Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Neurochemical मार्करों के लिए Biocytin-भरा और प्रसंस्कृत धारा के Immunostaining

Published: December 31, 2016 doi: 10.3791/54880
Automatic Translation
1, 2, 2, 2
1Graduate School of Biomedical Sciences, Rutgers New Jersey Medical School, 2Department of Pharmacology, Physiology and Neuroscience, Rutgers New Jersey Medical School

Summary

इस प्रोटोकॉल biocytin भरने और बाद प्रतिरक्षाऊतकरसायन postprocessing का उपयोग कर electrophysiological रिकॉर्डिंग के दौरान समझौता न्यूरॉन्स की रूपात्मक वसूली के लिए एक विधि प्रस्तुत करता है। हम बताते हैं कि मोटी biocytin से भरे वर्गों है कि दाग और coverslipped रहे थे एक दूसरे प्राथमिक एंटीबॉडी दिनों या महीनों बाद साथ restained जा सकता है।

Abstract

पैच दबाना तकनीक का उपयोग कोशिकाओं की electrophysiological रिकॉर्डिंग अलग neuronal फायरिंग पैटर्न पर आधारित प्रकार की पहचान के लिए अनुमति दी है। रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड में biocytin / Neurobiotin के शामिल किए जाने रूपात्मक विवरण, जो वृक्ष के समान द्रुमायण और क्षेत्रों दर्ज न्यूरॉन्स के axons द्वारा लक्षित निर्धारित करने के लिए आवश्यक हैं के पद अस्थायी वसूली परमिट। हालांकि, अलग नयूरोचेमिकल पहचान और कार्यों, सेल प्रकार विशिष्ट प्रोटीन के लिए immunohistochemical धुंधला के साथ आकृति विज्ञान के समान न्यूरॉन्स की उपस्थिति को देखते हुए निश्चित न्यूरॉन्स की पहचान करने के लिए आवश्यक है। नेटवर्क कनेक्टिविटी बनाए रखने के लिए, शारीरिक रिकॉर्डिंग के लिए मस्तिष्क वर्गों 300 माइक्रोन या अधिक से अधिक की मोटाई पर तैयार कर रहे हैं। हालांकि, इस मोटाई अक्सर एंटीबॉडी पैठ के साथ मुद्दों के कारण immunohistological postprocessing hinders, ऊतक के resectioning की जरूरत महसूस। स्लाइस की Resectioning एक चुनौतीपूर्ण कला है, अक्सर resulऊतकों और कोशिकाओं की आकृति विज्ञान के नुकसान में टिंग से electrophysiological डेटा प्राप्त हुई थी, डेटा को अनुपयोगी बताते हुए। आकृति विज्ञान डेटा हानि और neuronal मार्कर के चयन में गाइड की सीमा होती है की वसूली के बाद से, हम पहले सेल आकृति विज्ञान उबरने की रणनीति, माध्यमिक immunostaining द्वारा पीछा किया अपनाया है। हम शारीरिक रिकॉर्डिंग और आकृति विज्ञान की वसूली के लिए बाद में सीरियल immunostaining, नयूरोचेमिकल पहचान निर्धारित करने के लिए वर्गों के restaining के द्वारा पीछा के दौरान भरने biocytin लिए एक व्यावहारिक दृष्टिकोण का परिचय। हम रिपोर्ट है कि वर्गों है कि biocytin से भर गए, paraformaldehyde के साथ तय (पीएफए), दाग, और coverslipped हटा दिया है और एक दूसरे प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ दिन बाद restained जा सकता है। इस restaining coverslip के हटाने, एक बफर समाधान में वर्गों की धुलाई, और प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी के ऊष्मायन नयूरोचेमिकल पहचान उजागर करने के लिए शामिल है। विधि Dat को नष्ट करने के लिए फायदेमंद हैआकृति विज्ञान को ठीक करने में असमर्थता के कारण और नयूरोचेमिकल मार्कर के नीचे संकुचन के लिए एक नुकसान आकृति विज्ञान के आधार पर परीक्षण किया जाना है।

Introduction

मस्तिष्क अपने व्यक्तिगत न्यूरोनल तत्वों की संरचनात्मक और कार्यात्मक विशेषताओं में विविधता के लिए जाना जाता है। मस्तिष्क समारोह और विकृति में अलग neuronal प्रकार की भूमिकाओं को समझना लक्षण और न्यूरॉन्स की स्पष्ट पहचान की आवश्यकता है। संरचनात्मक, रूपात्मक सुविधाओं somato-वृक्ष के समान स्थान के आधार पर परिभाषित किया गया, संभावित जानकारी है कि एक दिया न्यूरॉन प्राप्त निर्धारित जबकि axonal द्रुमायण के पैटर्न संभावित पोस्टअन्तर्ग्रथनी लक्ष्यों को पहचानती है। न्यूरॉन्स की संरचनात्मक विविधता रेमन y Cajal के मौलिक ऊतकीय अध्ययनों 1 के दिनों से सराहना की गई है। एकल कोशिका रिकॉर्डिंग तकनीकों के आगमन से पता चला है कि संरचनात्मक रूप से अलग न्यूरॉन्स भी फायरिंग पैटर्न और synaptic विशेषताओं में मतभेद दिखा। संरचना और शरीर विज्ञान में विविधता GABAergic निरोधात्मक न्यूरॉन्स 2,3 में विशेष रूप से स्पष्ट है। इसके अलावा, यह है कि structurall तेजी से स्पष्ट हो गया हैY समान न्यूरॉन्स अलग नयूरोचेमिकल मार्कर के और दिखाने के लिए इसी 4 कार्यात्मक मतभेद व्यक्त कर सकते हैं। इसी तरह, एक ही नयूरोचेमिकल मार्कर के साथ न्यूरॉन्स अलग संरचना और कार्य 5-10 हो सकता है। इस प्रकार, व्यवहार में, नेटवर्क में न्यूरॉन्स की कार्यात्मक विशेषताओं का विश्लेषण और उनकी भूमिका दोनों रूपात्मक और नयूरोचेमिकल पहचान को परिभाषित करने पर जोर देता। यहाँ तक कि संवाददाता माउस विशिष्ट नयूरोचेमिकल मार्कर को निशाना लाइनों के आगमन के साथ, यह अक्सर immunohistology 11 के आधार पर आकृति विज्ञान और उप प्रकार पहचान निर्धारित करने के लिए आवश्यक है।

मानक तीव्र मस्तिष्क स्लाइस में दर्ज की कोशिकाओं को चिह्नित करने के लिए इस्तेमाल किया विधि, रिकॉर्डिंग के दौरान biocytin या Neurobiotin साथ उन्हें भरने paraformaldehyde में वर्गों (पीएफए) रिकॉर्डिंग के बाद ठीक है, और आकृति विज्ञान और neurochemistry प्रकट करने के लिए immunohistochemistry का उपयोग करने के लिए है। टुकड़ा शरीर क्रिया विज्ञान के लिए वर्गों की मोटाई के बाद आम तौर पर 300 माइक्रोन हैंया अधिक है, और क्योंकि ज्यादातर एंटीबॉडी कि गहराई के माध्यम से सभी तरह घुसना करने में विफल है, स्लाइस biocytin और नयूरोचेमिकल मार्कर 12-14 के लिए एक साथ immunostaining के लिए अनुमति देने के लिए 60 माइक्रोन या कम करने के लिए फिर से sectioned किए जाने की जरूरत है। दुर्भाग्य से, resectioning श्रमसाध्य है; सेक्शनिंग के दौरान ऊतक के नुकसान के जोखिम; और रूपात्मक पुनर्निर्माण उलझी ऊतक संकोचन करने के लिए अंतर पैदा कर सकते हैं। इसके अतिरिक्त, आकृति विज्ञान के पूर्व ज्ञान के उम्मीदवार मार्करों कि कोशिकाओं द्वारा व्यक्त किए जाने की संभावना है नीचे संकीर्ण मदद कर सकता है। हम मानक biocytin immunohistology प्रोटोकॉल को संशोधित किया है आकृति विज्ञान की वसूली के लिए और पहले तो संभावित नयूरोचेमिकल मार्कर की पहचान के लिए वर्गों के धारावाहिक प्रसंस्करण की अनुमति है।

