Summary
Этот протокол представляет собой метод морфологического восстановления нейронов исправленных во время электрофизиологических записей с использованием наполнения biocytin и последующего иммуногистохимического постобработки. Покажем, что толстые секции biocytin заполненные которые окрашивали и покрывали могут быть restained со вторым первичных дней антител или месяцев спустя.
Abstract
Электрофизиологические записи клеток с использованием метода патч зажим позволили для идентификации различных типов нейронов, основанных на образцах стрельбы. Включение biocytin / neurobiotin в записи электрода позволяет ретроспективном восстановление морфологических деталей, которые необходимы для определения ветвления дендритов и регионы, ориентированные на аксонов записанных нейронов. Однако, учитывая наличие морфологически сходных нейронов с различными нейрохимических идентичностей и функции, иммуногистохимическое окрашивание для белков клеточного типа конкретных важно, чтобы окончательно определить нейроны. Для поддержания подключения к сети, срезы головного мозга для физиологических записей готовят при толщине 300 мкм или больше. Тем не менее, эта толщина часто мешает иммуногистохимического постобработку из-за проблем с проникновением антител, что требует резекции ткани. Резекции срезов является сложным искусством, часто Ресултин в потере ткани и морфологии клеток, из которых электрофизиологические данные были получены, рендеринг данных непригодным для использования. Поскольку восстановление морфологии ограничит потери данных и руководство в выборе нейрональных маркеров, мы приняли стратегию восстановления морфологии клеток первого, а затем вторичным иммунным окрашиванием. Введем практический подход к biocytin наполнения во время физиологических записей и последующего серийного иммунным окрашиванием для восстановления морфологии, с последующим restaining участков для определения нейрохимических идентичности. Мы сообщаем, что участки, которые были заполнены с biocytin нелетучие с параформальдегидом (ПФА), окрашивали и покрывали могут быть удалены и restained со второй первичной дней антитела позже. Это restaining включает в себя удаление покровного, промывка секций в буферном растворе, и инкубацию первичных и вторичных антител выявить нейрохимических идентичность. Метод является предпочтительным для устранения ДАТпотери из-за невозможности восстановления морфологии и сужения нейрохимические маркеры для тестирования на основе морфологии.
Introduction
Мозг известен разнообразием в структурных и функциональных характеристик отдельных его элементов нейрональных. Понимание роли различных типов нейронов в функции мозга и патологии требует определения характеристик и однозначной идентификации нейронов. Конструктивно, морфологические признаки, определяемые сомато-дендритной месте определить потенциальные входы, которые получает данный нейрон, в то время как модель аксонов разветвление выявляет потенциальные постсинаптические цели. Структурное разнообразие нейронов была оценена со времен семенных гистологических исследований Рамона Кахаль в 1. Появление методов записи одноклеточных показало, что структурно различные нейроны также показывают различия в характере обжига и синаптических характеристик. Разнообразие в структуре и физиологии особенно проявляется в ГАМКергических тормозных нейронов 2,3. Кроме того, она становится все более очевидным, что конструкционнаяу аналогичные нейроны могут выражать различные нейрохимические маркеры и показать соответствующие функциональные 4 различия. Точно так же, нейроны с теми же нейрохимических маркеров могут иметь различные структуры и функции 5-10. Таким образом, на практике, анализ функциональных характеристик нейронов и их роли в сети влечет за собой устанавливает их морфологические и нейрохимические идентичностей. Даже с появлением репортерных мышей линий , ориентированных на конкретные нейрохимические маркеры, часто бывает необходимо определить морфологию и идентичность подтипа основана на иммуногистологии 11.
Стандартный метод, используемый для характеристики клеток, записанные в острых срезах мозга, чтобы наполнить их biocytin или neurobiotin во время записи, фиксации секций в параформальдегида (PFA) следующие записи, а также использовать иммуногистохимии для выявления морфологии и нейрохимические. Так как толщина секций для среза физиологии, как правило, 300 мкмили более, и потому , что большинство антител не проникают полностью через эту глубину, кусочки должны быть повторно разрезали до 60 мкм или менее , чтобы обеспечить одновременное иммуногистохимическое biocytin и нейрохимических маркеров 12-14. К сожалению, это трудоемкий резекции; риски потери ткани во время секционирования; и может привести к неравномерная усадка ткани, усложняя морфологическими реконструкций. Кроме того, предварительное знание морфологии может помочь сузить маркеры кандидатов, которые могут быть выражены клетками. Мы модифицировали стандартные протоколы biocytin Иммуногистология, чтобы позволить последовательной обработке секций первого для восстановления морфологии, а затем для идентификации потенциальных нейрохимических маркеров.
Иммуногистохимия является изучение распределения антигенов в тканях или клетках и могут быть визуализированы с использованием фермента, флуоресцентные метки, радиоактивные элементы или частицы золота коллоидных 15. Процедура яnvolves с использованием первичных антител, специфически метит и усиливать один или более специфических антигенов, с последующим использованием флуоресцентных вторичных антител, направленных первичное антитело для визуализации. Из-за необходимости различать спектры флуоресценции каждого вторичного антитела не перекрывали друг друга, только ограниченное количество антигенов, могут быть рассмотрены одновременно. Таким образом, предварительное знание морфологии может быть полезным при выборе кандидата нейрохимические маркеры для классификации клеток. Концептуально, Обоснованием последовательной обработке уже окрашенных участков основана на предпосылке , что иммунноокрашивания для одного белка или пептида , не должны мешать антигенных свойств и последующей иммунноокрашивания для структурно - независимого пептида 16. Это отсутствие помех из-за связывания антител к специфическим белком эпитопом на антигене, и, следовательно, позволяет одновременно окрашивании нескольких антигенов в той же ткани. Количество антигенов revealed иммунным окрашиванием ограничена необходимостью неперекрывающихся спектров флуоресцентных вторичных антител и необходимостью неадресный антигенов с антителами , индуцированными у разных видов , с тем чтобы устранить перекрестную реактивность 17,18. В то время как это рассуждение позади последовательного, а не одновременного мечения с двумя различными антителами, которые могут взаимодействовать, насколько нам известно, иммуногистохимическое второго антигена не сообщалось после завершения иммунноокрашивания для одного или нескольких антигенов на смонтированных участках. Здесь мы опишем метод последовательного иммунным ранее окрашенных и смонтированных секций. В то время как мы подробно этот процесс последовательной процедуры иммунноокрашивания для восстановления морфологии с последующим окрашиванием на белок / пептидных маркеров в толстых секций, одни и те же процедуры могут быть использованы в стандартных, тонкие гистологические срезы, а также. Кроме того, мы опишем практический подход, чтобы заполнить записанные нейроны с biocytin и процессом вытеснитьэлектрода из клетки после завершения записи , чтобы оптимизировать заполнение аксонов и дендритных беседок нейронов, как это представлено в нашей недавней работе 6,8.
