Summary
Este protocolo apresenta um método para a recuperação morfológica dos neurónios durante patched registos electrofisiolicos utilizando biocitina de enchimento e de pós-processamento subsequente imuno-histoquímica. Mostramos que as seções encheu-biocitina grossas que estavam manchados e lamínulas pode ser restained com um segundo dia de anticorpos primários ou meses mais tarde.
Abstract
registos electrofisiolicos de células utilizando a técnica de fixação de membranas permitiram a identificação de diferentes tipos neuronais com base em padrões de disparo. A inclusão de biocitina / neurobiotin no eletrodo de gravação permite a recuperação post-hoc de detalhes morfológicos, que são necessários para determinar a arborização dendrítica e as regiões abrangidas pelos axônios dos neurônios registrados. No entanto, dada a presença de neurônios morfologicamente semelhantes com identidades distintas neuroquímicos e funções, coloração imuno-histoquímica de proteínas específicas de células-type-é essencial para identificar definitivamente neurônios. Para manter a conectividade de rede, secções do cérebro para gravações fisiológicas são preparadas com uma espessura de 300 nm ou mais. No entanto, esta espessura muitas vezes dificulta pós-processamento imuno devido a problemas com a penetração de anticorpos, sendo necessária a ressecção do tecido. Ressecção de fatias é uma arte difícil, muitas vezes ResulTing na perda de tecido e morfologia das células a partir do qual foi obtido dados electrofisiológico, tornando os dados inutilizável. Uma vez que a recuperação da morfologia iria limitar a perda de dados e guia na selecção de marcadores neuronais, adoptámos uma estratégia de recuperar a morfologia celular em primeiro lugar, seguido de imunocoloração secundário. Nós introduzimos uma abordagem prática para biocitina enchimento durante as gravações fisiológicas e subsequente imunocoloração de série para a recuperação da morfologia, seguido pelo restaining de secções para determinar a identidade neuroquímica. Relatamos que as secções que foram preenchidos com biocitina, fixadas com paraformaldeído (PFA), coradas, e lamínulas pode ser removida e corada novamente com um segundo anticorpo primário dias posteriores. Este restaining envolve a remoção da lamela, a lavagem das secções em uma solução tampão, e a incubação de anticorpos primários e secundários para revelar a identidade neuroquímica. O método é vantajoso para eliminar DATuma perda devido a uma incapacidade de recuperar morfologia e para estreitar os marcadores neuroquímicos a ser testados com base na morfologia.
Introduction
O cérebro é conhecido pela diversidade das características estruturais e funcionais dos seus elementos neuronais individuais. Compreender os papéis de tipos neuronais distintas na função cerebral e patologia exige caracterização e identificação inequívoca dos neurônios. Estruturalmente, as características morfológicas definidos pela localização somato-dendrítica determinar as potenciais entradas que um determinado neurônio recebe, enquanto o padrão de arborização axonal identifica alvos potenciais pós-sinápticos. A diversidade estrutural dos neurônios tem sido apreciado desde os dias de estudos histológicos seminais do Ramón y Cajal 1. O advento das técnicas de gravação de uma única célula revelou que os neurônios estruturalmente distintos também mostram diferenças nos padrões de disparo e características sinápticas. A diversidade na estrutura e fisiologia é particularmente evidente em GABAérgicos neurónios inibitórios 2,3. Além disso, tornou-se cada vez mais evidente que structurallneurônios semelhantes y podem expressar diferentes marcadores neuroquímicos e mostrar correspondentes diferenças funcionais 4. Da mesma forma, os neurónios com os mesmos marcadores neuroquímicos podem ter estruturas e funções distintas 5-10. Assim, na prática, a análise das características funcionais de neurónios e o seu papel na rede requer a definição ambas as identidades morfológicas e neuroquímicas. Mesmo com o advento de linhas de ratinhos repórter segmentação marcadores neuroquímicos específicos, muitas vezes é necessário para determinar a morfologia e a identidade subtipo baseado em 11 imunohistologia.
O método padrão utilizado para caracterizar células registrados em fatias cerebrais agudas é para os encher biocitina ou neurobiotin durante a gravação, corrigir as seções de paraformaldeído (PFA), seguindo as gravações, e usar a imunohistoquímica para revelar a morfologia e neuroquímica. Uma vez que a espessura das secções para a fisiologia fatia são tipicamente 300 mmou mais, e porque a maioria dos anticorpos não conseguem penetrar todo o caminho através do que a profundidade, as fatias devem ser re-seccionados a 60 um ou menos, para permitir a imunocoloração simultânea para biocitina e marcadores neuroquímicos 12-14. Infelizmente, é trabalhoso ressecção; corre o risco de perda de tecido durante o corte; e pode conduzir a diferenças de encolhimento do tecido, o que complica reconstruções morfológicas. Além disso, o conhecimento prévio da morfologia poderia ajudar a diminuir os marcadores candidatos que são susceptíveis de ser expressa pelas células. Temos modificado os protocolos imunohistologia biocitina padrão para permitir o processamento em série de secções em primeiro lugar para a recuperação de morfologia e, em seguida, para a identificação de potenciais marcadores neuroquímicos.