Immunohistochemistry ऊतकों या कोशिकाओं में प्रतिजन वितरण का अध्ययन किया जाता है और एक एंजाइम, फ्लोरोसेंट लेबल, रेडियोधर्मी तत्वों, या सोने के कणों कोलाइड 15 का उपयोग कर देखे जा सकते हैं। प्रक्रिया मैंप्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग विशेष रूप से टैग और एक या एक से अधिक विशिष्ट एंटीजन, दृश्य के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी को निशाना फ्लोरोसेंट माध्यमिक एंटीबॉडी के उपयोग के बाद बढ़ाना nvolves। ओवरलैप के बिना प्रत्येक माध्यमिक एंटीबॉडी के प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रा अलग की जरूरत के कारण, केवल एंटीजन की एक सीमित संख्या में एक साथ जांच की जा सकती है। इस प्रकार, आकृति विज्ञान के पूर्व ज्ञान सेल वर्गीकरण के लिए उम्मीदवार नयूरोचेमिकल मार्कर का चयन करने में उपयोगी हो सकता है। धारणा, पहले से ही दाग वर्गों के धारावाहिक प्रसंस्करण के पीछे तर्क आधार यह है कि एक प्रोटीन या पेप्टाइड के लिए immunolabeling एक संरचनात्मक रूप से स्वतंत्र पेप्टाइड 16 के लिए प्रतिजनकता और बाद immunolabeling के साथ हस्तक्षेप नहीं करना चाहिए पर आधारित है। हस्तक्षेप की यह कमी एक प्रतिजन पर एक विशेष प्रोटीन मिलान के लिए एंटीबॉडी के बंधन की वजह से है और इसलिए एक ही ऊतक में कई एंटीजन के एक साथ धुंधला के लिए अनुमति देता है। एंटीजन की संख्या revealeडी immunostaining द्वारा फ्लोरोसेंट माध्यमिक एंटीबॉडी के गैर अतिव्यापी स्पेक्ट्रा के लिए जरूरत से और इतने के रूप में पार जेट 17,18 समाप्त करने के लिए विभिन्न प्रजातियों में उठाया एंटीबॉडी के साथ अलग-अलग एंटीजन लक्ष्य की जरूरत द्वारा सीमित है। हालांकि यह दो अलग एंटीबॉडी कि हमारे ज्ञान करने के लिए बातचीत कर सकते हैं, एक दूसरे प्रतिजन के लिए मुहिम शुरू की immunostaining वर्गों पर एक या एक से अधिक एंटीजन के लिए immunolabeling के पूरा होने के बाद सूचना नहीं किया गया है के साथ धारावाहिक के बजाय एक साथ लेबलिंग के पीछे तर्क है। यहाँ, हम पहले से सना हुआ और घुड़सवार वर्गों के धारावाहिक immunostaining के लिए एक विधि का वर्णन। जब तक हम आकृति विज्ञान की वसूली मोटी वर्गों में प्रोटीन / पेप्टाइड मार्करों के लिए धुंधला द्वारा पीछा के लिए एक सीरियल immunolabeling प्रक्रिया के लिए इस प्रक्रिया को विस्तार से, एक ही प्रक्रियाओं मानक में, पतली ऊतकीय वर्गों के रूप में अच्छी तरह से इस्तेमाल किया जा सकता है। इसके अलावा, हम biocytin और इस प्रक्रिया को बेदखल करने के साथ दर्ज न्यूरॉन्स को भरने के लिए एक व्यावहारिक दृष्टिकोण का वर्णनके रूप में हमारे हाल ही में काम 6,8 में प्रस्तुत रिकॉर्डिंग के पूरा होने पर सेल से इलेक्ट्रोड, axonal और न्यूरॉन्स के वृक्ष के समान arbors के भरने के अनुकूलन के लिए।

प्रक्रिया यहाँ वर्णित का सबसे महत्वपूर्ण लाभ यह है कि दर्ज सेल की आकृति विज्ञान पूरी तरह से ठीक किया जा सकता है और लकीर करने के लिए या स्लाइस immunostain प्रयास करने से पहले छवि उतारी है। कुछ एंटीबॉडी के प्रवेश के साथ मुद्दों को यह माध्यमिक immunostaining के लिए लकीर स्लाइस करने के लिए आवश्यक प्रदान कर सकते हैं हालांकि, प्रक्रियाओं यहाँ विस्तृत कई वर्गों से जटिल न्यूरॉन्स फिर से संगठित करने की आवश्यकता को समाप्त होगा और ऊतकों को नुकसान और अंतर सिकुड़न के कारण मुद्दों से बचना होगा, जो पुनर्निर्माण समझौता कर सकते हैं resectioning के बाद। एक अतिरिक्त लाभ यह है कि इस प्रक्रिया immunostaining और स्लाइस, जिसमें biocytin से भरे न्यूरॉन्स बरामद कर रहे हैं करने के लिए फिर से सेक्शनिंग सीमित द्वारा लागत, समय, प्रयास और महंगा एंटीबॉडी कम हो जाएगा। सबसे अधिक व्यावहारिक पहलू विज्ञापनपारंपरिक immunostaining कि ऊपर उल्लिखित तकनीक का उपयोग करने से पहले वर्गों दाग महीने पर किया जा सकता है। विशेष रूप से, आकृति विज्ञान की वसूली में काफी क्षमता है कि कोशिकाओं से शारीरिक डेटा सेल प्रकार की एक बुनियादी रूपात्मक लक्षण वर्णन प्राप्त करने में असमर्थता के कारण खारिज कर दिया है कम होगी।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. इलैक्ट्रोफिजियोलॉजी दौरान Biocytin भरने

नोट: पाठकों बुनियादी पैच दबाना रिकॉर्डिंग तकनीकों और इंस्ट्रूमेंटेशन 19-22, जो यहाँ पर सविस्तार नहीं कर रहे हैं के लिए वैकल्पिक स्रोतों का उल्लेख कर सकते हैं। कदम यहाँ विस्तृत मानते हैं कि उपकरण और पैच दबाना रिकॉर्डिंग के लिए प्रक्रियाओं को पहले से ही स्थापित कर रहे हैं, और विवरण biocytin भरने और बाद तदर्थ immunostaining से संबंधित जानकारी के लिए प्रतिबंधित कर दिया जाएगा। इस पांडुलिपि में उल्लिखित सभी प्रयोगों चूहों पर प्रदर्शन किया गया।

  1. 350 माइक्रोन 23 - एक vibratome का उपयोग, 300 की मोटाई में वांछित क्षेत्र का जीना मस्तिष्क वर्गों तैयार करते हैं।
  2. आंतरिक समाधान 6 के 1 एमएल biocytin के 2 मिलीग्राम जोड़कर 0.2% biocytin युक्त एक आंतरिक समाधान तैयार है। सर्वोत्तम परिणामों के लिए, 10 के लिए आंतरिक समाधान sonicate - 15 मिनट तक biocytin पूरी तरह घुल। अगले, एक 1 एमएल सिरिंज एक 0.2 और साथ सज्जित में आंतरिक समाधान लोड# 160; माइक्रोन रोमकूप आकार polypropylene फिल्टर टिप एक microloader से जुड़ी। एक ठंडा पैक पर इस लोडिंग सिरिंज रखें आंतरिक समाधान में एमजी-एटीपी और ना जीटीपी की स्थिरता को बनाए रखने के लिए।
    नोट: एक आंतरिक समाधान युक्त पोटेशियम gluconate (126 मिमी कश्मीर gluconate, 4 मिमी KCl, 10 मिमी HEPES, 4 मिमी मिलीग्राम एटीपी, 0.3 मिमी ना-जीटीपी, और 10 मिमी phosphocreatine) कुछ नयूरोचेमिकल मार्कर की वसूली के लिए इष्टतम है, immunolabeling दौरान parvalbumin भी शामिल है। हमारे अनुभव में, cesium- और क्लोराइड आधारित आंतरिक समाधान का उपयोग कर कुछ नयूरोचेमिकल मार्करों के लिए immunostaining ठीक करने की क्षमता कम कर देता है। Neurobiotin या एक सेल impermeant, फिक्स, ध्रुवीय biocytin साथ एक एलेक्सा Fluorophore के संयोजन दरियाफ्त एक वैकल्पिक biocytin के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।
  3. अवरक्त अंतर हस्तक्षेप विपरीत तहत, रिकॉर्डिंग के लिए उपयुक्त कक्ष कल्पना। अक्षतंतु के किसी व्यवधान को कम करने के लिए, अपनी धुरी "दृष्टिकोण" एफ का उपयोग कर के साथ पिपेट को कम से सेल शरीर दृष्टिकोणगर्मजोशी सबसे micromanipulators में उपलब्ध है। पैच दबाना शरीर क्रिया विज्ञान प्रोटोकॉल 19-22 का उपयोग कर अवरक्त अंतर हस्तक्षेप विपरीत तहत पूरे सेल रिकॉर्डिंग स्थापित करना।
    नोट: के रूप में यह अक्षतंतु, कटौती अंत (चित्रा 1 में हरा तीर) पर एक छाला के रूप में कल्पना की तोड़ होगा ख्यात अक्षतंतु की दिशा से आ रहा सेल से बचें। इसके अलावा, रिकॉर्डिंग पिपेट करने के लिए उच्च सकारात्मक दबाव लागू करने, जबकि biocytin का रिसाव, जो उच्च पृष्ठभूमि धुंधला में परिणाम होगा कम करने के लिए सेल के करीब पहुंच से बचें।