Самым важным преимуществом способа, описанного здесь, является то, что морфология записанном клетки могут быть полностью восстановлены и отображены перед попыткой резекции или immunostain ломтиков. Хотя проблемы с проникновением определенных антител может сделать необходимым резекция срезах для вторичного иммунным окрашиванием, процедуры, подробно здесь устранит необходимость перестройки сложных нейронов из нескольких секций, и позволит избежать проблем из-за потери ткани и дифференциальной усадки, которая может поставить под угрозу восстановление Следующий резекции. Дополнительным преимуществом является то, что процесс приведет к сокращению затрат, времени, усилий и дорогостоящих антител путем ограничения иммуноокрашивания и повторно секционирования на ломтики, в котором восстанавливаются biocytin заполненные нейроны. Наиболее практичным аспектом является объявлениеНАЯ иммунное, которые могут быть выполнены на срезах, окрашенных месяцев перед использованием вышеупомянутой методики. В частности, восстановление морфологии бы значительно уменьшить потенциал, что физиологические данные из клеток, отвергнутых из-за невозможности получить базовый уровень морфологическую характеристику типа клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Biocytin Заполнение во электрофизиологии
Примечание: читатели могут обратиться к альтернативным источникам для основных методов записи патч-зажим и приборов 19-22, которые не конкретизируются здесь. Подробно изложенные здесь шаги предполагают, что оборудование и процедуры для патч-зажим записи уже установлены, и описание будет ограничено к деталям, связанным с biocytin-начинку и ретроспективном иммуноокрашивания. Все эксперименты, описанные в этой рукописи были выполнены на крысах.
- Использование vibratome, подготовить живые срезах мозга требуемой области при толщине 300 - 350 мкм 23.
- Подготовьте внутренний раствор , содержащий 0,2% biocytin добавлением 2 мг biocytin к 1 мл раствора внутреннего 6. Для достижения наилучших результатов, разрушать ультразвуком внутреннее решение в течение 10 - 15 мин до тех пор, пока biocytin полностью растворяется. Затем загрузите внутренний раствор в шприц емкостью 1 мл, снабженную 0,2 &# 160; мкм размер пор полипропиленовый фильтр наконечник прикреплен к microloader. Держите этот загрузочный шприц на холодный компресс для поддержания стабильности Mg-АТФ и Na-GTP во внутреннем растворе.
Примечание: Внутренняя раствор, содержащий глюконат калия (126 мМ К-глюконат, 4 мМ КСl, 10 мМ HEPES, 4 мМ Mg-АТФ, 0,3 мМ Na-ГТФ, и 10 мМ креатинфосфат) является оптимальным для восстановления некоторых нейрохимических маркеров, в том числе парвальбумин, во время иммунноокрашивания. По нашему опыту, используя цезием и хлоридные на основе внутренних решений снижает способность к восстановлению иммунным для определенных нейрохимических маркеров. Neurobiotin или клетка-impermeant, поправимо, полярная Tracer комбинируя Alexa флуорофором с biocytin может быть использован в качестве альтернативы biocytin. - Под инфракрасным дифференциального интерференционного контраста, визуализировать соответствующую ячейку для записи. Для того, чтобы свести к минимуму любые нарушения аксона, подойти тело клетки за счет снижения пипетку вдоль своей оси с помощью "подход" псоборование доступны в большинстве микроманипуляторами. Создание записи целых клеток под действием инфракрасной дифференциального интерференционного контраста с использованием протоколов физиологии патч-зажим 19-22.
Примечание: Не приближаясь к ячейке в направлении предположительного аксона, как он будет разрывать аксон, визуализируются как пузырьке в конце выреза (зеленая стрелка на рисунке 1). Кроме того, во избежание подачи высокого положительного давления на пипетку записи при приближении к клетке, чтобы свести к минимуму разлив biocytin, что приведет к высокой фоновой окраски.
Рисунок 1. Предлагаемые плоскости для Приближаясь ячеек для Biocytin штриховки. Изображение иллюстрирует гранулу Cell (GC) заполняют с biocytin во время записи, которые были обработаны, чтобы выявить biocytin (красным цветом, используя 594-конъюгированного стрептавидина). GC имеет свои дендриты, ориентированные в плоскости XY. Обратите внимание на отрезанную ЗКАксон (зеленая стрелка) из-за движения пипетки вдоль плоскости XY. Обратите внимание, что он идеально подходить к этому нейрон вдоль плоскости XZ. Шкала бар: 50 мкм.
- В конфигурации зажим напряжения, определить емкость целой клетки и последовательное сопротивление в ответ на небольшой (5 мВ), краткие (30 мс) напряжением шаги, используя при помощи тестовой функции мембраны в режиме ванны при приобретении электрофизиологии данных и программного обеспечения для анализа. Это обеспечит создание условий записи цельноклеточная для обеспечения biocytin заполнения.
- Проводить физиологические записи в режиме либо current- или напряжения зажима по мере необходимости. Минимальное время записи> 10 мин при 34 ° C является идеальным.
Примечание: более длительное время записи может потребоваться для исследований, проведенных при комнатной температуре. - После завершения физиологических записей, повторно установить конфигурацию патч-зажим, медленно перемещая пипетку записи малыми шагами, чередуя вверх (вдоль оси Z.) инаружу (вдоль оси Х) в режиме напряжения зажим.
- Одновременно контролировать емкость и входное сопротивление, используя функцию "Мембрана тест", чтобы визуализировать потерю емкостных переходных процессов и распада нынешних ответов на прямой линии, что указывает на повторное уплотнение ячейки и создание сторонний-снаружи патч на кончик пипетки. Удерживая ячейку в деполяризованной потенциале (-40 мВ) будет способствовать процессу повторной герметизации.
Примечание: Эта процедура для удаления ячейки, как правило, обеспечивает полное восстановление сомы и дендритов. Не применять положительное давление в пипетке записи во время этой процедуры или в то время как отсоединение ячейку из пипетки. Визуализация сомы записанной ячейки в срезе указывает на успешное разъединение. Наличие остатков клеток или мембранный пластыря в конце обособленного наконечника обычно указывает на смещение сомы и не даст полной клеточной морфологии. - в кормовой частиэр отсоединении пипетку из клетки, сохраняют фрагмент в записи камеры в течение 3 - 5 мин, чтобы обеспечить перенос красителя к дистальной дендритов и аксонов процессов.
- Перенесите ломтики в 24-луночный планшет, содержащий 4% PFA для фиксации.
ВНИМАНИЕ: PFA является канцерогенным, а также соответствующие средства индивидуальной защиты, в том числе перчатки и маски для лица, должны быть использованы , чтобы избежать раздражения кожи и ингаляцию. PFA является огнеопасным и должен храниться вне досягаемости огня. PFA никогда не выбрасывать в канализацию и должны быть собраны как химические отходы. PFA фиксация должна быть изолирована от областей, используемых для приготовления живой срез, чтобы избежать загрязнения установки физиологии, в том числе пипеток передачи. - 24 - 48 ч после того, как PFA фиксации, передачи ломтиками до 0,1 М фосфатно-солевом буфере (PBS) для хранения до иммунной окраски.
Примечание: В идеале, biocytin восстановление и иммунным окрашиванием лучше всего, когда выполняется вскоре после фиксации, хотя окрашивание пер формируется в течение 7 сут фиксации дает хорошие результаты. Ломтики можно поддерживать в PBS с 0,02 - 0,05% азида натрия для окрашивания проводили до и в течение 90 дней после фиксации. Хотя на ночь фиксации в PFA хорошо подходит для большинства антител, возможно, что некоторые антитела работают лучше всего, когда длительность инкубации в фиксаторе снижается. Закрепление в PFA в течение более 48 часов снижает доступность антигенов и снижает вероятность успешного вторичного иммунным окрашиванием для нейрохимических маркеров.
ВНИМАНИЕ: азид натрия является чрезвычайно опасным и раздражителем при контакте с кожей или глазами или при приеме внутрь или ингаляции. Сильная передержке может привести к смерти. Канцерогенности и мутагенности соединения не известны. Используйте соответствующие средства индивидуальной защиты, включая перчатки, защитные очки, заставок лабораторный халат и респиратор. Азид натрия никогда не выбрасывать в канализацию и должны быть собраны как химические отходы.
(1 день)
Примечание: Следующая процедура иммунное для свободно плавающих секций и требует непрерывного встряхивания с низкой скоростью (2 об / мин, оборотов в минуту) на шейкере для всех этапов инкубации.
- Промыть 3 раза ткани в течение 10 мин каждый в 0,1 М PBS (рН = 7,4).
Примечание: 0,1 М PBS может быть коммерчески куплены или сделаны в лаборатории следующим образом (составляет 1 л): 8 г NaCl, 0,2 г KCl, 1,44 г Na 2 HPO 4 и 0,24 г KH 2 PO 4 в 1 л дН 2 0.
Примечание: Если нужный нейрохимические маркер известно, окрашивая белок / пептид может выполняться одновременно с biocytin окрашивания (шаги 2.2 - 2.4). Если окрашивание для biocytin только, переходите к шагу 2.5. - ВАРИАНТ: Блок с 10% блокирующего сыворотки (BS; нормальная козья сыворотка (NGS), разведенный в 0,3% Triton X-100 в PBS в течение 1 ч при комнатной температуре).
Примечание: Каждая скважина должнаполучают тот же объем раствора; рекомендуемый объем составляет от 250 - 500 мкл / лунку. Выбор блокирующей сыворотки основана на видах , в которых выращиваются вторичные антитела (например, NGS используется для красителя-конъюгированный козий анти- (соответствующие виды первичных антител)). Если возникнет необходимость в использовании вторичных антител, выработанных у разных видов к immunostain секции, включают в себя 10% от каждой нормальной сыворотке в блокировании стадии (2) и 3% от каждой нормальной сыворотки для первичного и вторичного этапов инкубации антитела. - (ДОПОЛНИТЕЛЬНЫХ) Инкубируйте разделы в первичных антител, CB - 1 R (поликлональные, морская свинка) с 0,3% тритона Х-100, и 3% БС в 0,1 М PBS при комнатной температуре O / N. CB 1 R используется для идентификации каннабиноидных рецептора типа 1 выражение.
Примечание: Этот шаг не является обязательным и не требуется, чтобы выявить заполнение biocytin. На рисунке 2 показана часть , помеченную для biocytin и CB 1 R в течение первого процесса окрашивания. O / N INCUbation при комнатной температуре достаточно для большинства первичных антител; Тем не менее, некоторые первичные антитела, в том числе CB 1 R, требуется 3 - 5 сут инкубации. Если инкубация должна быть больше, чем 1 г, рекомендуется инкубировать при температуре 4 ° С, так как Тритон Х-100 может проницаемыми ломтика и может привести к распаду ткани при длительной инкубации при комнатной температуре. Включают отрицательный контроль недостающую первичное антитело, по меньшей мере, одной секции для каждой серии экспериментов в качестве контроля специфичности вторичного антитела. Для отрицательных контролей, первичное антитело опущено, но 0,3% Тритон Х-100 в 0,1 М PBS и БС добавляются.
Рисунок 2. Успешное ССК Окрашивание 1 неделя После восстановления от Biocytin Окрашивание и C annabinoid рецептора типа 1 (CB 1 R) - <сильный> маркировка. (А - С) конфокальной изображения на 60X , показывающие biocytin заполненные нейрон (A) и CB 1 R иммунореактивности (B), с указанием стрелки. В этот же раздел был обработан для CCK иммунным окрашиванием после 1 недели (C). Наложение изображений показан на D. ССК иммунореактивности выявляли с помощью дальней красной и псевдо-окрашивается в голубой цвет. (E) Морфологические реконструкция biocytin кювету в A. Заметим , что biocytin и CB 1 R окрашивание очевидны даже после того, как второй CCK иммунным окрашиванием. Также обратите внимание ожидаемое распределение CB 1 R и CCK моделей иммуноокрашивания. (F - Н) Увеличенный изображение аксона из клетки, как и в А, показывают тесное взаимодействие локализации biocytin и CB 1 R в аксонов (наконечники стрел). Шкала бар: 50 мкм (А - Д), 100 мкм (Е), и 10 мкм (
(День 2)
- Промыть Срезы мозга 3x в течение 10 мин каждый в 0,1 М PBS (рН = 7,4).
- Инкубируйте разделы в конъюгата стрептавидин красный краситель (концентрация: 1: 1000; возбуждение: 594 нм с излучением в видимой красной области спектра) с 0,3% тритона Х-100 и 3% БС в 0,1 М PBS при 4 ° CO / N в темный (заворачивали в алюминиевую фольгу), чтобы показать biocytin. Дополнительно: включить вторичное антитело, козы против свинку (концентрация: 1: 500; возбуждение: 488 нм и излучение в зеленый цвет), в описанном выше инкубирования, если после дополнительного первичного инкубирования на этапе 2.3.
Примечание: Вторичное антитело будет необходима только при наличии дополнительного окрашивания первичное антитело (этап 2.3) выполняется. Для визуализации biocytin, в STREptavidin-флуорофора сопряжены с спектром излучения в красном цвете рекомендуется, так как она помогает визуализировать тонкие аксоны в деталях и с лучшей контрастностью (рис 1 - 3). Во время двойной или тройной иммунным окрашиванием, чтобы избежать перекрестной реактивности вторичных антител друг с другом, добавляют вторичные антитела, один за другим в последовательном режиме (2 ч интервал между последовательными добавлениями антител достаточно). Фигура 3А иллюстрирует biocytin заполненные ячейки обработаны без дополнительного окрашивания первичных антител и изображенную до резекции.
Рисунок 3. Успешное Второй Иммунологическое после Восстановление Biocytin Морфология и резекции. (А1) конфокальной изображение среза 300 мкм , показывающий восстановление дендритной морфологии biocytin кювету. (<сильные> A2) следы Мембранные напряжения нейрон в ответ на +500 и -100 текущих инъекций Папе. (Б) Восстановление biocytin заполненных сомы в секции 50 мкм , полученного после резекции секции (в A1) 300 мкм после монтажа и обработки изображений. (B2) Последующее иммунное тонкой секции выявлено колокализацию в biocytin заполненные сомы (правая панель) с ССК (средняя панель). На объединенном изображении показан на правой панели. Шкала бар: 50 мкм. Панель A2 воспроизводится с разрешения Ю. и др. , В печати 25. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
(3 -й день)
- срезы головного мозга Wash 3x в течение 10 мин каждый в 0,1 М PBS (рН = 7,4).
- Чтобы защитить флуоресценцию и облегчить повторное окрашивание в будущем, смонтировать секции в водной основе монтажной среды и запечатать края покровного стекла с прозрачным лаком для ногтей.
Примечание: Лучше всего restain секции как можно раньше, чтобы избежать трудностей при удалении лака для ногтей с горкой, плесени инвазии и обезвоживание тканей из-за утечки монтажной среды из предметное стекло. Микробное заражение можно предотвратить с помощью 0,02% азида натрия в PBS.
ВНИМАНИЕ: азид натрия является высокотоксичным и воспламеняется , когда он находится в контакте с водой. Пожалуйста, обратитесь к стандартных оперативных процедур для обработки и удаления опасных химических веществ.
(Дни 4 - 7) - Выполните конфокальной микроскопии с возбуждением при 594 и 488 нм , и при увеличении 20Х или 40Х , чтобы раскрыть biocytin заполненные нейроны в красных и нейрохимических маркеров (CB 1 R) в зеленый цвет. Оценка colabeling (Рисунок 2).
- Установите экспозицию камеры на менее чем за 100 мс, чтобы избежать фотообесцвечивания и obtaв конфокальной изображения штабеля аксонов и дендритных беседок из всего нейроне. Использование конфокальной стеки изображений и нейронные трассировки пакетов программного обеспечения для восстановления нейронов морфологии.
3. Окрашивание второй первичный гуморальный
Примечание: В то время как второй этап иммунным может быть выполнено 90 D после первого окрашивания, оптимальное окрашивание достигается, если второе окрашивание первичного антитела осуществляется в течение 7 - 10 г.
(После того, как 7 - 90 d)
- Нанесите ацетон на ватный тампон и раздеть лак для ногтей прочь стекло.
- Удалите покровное тщательно с помощью тонкой кончик пинцетом и положить несколько капель 0,1 М PBS на участках.