A imuno-histoquímica é o estudo de distribuição de antigénio em células ou tecidos e pode ser visualizada utilizando uma enzima, marcadores fluorescentes, elementos radioactivos, ou partículas coloidais de ouro 15. O procedimento involves usando anticorpos primários para marcar especificamente e amplificar um ou mais antigénios específicos, seguido pela utilização de anticorpos secundários fluorescentes segmentação do anticorpo primário para visualização. Devido à necessidade de diferenciar os espectros de fluorescência de cada anticorpo secundário sem sobreposição, apenas um número limitado de antigénios podem ser examinados simultaneamente. Assim, o conhecimento prévio da morfologia poderiam ser úteis para seleccionar os marcadores neuroquímicos candidatos para a classificação de células. Conceptualmente, a razão de processamento em série de secções coradas já baseia-se na premissa de que imunomarcação para uma proteína ou péptido não deve interferir com a antigenicidade e imunomarcação subsequente para um péptido estruturalmente independente 16. Esta falta de interferência é devido à ligação dos anticorpos para um epítopo da proteína específica num antigénio e, portanto, permite a coloração simultânea de múltiplos antigénios no mesmo tecido. O número de antigénios revealed por imunocoloração é limitada pela necessidade de espectros de não sobreposição dos anticorpos secundários fluorescentes e pela necessidade de direccionar antigénios individuais com anticorpos criados em diferentes espécies de modo a eliminar a reactividade cruzada 17,18. Enquanto este é o raciocínio por trás de rotulagem de série em vez de em simultâneo com dois anticorpos diferentes que podem interagir, a nosso conhecimento, imunocoloração para um segundo antigénio não foi relatado após a conclusão da imunomarcação para um ou mais antígenos em seções montadas. Aqui, descrevemos um método para imuno série de secções previamente coradas e montadas. Embora pormenor este processo para um processo de imunomarcação de série para a recuperação da morfologia seguido por coloração para marcadores de proteína / péptido em secções espessas, os mesmos procedimentos podem ser usados no padrão, secções histológicas finas bem. Além disso, descreve-se uma abordagem prática para encher neurónios gravados com biocitina e o processo para desalojar oeléctrodo da célula após a conclusão de gravações para optimizar o enchimento do axonal e mandris dendríticas de neurónios, tal como apresentado na nossa recente 6,8 trabalho.
A vantagem mais importante do processo aqui descrito é que a morfologia da célula gravado pode ser totalmente recuperado e fotografada antes de tentar a ressecção ou imunocoloração das fatias. Embora os problemas com a penetração de determinados anticorpos podem tornar necessária a fatias de ressecção para imunocoloração secundário, os procedimentos detalhados aqui iria eliminar a necessidade de reconstruir neurónios complexos de múltiplas secções e evitar problemas devido à perda de tecido e o encolhimento diferencial, o que pode comprometer a reconstrução seguinte ressecção. Uma vantagem adicional é que o processo irá reduzir custos, tempo, esforço e anticorpos caros, limitando imunocoloração e re-corte às fatias em que os neurônios-cheia biocitina são recuperados. O aspecto mais prático é o anúncioimunocoloração nal que pode ser realizada em secções coradas meses antes de usar a técnica acima mencionada. Em particular, a recuperação da morfologia reduziria consideravelmente o potencial que os dados fisiológicos das células é rejeitado devido a uma incapacidade para obter uma caracterização morfológica básica do tipo de célula.
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Protocol
1. biocitina enchimento durante Eletrofisiologia
NOTA: Os leitores podem se referir a fontes alternativas de técnicas básicas de patch-clamp gravação e instrumentação 19-22, que não são elaborados em cima aqui. As etapas detalhadas aqui supor que o equipamento e os procedimentos para as gravações de patch-clamp já estão estabelecidos, e a descrição será restrito aos detalhes relacionados com biocitina-enchimento e imunocoloração post-hoc. Todas as experiências descritas neste manuscrito foram realizadas em ratazanas.
- Usando um vibratome, preparar secções de cérebro vivo da região desejada, com uma espessura de 300-350 uM 23.
- Prepara-se uma solução contendo 0,2% interna biocitina por adição de 2 mg de biocitina a 1 ml de solução interna 6. Para melhores resultados, sonicar a solução interno de 10 - 15 minutos até que a biocitina dissolve-se completamente. Em seguida, carregar a solução interna numa seringa de 1 ml, equipado com um 0,2 &# 160; de poro ponta de filtro de tamanho de polipropileno ligado a um microloader. Manter esta seringa de carga em uma mala de frio para manter a estabilidade do Mg-ATP e GTP-Na na solução interna.
NOTA: Uma gluconato de potássio solução interna contendo (mM de K-gluconato 126, KCl 4 mM, HEPES 10 mM, 4 mM de Mg-ATP, 0,3 mM de Na-GTP, e fosfocreatina 10 mM) é óptima para a recuperação de certos marcadores neuroquímicos, incluindo parvalbumina, durante imunomarcação. Na nossa experiência, utilizando cesium- e soluções internas à base de cloreto reduz a capacidade de recuperar a imunocoloração para determinados marcadores neuroquímicos. Neurobiotin ou um, fixável, traçador polar célula-impermeabilizante combinando um fluoróforo com Alexa biocitina pode ser usado como uma alternativa para biocitina. - De acordo com contraste de interferência diferencial de infravermelhos, visualizar a célula apropriado para gravação. Para minimizar qualquer interrupção do axônio, a abordagem do corpo celular, diminuindo a pipeta ao longo de seu eixo, utilizando o "approach" função disponível na maioria dos micromanipuladores. Estabelecer gravações de célula inteira sob contraste de interferência diferencial de infravermelho usando protocolos fisiologia de patch-clamp 19-22.