आकृति 1
चित्रा 1. Biocytin भर के लिए कोशिकाओं आ लिए विमान गए। छवि (594 संयुग्मित streptavidin का उपयोग कर लाल रंग में) एक छोटा दाना सेल (जीसी) रिकॉर्डिंग है कि biocytin प्रकट करने के लिए संसाधित किया गया है के दौरान biocytin के साथ भरने को दिखाता है। जीसी अपनी डेन्ड्राइट XY विमान में उन्मुख है। सूचना है कटे दाना सेलअक्षतंतु (हरी तीर) XY विमान के साथ पिपेट आंदोलन की वजह से। ध्यान दें कि यह xz विमान के साथ इस न्यूरॉन दृष्टिकोण करने के लिए आदर्श है। स्केल पट्टी: 50 माइक्रोन।

  1. वोल्टेज दबाना विन्यास में, छोटे (5 एम वी) के लिए पूरे सेल समाई और श्रृंखला प्रतिरोध जवाब में, संक्षिप्त (30 एमएस) वोल्ट का निर्धारण एक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी डाटा अधिग्रहण और विश्लेषण सॉफ्टवेयर में स्नान मोड में झिल्ली परीक्षण समारोह का उपयोग कर का उपयोग कर कदम। इस पूरे सेल रिकॉर्डिंग शर्तों की स्थापना सुनिश्चित biocytin भरने के लिए अनुमति देने के लिए होगा।
  2. या तो current- या वोल्टेज दबाना मोड में शारीरिक रिकॉर्डिंग आचरण के रूप में की जरूरत है। 34 डिग्री सेल्सियस पर> 10 मिनट की एक न्यूनतम रिकॉर्डिंग समय आदर्श है।
    नोट: अब रिकॉर्डिंग बार कमरे के तापमान पर प्रदर्शन अध्ययन के लिए आवश्यक हो सकता है।
  3. शारीरिक रिकॉर्डिंग के पूरा होने पर, धीरे-धीरे छोटे चरणों में रिकॉर्डिंग पिपेट चलती है, ऊपर की ओर बारी (जेड अक्ष के साथ) द्वारा पैच दबाना विन्यास को फिर से स्थापित औरजावक वोल्टेज दबाना मोड में (एक्स अक्ष के साथ)।
  4. इसके साथ ही "झिल्ली परीक्षण" समारोह का उपयोग कैपेसिटिव यात्रियों के नुकसान और एक सीधी रेखा को वर्तमान प्रतिक्रियाओं के पतन कल्पना करने के लिए समाई और इनपुट प्रतिरोध की निगरानी, ​​सेल की फिर से सील और एक बाहर-बाहर की स्थापना का संकेत पिपेट नोक पर पैच। एक depolarized क्षमता (-40 एम वी) पर सेल होल्डिंग फिर से सीलिंग प्रक्रिया की सुविधा होगी।
    नोट: एक सेल को हटाने के लिए यह प्रक्रिया आम तौर पर सोम और dendrites की पूरी वसूली सुनिश्चित करता है। इस प्रक्रिया के दौरान या जब पिपेट से सेल detaching रिकॉर्डिंग पिपेट करने के लिए सकारात्मक दबाव लागू न करें। टुकड़ा में दर्ज सेल की सोमा के दृश्य सफल मुक्ति इंगित करता है। सेलुलर मलबे या अलग टिप के अंत में एक झिल्ली पैच की उपस्थिति आम तौर पर सोमा की अव्यवस्था को इंगित करता है और पूरा सेलुलर आकारिकी नहीं निकलेगा।
  5. पिछाड़ीबाहर का वृक्ष के समान और axonal प्रक्रियाओं के लिए डाई का परिवहन सुनिश्चित करने के लिए 5 मिनट - एर सेल से पिपेट detaching, 3 के लिए रिकॉर्डिंग कक्ष में टुकड़ा बरकरार रहती है।
  6. एक 24 अच्छी तरह से थाली निर्धारण के लिए 4% पीएफए ​​युक्त करने के लिए स्लाइस स्थानांतरण।
    चेतावनी: पीएफए कैंसर, और दस्ताने और एक चेहरे नकाब सहित उपयुक्त व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण, है, त्वचा में जलन और साँस लेना से बचने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए। पीएफए ​​ज्वलनशील है और आग की पहुंच से बाहर रखा जाना चाहिए। पीएफए ​​नाली में के बारे में नहीं निपटाया जाता है और रासायनिक अपशिष्ट के रूप में एकत्र किया जाना चाहिए। पीएफए ​​निर्धारण हस्तांतरण pipettes सहित रहते टुकड़ा तैयारी के लिए उपयोग शरीर क्रिया विज्ञान की स्थापना के संक्रमण से बचने के क्षेत्रों से अलग किया जाना चाहिए।
  7. 24 - 48 घंटे पीएफए ​​निर्धारण के बाद, immunostaining से पहले भंडारण के लिए 0.1 एम फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के लिए स्लाइस हस्तांतरण।
    नोट: आदर्श रूप में, वसूली और immunostaining biocytin सबसे अच्छा है जब जल्द ही निर्धारण के बाद प्रदर्शन कर रहे हैं, हालांकि धुंधला प्रति निर्धारण पैदावार अच्छे परिणाम के 7 डी के भीतर का गठन। निर्धारण के बाद करने के लिए और 90 से अधिक दिनों तक प्रदर्शन किया धुंधला के लिए 0.05% सोडियम azide - स्लाइस 0.02 के साथ पीबीएस में बनाए रखा जा सकता है। हालांकि पीएफए ​​में रात भर निर्धारण सबसे एंटीबॉडी के लिए अच्छी तरह से काम करता है, यह है कि कुछ एंटीबॉडी सबसे अच्छा काम जब लगानेवाला में ऊष्मायन की अवधि कम हो जाता है संभव है। 48 से अधिक घंटे के लिए पीएफए ​​में नियतन एंटीजन की उपलब्धता कम कर देता है और नयूरोचेमिकल मार्करों के लिए सफल माध्यमिक immunostaining की संभावना कम हो।
    चेतावनी: सोडियम azide बेहद खतरनाक और घूस या साँस लेना त्वचा या आंखों के साथ या पर संपर्क पर एक अड़चन है। गंभीर अधिक जोखिम मौत हो सकती है। कर्कटजननशीलता और परिसर के Mutagenicity नहीं जाना जाता है। दस्ताने, छप चश्मे, एक प्रयोगशाला कोट, और एक धूल श्वासयंत्र सहित उपयुक्त व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण का प्रयोग करें। सोडियम azide कभी नहीं नाली में निपटाया जाता है और रासायनिक अपशिष्ट के रूप में एकत्र किया जाना चाहिए।
e_title "> 2। पहले प्राथमिक एंटीबॉडी और Biocytin का धुंधला

(पहला दिन)
नोट: निम्न immunostaining प्रक्रिया मुक्त अस्थायी वर्गों के लिए है और सभी ऊष्मायन चरणों के लिए एक प्रकार के बरतन पर एक कम गति (2 क्रांतियों / मिनट, आरपीएम) पर झटकों निरंतर आवश्यकता है।