- Осторожно удалите разделы из слайда с помощью тонкой кисточки и промойте их в 0,1 М PBS в течение 24 - 48 часов на качалке , покрытой алюминиевой фольгой в условиях низкой освещенности при 4 о С.
Примечание: Очень важно, чтобы покрыть участки сluminum фольгу, чтобы избежать фотообесцвечивания. - Для того, чтобы обеспечить полное удаление монтажной среды, мыть секций 1 - 2x на следующий день в 0,1 М PBS в течение 10 минут каждый.
- Продолжить инкубации во втором первичного антитела (например, холецистокинин, нейропептид найдены в некоторых ГАМКергических интернейронов (CCK; концентрация: 1: 1000, мышиного моноклонального антитела)) в течение 1 сут (рисунок 2).
Примечание: Эта процедура аналогична шагу 2.3, но использует различные антитела. Кроме того, этап блокирования опускается во время повторного окрашивания. - Промыть срезах головного мозга три раза в течение 10 мин каждый в 0,1 М PBS (рН = 7,4).
- Пятно с флуорофора-конъюгированного вторичного козьего антитела анти-мыши (концентрация: 1: 500; длина волны возбуждения: 647 нм), убедившись в том, что спектры возбуждения эмиссии вторичных антител не перекрываются с стрептавидин (концентрация: 1: 1000; длина волны возбуждения: 594 нм) и до иммунофлюоресценциипятна.
- Установите секции в водной среде монтажа и герметизации края крышки скольжения с прозрачным лаком для ногтей.
Примечание: Храните секции при температуре 4 ° С в непрозрачном ящике для хранения, чтобы защитить флуоресценцию.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
После успешного завершения, секции сохраняют наполнитель biocytin и иммуномечение выполняется на этапе 2 и может быть визуализируют с помощью конфокальной микроскопии или эпифлуоресцентной. Кроме того, обработанные участки будут также показывают иммуногистохимическое антигена с меткой в процессе последующей обработки на этапе 3. В блоке , показанном на фиг.2, морфология biocytin заполненные нейрон в толстой секции (300 мкм) выявляли с помощью стрептавидина визуализируется в красном и первым первичным (CB 1 R) визуализируются в зеленом цвете. Первый иммунное проводили в течение 7 сут PFA фиксации. Срез был установлен в водной среде монтажной, визуализируют с помощью конфокальной микроскопии, и хранили в течение двух месяцев перед повторным окрашиванием для CCK антитела. Обратите внимание на морфологию записанного нейроне, в том числе аксонов беседок (рис 2E), был восстановлен из конфокальных изображений Obtained после первой процедуры окрашивания. Колокализации аксона с CB 1 R иммунореактивности (Рисунок 2 F - H) , как ожидается , на основании физиологических исследований. Второе окрашивание ССК проводили на срезах через два месяца после первой процедуры окрашивания. ССК изображался в дальней красной и псевдо цвета в голубой цвет для визуализации. Аналогичным образом , на рисунке 3 показан пример клетки , в которой biocytin маркировка была обнаружена и изображаемого в толстой секции (рис 3A1). Внутренняя физиология нейрона показана на рисунке 3A2. Срез был повторно разрезали на 50 мкм , и, хотя некоторые разделы , содержащие дендритные процессы были потеряны, раздел , содержащий сому выздоровел (рис 3B1). Последующее ССК иммунное шлифа показал экспрессию CCK в зеленом цвете в biocytin меченных сомы. Монтаж толстый ломоть в водной среде предотвращает еxcessive усадка ткани. В среднем, секции 300 мкм монтируются с использованием водной среды сжиматься примерно 25,67 ± 3,14% (n = 5 ломтиков) при измерении через одну неделю после монтажа. Таким образом, толстые секции установлены с использованием водной среды являются ~ 225 мкм, что позволяет резекции. В нескольких исследованиях контрольных, было подтверждено, что процесс иммунноокрашивания во второй раз не приводило к неспецифической маркировки антителом. Например, известно, что парвальбумина (PV) и ССК иммунореактивности являются взаимоисключающими в нейронах гиппокампа. Элементы управления , в котором первый этап иммуномечение (2) для biocytin (красный) и CCK (зеленый) последовал второй маркировки для парвальбумина (с возбуждением при 405 нм и излучение в синем) показал Неперекрывающиеся паттерны экспрессии (рисунок 4). Кроме того, отличительные ламинарного аксонального окрашивания модели нейронов , выражающие специфические нейрохимические маркеры (PV, ССК, CB 1 R) не были изменены с помощью сериал повторное окрашивание процедуры (Рисунки 2 - 4). Кроме того, вторичное окрашивание последовательно показало совместное мечение biocytin заполненные нейронов с нейрохимических маркеров ожидаемыми на основе физиологических записей. Таким образом, мы уверены в том, что процедура restaining не приводит к потере специфичности в маркировке.
Рисунок 4. Отсутствие Перекрытие между взаимоисключающими маркеров на второй Иммуноокрашивание после получения предварительного иммунным окрашиванием и монтаж секций. (А - С) конфокальной изображения при 10х , показывающие biocytin заполненные нейрон (А) в красном, указанном стрелкой, и CCK иммунореактивности в зеленом (В), указанном стрелкой. Обратите внимание на отсутствие перекрытия. В этот же раздел был обработан для парвальбумина (PV) иммунное окрашивание в синий цвет после более чем 2 -х месяцев (С). OVerlay изображений показана на D. Обратите внимание, что ФЭ аксоны распределены в слое гранулярных клеток, с CCK в молекулярном слое в ожидаемой неналегания рисунка. Также обратите внимание на отсутствие колокализации двух маркеров в нейронную somata. Увеличенному изображения справа показывают, что biocytin меченных нейрон выражает PV (Arrowhead), а не ССК (стрелка). Шкала бар: 100 мкм (А - Д), 20 мкм (панели справа). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Одной из распространенных причин неоптимального biocytin заполняет это случайное разрезание нейрональных процессов с пипеткой записи при приближении к клетке. Потерянный придаток клетки появляется как пузырьке из biocytin в конце аксона, как показано на рисунке 1 (зеленая стрелка). Аксонов везикулыповторно часто визуализируется при латание поверхностные клетки, аксоны которых могут быть разорваны во время процедуры нарезки. Тем не менее, оптимизация плоскости нарезка и знания аксонов картину распределения целевого класса клеток может помочь избежать приближения к сому от направления предполагаемого аксона, который также может разорвать аксона, что приводит к появлению аксонов пузырьке , В большинстве типов клеток, то предпочтительно, чтобы приближаться к телу клеток вдоль Z-оси (белая стрелка с меткой). Второй вопрос касается применения избыточного положительного давления в пипетку при приближении к клетке. Это может не только повредить клетки и ее соединения, но и вызывает внутренний раствор, содержащий biocytin разлить вокруг клетки, что приводит к высокой фоновой флуоресценции. Фоновое окрашивание также увеличивается , когда время , необходимое для приближения к клетке продлевается или когда качество среза не является оптимальным, что может поставить под угрозу способность определять клеточной морфологии (рис 5A). Можно вытащить сома в то время выбивании пипетку. Это приведет к отсутствию соматической морфологии (Фиг.5В). Во избежание вытаскивания ячейку, переместите пипетку вверх и наружу небольшими шагами, используя "тонких" настроек движения манипулятора. Если ячейка по-видимому, прикрепляется к пипетке через расширение длинный мембрана, кран / щелчку манипулятором осторожно, чтобы выбить пипетку из клетки. Избегайте использования грубой настройки манипулятора до тех пор, пока клетка полностью выбиты.
Рисунок 5. Изображения Проиллюстрировать Неудачные Biocytin заливок. (A) Изображение показывает высокую фоновой флуоресценции из - за избыточного положительного давления в пипетку записи, в результате чего в условиях плохой видимости клеток. Тончайшие структуры нейронных процессов, в том числе аксонов, визуализируются вне области йе разлива. Кроме того, обратите внимание, что сомы вынут. (B) Нейрон с сома вытащил во время пипеткой отряда. Стрелки показывают успешные заливок аксона и дендритов, в то время как сомы и придатков проксимальнее стрелки не были восстановлены. (C) Ячейка заплата в поверхностном слое среза (<50 мкм от поверхности) приводит к заполненных клеток , проявляющих резки аксонов и дендритов (наконечники стрел). Обратите внимание на то бисероплетением (стрелки) в ЗК дендритов, что указывает на плохое состояние здоровья клеток (С). Шкала бар: 50 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Наконец, для того, чтобы восстановить полную клеточную морфологию без отрубленных аксонов или дендритов, то лучше клетки-мишени> 50 мкм глубоко к поверхности среза. Поверхностные клетки могут иметь процессы, имеющиебыли сокращены, и может не нормальным набором синаптических входов.
Наиболее распространенные ошибки в restaining процедуры связаны с удалением покровного стекла и восстановления секции без повреждения ткани. Второй вопрос касается проникновения антител в толстой ткани, особенно при инкубации в течение ночи. В ряде случаев, лучшее проникновение было достигнуто путем инкубирования в первичных антител в течение 72 ч при температуре 4 ° С на орбитальном шейкере, помещенной в холодном помещении. Несмотря на то, повторно секционирования ткань является наиболее эффективной процедурой , чтобы обеспечить проникновение антител, увеличение длительности инкубации в первичных антител или увеличением концентрации детергента до 0,5 - 1% Triton-X100 может также способствовать проникновению антител 24. Поскольку большинство зарегистрированных нейронов расположены в пределах 50 - 100 мкм от поверхности раздела, мы находим, что окрашивание толстых секций достаточен для обозначения biocytinс наполнением somata или процессы на этом уровне. Тем не менее, рекомендуется, что степень маркировки антител проверяется на каждой секции перед интерпретацией отрицательных результатов совместной локализации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Критические шаги в рамках Протокола
Заполнение исправленной клетки с biocytin является наиболее важным шагом для обеспечения полного восстановления морфологии. Для полного восстановления клетки, важно, чтобы выбрать оптимальную ориентацию среза, чтобы свести к минимуму Отрыв процессов во время нарезания. Эта ориентация может отличаться в зависимости от типа схемы и ячейки обследуемого. Далее, необходимо, чтобы обеспечить достаточное время для biocytin диффундировать к дендритов и аксонов. Некоторые красители, такие как neurobiotin, также могут проникать нейроны, соединенные с записанной клетки через щелевые контакты. Размер наконечника пипетки также должна быть оптимизирована, так как сомы имеет тенденцию быть вытащены, когда отверстие велико и biocytin нагрузка скомпрометирован, когда кончик пипетки слишком мал. Кроме того, в то время как соответствующие процедуры расцепления из режима целых клеток имеют важное значение для восстановления сомы. После записи в течение 24 часов, последующей инкубацииломтиков в 4% PFA с последующей PBS гарантирует, что сшивание тканей снижается, что является критическим для иммуногистохимии. Хранение срезов при 4 ° С также имеет решающее значение для поддержания целостности среза. Тем не менее, длительное хранение в PFA уменьшает возможный успех с процедурами антител маркировки. Оптимизация концентрации и продолжительности инкубации первичных антител имеет важное значение, так как они будут отличаться для индивидуальных антител, и некоторые антитела могут потребовать от 3 - 5 сут инкубации для оптимального проникновения в толстой ткани. Для того, чтобы гарантировать, что срезы были целы до вторичного первичного меченых антител, адекватное необходима осторожность во время удаления покровного стекла.
Модификации и устранение неисправностей
Мы заметили, что нет истечения установленного между первым и вторым пятном. Секции были повторно окрашивали месяцев спустя на той же ткани и с более чем одним пятном. Внаши последние работы, мы сравнили секции обработаны методом повторного окрашивания с теми использованием стандартных протоколов иммуноокрашивания и не находят никаких очевидных различий в моделях окрашивания или робастность biocytin заполняет 6,9,25,26.
В то время как это еще предстоит проверить, то возможно, что повторное окрашивание может быть выполнена более чем один раз, с целостность ткани является ограничивающим фактором для повторной обработки. Наличие дискретных флуорофоров также представляет собой ограничение для количества антигенов, которые могут быть визуализированы. Таким образом, тщательная обработка ткани рекомендуется. Дополнительный процесс, который остается испытываемый restaining с использованием протоколов антигена восстановления (для поверхностных рецепторов). Так как целостность ткани сохраняется после удаления из покровного стекла, мы ожидаем, что эта процедура должна также работать в окрашивании протоколы, которые рекомендуют антиген-восстановление. В связи с этим, физиологические записи часто приводит к получению клеток без известных нейрохимических маркеров
Ограничения техники
Ограничение, связанные с выполнением иммуногистохимического окрашивания на толстых участках является недостаточное проникновение антител через полную толщину сечения, особенно со стандартной инкубации в течение ночи с первичным антителом. Кроме того, различные антитела и стрептавидин, используемые для выявления biocytin, может иметь проникновение дифференциальной ткани. Таким образом, рекомендуется, чтобы пробные прогоны выполнены, чтобы оценить глубину проникновения антител и изменять время инкубации, температуры, а также антитела и Triton & #160; X-100 концентрации для того, чтобы достичь оптимального проникновения срезов и окрашивания для каждого антитела. Следует также отметить, что успешное мечение с одним антителом или со стрептавидин-biocytin не означает, что второе антитело проникнет на ту же глубину разреза. Поэтому необходимо соблюдать осторожность, чтобы убедиться, проникновение каждого антитела к уровню, на котором рассматриваются процессы клеток biocytin-меченого для совместной локализации с нейрохимических маркером. Если проникновение является недостаточным, срез может быть повторно разрезали на <60 мкм для иммунологического окрашивания. Однако следует отметить, что, так как срезы были уже обработаны для biocytin, морфология клетки могут быть захвачены конфокальной микроскопии, чтобы исключить возможную потерю анатомических данных во время повторного секционирования и для облегчения нейронную реконструкции. Хотя вполне возможно, что возраст и животных может привести к изменению степени проникновения антител, мы успешно использовали эти процедуры в тканях крыс от 30-день- и более чем 60-дневных крыс и мышей.
Второе ограничение состоит в том, что biocytin своей природе не является флуоресцентной и не могут быть использованы для живого изображения и в режиме реального времени морфологической характеристики во время записи. Альтернативные несопр флуорофоры и Люцифер желтый были использованы для живых изображений клеток 27. Они не являются постоянными и теряют флуоресценцию при фиксации, что делает его непрактичным для апостериорных нейрохимических идентификации записанного нейроне. В последнее время флуорофоры с biocytin были введены, чтобы преодолеть это ограничение, и могут быть использованы для живого изображения, а также для апостериорных обработки в двух- и трехместных маркировки, как подробно описано здесь. Интересно отметить , что на сегодняшний день biocytin заливок привели к улучшению электрических и красящих свойств для комбинированных электрофизиологических и анатомических исследований по сравнению с Люцифером желтый 28.
Значимость техники в отношении существующих /Альтернативные методы
Основные преимущества использования протокола подробно здесь, что, в отличие от резекции, то biocytin заполненные структура и процессы клеток остаются нетронутыми и не приводят к постоянной потере ткани, ни к необходимости кропотливой реконструкций из нескольких секций. Таким образом, заполнение одноклеточного с последующим иммуноцитохимию может помочь в морфологической реконструкции и идентификации специфических нейрохимических маркеров.
Будущие приложения или направления после освоения этой техники
В целом, мы представляем новый практический подход к восстановлению морфологии и ретроспективном двух- и тройным иммунноокрашивания нейронов следующих электрофизиологических записей. Процесс является особенно выгодным для поиска новых маркеров по мере развития знаний, пересматривают нейроны, которые ранее были заполнены, визуализированы, и вошедшие в образ. Это особенно выгодно, так как тон иммуногистохимии может выполняться несколько недель или даже месяцев, сохраняя ткани и антитела. Этот метод не требует каких-либо специальных химических веществ и безопасно могут быть выполнены в любой лаборатории.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы хотели бы отметить поддержку со стороны NIH / NINDS R01 NS069861 и NJCBIR CBIR14IRG024 к VS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Sigma | S7653 | Immunostaining |
| KCl | Fluka | 60129 | Immunostaining |
| Na2HPO4 | Sigma | S7907 | Immunostaining |
| KH2PO4 | Sigma | 229806 | Immunostaining |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | Immunostaining |
| Guinea pig anti CB1 | Sigma | Af530-1 | Immunostaining |
| Mouse anti CCK | CURE, UCLA | courtesy of G. Ohning | Immunostaining |
| Rabbit anti Parvalbumin | Swant | PV27 | Immunostaining |
| Streptavidin, Alexa Fluor conjugate | Molecular Probes | S11227 | Immunostaining |
| Normal goat serum (NGS) | Sigma | G9023 | Immunostaining |
| Vectashield | Vector Labs | H-1000 | Immunostaining |
| Secondary Antibodies | Invitogen Molecular probes | Alexa Fluor conjugated dyes | Immunostaining |
| Labnet orbit low speed shaker | Bioexpress | S-2030-LS | Immunostaining |
| Forceps | Dumont | 11231-30 | Immunostaining |
| Slide folders | EMS | 71520 | Immunostaining |
| Vibratome VT 1200 S | Leica | 14048142066 | Electrophysiology |
| Multiclamp 700B amplifier | Molecular devices | Multiclamp 700B | Electrophysiology |
| pCLAMP 10 Software | Molecular devices | pCLAMP 10 | Electrophysiology |
| Digitizer | Molecular Devices | Digidata 1440 digitizer | Electrophysiology |
| Filter tips | Nalgene | 171-0020 | Electrophysiology |
| Sonicator | Fisher Scientific | 15-335-100 | Electrophysiology |
| Microloaders | Eppendorf | 930001007 | Electrophysiology |
| Biocytin | Sigma | B4261 | Electrophysiology |
References
- Garcia-Lopez, P., Garcia-Marin, V., Freire, M. The histological slides and drawings of cajal. Front Neuroanat. 4, 9 (2010).
- Klausberger, T., Somogyi, P. Neuronal diversity and temporal dynamics: the unity of hippocampal circuit operations. Science. 321 (5885), 53-57 (2008).
- Petilla Interneuron Nomenclature, G., et al. Petilla terminology: nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex. Nat Rev Neurosci. 9 (7), 557-568 (2008).
- Armstrong, C., Soltesz, I. Basket cell dichotomy in microcircuit function. J Physiol. 590 (4), 683-694 (2012).
- Povysheva, N. V., Zaitsev, A. V., Gonzalez-Burgos, G., Lewis, D. A. Electrophysiological heterogeneity of fast-spiking interneurons: chandelier versus basket cells. PLoS One. 8 (8), e70553 (2013).
- Gupta, A., Elgammal, F. S., Proddutur, A., Shah, S., Santhakumar, V. Decrease in tonic inhibition contributes to increase in dentate semilunar granule cell excitability after brain injury. J Neurosci. 32 (7), 2523-2537 (2012).
- Fish, K. N., Hoftman, G. D., Sheikh, W., Kitchens, M., Lewis, D. A. Parvalbumin-containing chandelier and basket cell boutons have distinctive modes of maturation in monkey prefrontal cortex. J Neurosci. 33 (19), 8352-8358 (2013).
- Yu, J., Swietek, B., Proddutur, A., Santhakumar, V. Dentate cannabinoid-sensitive interneurons undergo unique and selective strengthening of mutual synaptic inhibition in experimental epilepsy. Neurobiol Dis. 89, 23-35 (2016).
- Yu, J., Swietek, B., Proddutur, A., Santhakumar, V. Dentate total molecular layer interneurons mediate cannabinoid-sensitive inhibition. Hippocampus. 25 (8), 884-889 (2015).
- Varga, C., et al. Functional fission of parvalbumin interneuron classes during fast network events. Elife. 3, (2014).
- Kawashima, T., Okuno, H., Bito, H. A new era for functional labeling of neurons: activity-dependent promoters have come of age. Neural Circuits Revealed. , 109 (2015).
- Krook-Magnuson, E., Luu, L., Lee, S. H., Varga, C., Soltesz, I. Ivy and neurogliaform interneurons are a major target of mu-opioid receptor modulation. J Neurosci. 31 (42), 14861-14870 (2011).
- Szabadics, J., Soltesz, I. Functional specificity of mossy fiber innervation of GABAergic cells in the hippocampus. J Neurosci. 29 (13), 4239-4251 (2009).
- Iball, J., Ali, A. B. Endocannabinoid Release Modulates Electrical Coupling between CCK Cells Connected via Chemical and Electrical Synapses in CA1. Front Neural Circuits. 5, 17 (2011).
- Chen, X., Cho, D. -B., Yang, P. -C.
- Ranjan, A. K., et al. Cellular detection of multiple antigens at single cell resolution using antibodies generated from the same species. Journal of immunological. 379 (1), 42-47 (2012).
- Fuccillo, D. A., Sever, J. L. Concepts in Viral Pathogenesis II. , Springer. 324-330 (1986).
- Buchwalow, I. B., Minin, E. A., Boecker, W. A multicolor fluorescence immunostaining technique for simultaneous antigen targeting. Acta Histochem. 107 (2), 143-148 (2005).
- Qi, G., Radnikow, G., Feldmeyer, D. Electrophysiological and morphological characterization of neuronal microcircuits in acute brain slices using paired patch-clamp recordings. JoVE (Journal of Visualized Experiments. (95), e52358 (2015).
- Walz, W. Patch-clamp analysis : advanced techniques. 2nd edn. , Humana Press. (2007).
- Molnar, P. Patch-clamp methods and protocols. 403, Springer Science & Business Media. (2007).
- Martina, M., Taverna, S. Patch-clamp methods and protocols. , Humana Press. (2014).
- Booker, S. A., Song, J., Vida, I. Whole-cell patch-clamp recordings from morphologically- and neurochemically-identified hippocampal interneurons). J Vis Exp. (91), e51706 (2014).
- Jinno, S., Kosaka, T. Immunocytochemical characterization of hippocamposeptal projecting GABAergic nonprincipal neurons in the mouse brain: a retrograde labeling study. Brain research. 945 (2), 219-231 (2002).
- Yu, J., Proddutur, A., Swietek, B., Elgammal, F. S., Santhakumar, V. Functional Reduction in Cannabinoid-Sensitive Heterotypic Inhibition of Dentate Basket Cells in Epilepsy: Impact on Network Rhythms. Cereb Cortex. , (2015).
- Proddutur, A., Yu, J., Elgammal, F. S., Santhakumar, V. Seizure-induced alterations in fast-spiking basket cell GABA currents modulate frequency and coherence of gamma oscillation in network simulations. Chaos. 23 (4), 046109 (2013).
- Scharfman, H. E. Differentiation of rat dentate neurons by morphology and electrophysiology in hippocampal slices: granule cells, spiny hilar cells and aspiny 'fast-spiking' cells. Epilepsy Res Suppl. 7, 93-109 (1992).
- Tasker, J. G., Hoffman, N. W., Dudek, F. E. Comparison of three intracellular markers for combined electrophysiological, morphological and immunohistochemical analyses. J Neurosci Methods. 38 (2-3), 129-143 (1991).