NOTA: Evitar a aproximar-se da célula a partir da direcção do axónio putativo, uma vez que irá cortar o axónio, visualizado como uma vesícula na extremidade de corte (seta verde na Figura 1). Além disso, evitar a aplicação de alta pressão positiva para a pipeta de gravação, enquanto que se aproxima da célula para minimizar o derrame de biocitina, o que resultará na coloração de fundo elevado.
Figura 1. Sugestão de avião para se aproximar de células para biocitina preenchimentos. A imagem ilustra um celular Granule (GC) encher com biocitina durante a gravação que foi processada para revelar biocitina (em vermelho usando estreptavidina 594 conjugado). O GC tem suas dendrites orientadas no plano XY. Observe a célula granular cortadaaxônio (seta verde) devido ao movimento da pipeta ao longo do plano XY. Note que é ideal para abordar este neurônio ao longo do plano XZ. Barra de escala: 50 ^ m.
- Na configuração de fixação de voltagem, determinar a capacitância de células inteiras e resistência em série, em resposta a pequenas (5 mV), breves (30 ms) tensão etapas usando o teste usando a função da membrana no modo de banho em uma aquisição de dados e software de análise de electrofisiologia. Isto irá assegurar o estabelecimento de condições de gravação de célula inteira para permitir biocitina-enchimento.
- Realizar gravações fisiológicas no modo quer observação de correntes ou de tensão-clamp, conforme necessário. Um mínimo de tempo de gravação de> 10 min a 34 ° C é ideal.
NOTA: Longer tempos de gravação podem ser necessários para os exames realizados à temperatura ambiente. - Após a conclusão das gravações fisiológicas, re-estabelecer a configuração de patch-clamp, movendo-se lentamente a pipeta de gravação em pequenas etapas, alternadas para cima (ao longo do eixo Z) epara fora (ao longo do eixo X) no modo de voltagem-grampo.
- Simultaneamente monitorar a capacitância e entrada de resistência utilizando a função "membrana teste" para visualizar a perda de transientes capacitivo eo colapso das respostas atuais para uma linha reta, indicando a re-vedação da célula e o estabelecimento de um fora-out- remendar na ponta da pipeta. Segurando o celular em um potencial despolarizado (-40 mV) facilitará o processo de vedação re-.
NOTA: Este procedimento para a remoção de uma célula normalmente garante a recuperação completa do soma e dendritos. Não aplicar pressão positiva para a pipeta de gravação durante este processo ou durante a separar a célula a partir da pipeta. Visualização da soma da célula registrado na fatia indica desligamento bem sucedido. A presença de fragmentos celulares ou um remendo de membrana na extremidade da ponta individual geralmente indica o deslocamento do soma e não irá produzir a morfologia celular completa. - à réer separar da pipeta a partir da célula, reter a fatia na câmara de gravação para 3-5 min para garantir o transporte do corante para dendrítica distal e processos axonais.
- Transferir as fatias para uma placa de 24 poços contendo PFA a 4% para a fixação.
CUIDADO: PFA é cancerígeno, e equipamento de protecção individual adequado, incluindo luvas e uma máscara facial, deve ser usado para evitar a irritação da pele e inalação. PFA é inflamável e devem ser mantidos fora do alcance de fogo. PFA nunca é descartado no ralo e deve ser coletado como lixo químico. PFA fixação deve ser isolado a partir de superfícies utilizadas para a preparação fatia vivo para evitar a contaminação da instalação fisiologia, incluindo pipetas de transferência. - 24 - 48 h após a fixação PFA, transferir as fatias de 0,1 M de fosfato salino tamponado (PBS) para armazenamento antes da imunocoloração.
NOTA: Idealmente, biocitina recuperação e imunocoloração são melhores quando realizada logo após a fixação, embora por coloração formado dentro de 7 d de rendimentos de fixação bons resultados. As fatias podem ser mantidas em PBS com 0,02-0,05% de azida de sódio para a coloração e realizada até mais de 90 dias após a fixação. Embora a fixação durante a noite em PFA funciona bem para a maior parte dos anticorpos, é possível que alguns anticorpos funcionam melhor quando a duração da incubação no fixador é diminuído. Fixação em PFA durante mais 48 h reduz a disponibilidade de antigénios e diminui a probabilidade de sucesso para a imunocoloração secundário marcadores neuroquímicos.
CUIDADO: A azida de sódio é extremamente perigoso e irritante em contacto com a pele ou com os olhos ou a ingestão ou inalação. Grave excesso de exposição pode resultar em morte. A carcinogenicidade e mutagenicidade do composto não são conhecidos. Use equipamento de protecção individual adequado, incluindo luvas, óculos contra respingos, um jaleco e um respirador de poeira. A azida de sódio nunca é descartado no ralo e deve ser coletado como lixo químico.
(Dia 1)
NOTA: O seguinte procedimento é imunocoloração para secções de flutuação livre e requer agitação continua a uma velocidade baixa (2 revoluções / min, rpm) num agitador durante todas as etapas de incubação.
- Lavar o tecido 3x durante 10 minutos cada em PBS 0,1 M (pH = 7,4).
NOTA: PBS 0,1 M podem ser comercialmente adquiridas ou feitas em laboratório, como se segue (faz 1 L): 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na 2 HPO 4, e 0,24 g de KH 2 PO 4 em 1 L de dH 2 0.
NOTA: Se o marcador neuroquímica desejado é conhecido, a coloração por uma proteína / péptido pode ser realizada simultaneamente com coloração de biocitina (passos 2,2-2,4). Se coloração para biocitina somente, vá para o passo 2.5. - OPCIONAL: Bloco com 10% de soro de bloqueio (BS; soro normal de cabra (NGS) diluído em 0,3% de Triton X-100 em PBS durante 1 h à TA).
NOTA: Cada poço devereceber o mesmo volume da solução; o volume recomendado é de entre 250-500 mL / poço. A selecção do soro de bloqueio baseia-se nas espécies em que os anticorpos secundários são levantadas (por exemplo, NGS é usado para anti-cabra conjugado com corante (respectivas espécies de anticorpo primário)). Se surgir a necessidade de utilizar anticorpos secundários criados em diferentes espécies de imunocoloração secções, incluem 10% de cada soro normal no bloqueio de fase (2) e 3% de cada soro normal para os passos de incubação do anticorpo primário e secundário. - (OPCIONAL) Incubar as secções em anticorpo primário, CB 1 R (policlonal, cobaia) com 0,3% de Triton X-100, e 3% de BS em PBS a 0,1 M, à TA S / N. CB R 1 é utilizado para identificar o tipo de receptor canabinóide uma expressão.
NOTA: Este passo é opcional e não é necessário para revelar o recheio biocitina. A Figura 2 ilustra uma secção marcada por biocitina e CB 1 R durante o primeiro processo de coloração. O / N incubation à TA é suficiente para a maioria dos anticorpos primários; no entanto, certos anticorpos primários, incluindo CB 1 R, requerem 3-5 d de incubação. Se a incubação precisa ser mais longo do que 1 d, recomenda-se a incubar a 4 ° C por causa de Triton X-100 pode permeabilizar fatias e pode conduzir à desintegração do tecido durante a incubação prolongada à temperatura ambiente. Incluir um controlo negativo a que falta o anticorpo primário em, pelo menos, uma secção para cada série de experiências como controlo para a especificidade do anticorpo secundário. Para controlos negativos, o anticorpo primário é omitido, mas a 0,3% de Triton X-100 em PBS a 0,1 M e são adicionados BS.
Figura 2. sucedida CCK Coloração 1 semana após a recuperação de biocitina Coloração e C annabinoid Receptor tipo 1 (CB1 R) - <strong> rotulagem. (A - C) As imagens confocais a 60X mostrando o neurónio encheu-biocitina (A) e CB 1 R imunorreactividade (B), indicado pela seta. A mesma secção foi processada para a imunocoloração CCK após 1 semana (C). A sobreposição de imagens é mostrado na D. CCK imunorreatividade foi revelado usando far-vermelho e foi pseudo-colorido em ciano. (E) a reconstrução morfológica da célula-cheia biocitina em A. Observe que a biocitina e CB 1 R coloração são evidentes mesmo após a segunda imunocoloração CCK. Observe também a distribuição esperada de CB 1 R e padrões de positividade CCK. (F - H) imagem ampliada do axônio da célula, como em A, show de perto co-localização de biocitina e CB 1 R nos axônios (cabeças de seta). Barra de escala: 50 um (A - D), 100 um (E), e 10 uM (
(Dia 2)
- Lava-se a secções do cérebro 3x durante 10 minutos cada em PBS 0,1 M (pH = 7,4).
- Incubam-se as secções em estreptavidina conjugado de corante vermelho (concentração: 1: 1000; excitação: 594 nm com emissão no espectro vermelho visível) com 0,3% de Triton X-100 e 3% de BS em PBS a 0,1 M a 4 ° CO / N na escuro (embrulhados em papel alumínio) para revelar o biocitina. Opcional: inclua um anticorpo secundário, cabra porco anti-guiné (concentração: 1: 500; excitação: 488 nm e emissão em verde), com a incubação acima, se após a primeira incubação opcional na etapa 2.3.
NOTA: anticorpo secundário será apenas necessário se a coloração de anticorpo primário opcional (passo 2.3) é executada. Para visualizar biocitina, um streconjugado ptavidin-fluoróforo com um espectro de emissão em vermelho é recomendado, uma vez que ajuda a visualizar os axônios mais finas em detalhe e com melhor contraste (Figuras 1 - 3). Durante a imunocoloração dupla ou tripla, a fim de evitar a reactividade cruzada de anticorpos secundários uns com os outros, anticorpos secundários adicionar uma após a outra em série (2 h de intervalo entre adições de série dos anticorpos é suficiente). A Figura 3A ilustra uma célula cheia de biocitina processadas sem o anticorpo primário coloração opcional e fotografada antes da ressecção.
Figura 3. sucesso Segundo imunocoloração após a recuperação de biocitina Morfologia e ressecção. (A1) confocal imagem de uma fatia de 300 mm que mostra a recuperação da morfologia dendrítica de uma célula cheia de biocitina. (<strong> A2) traços de tensão membrana do neurônio em resposta a +500 e -100 pA injeções atuais. (B) A recuperação da soma cheio de biocitina em uma seção 50 mm obtido após ressecção da secção 300 mm (na A1) após a montagem e imagem. (B2) imunocoloração subsequente da seção fina revelou co-localização da soma cheio de biocitina (painel à direita) com CCK (painel do meio). A imagem mesclada é ilustrado no painel da direita. Barra de escala: 50 ^ m. Painel A2 é reproduzido com permissão de Yu et al. , No prelo 25. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
(Dia 3)
- secções cerebrais Lavar 3x durante 10 minutos cada em PBS 0,1 M (pH = 7,4).
- Para proteger a fluorescência e para facilitar a re-coloração no futuro, montar o segções em um meio de montagem de base aquosa e selar as bordas da lamela com unhas polonês claro.
NOTA: É melhor restain seções o mais cedo possível para evitar dificuldades na remoção da unha polonês a partir do slide, infestação de fungos, e desidratação do tecido devido à fuga do meio de montagem da lâmina de vidro. A contaminação microbiana pode ser prevenida utilizando 0,02% de azida de sódio em PBS.
CUIDADO: A azida de sódio é altamente tóxico e inflamável quando está em contacto com a água. Por favor, consulte os procedimentos operacionais padrão para o manuseio e descarte de produtos químicos perigosos.
(Dias 4 - 7) - Realizar imagem confocal com excitação a 594 e 488 nm e com uma ampliação de 20X ou 40X para revelar neurônios cheio de biocitina em marcadores vermelhos e neuroquímicas (CB 1 R) em verde. Avaliar colabeling (Figura 2).
- Definir a exposição da câmera para menos de 100 ms para evitar a fotodegradação e obtaem pilhas de imagens confocal dos mandris axonais e dendríticas de todo o neurônio. Use pilhas de imagens confocal e pacotes de software de rastreamento de neurônios para reconstruir a morfologia neuronal.
3. Coloração de o segundo anticorpo primário
Nota: Embora o segundo passo pode ser realizado imunocoloração 90 d após a primeira coloração, coloração óptima é conseguida, se a segunda coloração de anticorpo primário é realizada dentro de 7-10 d.
(Depois de 7-90 d)
- Aplicar acetona para um cotonete e tira a unha polonês fora da lâmina de vidro.
- Retirar as lamelas com cuidado usando uma pinça de ponta fina e coloque algumas gotas de 0,1 M PBS nas seções.
- Remova cuidadosamente as seções do slide usando um pincel fino e lavá-los em 0,1 M PBS durante 24 - 48 h num agitador coberto de folha de alumínio com pouca luz a 4 o C.
NOTA: É crucial para cobrir seções com umfolha luminum para evitar a fotodegradação. - Para assegurar a remoção completa do meio de montagem, lavar as secções 1 - 2x no dia seguinte em PBS a 0,1 M durante 10 min cada.
- Prosseguir com incubação no segundo anticorpo primário (por exemplo, a colecistocinina, um neuropeptídeo encontrado em certos interneurónios sensíveis a GABA (CCK; concentração: 1: 1000; anticorpo monoclonal de ratinho)) para um d (Figura 2).
NOTA: Este procedimento é semelhante para a etapa 2.3, mas utiliza um anticorpo diferente. Além disso, o passo de bloqueio for omitido durante a re-coloração. - Lavam-se as secções de cérebro três vezes durante 10 minutos cada em PBS 0,1 M (pH = 7,4).
- Mancha com o secundário anticorpo de cabra anti-ratinho fluoróforo-conjugado (concentração: 1: 500; de excitação comprimento de onda: 647 nm), certificando-se que os espectros de excitação das emissões do anticorpo secundário não se sobrepõem com estreptavidina (concentração: 1: 1000; comprimento de onda de excitação: 594 nm) e imunofluorescência préviamanchas.
- Montar as seções no meio de montagem aquoso e selar as bordas da lamínula com unhas polonês claro.
Nota: Armazenar as secções a 4 ° C numa caixa de armazenamento de opaco para proteger a fluorescência.
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Representative Results
Após a conclusão, as secções mantêm o preenchimento biocitina e a imunomarcação realizado no Passo 2 e pode ser fotografada usando confocal ou microscopia de epifluorescência. Além disso, as secções processadas também vai mostrar a imunocoloração para o antigénio marcado durante o processamento subsequente na etapa 3. Na secção ilustrada na Figura 2, a morfologia de um neurónio encheu-biocitina numa secção grossa (300 um) foi revelada utilizando estreptavidina visualizado em vermelho e a primeira primária (CB 1 R) visualizados em verde. O primeiro imunocoloração foi realizada dentro de 7 d de PFA fixação. A fatia foi montado num meio de montagem aquoso, fotografada usando um microscópio confocal, e armazenado por um período de dois meses antes da re-coloração com anticorpo para a CCK. Note-se a morfologia do neurónio gravado, incluindo mandris axonais (Figura 2E), foi reconstruída a partir das imagens confocais Sbtained após o primeiro processo de coloração. Co-localização do axônio com CB 1 R imunorreatividade (Figura 2 F - H) era esperado com base em estudos fisiológicos. A segunda coloração para CCK foi realizada em secções de dois meses após o primeiro processo de coloração. CCK foi fotografada na distante vermelho e foi pseudo-colorido em ciano para visualização. Da mesma forma, a Figura 3 ilustra um exemplo de uma célula na qual biocitina-marcação foi revelado e fotografada em uma secção de espessura (Figura 3A1). A fisiologia intrínseca do neurónio é ilustrado na Figura 3A2. A fatia foi re-seccionados a 50 mm e, embora algumas seções que contêm processos dendríticos foram perdidos, a seção que contém a soma recuperado (Figura 3B1). Subsequente imunocoloração CCK da seção fina mostraram expressão CCK em verde na soma marcado com biocitina. Montando a grossa fatia em meio aquoso impede eencolhimento do tecido xcessive. Em média, as secções 300 mícrons montado utilizando o meio aquoso redução de cerca de 25,67 ± 3,14% (n = 5 fatias) quando medida uma semana após a montagem. Assim, as secções espessas montado utilizando o meio aquoso são ~ 225 uM, permitindo a ressecção. Em vários estudos de controlo, verificou-se que o processo de imunomarcação para o segundo tempo não levou a marcação não-específica pelo anticorpo. Por exemplo, sabe-se que a parvalbumina (PV) e a imunorreactividade de CCK são mutuamente exclusivos em neurónios do hipocampo. Controlos em que o primeiro passo de imunomarcação (2) para biocitina (vermelho) e CCK (verde) foi seguido pelo segundo rotulagem para parvalbumina (com excitação a 405 nm e emissão a azul) mostraram padrões de expressão não-sobrepostas (Figura 4). Além disso, os padrões de coloração laminar axonal distintivas dos neurônios que expressam marcadores neuroquímicos específicos (PV, CCK, CB 1 R) não foram alterados pelo seriaprocedimentos l re-coloração (Figuras 2 - 4). Além disso, a coloração revelou consistentemente secundária co-marcação dos neurónios encheu-biocitina com os marcadores neuroquímicos esperados com base das gravações fisiológicas. Assim, estamos confiantes de que o procedimento restaining não levar à perda de especificidade na rotulagem.
Figura 4. Falta de sobreposição entre os marcadores mutuamente exclusivas sobre a Segunda Imunomarcação Seguindo Imunomarcação Antes e montagem das secções. (A - C) As imagens confocais a 10X mostrando um neurónio encheu-biocitina (A) no vermelho, indicado por uma ponta de seta, e a imunorreactividade de CCK em verde (B), indicado pela seta. Note-se a falta de sobreposição. A mesma secção foi processada para parvalbumina (PV) imunocoloração em azul depois de mais de 2 meses (C). o OVerlay de imagens é mostrado na D. Note-se que os axónios PV são distribuídas na camada de células granulares, com CCK na camada molecular do padrão não sobrepostas esperado. Observe também a falta de co-localização dos dois marcadores em somata neuronal. As imagens ampliadas à direita ilustram que o neurônio marcado com biocitina expressa PV (seta) e não CCK (seta). Barra de escala: 100? M (A - D), 20 uM (painéis à direita). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Uma razão comum para biocitina sub-óptima preenche é o rompimento acidental dos processos neuronais com a pipeta de gravação quando se aproxima da célula. Um apêndice perdido da célula aparece como uma bolha de biocitina no final de um axónio, como ilustrado na Figura 1 (seta verde). Axonal bolhas umare muitas vezes visualizada quando remendar células superficiais, cujos axônios podem ser cortados durante os procedimentos de corte. No entanto, a optimização do plano de corte e de conhecimento do padrão de distribuição axonal de a classe de células alvo pode auxiliar em evitar que se aproxima o soma a partir da direcção do axónio putativo, que também pode cortar o axónio, resultando no aparecimento de uma bolha axonal . Na maioria dos tipos de células, é preferível a aproximar-se do corpo da célula ao longo do eixo Z (seta branca com ponto). A segunda questão diz respeito à aplicação de pressão positiva excessiva para a pipeta enquanto se aproximava da célula. Isto pode não só danificar a célula e as suas ligações, mas também faz com que a solução contendo biocitina interno para derramar em torno da célula, levando a alta fluorescência de fundo. Coloração de fundo, também aumenta quando o tempo necessário para se aproximar da célula é prolongada ou quando a qualidade de fatia não é óptima, o que pode comprometer a capacidade de definir a morfologia celular (Figura 5A). É possível puxar para fora o soma enquanto desalojar a pipeta. Isto irá resultar numa falta de morfologia somática (Figura 5B). Para evitar puxando para fora da célula, mover a pipeta cima e para fora em pequenas etapas, usando as configurações de movimento "fino" do manipulador. Se a célula parece estar ligado a pipeta através de uma extensão de comprimento da membrana, da torneira / movimento do manipulador suavemente para desalojar a pipeta a partir da célula. Evite usar as configurações do manipulador grosseiros até que a célula esteja completamente desalojado.