  1. 0.1 एम पीबीएस (पीएच = 7.4) में 10 मिनट प्रत्येक के लिए ऊतक 3x धो लें।
    नोट: 0.1 एम पीबीएस व्यावसायिक रूप से खरीदा जा सकता है या बनाया प्रयोगशाला में इस प्रकार के रूप में (बनाता है 1 एल): सोडियम क्लोराइड की 8 ग्राम, KCl की 0.2 ग्राम, ना 2 4 HPO की 1.44 ग्राम, और के.एच. 2 के 0.24 छ पीओ 4 में 1 DH 2 0 एल।
    नोट: वांछित नयूरोचेमिकल मार्कर जाना जाता है, एक प्रोटीन के लिए धुंधला / पेप्टाइड एक साथ biocytin धुंधला के साथ किया जा सकता है (2.2 कदम - 2.4)। अगर केवल biocytin लिए धुंधला हो जाना, कदम दर 2.5 आगे बढ़ें।
  2. वैकल्पिक: 10% अवरुद्ध सीरम के साथ ब्लॉक (बी, सामान्य बकरी सीरम (NGS) आरटी पर 1 घंटे के लिए पीबीएस में 0.3% ट्राइटन X-100 में पतला)।
    नोट: प्रत्येक अच्छी तरह से करना चाहिएसमाधान का एक ही मात्रा प्राप्त; 500 μL / अच्छी तरह से - सिफारिश की मात्रा 250 के बीच है। अवरुद्ध सीरम का चयन प्रजातियों जिसमें माध्यमिक एंटीबॉडी उठाए गए हैं (जैसे, NGS डाई संयुग्मित बकरी विरोधी (संबंधित प्राथमिक एंटीबॉडी प्रजाति) के लिए प्रयोग किया जाता है) पर आधारित है। जरूरत के विभिन्न प्रजातियों में उठाया वर्गों immunostain के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग करने के लिए पैदा होती है, कदम (2) को रोकने में प्रत्येक सामान्य सीरम का 10% और प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी ऊष्मायन चरणों के लिए प्रत्येक सामान्य सीरम का 3% शामिल हैं।
  3. (वैकल्पिक) प्राथमिक एंटीबॉडी में वर्गों सेते हैं, सीबी 1 आर (पॉलीक्लोनल, गिनी पिग) आर टी ओ / एन पर 0.1 एम पीबीएस में 0.3% ट्राइटन X-100, और 3% बी एस के साथ। सीबी 1 आर cannabinoid रिसेप्टर टाइप 1 अभिव्यक्ति की पहचान के लिए प्रयोग किया जाता है।
    नोट: यह कदम वैकल्पिक है और biocytin भरने प्रकट करने की आवश्यकता नहीं। चित्रा 2 एक खंड प्रथम धुंधला प्रक्रिया के दौरान biocytin और सीबी 1 आर के लिए लेबल को दिखाता है। हे / एन incuआरटी पर bation प्राथमिक एंटीबॉडी के अधिकांश के लिए पर्याप्त है; ऊष्मायन के 5 डी - हालांकि, सहित सीबी 1 आर निश्चित प्राथमिक एंटीबॉडी, 3 की आवश्यकता है। ऊष्मायन होने के लिए अब से 1 डी की जरूरत है, यह 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं क्योंकि ट्राइटन X-100 स्लाइस permeabilize कर सकते हैं और कमरे के तापमान पर लंबे समय तक गर्मी के दौरान ऊतक के विघटन के लिए नेतृत्व कर सकते हैं सिफारिश की है। माध्यमिक एंटीबॉडी की विशिष्टता के लिए एक नियंत्रण के रूप में प्रयोगों के प्रत्येक श्रृंखला के लिए कम से कम एक खंड में प्राथमिक एंटीबॉडी की कमी एक नकारात्मक नियंत्रण शामिल हैं। नकारात्मक नियंत्रण के लिए, प्राथमिक एंटीबॉडी छोड़ दिया जाता है, लेकिन 0.1 एम पीबीएस में 0.3% ट्राइटन X-100 और बी एस जोड़ रहे हैं।

चित्र 2
चित्रा 2. सफल CCK धुंधला 1 Biocytin धुंधला और सी की वसूली के बाद सप्ताह annabinoid रिसेप्टर टाइप 1 (सीबी 1 R) - <strong> लेबलिंग। (ए - सी) 60X पर Confocal छवियों biocytin से भरे न्यूरॉन (ए) और सीबी 1 आर immunoreactivity (बी), नोक ने संकेत दिखा। एक ही अनुभाग 1 सप्ताह (सी) के बाद CCK immunostaining के लिए संसाधित किया गया था। छवियों के ओवरले डी में दिखाया गया है। CCK immunoreactivity दूर लाल का उपयोग कर पता चला था और सियान में छद्म रंग का था। (ई) ए नोट में biocytin से भरे सेल की रूपात्मक पुनर्निर्माण कि biocytin और सीबी 1 आर धुंधला दूसरी CCK immunostaining के बाद भी स्पष्ट कर रहे हैं। इसके अलावा सीबी 1 आर और CCK immunostaining पैटर्न की उम्मीद वितरण ध्यान दें। (एफ - एच) सेल से अक्षतंतु का बढ़ाया छवि, एक के रूप में, शो बंद biocytin के सह स्थानीयकरण और एक्सोन में सीबी 1 आर (तीर सिर)। स्केल पट्टी: 50 माइक्रोन (ए - डी), 100 माइक्रोन (ई), और 10 माइक्रोन ( एट अल से reproduced हैं। 2015 9। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

(दूसरा दिन)

  1. 0.1 एम पीबीएस (पीएच = 7.4) में मस्तिष्क वर्गों 10 मिनट प्रत्येक के लिए 3x धो लें।
  2. streptavidin लाल रंग साधना में वर्गों सेते (एकाग्रता: 1: 1,000; उत्तेजना: दिखाई लाल स्पेक्ट्रम में उत्सर्जन के साथ 594 एनएम) 4 डिग्री सीओ पर 0.1 एम पीबीएस में 0.3% ट्राइटन X-100 और 3% बी एस के साथ / एन में अंधेरे (एल्यूमीनियम पन्नी में लपेटा) biocytin प्रकट करते हैं। यदि 2.3 कदम में वैकल्पिक प्राथमिक ऊष्मायन के बाद: (488 एनएम और हरे रंग में उत्सर्जन उत्तेजना 500: 1 एकाग्रता), ऊपर ऊष्मायन के साथ: वैकल्पिक एक माध्यमिक एंटीबॉडी, बकरी विरोधी गिनी पिग शामिल करें।
    नोट: माध्यमिक एंटीबॉडी की जरूरत होगी ही अगर वैकल्पिक प्राथमिक एंटीबॉडी धुंधला (2.3 कदम) किया जाता है। biocytin कल्पना करने के लिए, एक streलाल रंग में एक उत्सर्जन स्पेक्ट्रम के साथ ptavidin-fluorophore साधना की सिफारिश की है, के रूप में यह विस्तार से और (आंकड़े 1 - 3) बेहतर विपरीत के साथ महीन एक्सोन कल्पना करने के लिए मदद करता है। डबल या ट्रिपल immunostaining के दौरान, ताकि एक दूसरे के साथ माध्यमिक एंटीबॉडी के पार जेट से बचने के लिए, माध्यमिक एंटीबॉडी एक के बाद एक एक सीरियल फैशन (एंटीबॉडी के धारावाहिक जोड़ के बीच 2 घंटे के अंतराल पर्याप्त है) में जोड़ें। चित्रा 3A एक biocytin से भरे सेल वैकल्पिक प्राथमिक एंटीबॉडी धुंधला बिना संसाधित और resectioning करने से पहले imaged को दिखाता है।

चित्र तीन
चित्रा 3. Biocytin आकृति विज्ञान और Resectioning बरामद होने के बाद सफल दूसरे Immunostaining। (A1) Confocal एक biocytin से भरे सेल के वृक्ष के समान आकृति विज्ञान की वसूली दिखा एक 300 माइक्रोन टुकड़ा की छवि। (<500 और -100 पीए वर्तमान इंजेक्शन के जवाब में न्यूरॉन की मजबूत> A2) झिल्ली वोल्टेज निशान। (बी) के बढ़ते और इमेजिंग के बाद एक 50 माइक्रोन धारा 300 माइक्रोन धारा (A1 में) resectioning के बाद प्राप्त में biocytin से भरे सोमा की वसूली। (बी 2) पतली धारा के बाद immunostaining CCK (मध्यम पैनल) के साथ biocytin से भरे सोमा (सही पैनल) की colocalization का पता चला। मर्ज किए गए छवि सही पैनल में सचित्र है। स्केल पट्टी: 50 माइक्रोन। पैनल ए 2 यू एट अल से अनुमति के साथ reproduced है। , प्रेस 25 में। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

(तीसरा दिन)

  1. धो मस्तिष्क वर्गों 0.1 एम पीबीएस (पीएच = 7.4) में 10 मिनट प्रत्येक के लिए 3x।
  2. प्रतिदीप्ति की रक्षा के लिए और भविष्य में फिर से धुंधला की सुविधा के लिए, सेकंड माउंटएक जलीय आधारित बढ़ते मध्यम में माहौल और स्पष्ट नेल पॉलिश के साथ coverslip के किनारों को सील।
    नोट: यह वर्गों restain करने के लिए जितनी जल्दी हो सके गिलास स्लाइड से बढ़ते मध्यम के रिसाव के कारण स्लाइड, मिट्टी प्रकोप, और ऊतकों की निर्जलीकरण से नेल पॉलिश को दूर करने में कठिनाइयों से बचने के लिए सबसे अच्छा है। माइक्रोबियल संदूषण पीबीएस में 0.02% सोडियम azide का उपयोग करके रोका जा सकता है।
    चेतावनी: सोडियम azide अत्यधिक विषाक्त और ज्वलनशील है जब यह पानी के साथ संपर्क में है। हैंडलिंग और खतरनाक रसायनों के निपटान के लिए मानक संचालन प्रक्रियाओं को देखें।
    (Days 4 - 7)
  3. 594 और 488 एनएम और 20X या 40X के एक बढ़ाई लाल और नयूरोचेमिकल मार्कर (सीबी 1 आर) हरे रंग में में biocytin से भरे न्यूरॉन्स प्रकट करने पर उत्तेजना के साथ confocal इमेजिंग प्रदर्शन। (चित्रा 2) colabeling का आकलन करें।
  4. कम से कम 100 एमएस करने के लिए कैमरा जोखिम सेट photobleaching और obta से बचने के लिएपूरे न्यूरॉन की axonal और वृक्ष के समान arbors के confocal छवि के ढेर में। confocal छवि के ढेर और न्यूरॉन ट्रेसिंग सॉफ्टवेयर संकुल का उपयोग न्यूरोनल आकृति विज्ञान को फिर से संगठित करने के लिए।

