mediate cannabinoid-sensitive inhibition. Hippocampus. 25 (8), 884-889 (2015).
- Varga, C., et al. Functional fission of parvalbumin interneuron classes during fast network events. Elife. 3, (2014).
- Kawashima, T., Okuno, H., Bito, H. A new era for functional labeling of neurons: activity-dependent promoters have come of age. Neural Circuits Revealed. , 109 (2015).
- Krook-Magnuson, E., Luu, L., Lee, S. H., Varga, C., Soltesz, I. Ivy and neurogliaform interneurons are a major target of mu-opioid receptor modulation. J Neurosci. 31 (42), 14861-14870 (2011).
- Szabadics, J., Soltesz, I. Functional specificity of mossy fiber innervation of GABAergic cells in the hippocampus. J Neurosci. 29 (13), 4239-4251 (2009).
- Iball, J., Ali, A. B. Endocannabinoid Release Modulates Electrical Coupling between CCK Cells Connected via Chemical and Electrical Synapses in CA1. Front Neural Circuits. 5, 17 (2011).
- Chen, X., Cho, D. -B., Yang, P. -C.
- Ranjan, A. K., et al. Cellular detection of multiple antigens at single cell resolution using antibodies generated from the same species. Journal of immunological. 379 (1), 42-47 (2012).
- Fuccillo, D. A., Sever, J. L. Concepts in Viral Pathogenesis II. , Springer. 324-330 (1986).
- Buchwalow, I. B., Minin, E. A., Boecker, W. A multicolor fluorescence immunostaining technique for simultaneous antigen targeting. Acta Histochem. 107 (2), 143-148 (2005).
- Qi, G., Radnikow, G., Feldmeyer, D. Electrophysiological and morphological characterization of neuronal microcircuits in acute brain slices using paired patch-clamp recordings. JoVE (Journal of Visualized Experiments. (95), e52358 (2015).
- Walz, W. Patch-clamp analysis : advanced techniques. 2nd edn. , Humana Press. (2007).
- Molnar, P. Patch-clamp methods and protocols. 403, Springer Science & Business Media. (2007).
- Martina, M., Taverna, S. Patch-clamp methods and protocols. , Humana Press. (2014).
- Booker, S. A., Song, J., Vida, I. Whole-cell patch-clamp recordings from morphologically- and neurochemically-identified hippocampal interneurons). J Vis Exp. (91), e51706 (2014).
- Jinno, S., Kosaka, T. Immunocytochemical characterization of hippocamposeptal projecting GABAergic nonprincipal neurons in the mouse brain: a retrograde labeling study. Brain research. 945 (2), 219-231 (2002).
- Yu, J., Proddutur, A., Swietek, B., Elgammal, F. S., Santhakumar, V. Functional Reduction in Cannabinoid-Sensitive Heterotypic Inhibition of Dentate Basket Cells in Epilepsy: Impact on Network Rhythms. Cereb Cortex. , (2015).
- Proddutur, A., Yu, J., Elgammal, F. S., Santhakumar, V. Seizure-induced alterations in fast-spiking basket cell GABA currents modulate frequency and coherence of gamma oscillation in network simulations. Chaos. 23 (4), 046109 (2013).
- Scharfman, H. E. Differentiation of rat dentate neurons by morphology and electrophysiology in hippocampal slices: granule cells, spiny hilar cells and aspiny 'fast-spiking' cells. Epilepsy Res Suppl. 7, 93-109 (1992).
- Tasker, J. G., Hoffman, N. W., Dudek, F. E. Comparison of three intracellular markers for combined electrophysiological, morphological and immunohistochemical analyses. J Neurosci Methods. 38 (2-3), 129-143 (1991).