Figura 5. Imagens ilustram mal sucedidas Fills biocitina. (A) Imagem que mostra a alta fluorescência de fundo devido à excessiva pressão positiva na pipeta de gravação, resultando em visibilidade celular pobres. estruturas mais finas de processos neuronais, incluindo os axônios, são visualizados além da região de the derrame. Além disso, observe que a soma tenha sido puxado para fora. (B) Um neurônio com a soma tirou durante descolamento pipeta. As setas mostram preenchimentos de sucesso do axônio e dendritos, enquanto que a soma e apêndices proximal às flechas não foram recuperados. (C) Uma célula de patched em uma camada superficial da fatia (<50 mm a partir da superfície) resulta em células que exibem cheios axónio cortado e dendrites (setas). Observe o beading (setas) dos dendritos das células de grânulos, indicando a saúde das células pobres (C). Barra de escala: 50 ^ m. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Finalmente, a fim de recuperar a morfologia celular completo sem axônios ou dendritos cortadas, é melhor a célula alvo> 50 mm de profundidade para a superfície da fatia. células superficiais podem ter processos que têmforam cortados e podem não ter o complemento normal de entradas sinápticas.
As armadilhas mais comuns nos procedimentos restaining estão associados com a remoção da lamela e a recuperação da secção, sem danificar o tecido. A segunda questão diz respeito a penetração de anticorpos no tecido grosso, especialmente quando incubadas durante a noite. Em vários casos, uma melhor penetração foi conseguido por incubação em anticorpo primário durante até 72 h a 4 ° C num agitador orbital colocados numa sala fria. Embora re-seccionamento do tecido é o processo mais eficaz para assegurar uma penetração anticorpo, prolongando a duração da incubação em anticorpo primário ou aumentando a concentração de detergente a 0,5 - 1% de Triton-X100 também podem auxiliar a penetração do anticorpo 24. Uma vez que a maioria dos neurónios gravadas estão localizados dentro de 50 - 100 | iM a partir da superfície da secção, descobrimos que a coloração de secções de espessura é adequada para etiquetar biocitinasomata -filled ou processos a este nível. No entanto, recomenda-se que a extensão da rotulagem anticorpo é verificado em cada seção antes de interpretar os resultados co-localização negativos.
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Discussion
Passos críticos dentro do Protocolo
Encher a célula remendado com biocitina é o passo mais crucial para garantir a recuperação completa da morfologia. Para a completa recuperação da célula, é essencial para seleccionar uma orientação fatia ideal para minimizar o rompimento de processos durante o corte. Esta orientação pode variar de acordo com o tipo de circuito e celular em exame. Em seguida, é essencial para que haja tempo suficiente para o biocitina para difundir os dendritos e axônios. Alguns corantes, tais como neurobiotin, também pode penetrar neurônios acoplados à célula gravada através de junções. O tamanho da ponta da pipeta, também necessita de ser optimizada, como a soma tende a ser puxado para fora quando a abertura é grande e carregamento biocitina fica comprometida quando a ponta de pipeta é muito pequeno. Além disso, os procedimentos adequados, de desengate a partir do modo de células inteiras são essenciais para recuperar a soma. Depois de gravar durante 24 h, a incubação subsequentedas fatias em PFA a 4%, seguido de PBS que assegura a ligação cruzada dos tecidos seja reduzido, que é fundamental para imuno-histoquímica. Armazenamento das fatias a 4 ° C também é crucial para manter a integridade da fatia. No entanto, o armazenamento prolongado em PFA reduz eventual sucesso com os procedimentos de rotulagem de anticorpos. Optimizar a concentração e a duração da incubação do anticorpo primário é importante, uma vez que estes serão diferentes para os anticorpos individuais, e alguns anticorpos podem requerer 3-5 d de incubação para a melhor penetração no tecido grosso. Para garantir que as fatias não estão danificados antes da coloração do anticorpo primário e secundário, o tratamento adequado é necessário durante a remoção da tampa de deslizamento.
Modificações e resolução de problemas
Temos observado que não há tempo definido entre a primeira ea segunda mancha. As secções foram re-corados meses mais tarde, no mesmo tecido e com mais do que um corante. Dentronossas obras recentes, em comparação secções processadas utilizando o método de re-coloração com aqueles que utilizam protocolos imunocoloração padrão e não encontrar nenhuma diferença óbvia nos padrões de coloração ou a robustez do biocitina enche 6,9,25,26.