3. दूसरी प्राथमिक एंटीबॉडी का धुंधला

नोट: दूसरी immunostaining कदम पहले धुंधला के बाद किया जा सकता है जबकि 90 डी, इष्टतम धुंधला अगर दूसरी प्राथमिक एंटीबॉडी धुंधला भीतर 7 किया जाता हासिल की है - 10 घ।

(7 के बाद - 90 घ)

  1. एक कपास झाड़ू के लिए एसीटोन लागू करें और गिलास स्लाइड के बंद नेल पॉलिश पट्टी।
  2. coverslip ध्यान से निकालें ठीक टिप संदंश का उपयोग और वर्गों पर 0.1 एम पीबीएस की कुछ बूंदों डाल दिया।
  3. ध्यान से ठीक एक पेंट ब्रश का उपयोग स्लाइड से वर्गों को हटाने और उन्हें 24 के लिए 0.1 एम पीबीएस में धो - 4 ओ सी पर एक प्रकार के बरतन कम रोशनी में एल्यूमीनियम पन्नी में कवर पर 48 ज
    नोट: यह एक साथ वर्गों को कवर करने के लिए महत्वपूर्ण हैluminum पन्नी photobleaching से बचने के लिए।
  4. 2x अगले दिन पर 0.1 एम पीबीएस में 10 मिनट प्रत्येक के लिए - बढ़ते मध्यम से पूरी तरह हटाने सुनिश्चित करने के लिए, 1 वर्गों धो लें।
  5. दूसरी प्राथमिक एंटीबॉडी में ऊष्मायन के साथ आगे बढ़ें (जैसे, cholecystokinin, एक neuropeptide कुछ GABAergic interneurons (CCK में पाया; एकाग्रता: माउस मोनोक्लोनल एंटीबॉडी) 1,000: 1) 1 डी (चित्रा 2) के लिए।
    नोट: यह प्रक्रिया कदम करने के लिए 2.3 समान है, लेकिन एक अलग एंटीबॉडी का उपयोग करता है। इसके अतिरिक्त, अवरुद्ध कदम फिर से धुंधला दौरान छोड़ा जाता है।
  6. मस्तिष्क वर्गों 0.1 एम पीबीएस (पीएच = 7.4) में 10 मिनट प्रत्येक के लिए तीन बार धोएं।
  7. fluorophore संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी बकरी विरोधी माउस के साथ दाग (एकाग्रता: 1: 500; उत्तेजना तरंगदैर्ध्य: 647 एनएम), सुनिश्चित करें कि माध्यमिक एंटीबॉडी की उत्तेजना उत्सर्जन स्पेक्ट्रा streptavidin (एकाग्रता के साथ ओवरलैप नहीं कर रही है: 1: 1,000; उत्तेजना तरंगदैर्ध्य: 594 एनएम) और पूर्व immunofluorescenceदाग।
  8. जलीय बढ़ते मध्यम वर्गों में माउंट और स्पष्ट नेल पॉलिश के साथ कवर पर्ची के किनारों को सील।
    नोट: प्रतिदीप्ति की रक्षा के लिए एक अपारदर्शी भंडारण बॉक्स में 4 डिग्री सेल्सियस पर वर्गों स्टोर।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

सफल समापन पर, वर्गों biocytin भरने और immunolabeling चरण 2 में प्रदर्शन किया और confocal या epifluorescence माइक्रोस्कोपी का उपयोग imaged किया जा सकता बरकरार रहती है। इसके अलावा, संसाधित वर्गों भी प्रतिजन चरण 3 में बाद के प्रसंस्करण के दौरान लेबल अनुभाग चित्रा 2 में सचित्र में लिए immunostaining दिखाएगा, एक मोटी धारा (300 माइक्रोन) में एक biocytin से भरे न्यूरॉन की आकृति विज्ञान streptavidin का उपयोग कर पता चला था लाल और पहले प्राथमिक (सीबी 1 आर) में कल्पना की हरे रंग में कल्पना की। पहले immunostaining पीएफए ​​निर्धारण के 7 डी के भीतर प्रदर्शन किया गया था। टुकड़ा एक जलीय बढ़ते मध्यम में रखा गया था, एक confocal खुर्दबीन का उपयोग imaged, और इससे पहले CCK एंटीबॉडी के लिए फिर से धुंधला दो महीने की अवधि के लिए भंडारित किया। नोट दर्ज न्यूरॉन की आकृति विज्ञान, axonal arbors (चित्रा 2 ई) सहित confocal छवियों ओ से खंगाला गया थापहले धुंधला प्रक्रिया के बाद btained। सीबी 1 आर immunoreactivity साथ अक्षतंतु की Colocalization (चित्रा 2 एफ - एच) शारीरिक अध्ययन पर आधारित उम्मीद थी। CCK के लिए दूसरा धुंधला दो महीने पहले धुंधला प्रक्रिया के बाद वर्गों पर प्रदर्शन किया गया था। CCK दूर लाल में imaged किया गया था और दृश्य के लिए सियान में छद्म रंग का था। इसी तरह, चित्रा 3 एक सेल में जो biocytin लेबलिंग से पता चला था और एक मोटी अनुभाग में imaged (चित्रा 3A1) का एक उदाहरण दिखाता है। न्यूरॉन के आंतरिक शरीर क्रिया विज्ञान चित्रा 3A2 में सचित्र है। टुकड़ा 50 माइक्रोन पर फिर से sectioned किया गया था और, हालांकि कुछ वृक्ष के समान प्रक्रियाओं युक्त वर्गों खो गए थे, सोमा युक्त खंड बरामद (चित्रा 3B1)। पतली धारा के बाद CCK immunostaining biocytin लेबल सोमा में हरे रंग में CCK अभिव्यक्ति दिखाया। एक जलीय माध्यम में मोटी टुकड़ा बढ़ते ई रोकताxcessive ऊतक संकोचन। औसत पर, 300 माइक्रोन वर्गों जलीय माध्यम के बारे में 25.67 ± 3.14% (एन = 5 स्लाइस) से हटना जब बढ़ते के बाद एक सप्ताह मापा का उपयोग कर रखा होगा। इस प्रकार, मोटी वर्गों जलीय माध्यम का उपयोग कर रखा resectioning के लिए अनुमति ~ 225 माइक्रोन कर रहे हैं। कई नियंत्रण अध्ययन में यह साबित हो गया है कि दूसरी बार के लिए immunolabeling की प्रक्रिया गैर विशिष्ट एंटीबॉडी द्वारा लेबलिंग करने के लिए नेतृत्व नहीं किया था। उदाहरण के लिए, यह ज्ञात है कि parvalbumin (पीवी) और CCK immunoreactivity hippocampal न्यूरॉन्स में परस्पर अनन्य हैं। नियंत्रण जिसमें biocytin (लाल) और CCK (हरा) के लिए पहला कदम immunolabeling (2) दूसरा (405 एनएम और नीले रंग में उत्सर्जन में उत्तेजना के साथ) parvalbumin के लिए लेबलिंग के द्वारा किया गया गैर अतिव्यापी अभिव्यक्ति पैटर्न (चित्रा 4) दिखाया। इसके अतिरिक्त, विशिष्ट नयूरोचेमिकल मार्कर व्यक्त न्यूरॉन्स के विशिष्ट लामिना axonal धुंधला पैटर्न (पीवी, CCK, सीबी 1 आर) Seria से बदल नहीं किया गया हैएल फिर से धुंधला प्रक्रियाओं (आंकड़े 2 - 4)। इसके अलावा, माध्यमिक धुंधला लगातार शारीरिक रिकॉर्डिंग के आधार पर उम्मीद नयूरोचेमिकल मार्कर के साथ biocytin से भरे न्यूरॉन्स के सह-लेबलिंग का पता चला। इस प्रकार, हमें विश्वास है कि restaining प्रक्रिया लेबलिंग में विशिष्टता के नुकसान के लिए नेतृत्व नहीं करता है।

