Nörokimyasal markerleri Biocytin dolu ve İşlenmiş Bölümler immün

Summary

Bu protokol, biocytin doldurma ve sonraki immünohistokimyasal Postprocess kullanılarak elektrofizyolojik kayıtları sırasında yamalı nöronların morfolojik geri kazanılması için bir yöntem sunulur. Biz, lekeli ve kaplandı kalınlığında biocytin dolu bölümler, daha sonra ikinci bir birincil antikor gün ya da ay ile tekrar boyanmış edilebileceğini göstermektedir.

Abstract

yama kelepçe tekniğiyle hücreleri elektrofizyolojik kayıtları ateş şekillerine göre, farklı nöronal türlerinin tanımlanması için mümkün hale gelmiştir. Kayıt elektrot biocytin / neurobiotin dahil dendritik arborization ve kaydedilen nöronların akson hedef bölgeleri belirlemek için gerekli olan morfolojik detaylar, post-hoc kurtarma izin verir. Bununla birlikte, farklı bir nörokimyasal kimlikleri ve işlevleri, hücre tipi özel proteinler için immünohistokimyasal boyama ile morfolojik olarak benzer nöronların varlığı göz önüne alındığında kesin nöronlar tespit etmek şarttır. Ağ bağlantısı sağlamak için, fizyolojik kayıtlar için beyin kesitleri 300 um ya da daha büyük bir kalınlıkta hazırlanır. Ancak, bu kalınlık genellikle doku geriden kestirmeye gerektiren nedeniyle antikor penetrasyon ile ilgili sorunlar immünohistolojik postprocessing engellemektedir. dilim rezeksiyon genellikle resul, zorlu bir sanattırdoku ve hücre morfolojisi kaybına ting başka elektroifzyolojik veriler gereksiz verilerin işleme elde edilmiştir. nöronal belirteçlerin seçiminde veri kaybı ve rehber sınırlayacak morfoloji kurtarma yana, ikincil immün tarafından takip ilk hücre morfolojisi kurtarma stratejisini, kabul ettiler. Biz fizyolojik kayıtları ve nörokimyasal kimliğini belirlemek için bölümlerin restaining ardından morfoloji geri kazanılması için daha sonraki seri immün sırasında dolum biocytin için pratik bir yaklaşım getirmektedir. Biz, (PFA) paraformaldehid ile sabitlendi, koyulaştınldı ve kaplandı biocytin ile doldurulmuştur bölümleri ayrılmış ve daha sonra, ikinci bir birincil antikor gün ile tekrar boyanmış olabilir bildirmektedir. Bu restaining lamel kaldırılmasını, bir tampon çözelti içinde bölümlerin yıkama ve nörokimyasal kimlik ortaya çıkarmak için birincil ve ikincil antikorlar kuluçka içerir. yöntem, DAT ortadan kaldırmak için avantajlıdırmorfolojisi kurtarmak için bir yetersizlik nedeniyle ve nörokimyasal belirteçlerinin daraltarak için bir kayıp morfolojiye göre test edilecek.

Introduction

Beyin bireysel nöronal elementlerin yapısal ve işlevsel özellikleri çeşitlilik için bilinir. beyin fonksiyonu ve patoloji farklı nöron tiplerinin rolleri anlamak karakterizasyonu ve nöronların kesin kimlik gerektirir. aksonal arborization desen potansiyel postsinaptik hedefleri tanımlar iken Yapısal, somato-dendritik yere göre tanımlanan morfolojik özellikleri, belirli bir nöron alır potansiyel girişleri belirler. Nöronların yapısal çeşitlilik Ramon y Cajal seminal histolojik çalışmalar ¹ günlerinden beri takdir edilmiştir. Tek hücreli kayıt tekniklerinin ortaya çıkışı, yapısal olarak farklı nöron ayrıca fırınlama desen ve sinaptik karakteristikleri bakımından farklılıklar gösterir ortaya koymuştur. Yapı ve fizyolojisi çeşitlilik GABAerjik inhibitör nöronlar ^2,3 özellikle belirgindir. Buna ek olarak, bu structurall giderek daha açık hale gelmiştiry benzer nöronlar işlevsel farklılıkları ⁴ gelen farklı nörokimyasal işaretleri ve gösteri ifade edebilir. Benzer şekilde, aynı nörokimyasal işaretleri ile nöronlar farklı yapılar ve fonksiyonları ^5-10 olabilir. Dolayısıyla, uygulamada, ağ nöronların işlev özelliklerinin analizi ve rolü, hem morfolojik ve nörokimyasal kimlik tanımlama gerektirmektedir. Hatta belirli nörokimyasal belirteçleri hedefleyen raportör fare hatları gelişine, o immünohistoloji ¹¹ dayalı morfoloji ve alt tipi kimliğini belirlemek için genellikle gereklidir.

akut beyin dilimleri kaydedilen hücreleri karakterize etmek için kullanılan standart yöntem, kayıt sırasında biocytin veya neurobiotin ile doldurun kayıtları aşağıdaki paraformaldehid bölümleri (PFA) düzeltmek ve morfolojisi ve sinir kimyasını ortaya çıkarmak için immünhistokimya kullanmaktır. dilim fizyolojisi için bölümlerin kalınlığı bu yana 300 mikron tipik olarakBir çok antikor bu derinlik tüm yol boyunca nüfuz başarısız daha çünkü veya dilimler biocytin ve nöro-kimyasal işaretlerin ^12-14 için eş zamanlı olarak immün izin vermek için 60 um ya da daha az yeniden kesitli olması gerekir. Ne yazık ki, rezeksiyon zahmetlidir; Kesit sırasında doku kaybı riskini; ve morfolojik rekonstrüksiyon komplike doku farklı büzülmeden yol açabilir. Ayrıca, morfoloji ön bilgi hücreleri tarafından ifade edilmesi muhtemeldir aday işaretlerini daraltmak yardımcı olabilir. Biz ilk morfoloji geri kazanımı için ve daha sonra olası nörokimyasal belirteçlerin tanımlanması için bölümlerin seri işleme izin vermek standart biocytin immünohistolojisi protokolleri değiştirdiniz.

İmmünohistokimya dokular ya da hücrelerin antijen dağılımının çalışmadır ve bir enzim, floresan etiketler, radyoaktif elementler, veya altın kolloid partiküller ¹⁵ ile görselleştirilebilir. prosedür Iözel olarak görselleştirme için birincil antikor hedefleme, ışıltılı ikincil antikorlar kullanılarak, ardından bir veya daha fazla spesifik antijenler, etiket ve yükseltmek için primer antikorlar kullanılarak nvolves. çakışma olmadan her bir ikincil antikorun flüoresans spektrumunu ayırt ihtiyacı nedeniyle, antijenlerin, sadece sınırlı sayıda eş zamanlı olarak kontrol edilebilir. Böylece, morfolojisi ön bilgi hücre sınıflandırma için aday nörokimyasal belirteçleri seçiminde yararlı olabilir. Kavramsal olarak, daha önce lekeli bölümlerinin seri işleme arkasındaki mantık, bir protein veya peptid için immün bir yapısal olarak bağımsız peptid ¹⁶ antijenite ve daha sonra immunolabeling engel olmamalıdır prensibine dayalıdır. müdahalenin olmaması, bir antijen üzerindeki belirli bir protein epitopa antikorların bağlanma nedeniyle ve bu nedenle aynı dokuda birden fazla antijene eşzamanlı boyama sağlar. antijenlerin sayısı revealeimmün D floresan ikincil antikor örtüşmeyen spektrumları için olan ihtiyaç ile çapraz reaktivite ^17,18 ortadan kaldırmak için, farklı türlerde antikorlarla bağımsız antijenleri hedeflemek için ihtiyaç tarafından sınırlıdır. Bu monte bölümlerde bir veya birden fazla antijenler için immunolabeling tamamlandıktan sonra rapor edilmemiştir ikinci bir antijen için immün, bildiğimiz kadarıyla, etkileşebilir iki ayrı antikorlar ile seri ziyade eş zamanlı etiketleme arkasındaki mantık iken. Burada, daha önce boyanmış ve monte edilmiş bölümlerinin seri immün için bir yöntem tarif eder. detaylardaki kalınlığında kesitler protein / peptid belirteçleri için boyanarak, ardından morfolojisinin geri kazanımı için bir seri immün prosedürü için bu işlemi yaparken, aynı işlemler ince histolojik kesitler de bir standart olarak kullanılabilir. Buna ek olarak, biocytin ve çıkarmak için işlem ile kaydedilen nöronların doldurmak için pratik bir yaklaşım tarifBizim son çalışma ^6,8 sunulduğu gibi kayıtların tamamlanmasından sonra hücreden elektrot, akson ve nöronların dendritik milleri doldurulmasını optimize etmek.

Burada anlatılan prosedürün en önemli avantajı kaydedilen hücrenin morfolojisi tamamen iyileşti ve rezeksiyon veya dilimler immunostain çalışmadan önce görüntülü olabilir olmasıdır. Bazı antikorların penetrasyonu ile ilgili sorunlar ikincil immün için rezeksiyon dilimleri gerekli hale olsa da, burada ayrıntılı prosedürler birden fazla bölüm karmaşık nöronlar yeniden ihtiyacını ortadan kaldıracaktır ve yeniden tehlikeye hangi doku kaybı ve diferansiyel büzülmesine bağlı sorunları önleyeceğini geriden kestirmeye et. Bir avantajı süreci immün ve biocytin dolu nöronlar kurtarıldı edildiği dilimleri yeniden kesit sınırlayarak maliyet, zaman, çaba ve pahalı antikorların azaltılması olacaktır. En pratik yönü reklamdırYukarıda belirtilen teknik kullanılarak daha önce kesitler lekeli ay yapılabilir ditional immün. Özellikle, morfoloji kurtarma ölçüde hücrelerden fizyolojik veriler nedeniyle hücre tipi bir temel morfolojik karakterizasyon elde etmek için bir yetersizlik atılır bu potansiyeli azaltacaktır.

Protocol

Elektrofizyoloji sırasında 1. Biocytin Dolum

NOT: okuyucular burada üzerine özenli değil temel yama-kelepçe kayıt teknikleri ve enstrümantasyon ^19-22, alternatif kaynaklara başvurabilirsiniz. Burada ayrıntılı adımlar yama-kelepçe kayıtları için ekipman ve prosedürler zaten kurulmuş olduğunu varsayalım ve açıklama biocytin doldurma ve post-hoc immün ilgili ayrıntılar ile sınırlı olacak. Bu yazıda belirtilen tüm deneyler fareler üzerinde gerçekleştirilmiştir.

1. 350 um ²³ - bir vibratome kullanarak, 300 bir kalınlıkta, arzu edilen bölgenin canlı beyin kesitler hazırlamak.
2. İç çözeltisi ⁶ 1 ml biocytin 2 mg eklenerek% 0.2 biocytin içeren bir iç çözelti hazırlayın. biocytin tamamen eriyene kadar 15 dakika - En iyi sonuçlar için, 10 iç çözüm sonikasyon. Daha sonra, bir 0.2 ile donatılmış bir 1 ml şırınga içinde, iç çözüm yük# 160; mikron gözenek boyutu polipropilen filtre ucu Microloader bağlı. iç çözümü Mg-ATP ve Na-GTP istikrarı korumak için soğuk paketi üzerinde bu yükleme şırınga tutun.
   Not: bir iç çözelti içeren bir potasyum glukonat (126 mM K-glukonat, 4 mM KCI, 10 mM HEPES, 4 mM Mg-ATP, 0.3 mM Na-GTP, 10 mM fosfokreatin), bazı nöro-kimyasal işaretlerin geri kazanımı için uygun bir immün sırasında parvalbumin dahildir. bizim deneyim, Sezyum ve klorür bazlı iç çözümleri kullanarak belirli nörokimyasal belirteçler için immün kurtarmak için yeteneğini azaltır. Neurobiotin ya biocytin bir Alexa Fluorofor birleştiren bir hücre geçirgenliği olmayan, tamir edilebilir polar iz biocytin alternatif olarak kullanılabilir.
3. Kızılötesi diferansiyel girişim kontrast altında kayıt için uygun hücre görselleştirmek. akson kesintileri en aza indirmek için, "yaklaşım" f kullanarak ekseni boyunca pipet düşürerek hücre gövdesi yaklaşımEn Mikromanipülatörler mevcuttur unction. Patch-kelepçe fizyolojisi protokolleri ^19-22 kullanarak kızılötesi diferansiyel girişim kontrast altında tam hücre kayıtları kurmak.
   NOT: kesik ucuna (Şekil 1'de yeşil ok) bir bleb olarak görüntülenmiştir akson, sever gibi, varsayılan akson yönden hücreyi yaklaşan kaçının. Ayrıca, yüksek arka plan boyama neden olacaktır biocytin ve dökülme, en aza indirmek için hücreyi yaklaşırken kayıt pipet yüksek pozitif basınç uygulamaktan kaçının.

Şekil 1. Biocytin doldurur için Hücreleri yaklaşırken için Plane önerdi. Resim (594-konjuge streptavidin kullanılarak kırmızı), bir granül hücre (GC) biocytin ortaya çıkarmak için işlendikten kayıt sırasında biocytin dolgu göstermektedir. GC XY düzleminde odaklı olarak dendrit vardır. kopmuş granül hücre dikkatakson nedeniyle XY düzlemi boyunca pipet hareketine (yeşil ok). o XZ düzlemi boyunca bu nöron yaklaşım ideal olduğunu unutmayın. Ölçek çubuğu: 50 mikron.

4. gerilim kelepçe yapılandırmada, küçük (5 mV) yanıt olarak tüm hücre kapasitans ve seri direnç, kısa (30 ms) gerilim belirlemek, bir elektrofizyoloji veri toplama ve analiz yazılımı banyo modunda membran testi işlevini kullanarak kullanarak adımlar. Bu biocytin-dolum sağlamak için tüm hücre kayıt koşullarına kurulmasını sağlayacaktır.
5. gerektiği gibi ya akım-veya voltaj-kelepçe modunda fizyolojik kayıtları yürütün. 34 ° C de> 10 dk bir minimum kayıt süresi idealdir.
   NOT: Daha uzun kayıt süreleri, oda sıcaklığında gerçekleştirilen çalışmalar için gerekli olabilir.
6. Fizyolojik kayıtların tamamlanmasının ardından, yavaş yavaş (Z ekseni boyunca) yukarı alternatif, küçük adımlarla kayıt pipet hareket ettirerek yama-kelepçe yapılandırmasını yeniden kurmak vedışarı doğru voltaj-kelepçe modunda (X ekseni boyunca).
7. Eş zamanlı olarak hücrenin yeniden sızdırmazlık ve bir dış-çıkış kurulmasını gösteren kapasitif geçici kaybı ve düz bir çizgi mevcut yanıtların çöküşünü görselleştirmek için "membran testi" fonksiyonunu kullanarak kapasite ve giriş direnci izlemek pipet ucunda yama. bir depolarize potansiyeli (-40 mV) hücreyi Holding yeniden mühürleme işlemini kolaylaştıracaktır.
   NOT: Bir hücrenin uzaklaştırılması için Bu prosedür genellikle soma ve dendritler tam iyileşme sağlar. Bu işlem sırasında ya da pipetle hücreyi ayırarak kayıt sırasında pipet pozitif basınç uygulamayın. dilim kaydedilen hücrenin soma Görselleştirme başarılı ayrılmasını gösterir. Hücresel enkaz veya müstakil ucu sonunda bir zar yama varlığı genellikle soma çıkık gösterir ve tam hücresel morfoloji vermez.
8. kıçtaDistal dendritik ve aksonal süreçleri boya taşınmasını sağlamak için 5 dakika - hücreden pipet ayrılmakta er, 3 kayıt odasına dilim korur.
9. tespiti için% 4 PFA ihtiva eden bir 24-çukurlu plaka dilimleri aktarın.
   UYARI: PFA kanserojen ve eldiven ve yüz maskesi dahil olmak üzere uygun kişisel koruyucu donanımlar, olduğu, cilt tahrişine ve inhalasyon önlemek için kullanılmalıdır. PFA yanıcı ve yangın ulaşamayacağı tutulmalıdır. PFA drenaj bertaraf asla ve kimyasal atık olarak toplanan gerekir. PFA tespit transferi pipetler dahil fizyoloji kurulum kirlenmesini önlemek için canlı dilim hazırlanması için kullanılan alanlar, izole edilmelidir.
10. 24-48 saat PFA tespit sonrasında önce immün depolama için 0.1 M fosfat tamponlu tuz (PBS) dilim aktarın.
    NOT: İdeal olarak, kurtarma ve immün biocytin boyama per rağmen, kısa bir süre tespit sonrasında gerçekleştirilir en iyi zaman sabitleme verimleri iyi sonuçlar 7 gün içerisinde kurdu. Bu nedenle ameliyat sonrası gün 90 üzerinde kadar gerçekleştirilen boyama için,% 0.05 sodyum azid - Dilimler 0.02 PBS içinde muhafaza edilebilir. PFA gece boyunca tespiti en antikorlar için iyi çalışmasına rağmen, sabitleyici inkübasyon süresi azalır bazı antikorlar, en iyi sonucu olasıdır. 48 st için PFA Tespit antijenlerin kullanılabilirliğini azaltır ve nörokimyasal belirteçler için başarılı ikincil immün şansını azaltmaktadır.
    DİKKAT: Sodyum azit son derece tehlikeli ve yenmesi veya inhalasyon cilt veya gözlerle veya üzerine temas halinde tahriş edicidir. Şiddetli aşırı maruz kalma ölümle sonuçlanabilir. bileşik kanserojenliği ve mutajenisite bilinmemektedir. eldiven, gözlük sıçrama, bir laboratuvar önlüğü ve toz solunum dahil olmak üzere uygun kişisel koruyucu donanımları kullanın. Sodyum azit drenaj bertaraf asla ve kimyasal atık olarak toplanan gerekir.

Ana birincil antikor ve Biocytin arasında e_title "> 2. Boyama

(1.gün)
Not: Aşağıdaki immüno-boyama prosedüründe serbest yüzen bölümler için ve inkübasyon adımları için bir çalkalayıcı üzerinde düşük bir hızda (2 devir / dakika, rpm) sürekli bir şekilde çalkalanarak gerektirir.

1. 0.1 M PBS (pH = 7.4) içinde 10 dakika her biri için, doku 3x yıkanır.
   Not: NaCl 8 g, KCI, 0.2 g, Na ₂ HPO ₄ 1.44 g, ve KH ₂ 0.24 g _PO4, 1: aşağıdaki şekilde, 0.1 M PBS, ticari olarak laboratuarda satın alınabilir ya da yapılabilir (1 L) yapar dH ₂ 0 L.
   Not: İstenilen nörokimyasal işaretçi biliniyorsa, bir protein için boyama / peptid biocytin boyama ile eş zamanlı olarak gerçekleştirilebilir (2.2 adım - 2.4). Sadece biocytin için boyama ise 2.5 adıma geçin.
2. İSTEĞE BAĞLI:% 10 serum engelleme Blok (bs, oda sıcaklığında 1 saat için PBS içinde% 0.3 Triton X-100 ile seyreltilmiş normal keçi serumu (NGS)).
   NOT: Her iyi olmalıçözeltinin aynı hacmi içerir; / Kuyu 500 uL - tavsiye hacmi 250 arasındadır. Engelleme serum seçimi ikincil antikorlar (örneğin, NGS boya-konjüge edilmiş keçi anti (ilgili primer antikor türleri) için kullanılır) yetiştirilir olan türlere dayanmaktadır. başlıkların immunostain farklı türlerde ortaya sekonder antikor kullanımı ortaya çıkarsa, adım (2) bloke etmek üzere, her normal serum% 10 ve birincil ve ikincil antikor inkübasyon adımları için, her normal serum% 3 arasındadır.
3. (İSTEĞE BAĞLI) primer antikor bölümleri inkübe RT O / N 0.1 M PBS içinde% 0.3 Triton X-100 ve% 3 BS _CB1 R (poliklonal hamster). _CB1 R kanabinoid reseptör tip 1 ekspresyonunu tespit etmek için kullanılır.
   NOT: Bu adım isteğe bağlıdır ve biocytin dolum ortaya çıkarmak için gerekli değildir. Şekil 2, ilk boyama işlemi sırasında biocytin ve CB ₁ R etiketli bir bölümü göstermektedir. O / N incuOda sıcaklığında Bation birincil antikor çok için yeterlidir; inkübasyon 5 d - ancak, CB ₁ R dahil olmak üzere bazı birincil antikorlar, 3 gerektirir. İnkübasyon daha uzun 1 D olması gerekir, Triton X-100 dilimleri geçirgenliği ve oda sıcaklığında uzun süreli inkübasyon sırasında doku tahrip olmasına yol açmaktadır, çünkü 4 ° C'de inkübe etmek önerilir. İkinci antikorun, belli bir kontrol olarak deney, her dizi için, en az bir bölümünde primer antikor içermeyen bir negatif kontrol içerir. Negatif kontroller için ilk antikor ihmal edilir ancak% 0.3 Triton 0.1 M PBS içinde X-100 ve BS eklenir.

Şekil 2. Başarılı CCK Boyama Biocytin Boyama ve C Kurtarma ardından 1 Hafta Reseptör Tip 1 (CB ₁ R) annabinoid - <strong> etiketleme. (A - C) ok ile gösterilen biocytin doldurulmuş nöron (A) ve _CB1 R immünoreaktivitesi (B) gösteren 60X konfokal ve görüntüler. Aynı bölümü 1 hafta (C), sonra, CCK immün işlenmiştir. Görüntü bindirme D 'de gösterilmiştir. CCK immunreaktivitesine uzak-kırmızı kullanılarak ortaya çıktı ve camgöbeği pseudo-boyandı. (E) biocytin ve CB ₁ R boyama hatta ikinci CCK immün sonra belirgin olduğu A. Not biocytin dolu hücrenin morfolojik yeniden yapılanma. Ayrıca CB ₁ R ve CCK immün desen beklenen dağılımı not edin. (F - H) A olarak hücreden akson Büyütülmüş görüntü, biocytin gösterisi yakın işbirliği yerelleştirme ve akson CB ₁ R (ok başları). Ölçek çizgisi: 50 um (A - D), 100 um (E) ve 10 um ( ve ark çoğaltılamaz edilir. 2015 ^9. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

(2. gün)

4. 0.1 M PBS (pH = 7.4) bölümler 10 dakika her biri için 3x beyin yıkayın.
5. streptavidin kırmızı boya birleşmişi 'bölümleri inkübe (konsantrasyon: 1: 1000, eksitasyon: görünür tayfta emisyon 594 nm)' de, 4 ° CO 0.1 M PBS içinde% 0.3 Triton X-100 ve% 3 BS / K koyu (alüminyum folyo ile sarılmış) biocytin ortaya çıkarmak için. Aşama 2.3 isteğe bağlı primer inkübasyonun ardından yukarıdaki inkübasyon: (yeşil 488 nm ve emisyon uyarım 500: 1 konsantrasyon): İsteğe ikincil antikor, keçi anti-kobay içerir.
   Not: İkincil antikor isteğe bağlı birinci antikor, boyama (2.3 aşama) yerine getirilmesi durumunda gerekli olacaktır. Bir stre biocytin görselleştirmek içino (- 3 Şekil 1) detaylı ve daha iyi kontrasta sahip ince aksonlar görselleştirmek için yardımcı olarak kırmızı bir emisyon spektrumu ile ptavidin-flüorofor konjuge tavsiye edilir. iki ya da üç immün sırasında birbirleri ile sekonder antikorların çapraz reaktivite önlemek için, seri bir şekilde (antikorlar seri eklemeler arasında 2 saat aralığı yeterlidir) peş sekonder antikorlar, bir ekleyin. Şekil 3A, isteğe bağlı birinci antikor boyama işlenip rezeksiyon önce görüntülü bir biocytin dolu bir hücreyi göstermektedir.

Şekil 3. Biocytin Morfoloji ve rezeksiyon ve Kurtarma aşağıdaki Başarılı İkinci immün. Bir biocytin dolu hücrenin dendritik morfoloji kurtarma gösteren 300 mikron dilim (A1) Konfokal görüntü. (<500 ve -100 pA akım enjeksiyonları cevaben nöron strong> A2) Membran gerilim izleri. Montaj ve görüntüleme sonrası (A1) 300 mikron bölüm rezeksiyon sonrası elde edilen 50 mikron bölümünde biocytin dolu soma (B) Kurtarma. (B2) ince bölümün sonraki immün CCK (orta panel) ile biocytin dolu soma (sağ panel) ko saptandı. Birleştirilen görüntü sağ panelde gösterilmektedir. Ölçek çubuğu: 50 mikron. Panel A2 Yu ve ark izni ile yeniden üretilir. Basın ^25. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

(Gün 3)

6. Yıkama beyin kesitleri 0,1 M PBS (pH = 7.4) içinde 10 dakika her biri için 3 kat.
7. floresan korumak ve gelecekte yeniden boyama kolaylaştırmak için, sek montajSu esaslı bir montaj ortamı içinde sonuçlarını ve şeffaf tırnak cilası ile lamel kenarlarını kapatırlar.
   NOT: nedeniyle cam slayt montaj orta kaçak slayt, kalıp istila ve doku dehidratasyon oje kaldırarak zorluklar önlemek için mümkün olduğunca erken bölümleri restain en iyisidir. Mikrobiyal kirlenme PBS içinde% 0.02 sodyum azid ile önlenebilir.
   DİKKAT: su ile temas halinde olduğunda, sodyum azid oldukça toksik ve yanıcı değildir. Tehlikeli kimyasalların taşınması ve bertarafı için standart işletim prosedürlerine bakınız.
   (Gün 4-7)
8. 594 ve 488 nm ve yeşil, kırmızı ve nöro-kimyasal işaretlerin _(CB1 R) 'de biocytin doldurulmuş nöronlar ortaya çıkarmak için 20X ya 40X bir büyütmede eksitasyonla confocal görüntüleme gerçekleştirin. (Şekil 2) colabeling değerlendirin.
9. photobleaching ve obta önlemek için en az 100 ms Kamera pozu ayarlamakTüm nöronun akson ve dendritik milleri konfokal görüntü yığınlar. Kullanım konfokal görüntü yığınları ve nöron izleme yazılım paketleri nöronal morfoloji yeniden.

İkinci primer antikor 3. boyanması

NOT: İkinci immün adımı ilk boyandıktan sonra 90 d yapılabilir iken ikinci primer antikor boyama 7 içinde yapılırsa, optimum boyama elde edilir - 10 d.

(7 Sonra - 90 d)

1. Bir pamuklu çubukla için aseton uygulayın ve cam slayt kapalı oje şerit.
2. ince uçlu forseps kullanılarak dikkatlice lamel çıkarın ve bölümlerde 0.1 M PBS birkaç damlacıklar koydu.
3. Dikkatle ince bir boya fırçası kullanarak slayt bölümleri çıkarmak ve 24 için 0.1 M PBS içinde yıkayın - 4 ^o C'de düşük ışıkta alüminyum folyo kaplı bir çalkalayıcı üzerinde 48 saat
   NOT: bir ile bölümleri kapsayacak şekilde önemlidirluminum folyo photobleaching önlemek için.
4. 10 dakika her biri için 0.1 M PBS ertesi günü 2x - montaj orta tümüyle kaldırılmasını sağlamak için, bölümlerinin 1 yıkayın.
5. Ikinci birincil antikor inkübasyon ile devam (örneğin, kolesistokinin, belirli bir GABAerjik internöronlar (CCK bulunan bir nöropeptid, konsantrasyon: 1: 1,000; fare monoklonal antikoru)) 1 gün (Şekil 2) dir.
   NOT: Bu işlem 2.3 adıma benzer ama farklı antikor kullanılır. Ayrıca, engelleme adımı yeniden boyama esnasında göz ardı edilir.
6. 0.1 M PBS (pH = 7.4) içinde 10 dakika için her beyin kesitlerinde üç kez yıkayın.
7. fluorofor-konjuge sekonder antikor keçi anti-fare ile Leke (konsantrasyon: 1: 500; dalgaboyu: 647 nm), ikincil antikor uyarma-emisyon spektrumları streptavidin (konsantrasyon ile örtüşmeyen emin: 1: 1.000; eksitasyon dalga boyu: 594 nm) ve önceden immünofloresanlekeleri.
8. Sulu montaj ortamında bölümleri monte edin ve şeffaf tırnak cilası ile kapak kayma kenarları mühür.
   Not: floresan korumak için opak muhafaza kutusu içinde 4 ° C'de bölümleri saklayın.

Representative Results

başarı ile tamamlayan bölümler biocytin dolgu ve immün 2. adımda gerçekleştirilen ve konfokal veya Epifloresans mikroskopi kullanılarak görüntülü olabilir korur. Buna ek olarak, işleme bölümleri de Şekil 2'de gösterilen bölümde 3. adımda takip eden işlemler sırasında etiketli antijen için immün gösterir, kalın bir bölüm (300 um) bir biocytin doldurulmuş nöron morfolojisi streptavidin kullanılarak ortaya çıkarılmıştır kırmızı ve ilk birincil (CB ₁ R) görüntülenmiştir yeşil görüntülendi. İlk immün PFA fiksasyon 7 gün içerisinde gerçekleştirildi. Dilim CCK antikor yeniden boyama önce konfokal mikroskop kullanılarak ve iki aylık bir süre için saklanabilir sulu yapıştırma vasatı içerisinde monte edilmiştir. Aksonal milleri (Şekil 2E) de dahil olmak üzere kaydedilen nöron morfolojisi, Not, konfokal görüntüleri o yeniden inşa edildiİlk boyama işleminden sonra btained. CB ₁ R immünoreaktivitesinde ile akson ko (Şekil 2 F - H) fizyolojik çalışmalara dayanan bekleniyordu. CCK ikinci boyama iki ay ilk boyama işlemi sonrasında bölümlerinde gerçekleştirilmiştir. CCK uzak-kırmızı görüntülenmiştir ve görselleştirme için mavi pseudo-boyandı. Benzer şekilde, Şekil 3, (Şekil 3A1) biocytin-etiketleme ortaya çıktı ve kalın bölümdeki görüntülenmiş olan bir hücrenin bir örneğini göstermektedir. Nöronun iç kaynaklı fizyolojisi Şekil 3A2 de gösterilmiştir. Dilim dendritik süreçleri içeren bazı bölümleri kayıp olmasına rağmen, soma içeren bölüm (Şekil 3B1) kurtarıldı, 50 mikron yeniden kesitli edildi ve. İnce bölümün sonraki CCK immün biocytin etiketli soma yeşil CCK ifadesi gösterdi. sulu bir ortamda, kalın dilim Montaj e önlerxcessive doku büzülme. Ortalama olarak, 300 um'lik kesitler, montajdan sonra bir hafta ölçüldüğünde sulu ortam yaklaşık 25.67 ±% 3.14 (n = 5 dilim) küçülecek kullanılarak monte edilebilir. Böylece, kalın kesitler sulu ortam kullanılarak monte rezeksiyon için izin ~ 225 mikron. Birkaç kontrol çalışmalarda, ikinci kez immunolabeling süreci antikor non-spesifik etiketleme yol olmadığını teyit edilmiştir. Örneğin, parvalbumin (SV) CCK immünoreaktivitesi hipokampal nöronlar birbirinden bağımsız olduğu bilinmektedir. Biocytin (kırmızı) ve CCK (yeşil) ilk immün basamak (2) (mavi 405 nm'de ve emisyon eksitasyon) parvalbumin ikinci etiketleme ve ardından edildiği Kontroller örtüşmeyen ekspresyon modelleri (Şekil 4). Buna ek olarak, belirli nörokimyasal belirteçler ifade nöronlar ayırt edici laminer aksonal boyanma (PV, CCK, CB ₁ R) seria tarafından değiştirilmiş değill yeniden boyama işlemleri (Şekil 2-4). Üstelik, ikinci boyama, sürekli fizyolojik kayıtları temelinde beklenen nöro-kimyasal işaretlerin ile biocytin doldurulmuş nöronların eş etiketleme saptandı. Böylece, restaining işlemi etiketleme özgüllük kaybına yol değildir inanıyoruz.

Şekil önce immün boyamayı izleyen ve Bölüm montajı İkinci immün boyanma üzerinde karşılıklı olarak özel Belirteçleri arasında Overlap 4. eksikliği. (A - C) okla gösterilen yeşil (B) 'de bir ok ve CCK immunoreaktivitesi ile belirtilen kırmızı bir biocytin doldurulmuş nöron (A) gösteren 10X konfokal ve görüntüler. üst üste binme olmaması dikkat edin. Aynı bölüm 2 aydan fazla (C) sonra mavi immün parvalbumin (PV) için işlendi. ovgörüntülerin erlay D 'de gösterilmiştir. PV aksonlar beklenen örtüşmeyen desen molekül tabakasında CCK ile tanecik hücre katmanlarında dağıtılır unutmayın. Ayrıca nöron somata her iki işaretleyicinin bir yardımcı sınırlama olmaması not edin. sağa Yakınlaştırılmış görüntüler biocytin etiketli nöron PV (ok başı) ve CCK (ok) ifade ettiğini göstermektedir. Ölçek çubuğu: 100 mikron (A - D), 20 mikron (sağ paneller). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

doldurur sub-optimal biocytin için yaygın bir nedeni hücre yaklaşırken kayıt pipet ile nöronal süreçlerin yanlışlıkla kesilmesi olduğunu. Şekil 1 (yeşil ok) 'de gösterildiği gibi bir hücrenin bir kayıp uzantısı, bir akson sonunda biocytin bir kabarcığın olarak görünür. Aksonal bleb birkimin aksonlar dilimleme işlemleri sırasında kopmuş olabilir yüzeysel hücreler, yama çoğu zaman görüntülenmiştir yeniden. Ancak, dilimleme ve hedeflenen hücre sınıfının aksonal dağılım paterni bilgisi uçağın optimizasyonu bir akson bleb görünümü elde, ayrıca akson sever olabilir varsayılan akson, yönünden soma yaklaşan kaçınarak yardımcı olabilir . çoğu hücre tiplerinde, Z ekseni (işareti beyaz ok) boyunca hücre gövdesi yaklaşım tercih edilir. hücreyi yaklaşırken ikinci bir konu pipet aşırı pozitif basınç uygulanmasını ilgilidir. Bu sadece hücre ve bağlantılarını zarar değil, aynı zamanda yüksek eşiğe yol açan hücrenin çevresindeki dökmek için biocytin içeren iç çözümü neden olamaz. Hücreyi yaklaşım için harcanan zaman uzun veya arka plan boyama da artar dilim kalitesi hücresel morfoloji (Şekil 5A tanımlama yeteneği tehlikeye hangi optimal olmadığında). Pipet yerinden oynatmamaya ederken soma çekin mümkündür. Bu somatik morfoloji eksikliği (Şekil 5B) neden olur. hücreyi çekerek önlemek için, manipülatör "iyi" hareket ayarlarını kullanarak küçük adımlarla yukarı ve dışarı pipet hareket ettirin. Hücre uzun bir membran uzantısı, musluk / fiske ile pipet manipülatör bağlı görünüyorsa yavaşça hücreden pipet çıkarmak için. Hücre tamamen yerinden kadar kaba manipülatör ayarlarını kullanmaktan kaçının.

Şekil 5. Görüntüler Başarısız Biocytin doldurur Illustrate. Zayıf hücre görüş sonuçlanan kayıt pipet aşırı pozitif basınç, yüksek arka plan floresan gösteren (A) Görüntü. aksonlar dahil nöronal süreçlerin, ince yapıları, inci bölge ötesinde canlandırırlare dökülme. Ayrıca, soma çekti olmuştur dikkat edin. Soma ile (B) nöron pipet dekolmanı sırasında çıkardı. Oklar soma ise, akson ve dendritler başarılı dolguları göstermek ve oklar yakın kurtarıldı değil uzantıları. (C) dilim yüzeysel tabakasında yamalı bir hücre (yüzeyden <50 mikron) kesim akson ve dendrit (ok başları) sergileyen dolu hücrelerde sonuçları. Kötü hücre sağlığı (C) gösteren granül hücre dendritlerinin boncuk (oklar) dikkat edin. Ölçek çubuğu: 50 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Son olarak, kopmuş akson veya dendritler olmadan hücresel morfoloji kurtarmak için, o dilim yüzeyine derin hücre> 50 mikron hedef en iyisidir. Yüzeysel hücreler olan süreçleri olabilirkesilmiş ve sinaptik girdilerin normal tamamlayıcı olmayabilir.

tekrar boyama işlemlerinde en çok tuzaklar lamel çıkarılması ve dokuya zarar vermeden bölümün geri kazanımı ile ilgilidir. gece boyunca inkübe zaman ikinci bir konu, özellikle, kalın dokuya antikor penetrasyonu ile ilgilidir. Pek çok durumda, iyi nüfuz soğuk bir odaya yerleştirilmiş bir orbital çalkalayıcı üzerinde 4 ° C de en fazla 72 saat için primer antikor, inkübasyon yolu ile elde edilmiştir. ²⁴ nüfuz da antikor yardımcı olabilir% 1 Triton-X100 - Her ne kadar primer antikor inkübasyon süresi uzatan ya da 0.5 deterjan konsantrasyonunu arttırarak, doku antikor penetrasyon sağlamak için en etkili yöntemdir yeniden kesit. En kaydedilen nöronlar 50 içinde yer almaktadır beri - bölümün yüzeyinden 100 um, biz kalın kesitlerin boyanması biocytin etiketlemek için yeterli olduğunu bulmakBu seviyede -filled SOMATA veya işlemler. Ancak, antikor etiketleme ölçüde olumsuz ko-lokalizasyon sonuçları yorumlama önce her bölümde kontrol edilmesi tavsiye edilir.

Discussion

Protokol çerçevesinde kritik adımlar

biocytin ile yamalı hücreyi Dolum morfoloji tam iyileşme sağlamak için en önemli adımdır. Hücrenin tam iyileşme için, dilimleme sırasında süreçlerin kopardığınızı en aza indirmek için en uygun dilim yönünü seçmek için esastır. Bu yönelim, inceleme altındaki devre ve hücre tipine bağlı olarak farklılık gösterebilir. Daha sonra, biocytin dendrit ve akson yayılmaya için yeterli zaman tanımak esastır. Böyle neurobiotin gibi bazı boyalar, aynı zamanda gap junction aracılığıyla kaydedilmiş hücreye bağlanmış nöronlar nüfuz edebilir. pipet boyutu da soma açılış büyük ve pipet çok küçük olduğunda biocytin yükleme tehlikeye zaman dışarı çekilebilir eğilimi, optimize edilmesi gerekmektedir. Ayrıca, uygun prosedürler tam hücreli modundan avara ederken soma kurtarmak için gereklidir. 24 saat süre ile, kayıt enkübasyondan sonra,PBS, ardından% 4 PFA dilimlerinin dokuların çapraz bağlama immünohistokimya için de önemli olan, düşürülmesini sağlar. 4 ° C'de dilim depolanması da dilim bütünlüğünü korumak için çok önemlidir. Ancak, PFA uzun süreli depolama antikor etiketleme prosedürleri ile nihai başarısını azaltmaktadır. Kalın dokuda uygun penetrasyon için kuluçkalama 5 gün - bu bireysel antikorlar için farklı olacaktır ve bazı antikorlar, 3 isteyebilir primer antikor inkübasyon konsantrasyonu ve süresi optimize etmek önemlidir. Dilimler primer antikor boyama önce hasarsız olduğundan emin olmak için, yeterli bakım kapak kayma çıkarılması sırasında ihtiyaç vardır.

Değişiklikler ve Sorun Giderme

Biz birinci ve ikinci leke arasında hiçbir set süresi olduğunu gözlemledik. Bölümler aynı doku üzerinde birden fazla boya ile tekrar boyanmış ay sonra olmuştur. İçindeBizim son çalışmalar, biz bu kullanılarak standart immün protokolleri ile yeniden boyama yöntemi kullanılarak işlenir bölümleri karşılaştırıldı ve boyanma veya biocytin sağlamlığı ^6,9,25,26 doldurur hiçbir belirgin fark.

Bu, test edilecek devam ederken, yeniden boyama doku bütünlüğü tekrar kullanım için sınırlayıcı bir faktör olmak üzere birden fazla kez gerçekleştirilebilir mümkündür. ayrık fluorophores kullanılabilirliği de görüntülenebilir antijenler sayısı için bir sınır teşkil etmektedir. Bu nedenle, doku dikkat kullanımı tavsiye edilir. test edilecek kalır ek bir işlem (yüzey reseptörleri için) antijen kurtarma protokolleri kullanılarak tekrar boyama olduğunu. doku bütünlüğü kapak kayma çıkarıldıktan sonra korunur, biz prosedürü de antijen-kurtarma tavsiye protokolleri boyama çalışması gerektiğini bekliyoruz. Bu bağlamda, fizyolojik kayıtları genellikle bilinen nöro-kimyasal işaretlerin hücreleri elde bilindiği mümkün olmasa da, olası belirteçler için yeniden boyama morfolojisi ve elektriksel özellikleri temelinde tarif edilmiştir nöronlar için belirteçlerin tanımlanmasını kolaylaştırabilir.

Tekniğin Sınırlamalar

kalınlığında kesitler üzerinde immunohistokimyasal boyama performans ile ilişkili bir sınırlama özellikle primer antikor standart bir gecede inkübasyon ile, bölümün tam kalınlığı boyunca antikorun yetersiz penetrasyon olduğunu. Ayrıca, biocytin ortaya çıkarmak için kullanılan farklı antikorlar ve streptavidin, diferansiyel doku penetrasyonu olabilir. Nedenle, deneme çalışır antikor penetrasyon derinliğini değerlendirmek ve inkübasyon süreleri, sıcaklıkları değiştirmek için yapılır ve antikor ve Triton & # tavsiye edilir160; amacıyla X-100 konsantrasyonları, her bir antikor için uygun kesit nüfuz etme ve boyama elde etmek. Aynı zamanda, bir antikor ya da streptavidin biocytin ile başarılı markalama bir ikinci antikor bölümü aynı derinliğe kadar nüfuz edeceği anlamına gelmez unutulmamalıdır. Bu nedenle, bakım biocytin-etiketli hücre süreçleri nörokimyasal işaretleyici ile eş-lokalizasyonu için incelenir hangi düzeyine her bir antikorun nüfuz doğrulamak için dikkat edilmelidir. penetrasyon yetersiz ise, dilim immün için <60 mikron yeniden kesitli olabilir. dilim zaten biocytin için işlendi çünkü, hücrenin morfolojisi yeniden kesit sırasında anatomik Olası veri kaybını ortadan kaldırmak ve nöronal yeniden kolaylaştırmak için konfokal görüntüleme ile yakalanan olabilir ki, unutmayın. yaş ve hayvan türleri antikor penetrasyon derecesini değiştirebilir olabilir mümkün olsa da, başarıyla 30- sıçan dokusundaki bu prosedürleri kullandıkgündüz ve 60 günlük fareler üzerinde ve farelerde.

İkinci bir kısıtlama biocytin doğal floresan değildir ve kayıt sırasında canlı görüntüleme ve gerçek zamanlı morfolojik karakterizasyonu için kullanılamaz olmasıdır. Alternatif konjüge edilmemiş fluorophores ve Lucifer Yellow hücreleri ²⁷ canlı görüntüleme için kullanılmıştır. Bunlar kalıcı değildir ve kaydedilen nöronun post-hoc nörokimyasal tanımlama için bu pratik hale fiksasyon üzerine floresan kaybedersiniz. Son zamanlarda, biocytin sahip flüoroforlar, bu sınırlamayı aşmak için burada ayrıntılı olarak, canlı görüntüleme için yanı sıra, çift ya da üçlü-etiketleme post-hoc işlem için kullanılabilir tanıtılmıştır. Lucifer Yellow ²⁸ ile karşılaştırıldığında İlginç bir şekilde, şimdiye kadar, biocytin dolgular Birleştirilen elektrofizyolojik ve anatomik çalışmalar için daha iyi elektriksel ve boyama özellikleri ile sonuçlanmıştır.

Mevcut Göre Tekniği Önemi /alternatif Yöntemler

Burada ayrıntılı protokol kullanmanın önemli avantajları rezeksiyon aksine, biocytin dolu hücre yapısı ve süreçleri değişmeden kalır ve doku kalıcı kaybına yol açmaz, ne birden bölümden zahmetli rekonstrüksiyon için bir ihtiyaç, vardır. Bu nedenle, immunositokimya ve ardından tek hücreli bir dolgu morfolojik yeniden yapılanma ve belirli bir nöro-kimyasal işaretlerin belirlenmesine yardımcı olabilir.

Bu Tekniği Mastering sonra gelecek Uygulamalar veya Tarifi

Toplamda, biz morfolojisi ve sonrası-hoc çift ve elektrofizyolojik kayıtlar aşağıdaki nöronların üçlü immunolabeling kurtarma için yeni bir pratik bir yaklaşım sunmak. işlem bilgisi geliştikçe, daha önce doldurulmuş görselleştirilebilir ve görüntülenmiştir yeniden değerlendirilmesi nöronlar, yeni işaretleri bulmak için özellikle avantajlıdır. Bu T için özellikle avantajlıdır,O İmmünhistokimya doku ve antikorlar tasarruf hatta aylar sonra hafta gerçekleştirilen veya yapılabilir. yöntem, herhangi bir özel kimyasallar gerektirmez ve güvenli bir şekilde herhangi bir laboratuvarda yapılabilir.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
NaCl	Sigma	S7653	Immunostaining
KCl	Fluka	60129	Immunostaining
Na2HPO4	Sigma	S7907	Immunostaining
KH2PO4	Sigma	229806	Immunostaining
Triton X-100	Sigma	T8787	Immunostaining
Guinea pig anti CB1	Sigma	Af530-1	Immunostaining
Mouse anti CCK	CURE, UCLA	courtesy of G. Ohning	Immunostaining
Rabbit anti Parvalbumin	Swant	PV27	Immunostaining
Streptavidin, Alexa Fluor conjugate	Molecular Probes	S11227	Immunostaining
Normal goat serum (NGS)	Sigma	G9023	Immunostaining
Vectashield	Vector Labs	H-1000	Immunostaining
Secondary Antibodies	Invitogen Molecular probes	Alexa Fluor conjugated dyes	Immunostaining
Labnet orbit low speed shaker	Bioexpress	S-2030-LS	Immunostaining
Forceps	Dumont	11231-30	Immunostaining
Slide folders	EMS	71520	Immunostaining
Vibratome VT 1200 S	Leica	14048142066	Electrophysiology
Multiclamp 700B amplifier	Molecular devices	Multiclamp 700B	Electrophysiology
pCLAMP 10 Software	Molecular devices	pCLAMP 10	Electrophysiology
Digitizer	Molecular Devices	Digidata 1440 digitizer	Electrophysiology
Filter tips	Nalgene	171-0020	Electrophysiology
Sonicator	Fisher Scientific	15-335-100	Electrophysiology
Microloaders	Eppendorf	930001007	Electrophysiology
Biocytin	Sigma	B4261	Electrophysiology