Enquanto ele continua a ser testado, é possível que volte a coloração pode ser realizada mais de uma vez, com a integridade do tecido ser um fator limitante para o tratamento repetido. A disponibilidade de fluoróforos discretos também coloca um limite para o número de antigénios que podem ser visualizados. Portanto, um tratamento cuidadoso do tecido é aconselhada. Um processo adicional de que continua a ser testado é restaining usando protocolos de recuperação de antigénios (por receptores de superfície). Desde a integridade do tecido é mantida após a remoção da lâmina de cobertura, esperamos que o procedimento também deve trabalhar na coloração de protocolos que recomendam antígeno-recuperação. A este respeito, as gravações fisiológicas, muitas vezes produzir células sem marcadores neuroquímicos conhecidos
Limitações da técnica
Uma limitação associada a realização de coloração imuno-histoquímica em secções de espessura, é a penetração insuficiente do anticorpo através da espessura total da secção, especialmente com incubação durante a noite padrão no anticorpo primário. Além disso, diferentes anticorpos e estreptavidina, utilizados para revelar biocitina, pode ter a penetração nos tecidos diferencial. Assim, recomenda-se que períodos de experiência são realizados para avaliar a profundidade de penetração do anticorpo e para modificar os tempos de incubação, as temperaturas, e anticorpo e Triton & #160; X-100 em concentrações de forma a conseguir uma penetração óptima da fatia e a coloração para cada anticorpo. Deve também ser notado que a rotulagem sucesso com um anticorpo ou com estreptavidina-biocitina não implica que um segundo anticorpo vai penetrar para a mesma profundidade da secção. Portanto, deve ser tomado cuidado para verificar a penetração de cada anticorpo ao nível em que os processos celulares marcados com biocitina são examinados para a co-localização com o marcador neuroquímica. Se a penetração é insuficiente, a fatia pode ser re-seccionados a <60 uM para a imunocoloração. Note-se, no entanto, que desde que as fatias já foram processados para biocitina, a morfologia da célula pode ser capturado por imagem confocal para eliminar a possibilidade de perda de dados durante a re-anatómicas de seccionamento e de facilitar a reconstrução neuronal. Embora seja possível que as espécies de animais e em geral podem alterar o grau de penetração do anticorpo, temos utilizado com sucesso estes procedimentos em tecidos de rato a partir de 30-dia- e sobre ratos de 60 dias de idade e em ratinhos.
Uma segunda limitação é que biocitina não é inerentemente fluorescente e não pode ser usado para geração de imagens ao vivo e caracterização morfológica em tempo real durante a gravação. Fluoróforos não conjugados alternativos e amarelo Lucifer têm sido utilizados para geração de imagens ao vivo das células 27. Eles não são permanentes e perder fluorescência mediante a fixação, tornando-se impraticável para identificação post-hoc neuroquímica do neurônio gravado. Recentemente, fluoróforos com biocitina foram introduzidas para superar esta limitação e podem ser utilizadas para imagens ao vivo, bem como para o processamento pós-hoc em-marcação tripla ou dupla, como detalhado aqui. Curiosamente, até à data, preenchimentos biocitina resultaram em melhores propriedades elétricas e de coloração para estudos eletrofisiológicos e anatômicos combinados quando comparado com Lucifer amarelo 28.
Importância da Técnica em Matéria de Existente /Métodos alternativos
As vantagens principais de usar o protocolo detalhado aqui é que, ao contrário de ressecção, a estrutura de célula cheia de biocitina e processos permanecem intactas e não conduzem à perda permanente de tecidos, nem a necessidade de uma reconstruções laboriosas de múltiplas secções. Assim, um enchimento de uma única célula seguido por imunocitoquímica pode ajudar na reconstrução morfológica e identificação de marcadores neuroquímicos específicos.
Aplicações futuras ou chegar depois de dominar esta técnica
Ao todo, nós apresentamos uma abordagem prática da novela para a recuperação da morfologia e post-hoc duplo e triplo-imunomarcação de neurônios seguinte registros eletrofisiológicos. O processo é particularmente vantajoso para encontrar novos marcadores como o conhecimento evolui, os neurônios reavaliar que foram previamente preenchidos, visualizadas e fotografadas. É particularmente vantajoso porque tele imunohistoquímica pode ser realizada semanas ou mesmo meses mais tarde, poupando tecidos e anticorpos. O método não requer quaisquer produtos químicos especiais e com segurança pode ser realizado em qualquer laboratório.
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Disclosures
Os autores não têm nada para revelar.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer o apoio do NIH / NINDS R01 NS069861 e NJCBIR CBIR14IRG024 para VS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Sigma | S7653 | Immunostaining |
| KCl | Fluka | 60129 | Immunostaining |
| Na2HPO4 | Sigma | S7907 | Immunostaining |
| KH2PO4 | Sigma | 229806 | Immunostaining |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | Immunostaining |
| Guinea pig anti CB1 | Sigma | Af530-1 | Immunostaining |
| Mouse anti CCK | CURE, UCLA | courtesy of G. Ohning | Immunostaining |
| Rabbit anti Parvalbumin | Swant | PV27 | Immunostaining |
| Streptavidin, Alexa Fluor conjugate | Molecular Probes | S11227 | Immunostaining |
| Normal goat serum (NGS) | Sigma | G9023 | Immunostaining |
| Vectashield | Vector Labs | H-1000 | Immunostaining |
| Secondary Antibodies | Invitogen Molecular probes | Alexa Fluor conjugated dyes | Immunostaining |
| Labnet orbit low speed shaker | Bioexpress | S-2030-LS | Immunostaining |
| Forceps | Dumont | 11231-30 | Immunostaining |
| Slide folders | EMS | 71520 | Immunostaining |
| Vibratome VT 1200 S | Leica | 14048142066 | Electrophysiology |
| Multiclamp 700B amplifier | Molecular devices | Multiclamp 700B | Electrophysiology |
| pCLAMP 10 Software | Molecular devices | pCLAMP 10 | Electrophysiology |
| Digitizer | Molecular Devices | Digidata 1440 digitizer | Electrophysiology |
| Filter tips | Nalgene | 171-0020 | Electrophysiology |
| Sonicator | Fisher Scientific | 15-335-100 | Electrophysiology |
| Microloaders | Eppendorf | 930001007 | Electrophysiology |
| Biocytin | Sigma | B4261 | Electrophysiology |
References
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