चित्रा 4
चित्रा पहले Immunostaining के बाद और वर्गों के बढ़ते दूसरा Immunostaining पर परस्पर अनन्य मार्करों के बीच ओवरलैप के 4. अभाव। (ए - सी) 10X पर Confocal छवियों लाल रंग में एक biocytin से भरे न्यूरॉन (ए), ग्रीन (बी) में एक नोक, और CCK immunoreactivity ने संकेत दिया, तीर द्वारा संकेत दिखा। ओवरलैप की कमी पर ध्यान दें। एक ही अनुभाग parvalbumin (पीवी) अधिक से अधिक 2 महीने (सी) के बाद नीले रंग में immunostaining के लिए संसाधित किया गया था। ovछवियों की erlay डी में दिखाया गया है। ध्यान दें कि पीवी एक्सोन उम्मीद nonoverlapping पैटर्न में आणविक परत में CCK के साथ, दाना सेल परत में वितरित कर रहे हैं। इसके अलावा न्यूरोनल somata में दो मार्करों की colocalization की कमी पर ध्यान दें। सही करने के लिए जूम छवियों कि biocytin लेबल न्यूरॉन व्यक्त पीवी (नोक) और नहीं CCK (तीर) को दर्शाते हैं। स्केल पट्टी: 100 माइक्रोन (ए - डी), 20 माइक्रोन (सही करने के लिए पैनल)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

एक आम कारण उप इष्टतम biocytin के लिए भरता रिकॉर्डिंग पिपेट सेल से आ रहा है, जबकि साथ neuronal प्रक्रियाओं का आकस्मिक विच्छेद है। के रूप में चित्रा 1 (हरी तीर) में सचित्र सेल के एक खो उपांग, एक अक्षतंतु के अंत में biocytin की एक छाला के रूप में प्रकट होता है। Axonal blebs एकअक्सर कल्पना की जब सतही कोशिकाओं, जिसका एक्सोन टुकड़ा करने की क्रिया प्रक्रिया के दौरान कटे जा सकता पट्टी कर रहे हैं। हालांकि, टुकड़ा करने की क्रिया और लक्षित सेल वर्ग की axonal वितरण पैटर्न के ज्ञान के विमान के अनुकूलन ख्यात अक्षतंतु, जो भी अक्षतंतु तोड़ सकते हैं की दिशा से आ रहा सोमा से बचने में सहायता कर सकते हैं, एक axonal छाला की उपस्थिति में जिसके परिणामस्वरूप । सबसे प्रकार की कोशिकाओं में, यह (निशान के साथ सफेद तीर) जेड अक्ष के साथ सेल शरीर दृष्टिकोण करने के लिए बेहतर है। एक दूसरा मुद्दा है, जबकि सेल के करीब पहुंच पिपेट करने के लिए अत्यधिक सकारात्मक दबाव के आवेदन का सवाल है। यह केवल सेल और अपने कनेक्शन को नुकसान नहीं कर सकते हैं, लेकिन यह भी biocytin युक्त सेल चारों ओर फैल, उच्च पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति के लिए अग्रणी आंतरिक समाधान का कारण बनता है। पृष्ठभूमि धुंधला भी बढ़ जाती है जब समय सेल दृष्टिकोण करने के लिए लिया जाता है लंबे समय तक या जब टुकड़ा गुणवत्ता इष्टतम है, जो सेलुलर आकारिकी (चित्रा 5 ए परिभाषित करने की क्षमता के साथ समझौता नहीं कर सकते है)। यह जबकि पिपेट dislodging सोमा बाहर खींचने के लिए संभव है। यह दैहिक आकृति विज्ञान की कमी (चित्रा 5 ब) में परिणाम होगा। सेल बाहर खींच से बचने के लिए जोड़तोड़ की "ठीक" आंदोलन सेटिंग्स का उपयोग छोटे चरणों में ऊपर और बाहर पिपेट चलते हैं। धीरे सेल से पिपेट को बेदखल करने के लिए सेल जोड़तोड़ एक लंबे झिल्ली विस्तार, नल / झाड़ू के माध्यम से पिपेट से जुड़े होने की दिखाई देता है। जब तक सेल को पूरी तरह उखाड़ फेंकना गया है मोटे जोड़तोड़ सेटिंग्स का उपयोग करने से बचें।

चित्रा 5
चित्रा 5। छवियाँ असफल Biocytin भरता वर्णन। (ए) उच्च पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति दिखा छवि रिकॉर्डिंग पिपेट में अत्यधिक सकारात्मक दबाव, गरीब सेल दृश्यता में जिसके परिणामस्वरूप के कारण है। एक्सोन सहित neuronal प्रक्रियाओं, के महीन संरचनाओं, वीं के क्षेत्र से परे कल्पना कर रहे हैंई फैल। इसके अलावा, सूचना है कि सोमा बाहर निकाला गया है। (बी) सोमा के साथ एक न्यूरॉन पिपेट टुकड़ी के दौरान बाहर खींच लिया। तीर, अक्षतंतु और dendrites के सफल भरता दिखाने सोमा जबकि और appendages तीरों को समीपस्थ बरामद नहीं किया गया है। (सी) एक सेल टुकड़ा की एक सतही परत में समझौता (<सतह से 50 माइक्रोन) में कटौती अक्षतंतु और dendrites (तीर) का प्रदर्शन भरा कोशिकाओं में परिणाम है। नोटिस दाना सेल dendrites के beading (तीर), गरीब सेल स्वास्थ्य (सी) का संकेत है। स्केल पट्टी: 50 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

अंत में, आदेश कटे एक्सोन या डेन्ड्राइट के बिना पूरा सेलुलर आकृति विज्ञान को ठीक करने के लिए, यह सबसे अच्छा सेल> 50 माइक्रोन टुकड़ा सतह के लिए गहरी लक्ष्य है। सतही कोशिकाओं प्रक्रियाओं है कि हो सकता हैकटौती की गई और synaptic आदानों के सामान्य पूरक कमी हो सकती है।

restaining प्रक्रियाओं में सबसे आम नुकसान coverslip के हटाने और ऊतकों को नुकसान पहुँचाए बिना खंड की वसूली के साथ जुड़े रहे हैं। जब रातोंरात incubated एक दूसरा मुद्दा मोटी ऊतक में एंटीबॉडी प्रवेश का सवाल है, विशेष रूप से। कई मामलों में, बेहतर पैठ एक ठंडे कमरे में रखा एक कक्षीय प्रकार के बरतन पर 4 डिग्री सेल्सियस पर अप करने के लिए 72 घंटे के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी में incubating द्वारा हासिल किया गया है। हालांकि फिर से सेक्शनिंग ऊतक एंटीबॉडी प्रवेश सुनिश्चित करने के लिए सबसे प्रभावी प्रक्रिया है, प्राथमिक एंटीबॉडी में ऊष्मायन की अवधि के समय को बढ़ाने या 0.5 करने के लिए डिटर्जेंट एकाग्रता में वृद्धि - 1% ट्राइटन-X100 भी एंटीबॉडी सहायता कर सकते हैं प्रवेश 24। चूंकि ज्यादातर दर्ज न्यूरॉन्स 50 के भीतर स्थित हैं - खंड की सतह से 100 माइक्रोन, हम पाते हैं कि मोटी वर्गों का धुंधला biocytin लेबल करने के लिए पर्याप्त है-filled somata या इस स्तर पर प्रक्रियाओं। हालांकि, यह सिफारिश की है कि एंटीबॉडी लेबलिंग की हद तक नकारात्मक सह स्थानीयकरण परिणामों की व्याख्या से पहले प्रत्येक खंड पर जाँच की है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम

biocytin के साथ समझौता सेल भरने सबसे महत्वपूर्ण कदम आकृति विज्ञान की पूरी वसूली सुनिश्चित करने के लिए है। सेल की पूरी वसूली के लिए, यह टुकड़ा करने की क्रिया के दौरान प्रक्रियाओं के विच्छेद कम करने के लिए एक इष्टतम टुकड़ा उन्मुखीकरण का चयन करने के लिए आवश्यक है। इस उन्मुखीकरण परीक्षा के अंतर्गत सर्किट और सेल प्रकार के आधार पर अलग हो सकता। इसके बाद, यह पर्याप्त समय biocytin dendrites और एक्सोन को फैलाना के लिए अनुमति देने के लिए आवश्यक है। ऐसे Neurobiotin के रूप में कुछ रंजक, भी अंतराल जंक्शनों के माध्यम से दर्ज सेल करने के लिए मिलकर न्यूरॉन्स घुसना कर सकते हैं। विंदुक टिप के आकार को भी अनुकूलित किया जाना है, के रूप में सोमा को बाहर निकाला जा सकता है जब उद्घाटन बड़ी है और जब विंदुक टिप बहुत छोटा है biocytin लोडिंग समझौता किया है आदत की जरूरत है। इसके अतिरिक्त, उचित प्रक्रिया है, जबकि पूरे सेल मोड से disengaging सोमा ठीक करने के लिए आवश्यक हैं। 24 घंटे के लिए रिकॉर्डिंग, बाद में ऊष्मायन के बाद4% पीएफए ​​में स्लाइस पीबीएस द्वारा पीछा सुनिश्चित करता है कि ऊतकों के पार से जोड़ने कम हो जाता है, जो immunohistochemistry के लिए महत्वपूर्ण है। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्लाइस की स्टोरेज भी टुकड़ा अखंडता को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है। हालांकि, पीएफए ​​में लंबे समय तक भंडारण एंटीबॉडी लेबलिंग प्रक्रियाओं के साथ अंतिम सफलता कम कर देता है। मोटी ऊतक में इष्टतम प्रवेश के लिए ऊष्मायन के 5 डी - इन के रूप में अलग-अलग एंटीबॉडी के लिए अलग होगा, और कुछ एंटीबॉडी से 3 की आवश्यकता हो सकती एकाग्रता और प्राथमिक एंटीबॉडी ऊष्मायन की अवधि का अनुकूलन, महत्वपूर्ण है। यह सुनिश्चित करें कि स्लाइस माध्यमिक प्राथमिक एंटीबॉडी धुंधला पहले undamaged कर रहे हैं, पर्याप्त देखभाल कवर पर्ची को हटाने के दौरान की जरूरत है।

संशोधन और समस्या निवारण

हमने देखा है पहले और दूसरे दाग के बीच कोई निर्धारित अवधि नहीं है। धारा फिर से दाग महीने बाद ही ऊतक पर और अधिक से अधिक एक दाग के साथ किया गया है। मेंहमारे हाल ही में काम करता है, हम उन मानक immunostaining प्रोटोकॉल का उपयोग के साथ फिर से धुंधला विधि का उपयोग संसाधित वर्गों की तुलना में और धुंधला पैटर्न या biocytin की मजबूती भरता 6,9,25,26 में कोई स्पष्ट अंतर पाते हैं।

हालांकि यह परीक्षण किया जाना बना रहता है, यह संभव है कि फिर से धुंधला ऊतक अखंडता दोहराया से निपटने के लिए एक सीमित कारक होने के साथ, एक बार से अधिक किया जा सकता है। असतत fluorophores की उपलब्धता भी एंटीजन की संख्या है कि कल्पना की जा सकती है के लिए एक सीमा बन गया है। इसलिए, ऊतक का सावधानी से निपटने की सलाह दी है। एक अतिरिक्त प्रक्रिया का परीक्षण किया जाना बना रहता है कि (सतह रिसेप्टर्स के लिए) प्रतिजन वसूली प्रोटोकॉल का उपयोग restaining है। चूंकि ऊतक की अखंडता को कवर पर्ची से हटाने के बाद बनाए रखा है, हम उम्मीद करते हैं कि प्रक्रिया भी प्रोटोकॉल है कि प्रतिजन वसूली की सिफारिश धुंधला में काम करना चाहिए। इस संबंध में, शारीरिक रिकॉर्डिंग अक्सर कोई ज्ञात नयूरोचेमिकल मार्कर के साथ कोशिकाओं उपज एक प्राथमिकताओं नहीं जाना जा सकता है, संभावित मार्करों के लिए फिर से धुंधला न्यूरॉन्स कि आकृति विज्ञान और बिजली के गुणों के आधार पर वर्णित किया गया है के लिए मार्कर की पहचान की सुविधा सकता है।

तकनीक की सीमाएं

मोटी वर्गों पर immunohistochemical धुंधला प्रदर्शन के साथ जुड़े एक सीमा विशेष रूप से प्राथमिक एंटीबॉडी में मानक रात ऊष्मायन के साथ, खंड की पूरी मोटाई के माध्यम से एंटीबॉडी की अपर्याप्त पैठ है। इसके अलावा, विभिन्न एंटीबॉडी और streptavidin, biocytin प्रकट करने के लिए इस्तेमाल किया, अंतर ऊतक प्रवेश कर सकते हैं। इस प्रकार, यह सिफारिश की है कि ट्रायल रन एंटीबॉडी प्रवेश की गहराई का आकलन करने और ऊष्मायन बार तापमान को संशोधित करने के लिए प्रदर्शन कर रहे हैं, और एंटीबॉडी और ट्राइटन & #160; क्रम में एक्स 100 सांद्रता प्रत्येक एंटीबॉडी के लिए इष्टतम टुकड़ा पैठ और धुंधला प्राप्त करने के लिए। यह भी ध्यान दिया जाना चाहिए कि एक एंटीबॉडी या streptavidin-biocytin के साथ साथ सफल लेबलिंग मतलब यह नहीं है कि एक दूसरे एंटीबॉडी अनुभाग का एक ही गहराई तक घुसना होगा। इसलिए, ध्यान किस स्तर पर biocytin लेबल सेल प्रक्रियाओं नयूरोचेमिकल मार्कर के साथ सह स्थानीयकरण के लिए जांच कर रहे हैं करने के लिए प्रत्येक एंटीबॉडी के प्रवेश सत्यापित करने के लिए लिया जाना चाहिए। अगर पैठ अपर्याप्त है, टुकड़ा immunostaining के लिए <60 माइक्रोन पर फिर से sectioned जा सकता है। ध्यान दें, तथापि, कि जब से स्लाइस पहले से ही biocytin के लिए प्रोसेस किया गया, सेल की आकृति विज्ञान confocal इमेजिंग द्वारा कब्जा किया जा सकता है फिर से सेक्शनिंग दौरान शारीरिक डेटा के संभावित नुकसान को खत्म करने और neuronal पुनर्निर्माण की सुविधा के लिए। हालांकि यह संभव है कि उम्र और पशु प्रजातियों एंटीबॉडी प्रवेश की डिग्री को बदल सकता है, हम सफलतापूर्वक इन प्रक्रियाओं चूहे के ऊतकों में 30 से इस्तेमाल किया हैदिन और 60 दिन पुरानी चूहों पर और चूहों में।

एक दूसरी सीमा है कि biocytin स्वाभाविक फ्लोरोसेंट नहीं है और रिकॉर्डिंग के दौरान रहते इमेजिंग और वास्तविक समय रूपात्मक लक्षण वर्णन के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है। वैकल्पिक unconjugated fluorophores और लूसिफ़ेर पीले कोशिकाओं 27 का जीना इमेजिंग के लिए उपयोग किया गया है। वे स्थायी नहीं हैं और निर्धारण पर प्रतिदीप्ति खो, यह दर्ज न्यूरॉन के पद अस्थायी नयूरोचेमिकल पहचान के लिए अव्यावहारिक बना रही है। हाल ही में, biocytin साथ fluorophores इस सीमा को पार करने के लिए और के रूप में यहाँ विस्तृत, लाइव इमेजिंग के लिए के रूप में अच्छी तरह से डबल या ट्रिपल-लेबलिंग में पद अस्थायी प्रसंस्करण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता पेश किया गया है। दिलचस्प बात यह है, आज तक, biocytin भरता संयुक्त electrophysiological और संरचनात्मक अध्ययन के लिए बेहतर बिजली और धुंधला गुण में जब लूसिफ़ेर पीला 28 की तुलना में हुई है।

मौजूदा सम्मान के साथ तकनीक का महत्व /वैकल्पिक तरीके

प्रोटोकॉल यहाँ विस्तृत उपयोग करने का प्रमुख लाभ है कि, resectioning के विपरीत, biocytin से भरे सेल संरचना और प्रक्रियाओं को बरकरार रहेगा और ऊतकों की स्थायी नुकसान का कारण नहीं है, और न ही कई वर्गों से श्रमसाध्य पुनर्निर्माण के लिए एक की जरूरत के लिए कर रहे हैं। इस प्रकार, एक एकल कोशिका भरने immunocytochemistry द्वारा पीछा किया रूपात्मक पुनर्निर्माण और विशिष्ट नयूरोचेमिकल मार्कर की पहचान करने में मदद कर सकते हैं।

भविष्य के अनुप्रयोगों या दिशा-निर्देश इस तकनीक माहिर के बाद

सभी में, हम आकृति विज्ञान और बाद तदर्थ डबल और electrophysiological रिकॉर्डिंग निम्नलिखित न्यूरॉन्स की ट्रिपल immunolabeling की वसूली के लिए एक उपन्यास व्यावहारिक दृष्टिकोण प्रस्तुत करते हैं। प्रक्रिया नया मार्कर फिर से मूल्यांकन न्यूरॉन्स कि इससे पहले, भरे थे कल्पना की है, और imaged पाने के ज्ञान के रूप में विकसित, के लिए विशेष रूप से लाभप्रद है। ऐसा नहीं है क्योंकि टी विशेष रूप से लाभप्रद हैवह immunohistochemistry सप्ताह से प्रदर्शन किया जा सकता है या यहां तक ​​कि महीने बाद, ऊतक और एंटीबॉडी की बचत। विधि किसी विशेष रसायन की आवश्यकता नहीं है और सुरक्षित रूप से किसी भी प्रयोगशाला में प्रदर्शन किया जा सकता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

लेखकों बनाम एनआईएच / NINDS R01 NS069861 और NJCBIR CBIR14IRG024 से समर्थन स्वीकार करना चाहते हैं

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NaCl Sigma S7653 Immunostaining
KCl Fluka 60129 Immunostaining
Na2HPO4  Sigma S7907 Immunostaining
KH2PO4  Sigma 229806 Immunostaining
Triton X-100 Sigma T8787 Immunostaining
Guinea pig anti CB1  Sigma Af530-1 Immunostaining
Mouse anti CCK CURE, UCLA courtesy of G. Ohning Immunostaining
Rabbit anti Parvalbumin Swant PV27 Immunostaining
Streptavidin, Alexa Fluor conjugate Molecular Probes S11227 Immunostaining
Normal goat serum (NGS) Sigma G9023 Immunostaining
Vectashield  Vector Labs H-1000 Immunostaining
Secondary Antibodies Invitogen Molecular probes Alexa Fluor conjugated dyes Immunostaining
Labnet orbit low speed shaker Bioexpress S-2030-LS Immunostaining
Forceps Dumont 11231-30 Immunostaining
Slide folders EMS 71520 Immunostaining
Vibratome VT 1200 S Leica 14048142066 Electrophysiology
Multiclamp 700B amplifier Molecular devices Multiclamp 700B Electrophysiology
pCLAMP 10 Software Molecular devices pCLAMP 10  Electrophysiology
Digitizer Molecular Devices Digidata 1440 digitizer Electrophysiology
Filter tips Nalgene 171-0020 Electrophysiology
Sonicator Fisher Scientific 15-335-100 Electrophysiology
Microloaders Eppendorf 930001007 Electrophysiology
Biocytin Sigma B4261 Electrophysiology

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Garcia-Lopez, P., Garcia-Marin, V., Freire, M. The histological slides and drawings of cajal. Front Neuroanat. 4, 9 (2010).
  2. Klausberger, T., Somogyi, P. Neuronal diversity and temporal dynamics: the unity of hippocampal circuit operations. Science. 321 (5885), 53-57 (2008).
  3. Petilla Interneuron Nomenclature, G., et al. Petilla terminology: nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex. Nat Rev Neurosci. 9 (7), 557-568 (2008).
  4. Armstrong, C., Soltesz, I. Basket cell dichotomy in microcircuit function. J Physiol. 590 (4), 683-694 (2012).
  5. Povysheva, N. V., Zaitsev, A. V., Gonzalez-Burgos, G., Lewis, D. A. Electrophysiological heterogeneity of fast-spiking interneurons: chandelier versus basket cells. PLoS One. 8 (8), e70553 (2013).
  6. Gupta, A., Elgammal, F. S., Proddutur, A., Shah, S., Santhakumar, V. Decrease in tonic inhibition contributes to increase in dentate semilunar granule cell excitability after brain injury. J Neurosci. 32 (7), 2523-2537 (2012).
  7. Fish, K. N., Hoftman, G. D., Sheikh, W., Kitchens, M., Lewis, D. A. Parvalbumin-containing chandelier and basket cell boutons have distinctive modes of maturation in monkey prefrontal cortex. J Neurosci. 33 (19), 8352-8358 (2013).
  8. Yu, J., Swietek, B., Proddutur, A., Santhakumar, V. Dentate cannabinoid-sensitive interneurons undergo unique and selective strengthening of mutual synaptic inhibition in experimental epilepsy. Neurobiol Dis. 89, 23-35 (2016).
  9. Yu, J., Swietek, B., Proddutur, A., Santhakumar, V. Dentate total molecular layer interneurons mediate cannabinoid-sensitive inhibition. Hippocampus. 25 (8), 884-889 (2015).
  10. Varga, C., et al. Functional fission of parvalbumin interneuron classes during fast network events. Elife. 3, (2014).
  11. Kawashima, T., Okuno, H., Bito, H. A new era for functional labeling of neurons: activity-dependent promoters have come of age. Neural Circuits Revealed. , 109 (2015).
  12. Krook-Magnuson, E., Luu, L., Lee, S. H., Varga, C., Soltesz, I. Ivy and neurogliaform interneurons are a major target of mu-opioid receptor modulation. J Neurosci. 31 (42), 14861-14870 (2011).
  13. Szabadics, J., Soltesz, I. Functional specificity of mossy fiber innervation of GABAergic cells in the hippocampus. J Neurosci. 29 (13), 4239-4251 (2009).
  14. Iball, J., Ali, A. B. Endocannabinoid Release Modulates Electrical Coupling between CCK Cells Connected via Chemical and Electrical Synapses in CA1. Front Neural Circuits. 5, 17 (2011).
  15. Chen, X., Cho, D. -B., Yang, P. -C. Double staining immunohistochemistry. N Am J Med Sci. 2 (5), 241-245 (2010).
  16. Ranjan, A. K., et al. Cellular detection of multiple antigens at single cell resolution using antibodies generated from the same species. Journal of immunological. 379 (1), 42-47 (2012).
  17. Fuccillo, D. A., Sever, J. L. Concepts in Viral Pathogenesis II. , Springer. 324-330 (1986).
  18. Buchwalow, I. B., Minin, E. A., Boecker, W. A multicolor fluorescence immunostaining technique for simultaneous antigen targeting. Acta Histochem. 107 (2), 143-148 (2005).
  19. Qi, G., Radnikow, G., Feldmeyer, D. Electrophysiological and morphological characterization of neuronal microcircuits in acute brain slices using paired patch-clamp recordings. JoVE (Journal of Visualized Experiments. (95), e52358 (2015).
  20. Walz, W. Patch-clamp analysis : advanced techniques. 2nd edn. , Humana Press. (2007).
  21. Molnar, P. Patch-clamp methods and protocols. 403, Springer Science & Business Media. (2007).
  22. Martina, M., Taverna, S. Patch-clamp methods and protocols. , Humana Press. (2014).
  23. Booker, S. A., Song, J., Vida, I. Whole-cell patch-clamp recordings from morphologically- and neurochemically-identified hippocampal interneurons). J Vis Exp. (91), e51706 (2014).
  24. Jinno, S., Kosaka, T. Immunocytochemical characterization of hippocamposeptal projecting GABAergic nonprincipal neurons in the mouse brain: a retrograde labeling study. Brain research. 945 (2), 219-231 (2002).
  25. Yu, J., Proddutur, A., Swietek, B., Elgammal, F. S., Santhakumar, V. Functional Reduction in Cannabinoid-Sensitive Heterotypic Inhibition of Dentate Basket Cells in Epilepsy: Impact on Network Rhythms. Cereb Cortex. , (2015).
  26. Proddutur, A., Yu, J., Elgammal, F. S., Santhakumar, V. Seizure-induced alterations in fast-spiking basket cell GABA currents modulate frequency and coherence of gamma oscillation in network simulations. Chaos. 23 (4), 046109 (2013).
  27. Scharfman, H. E. Differentiation of rat dentate neurons by morphology and electrophysiology in hippocampal slices: granule cells, spiny hilar cells and aspiny 'fast-spiking' cells. Epilepsy Res Suppl. 7, 93-109 (1992).
  28. Tasker, J. G., Hoffman, N. W., Dudek, F. E. Comparison of three intracellular markers for combined electrophysiological, morphological and immunohistochemical analyses. J Neurosci Methods. 38 (2-3), 129-143 (1991).

Tags

तंत्रिका विज्ञान अंक 118 आकृति विज्ञान biocytin immunohistochemistry नयूरोचेमिकल मार्कर डबल लेबलिंग पैच दबाना
Neurochemical मार्करों के लिए Biocytin-भरा और प्रसंस्कृत धारा के Immunostaining
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Swietek, B., Gupta, A., Proddutur,… More

Swietek, B., Gupta, A., Proddutur, A., Santhakumar, V. Immunostaining of Biocytin-filled and Processed Sections for Neurochemical Markers. J. Vis. Exp. (118), e54880, doi:10.3791/54880 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter