Summary
We ontwierpen een continu kweken inrichting voor gebruik met systemen optogenetic aan kweken van microben en regelmatig afbeeldingscellen branden in het effluent met een omgekeerde microscoop. Het kweken, sampling, beeldvorming en beeldanalyse zijn volledig geautomatiseerd, zodat dynamische reacties op de verlichting kan worden gemeten over meerdere dagen.
Abstract
Optogenetische systemen maken gebruik van genetisch gecodeerde eiwitten die conformatie veranderen als reactie op specifieke golflengten van licht om cellulaire processen veranderen. Er is behoefte aan het kweken en meetsystemen die gebruik geprogrammeerd verlichting en stimulering van optogenetic systemen. We presenteren een protocol voor het bouwen en gebruiken van een continue kweekapparaat microbiële cellen met geprogrammeerde doses van licht verlichten en automatisch verkrijgen en afbeeldingen van cellen in het effluent geanalyseerd. De werking van deze inrichting een chemostat kan de groeisnelheid en de cellulaire omgeving goed te regelen. Het effluent van de continue celkweek wordt regelmatig bemonsterd en de cellen worden afgebeeld door multi-channel microscopie. Het kweken, sampling, beeldvorming en beeldanalyse zijn volledig geautomatiseerd, zodat dynamische reacties in de fluorescentie-intensiteit en cellulaire morfologie van de cellen in de steekproef uit de kweek effluent worden gemeten over meerdere dagenzonder gebruikersinvoer. We tonen de bruikbaarheid van deze kweken inrichting door het dynamisch induceren eiwitproductie in een stam van Saccharomyces cerevisiae vervaardigd met een optogenetic systeem dat transcriptie activeert.
Introduction
Optogenetische systemen gebruiken licht om een groeiende lijst van cellulaire processen, waaronder genexpressie, 1, 2, 3, 4, 5 eiwit lokalisatie, 6 eiwitactiviteit, 6, 7, 8 eiwitbinding, 8, 9, 10 en eiwitafbraak controleren. 11 Werkwijze voor het kweken van cellen in een gecontroleerde omgeving met geprogrammeerde optische stimulatie en het meten van hun reactie op biologisch relevante tijdschalen moet het potentieel van deze instrumenten benutten voor onderzoek in de celbiologie en biotechnologie. Onze methode maakt gebruik van chemostatische een constante celgroei handhaven in een goed gemengde, aegewaardeerd en temperatuurregeling glazen kweekvat 12, 13 dat is blootgesteld aan verlichting geprogrammeerd. We afbeelding individuele cellen in de kweek effluent met een omgekeerde microscoop om de respons van de cultuur geprogrammeerde belichting te meten. Het kweken, sampling, beeldvorming en beeldanalyse zijn volledig geautomatiseerd, zodat de fluorescentie-intensiteit en cellulaire morfologie van het effluent celkweek kan worden gemeten over meerdere dagen zonder input van de gebruiker.
Dit protocol kan in de meeste laboratoria vertrouwd groeiende celkweek en microscopie uitgevoerd, en de gebruikte apparatuur is goedkoop en van gemakkelijk beschikbare componenten. Een transparante kweekvat wordt boven een matrix van licht-emitterende diodes (LEDs) kan uitzenden 1 uW / cm 2 -10 mW / cm2 licht geplaatst. Microben worden gekweekt in het kweekvat continu; een peristaltische pomp wordt gebruikt om media aan deverdunning, andere wordt gebruikt om de cultuur intrekken een lager aan de microscoop, en het verschil ontsnapt via een overloop. Een verwarmingselement handhaaft de temperatuur. Lucht wordt continu gepompt in het kweekvat om een positieve druk te handhaven en te mengen en beluchten cultuur. Met uitzondering van de luchtpomp, wordt het vermogen deze worden geregeld door een microcontroller die ook ontvangt input van een thermometer en een aangesloten computer. Het effluent celkweek wordt gepompt naar een microfluïdische apparaat op het podium van een omgekeerde microscoop. Non-tl en tl-beelden worden automatisch overgenomen. De cellen in de afbeeldingen worden gekenmerkt door een algoritme dat elke cel lokaliseert een interessegebied (ROI) en meet de eigenschappen van elke ROI.
Als u een toepassing van dit protocol aan te tonen, we meten de respons op wisselende lichtintensiteiten van Saccharomyces cerevisiae cellen ontworpen met een blauw licht verantwoorve optogenetic systeem dat de transcriptie van fluorescerend eiwit regelt. S. cerevisiae, algemeen bekend als bakkersgist, werd geselecteerd omdat meerdere optogenetic systemen voor het reguleren van genexpressie in dit systeem bestaan 14, 15, 16. Bovendien is deze modelorganisme gebruikt voor studies in systeembiologie 17 en een chassis voor biotechnologische toepassingen 18, 19, 20. De representatieve resultaten tonen aan dat dit protocol kan worden gebruikt om transcriptie van een kweek over meerdere dagen regelen door het variëren ingang lichtintensiteiten en het meten van de productie van een fluorescerende reporter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Figuur 1: De continue kweken apparaat. Deze vereenvoudigde diagram toont hoe de inrichting moet worden gemonteerd bij gebruik cultuur, verlichten, en meet de optische eigenschappen van de microben. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Overzicht van het protocol. De stappen in het gearceerde gebied moet worden herhaald telkens wanneer het protocol wordt gebruikt. Closed loop control is mogelijk 34, maar is niet in dit protocol uitgevoerd.
1. Monteer de Thermometer aan de Raad van de Kring
Figuur 3: Verbindingen met thermometer waarden te lezen. Deze grafiek toont hoe de digitale thermometer moet worden aangesloten op de printplaat zodat de microcontroller feedback aan de temperatuur van de kweek controle te krijgen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Soldeer de Ground, Data, en positieve spanning lijnen van de digitale thermometer aan hun respectieve doorgaande gaten gemarkeerd "GD + V."
- Knip een pin van een vrouwelijke 3-pin header en trim de resterende 2 pinnen met draad clippers, zodanig dat het past in de twee doorlopende gaten met het label "R2" en de microcontroller niet belemmeren. Soldeer deze op zijn plaats. Sluit de twee gesoldeerde pinnen door het invoegen van een 4,7 kOhm weerstand in de pin header.
2. Sluit de Power-Control Componenten naar het Circuit Board
Figuur 4: Aansluitingen aan de macht te controleren om de verwarming pad. Deze figuur toont hoe de printplaat en toebehoren worden gemonteerd om vermogensbesturing het verwarmingselement. De onderdelen ter controle van de peristaltische pompen worden op soortgelijke wijze verbonden. Merk op dat de componenten van de thermometer zijn verwijderd voor de duidelijkheid. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Snijd 1 cm uit de pennen van vijf vrouwelijke 3-pin headers. Soldeer deze naar de posities op de printplaat (PCB) gemarkeerd als "# 1", "# 2," "# 3", "# 4" en "CB E."
- Snijd 1 cm uit de pennen van een vrouwelijke 6-pin en 8-pin header. Soldeer deze naast elkaar tede kolom van doorgaande gaten gelabeld K1 tot K14.
- Sluit de verwarming pad op de printplaat.
- Steek de uiteinden van een 100 kQ weerstand in de doorgaande gaten gemerkte K1 en K2 op de printplaat. Plaats een metaal-oxide-halfgeleider veldeffecttransistor (MOSFET) in de positie aangeduid # 1 op de printplaat, het label van de MOSFET gericht naar de K1 tot K14 doorgaande gaten zodat de bron pin dichtst bij de "# "label en de afvoer pin verst van de" # "label.
- Snijd de grond lijn van de 5 V gelijkstroom (DC) voedingskabel en sluit deze aan J2. Sluit de grond lijn van de verwarming pad te J1. Sluit K3 naar pin 3 met een 1 kOhm weerstand. Huidige moet nu alleen voortvloeien uit J1 tot J2 wanneer pen 3 is ingesteld op + 5V.z
LET OP: De weerstand / MOSFET set fungeert als een schakelaar die stroom maakt van pin J1 te stromen naar J2 als pin 3 van de microcontroller is ingesteld op 5 V.
- Aansluitende trage peristaltische pomp.
- Steek de uiteinden van een 100 kQ weerstand in de doorgaande gaten gemerkte K4 en K5 op de printplaat. Plaats een MOSFET in de positie aangeduid # 2 op de printplaat, het label van de MOSFET gericht naar de K1 tot K14 doorgaande gaten zodat de bron pin dichtst bij de "#" label en de afvoer pin verst van de "#" etiket.
- Snijd de grond lijn van de 12 V DC voeding kabel van de trage peristaltische pomp. Sluit de peristaltische pomp tegenover eind aan J3 en de muur wrat geconfronteerd einde aan J4. Sluit K6 naar pin 4 met een 1 kOhm weerstand. Huidige moet nu alleen voortvloeien uit J3 naar J4 wanneer pen 4 is ingesteld op 5 V.
- Sluit de snelle peristaltische pomp
- Steek de uiteinden van een 100 kQ weerstand in de doorgaande gaten gemerkte K7 en K9 op de printplaat. Plaats een MOSFET in de positie aangeduid # 3 op de printplaat, het label van de MOSFET gericht naar de K1 tot K14 doorgaande gaten s o de bron pin dichtst bij de "#" label en de afvoer pin verst van de "#" label.
- Snijd de grond lijn van de 12 V DC voeding kabel van de snelle peristaltische pomp. Sluit de peristaltische pomp tegenover eind aan J5 en de muur wrat geconfronteerd einde aan J6. Sluit K9 aan pin 5 met een 1 kOhm weerstand. Huidige moet nu alleen voortvloeien uit J5 tot J6 als pin 5 is ingesteld op 5 V.
3. Sluit de LED Matrix aan de Raad van de Kring
Figuur 5: Verbindingen met de LED-matrix te regelen. Deze figuur toont hoe de LED matrix moet worden aangesloten op de printplaat. Het toont ook aan dat de printplaat kan worden gestapeld op de microcontroller. Merk op dat de componenten van de thermometer en de controle gelijkspanning naar andere inrichtingen voor de duidelijkheid verwijderd.es / ftp_upload / 54894 / 54894fig5large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Soldeer de 6-pins 10-pin en de twee 8-polige headers in de doorgaande gaten aan de zijkant van de printplaat, zodat het kan worden gestapeld bovenop de microcontroller.
- Soldeer de 100 nF en de 10 uF condensatoren om hun gemarkeerde plaatsen op de printplaat, en merkt op dat de negatieve pool van de 10 uF condensator (kortere) moet worden aangesloten op het doorgaande gat gemarkeerd met een negatief teken.
- Soldeer de LED bestuurder de 2 door 12 set van doorgaande gaten, met de inkeping op de bestuurder ver van de doorgaande gaten gereserveerd voor de LED-matrix.
- Soldeer 2 kolommen van de mannelijke pin headers aan de doorgaande gaten gemarkeerd voor de LED-matrix, en trim de uiteinden van deze onder de broodplank zodanig dat zij de microcontroller niet zal belemmeren. Sluit deze aan op twee 8-draads strips van vrouwelijke / jumper draden vrouw. Sluit een tweede set van mannelijkespeldkopballen naar de andere kant van de draadbruggen.
- Plaats de LED-matrix over de mediaan van de broodplank, en plaats de tweede set pin headers om de kolommen aan beide zijden van de matrix. Zorgen dat de elektrische aansluitingen zijn hetzelfde alsof de LED matrix die rechtstreeks zijn verbonden met de printplaat met het label van de matrix die overeenkomt met de gedeclareerde kolom van doorgaande gaten.
- Knip een pin van een vrouwelijke 3-pin header en trim de resterende 2 pinnen met draad clippers, zodanig dat het past in de twee doorlopende gaten met het label "R1" en de microcontroller niet belemmeren. Solderen dit. Sluit de twee gesoldeerde pinnen door het invoegen van een 1 kOhm weerstand in de pin header.
Opmerking: De kweekvat wordt gestapeld op de LED-matrix. Als de draad linten belemmeren het schip, compenseren ze uit de matrix. Gebruik vervolgens massieve kerndraad om de kloof tussen de pennen en de matrix aderige pennen, zodanig dat de elektrische aansluitingen niet ch overbruggenange.
4. Installeer Software en Verbinden met Hardware
- Stapel de printplaat de microcontroller.
- Volg de links in de lijst met materialen om de Integrated Development Environment (IDE) en aangepaste code te downloaden voor de microcontroller.
- Sluit de microcontroller aan de microscoop computer via een AB-Universal Serial Bus (USB) kabel. Compileren en uploaden van de aangepaste code naar de microcontroller.
- Download Micro-Manager 21, 22 en 23 FIJI. Configureren Micro-Manager als FIJI plugin door het kopiëren van alle 'dll' bestanden, de map "mmplugins" en de "mmautofocus" directory van de map waarin Micro-Manager in de directory "Fiji.app" werd gedownload. Ook, kopieert u de "plugins / Micro-Manager" directory in de directory "Fiji.app/plugins".
- Download de "BioreactorController.jar" bestand into de directory "Fiji.app/mmplugins".
- Open Micro-Manager van Fiji> Plugins> Micro-Manager> Micro-Manager Studio. Gebruik de Hardware Configuration Wizard om de software aan de microscoop te configureren. Neem de "FreeSerialPort" device in de wizard met het label van de poort waarop de AB USB-kabel is aangesloten.
5. Zorg en karakteriseren van de Light-proof behuizing voor de kweekvat
- Stack drie 8-pins IC sockets als bouwstenen op breadboard op elke hoek van de LED-matrix zodat het kweekvat daarop kunnen rusten boven de matrix.
- Bevestig een gedeelte van diffusie papier onder de toplaag van de bussen, zodat het licht dat het kweekvat van de LED-matrix diffuus.
- Knip drie 8 "door 6" gedeelten van zwarte foam. Snijd een gedeelte dat dezelfde grootte als de elektronische breadboard (2,3 "x 3,5") vanaf de binnenzijde van de eerste two en een gedeelte dat de grootte van de rechthoek die de IC sockets (0,9 "x 1,8") vanaf de binnenzijde van de derde. Stapel lagen die via LED matrix zodanig dat de uiteindelijke laag met de 0,9 "x 1,8" opening ligt zelfs met de bovenkant van de IC sockets en omgeeft de LED-matrix.
- Snij een extra blad van zwarte foam in de helft van een 6 "met 24" rechthoek te maken. Rol dit in een holle kolom van zwarte schuim dat de kweekvat kan passen in met ruimte voor buizen en draden, zodanig dat het thermisch en optisch zal isoleren de kweekvat.
- Centreer de holle kolom van zwart schuim over de LED-matrix en markeer de grens van de kolom op de laag zwarte foam eronder. Deze grens zal in het teken waar het zou moeten worden gecentreerd in de toekomst.
- Knip een 3 "x 3" deel van de zwarte schuim. Gebruik later als deksel dat kan worden geplakt is aan de top van de kolom extern licht te blokkeren.
- Bevestig de fotodiode stroom sensor aan Th e kweken cap schip met tape, hechten de dop en plaats de kweekvat in de behuizing.
- In Micro-Manager, ga naar Plugins> Bioreactor Controller. Stel de matrix te verlichten op een subset van het bereik van mogelijke intensiteiten bij 30 s intervallen.
- Noteer de lichtintensiteiten zoals weergegeven op de power meter console aangesloten op het elektriciteitsnet sensor. Deze metingen mogelijk maken dat de werkelijke lichtintensiteit aan te duiden wanneer het aantal LEDs die verlicht en de pulsbreedte gemoduleerde (PWM) stroom naar de LEDs wordt ingesteld.
6. Bereid de kweekvat
Figuur 6: Schip verbindingen. Deze grafiek toont hoe het vaartuig leidingen van de inrichting moet worden verbonden alvorens te worden geautoclaveerd.blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Markeer de hoogte die overeenkomt met elk 2 ml toename van vloeistof in het gebied van 10 ml tot 30 ml in het kweekvat. Plaats 10 ml steriel gedemineraliseerd water, markeert het waterpeil, voeg 2 ml, markeert het waterpeil, en herhaal tot het 30 ml niveau wordt gemarkeerd. Bedek de markeringen met doorzichtige tape, zodat ze zijn niet gemakkelijk te verwijderen en afvoeren van de vloeistof.
- Plaats het lange einde van de aluminium-poort door de siliconen pakking, in het kweekvat. Schroef de dop.
- Betrekking hebben op een korte aluminium poort uitlaat met 1/16 "ID siliconenslang. Sluit het distale uiteinde door het inbrengen van een vrouwelijke luer lock en vervolgens verbinden van een mannelijke luer lock aansluiting. Deze aanvullende uitlaat, en wordt niet gebruikt (buis 6 in figuur 6 ).
- Sluit twee korte segmenten van 1/16 "ID silicone met mannelijke en vrouwelijke Luer sloten. Sluit het ene uiteinde van een korte aluminium poort stopcontact en steek de distal end met een mannelijke luer en vrouwelijke Luer lock plug. Het schip wordt geïnoculeerd door deze buis (tube 7 / 7,1 in figuur 6).
- Verbinden twee 1/16 "ID buizen naar de uiteinden van de 1/16" ID peristaltische slangen en aansluitingen. Sluit het ene uiteinde van een korte aluminium poort en sluit het andere (buis 4 in figuur 6). Later wordt deze aangesloten op de media kolf.
7. Bereid de Media Fles
- Sluit een 1/16 "binnendiameter (ID) siliconenslang de langste aluminium poort. De buis moet lang genoeg zijn om de media kolf bereiken. Sluit een 1/8" ID male luer lock een kort segment van 1/16 " ID slangen, sluit deze aan op de voorgaande buis ,, en steek deze korte segment in de rubberen stop op de media kolf (buis 3 in figuur 6).
- Klem de buis. Deze verbinding maakt het mogelijk lucht uit de media fles te stromen naar het kweekvat. Wanneer de media fles later wordt gepompt met lucht eend deze buis ontspannen is, zal de cultuur worden gemengd, cellenbeton, en bewaard bij een positieve druk door de inkomende bubbels.
- Plaats een 1/16 "ID buis lang genoeg om de bodem van de kolf in de stop, waardoor media wordt overgedragen bereikt. Verbind een 1/16" ID tube deze, en een 3/16 "ID buis dat. plug deze met een 3/16 "ID vrouwelijke luer lock en een mannelijke luer lock connector (tube 1 / 1,1 in figuur 6).
- De derde gat in de stop worden gevuld met een kort segment van 1/16 "ID slang, verbonden met twee andere segmenten drager diameter buis en aangesloten aan het distale einde (buis 2 / 2,1 in Figuur 6). Dit zal worden aangesloten een vacuümpomp en later een aquariumpomp.
OPMERKING: Indien de slang niet gemakkelijk door de gaten in de rubberen stop past, snijd de uiteinden van de buis schuin. Vervolgens kan het schuine uiteinde dat wordt geduwd door het gat worden gebruikt om de rest te trekken door.
- Plaats een mannelijke luer lock in een segment van 1/16 "ID siliconenslangen en dan stevig plaats 0,022" ID polytetrafluorethyleen (PTFE) buis. Afzonderlijk, voeg een vrouwelijke luer lock een 1/16 "ID tube. Vervolgens draad ene uiteinde langs de PTFE-buis aan de sluizen en de andere een korte aluminium poort (buis 5 in figuur 6) verbindt.
- Sluit de blootgestelde 1/50 "ID silicone buis naar de 1/50" ID peristaltische buis en aansluitingen. Om dit aan te sluiten drie segmenten van 1/50 "ID slangen en twee segmenten van 0,022" ID polytetrafluorethyleenslangen, ze afwisselend. Verbind deze aan de kolf via effluent 1/16 "ID buis (buis 5 in figuur 6).
- Ene uiteinde van een 1/16 "ID siliconenslang de tweede langste buis van het aluminium poort en het andere uiteinde op de effluent kolf. Deze aluminiumbuis wordt het cultuurvolume en overmaat cultuur overloopt in het effluent houder (buis 8 in
- Autoclaaf het kweken samenstel bij 121 ° C en 15 psi (algemeen sterilisatie) gedurende 30 min.
Opmerking: De buizen waardoorheen de media kolf wordt gevuld, waardoor de media kolf gezogen, en waardoor het kweekvat wordt geïnoculeerd meerdere segmenten buis zodat als het distale segment is verontreinigd, kan worden afgevoerd naar een steriele onthullen segment. - Autoclaaf het kweken samenstel bij 121 ° C en 15 psi (algemeen sterilisatie) gedurende 30 min.
9. Bereid de microfluïdische kanaal
- Meng polydimethylsiloxaan (PDMS) en hardingsmiddel in een 9: 1 verhouding. Degas en giet op het silicium meester mal.
- Hard de PDMS gedurende 2 uur bij 65 ° C en vervolgens snijden van het masker met een scheermesje. Snijd rond de PDMS totdat deze loskomt uit de mal. Vermijd naar beneden te duwen en het breken van de breekbare wafel.
- Gebruik een 1,2 mm ID biopsie perforator om gaten te slaan aan beide uiteinden van het kanaal.
- Plasma bond de PDMS aan de dekking van glas 24.
- Tape de lange uiteinden van het dekglas op het dragend aluminium frame zodat de PDMS kanaal wordt gecentreerd op het aluminium frame en bak de PDMS nogmaals 2 uur bij 65 ° C.
10. Vul de Media Fles
Figuur 7: Het toevoegen van media. Dit diagram laat zien hoe de media afgezogen in de media fles zou moeten zijn. Het zorgt ervoor dat de media steriel blijft. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Maak de juiste media. Wordt daarbij kweeksysteem zal als een chemostaat gebruikt media beperkt voor een bepaalde voedingsstof.
OPMERKING: Voorbeelden van standaard media samenstelling voor studies met S. cerevisiae al eerder zijn gepubliceerd op 25,= "xref"> 26, 27, 28, 29. - Bevestig het vacuüm filter om een fles van 100 ml, verwijder de tepel deksel, verwijder de witte stekker uit de tepel van het vacuüm filter met steriel pincet.
- Sluit de 3/16 "ID siliconenslang aan de nippel, de media kolf andere vrije buis met een vacuümpomp (buizen 1 en 2 in figuur 7, respectievelijk), en zorgen dat de buis die de media kolf met het kweekvat wordt vastgeklemd gesloten (buis 3 in figuur 7).
- Vul het filter met media, zet de vacuümpomp, en vervolgens filteren de rest van de media. Klem de 1/16 "ID silicone slangen aangesloten op het vacuüm (buis 2 in figuur 7) en schakel de vacuümpomp.
- Verwijder de leurs uit het middensegment van 1/16 "ID slangen aangesloten op de vacuümpomp zodat een onbesmette einde van de buis toegankelijk is. Invoegen the blauw einde van een steriele spuit luchtfilter in deze buis.
- Klem de 3/16 "ID silicone (tube 1 in figuur 7) en haal de mannelijke Luer van het. Haal de stekker uit de vrouwelijke Luer media inlaatbuis het kweken schip. Sluit deze mannelijke en vrouwelijke luers de media in staat te zijn gepompt in het kweekvat.
- Verwijder het vacuüm filter en de dop op de 100 ml fles media die was verbonden aan het vacuüm filter.
- Een dag voor het kweekvat wordt geïnoculeerd Inoculeer een enkele kolonie van de optogenetic microbe in een reageerbuisje met 4 ml verzameld in de vorige stap media, en laat het overnacht groeien bij 30 ° C of cultuur optimale temperatuur groeitemperatuur onder roeren.
11. Bouw de opstelling Around the Microscope
- Stel de continue kweken samenstel nabij de microscoop met de media boven het kweekvat en de kolf effluent kolf onder het kweekvat, zodat de buis samengesteld uit segmenten van 0,022 "ID PTFE-buis (buis 5 in figuur 6) de microscoop podium kan bereiken. Bind veilig beneden de rubber stoppen van de media kolf en afvalwater container.
- Koppel de uiteinden van de 0.022 "ID PTFE slang van de 1/50" ID siliconenslang ze te verbinden (buis 5 in figuur 6), en sluit deze doelen in de inlaat en de uitlaat van de microfluïdische apparaat.
- Sluit de witte einde van de spuit luchtfilter naar het aquarium pomp. De luchtdruk zal media duwen in het kweekvat.
- Als de media het niveau van het effluent haven bereikt, wikkel de 1/16 "ID media inlaat slangen en aansluitingen rond de langzame peristaltische pomp (buis 4 in figuur 6) en de 1/50" ID monster outlet slangen en aansluitingen rond de snelle peristaltische pomp (buis 5 in figuur 6).
- Beluchten de media door unclamping de lucht tutussen de media kolf en kweekvat.
- Tape het verwarmingselement en de thermometer kweekvat zodat de temperatuur kan worden geregeld. Spoel de media slang rond het kweekvat, zodat het invoeren van media zal op dezelfde temperatuur als het vat.
OPMERKING: De PWM stroom naar het verwarmingselement wordt geregeld door de microcontroller welke ingangen gebruik van de thermometer de kweekvat bij de gewenste temperatuur te houden. - Steek de kweekvat in de zwarte schuim behuizing over de LED-matrix, en ervoor zorgen dat de buizen niet worden geknepen.
- In Micro-Manager, ga naar Plugins> Bioreactor Controller. Stel de "Media pomp verhouding op" het veld tot 0,1 en de "Sample pump verhouding op" veld op 0. De stroomsnelheid zal zeer laag zijn, maar meer dan de snelheid van de verdamping.
- Klem de binnenkomende lucht slang tussen de media kolf en het kweken van schip. Haal de stekker uit de enting buis (tube 7 in figuur
- Bedek de behuizing, zodat er geen licht binnenkomt, en laat de cultuur groeien 's nachts.
12. Calibrate de Pumping Tarieven
- In Micro-Manager, ga naar Plugins> Bioreactor Controller. Stel de "Media pomp verhouding op" veld naar 0,5 en de "Sample pump verhouding op" veld 0.
- Koppel de overloopbuis van het effluent kolf (buis 8 in figuur 6) en de monsterbuis uit de uitstroom kolf (buis 8 in figuur 6) en laat effluent in afzonderlijke vaten. Verzamel effluent gedurende 1 uur, beginnend na de pompen gedurende 15 min zijn.
- Bereken de stroomsnelheid van media in de kweekvat van de gegevens die in het vat als volume:
- Pas de waarde van de "Media pomp verhouding op" veld door deze lineaire schatting:
waar
- Doorloopt deze kalibratieprocedure totdat het verschil tussen de gewenste debiet en de gemeten stroomsnelheid is <0,2 ml / h, waarbij de stroomsnelheid wordt gemiddeld over een periode van 1 uur.
- Verhoging van de waarde van de "bemonsteringsverhouding op" veld en kalibreren op soortgelijke wijze tot ongeveer 4/5 e van het volume verlaat het kweekvat wordt gepompt door de monsternamepomp en ongeveer 1/5 van het volume verlaat door middel de overloop poort.
- Laat de cultuur dichtheid in de continue kweken apparaat in evenwicht onder deze omstandigheden 's nachts.
LET OP: Als het doel debieten niet kan worden bereikt, veranderende peristaltische pomp slang. Vloeistof wordt gepompt tegen een hogere snelheid wanneer grotere diameter buis wordt gebruikt. Volg stap 14 en dan terug naar stap 8.4. - Pas de waarde van de "Media pomp verhouding op" veld door deze lineaire schatting:
13. Collect Microscope Beelden van Gekweekte Microben
- Vul het Stage Positie List in Micro-Manager met een reeks niet-overlappende posities waarop beelden van de cellen gepompt in de microfluïdische kanaal zal in de focal plane.
- Open de "Bioreactor Controller" plugin. Selecteer de gewenste LED-matrix tijdsverloop, imaging-kanalen, en andere experimentele instellingen van de aanwijzingen. Verzamelen en analyseren van beelden.
- Terwijl het experiment loopt, ervoor te zorgen dat de media in de media kolf helder blijft. Als het bewolkt is, dan is besmet.
14. Post-experiment
- Gooi media, overtollige celcultuur en afvalwater.
- Vul de media kolf met 200 ml 20% EtOH gemengd met gedeïoniseerd water. Voer het chemostat zoals het eerder hadis uitgevoerd tijdens het experiment uit te spoelen cel puin en media.
- Wanneer de alcohol oplossing afgetapt uit de media fles, demonteer de chemostaat volledig.
- Was glaswerk en buizen met warm water en zachte zeep en goed naspoelen met gedemineraliseerd water. Laten drogen.
- Open de "microcontrollerRecords.csv" bestand om de temperatuur en de LED-matrix-status in de loop van het experiment te beoordelen, het bestand "Summary.csv" om de samenvatting van de gegevens van elke set van foto's en de review "Resultaten <n> .csv" bestanden om gegevens samenvatten elke ROI van elke periode, waarbij n de n dataset te beoordelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Deze inrichting werd gebruikt om een kweek van S. cerevisiae tot expressie geel fluorescerend eiwit (YFP) als reactie op blauw licht stimuleren via een induceerbare optogenetic transcriptiesysteem basis van de Cry2 / CIB1 eiwit pair 30. De cellen werden gekweekt in chemostatically-fosfaat beperkte media met een gemiddelde verwatering van 0,2 ± 0,008. Fosfaat beperking wordt vaak gebruikt in S. cerevisiae chemostat experimenten om de groei te regelen en de effecten van fosfaat beperking zijn goed gekarakteriseerd. 31, 32, 33 Effluent uit de continu verdunde kweekvat werd bemonsterd om een microfluïdische apparaat op een omgekeerde microscoop. De beelden werden automatisch geanalyseerd zoals getoond in figuur 8. Individuele cellen werden geïdentificeerd in de achtergrond afgetrokken fase-contrast beelden en hun YFP Concentratie werd geschat uit de gemeten fluorescentie van de achtergrond afgetrokken fluorescentiebeelden.
De fluorescentie van 169.677 cellen werd geanalyseerd 33.600 afbeeldingen effluent verkregen uit 28 locaties in de microfluïdische apparaat om de 70 uur van het experiment. We gebruikten een omgekeerde microscoop uitgerust met een fluorescentie verlichtingssysteem en een CMOS-camera. De YFP beelden werden verkregen met een 500/20 nm excitatie filter, een 535/30 nm emissie filter, en een T515lp dichroic. Beelden werden genomen met een contrast doel 40X fase, onder Köhler verlichting. Beelden werden opgenomen in 16-bit kleurdiepte met 87 pixels per micrometer kwadraat. De kweek werd blootgesteld aan variërende intensiteiten van blauw licht gedurende 6 uur intervallen, gevolgd door volledige duisternis gedurende 6 uur intervallen. De cultuur waren blootgesteld vóór de eerste meting, daarom wordt een fluorescentie-intensiteit afneemt tijdens de eerste donkere periode aan het licht. </ P>
Figuur 9 toont de fluorescentie door YFP productie na activering van het optogenetic als reactie op het verlichten van de kweekvat. Het toont het nut van enkele cel metingen van de fluorescentie in een populatie gemiddelde eencellige gemeten hoe de populatie verdeling van fluorescentie-intensiteit. Let op de uitschieter bij 42 h 26 min. Nadat de bijbehorende afbeeldingen, bleek dat er klonten van cellen in het merendeel van de beelden worden gebruikt om de samengestelde achtergrondbeeld ontwikkeld, waardoor artefacten die cellen in de achtergrond afgetrokken beeld leek. Ook een zeepbel uit het kweekvat werd gepompt om de microfluïdische kanaal en delen van de randen waren verward als cellen door de beeldanalyse algoritme. Aangezien noch de bel of de voorwerpen uit het aftrekken van de achtergrond overeen met de werkelijke cellen, de gemeten fluorescentie-intensiteitlager is dan de auto-fluorescentie van de cellen. Deze figuur toont de kwaliteit van de gegevens die automatisch meer dan 3 d kunnen worden verworven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 8: visuele voorstelling van de beeldanalyse algoritme. Deze beelden zijn bijgesneden en uitgebreid voor kijkgemak. (A) Zes beelden worden verworven om de achtergrond afgetrokken fase contrast beeld van de celkweek te genereren. Na het belangrijkste beeld wordt verkregen, worden vijf extra beelden die met de effluent-bemonsteringspomp kort ingeschakeld tussen elke aankoop om ervoor te zorgen dat de cellen worden verplaatst. Een samengestelde achtergrondbeeld wordt gegenereerd uit de vijf componentbeelden. De waarde van elke pixelde achtergrondafbeelding in de mediaanwaarde van diezelfde pixel over de 5 component beelden. (B) Het beeld-achtergrond afgetrokken wordt vervolgens omgezet in een binair. De binaire Vervolgens wordt verwijd en de gaten in continue gedeelten van de binaire gevuld. De gele lijnen overeen met geselecteerde gebieden van belang (ROI), op basis van grootte en circulariteit criteria. (C) De ROI worden afgebeeld op de fluorescerende beeld, waarbij de fluorescentie van elke cel wordt gemeten als de helderste pixel in het ROI. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 9: Spreiding van de bevolking van de fluorescentie-intensiteiten in de tijd. In deze deelfiguren logaritme van de gemeten fluorescence wordt weergegeven, volgt de gangbare praktijk in flowcytometrie. De lijn in de A en B geeft de intensiteit van het licht geabsorbeerd of afgebogen door de cultuur, die wordt gemeten als het verschil in intensiteit tussen licht dat door steriele media en het licht dat door celkweek in het kweekvat. Het is uitgezet tegen de tweede ordinaat-as. (A) Een doos en whisker plot (5e percentiel, 25e percentiel, mediaan, 75e percentiel, 95 ste percentiel) van de logaritme van de gemeten fluorescentie van de bevolking in de tijd. (B) een 2-dimensionaal histogram van dezelfde gegevens, waarbij de kleur overeenkomt met de genormaliseerde frequentie van cellen met een gemeten fluorescentie in het bereik van de overeenkomstige bak. De kleuren werden geschaald naar het bereik van data zonder dat de uitschieter op 42 h 26 min inbegrepen. De genormaliseerde frequentie van de uitschieter in de laagste fluorescentie binis 0,7. (C) Ééndimensionale histogrammen van de logaritme van de gemeten fluorescentie van de populatie voor de eerste geregistreerde blootstelling aan licht en na de grootste blootstelling aan licht. Het toont aan dat de licht-geïnduceerde expressie van YFP in deze stam bimodaal. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We hebben dit apparaat met flexibiliteit in het achterhoofd. Al het gebruikte code is gratis en open-source. Het beeld standaard analyseproces naar segment cellen is eenvoudig en loopt snel op. Custom analyse kan worden uitgevoerd door het opnemen van input van de gebruiker, terwijl het analyseren van een representatief beeld van de Fiji-grafische user interface, het omzetten van de input voor een BeanShell script, en dan het instellen van de plugin om het script te bellen. Wanneer het wordt genoemd, zal dit script een String array met de naam "beelden" met het bestand paden naar de meest recente set van achtergrond afgetrokken beelden worden verzonden. Beelden en gegevens worden opgeslagen als zij worden verzameld, zodat zij niet verloren als een experiment abrupt eindigt. Een blauwe LED-array is gekozen voor het induceren optogenetic ons systeem, maar het kan worden vervangen door LED's van verschillende kleuren. Er zijn extra input en output pinnen op de microcontroller en doorgaande gaten tegen MOSFET schakelaar en relais schakelaar op de printplaat die het gemakkelijkdit systeem worden aangepast voor complexere doeleinden. Bijvoorbeeld, om dit apparaat te bedienen als turbidostat, gebruik maken van de extra pinnen op de microcontroller een LED stroom te voorzien en te lezen waarden uit een licht-sensor vastgebonden aan het kweekvat, en dan is de software om troebelheid te meten wijzigen en dienovereenkomstig te verdunnen van het vaartuig .
Er moet voor worden gezorgd dat de kweek niet vervuild, gevoelige microscopie apparatuur te beschermen en ervoor te zorgen dat de vloeistof stroomsnelheden consistent. Onzuiverheden alvorens wanneer de kweekvat opzettelijk geënt kan worden gedetecteerd door te wachten enkele dagen voor enten het vaartuig en het verifiëren dat er geen groei binnen. Om te voorkomen dat morsen celkweek op de microscoop doelstelling, controleer dan of de microfluïdische apparaat niet lekken door eerst pompen celkweek door middel van het over een absorberende doek. Wanneer de stroming van media in het kweekvat inconsistent is meestal omdat de buis omde rollen van de peristaltische pomp is te slap. Als de luchtstroom uit het aquarium pomp is inconsistent, ervoor te zorgen dat er geen U-vormige bochten in de effluent buis waar de vloeistof kan bundelen en inconsequent weerstaan luchtstroom. Als buizen verstopt raakt na een experiment, omdat de media is opgedroogd binnenkant van het, genieten van de verstopte buizen in een warmwaterbad om de klomp te ontbinden.
Er zijn intrinsieke beperkingen om dit protocol te overwegen bij het plannen van een experiment of het analyseren van de resultaten. Afhankelijk van de verdunning en buislengte gebruikt, is er een vertraging van ongeveer 10 minuten waarbij de celkweek het kweekvat op de microscoop wordt gepompt. Daarom is het niet goed geschikt voor het bestuderen gebeurtenissen over kortere tijdschalen. Ook tijdens het experiment continu koelen gedurende tien dagen, alleen beperkt door het volume van media, de evolutie van de celkweek worden beschouwd als de duur van het experiment toeneemt. de limiting voedingsstoffen van de media een grote invloed op de stofwisseling en genexpressie 35, 36, 37, 38, 39 en moet derhalve worden bepaald op basis van de aspecten van de fysiologie bestudeerd. Bij het analyseren van de resultaten, de beelden, vooral de beelden van afgelegen datapunten-moet worden herzien voor fouten in de manier waarop de ROI's werden geïdentificeerd door de beeldanalyse routine. Het is mogelijk dat luchtbellen of artefacten te verwarren op cellen, waardoor de gemeten fluorescentie scheeftrekken. Een eenvoudige manier om dergelijke foutieve meting te voorkomen, is alle ROI ontdoen met fluorescentie-intensiteit onder de auto-fluorescentie-intensiteit.
Dit protocol zal nuttig zijn voor het meten van fluorescentie-intensiteit en / of cellulaire morfologie van effluent celkweek in reactie op licht in organismen die kunnen groeien in continue cultuur, ingesteldTLE om een consistente focal plane wanneer not stirred, en worden automatisch herkend door een beeldanalyse algoritme. De standaard cel identificatie-algoritme gebruikt hier zullen de meeste rechtstreeks van toepassing zijn op ruwweg sferische microben die lijken op gist zijn. Een alternatief 40 van dit protocol is om microben te groeien in een set van batch culturen, en dan proeven van een partij voor elk tijdstip en karakteriseren van het monster door flowcytometrie. De voordelen van de hier beschreven protocol zijn de monsterneming van dezelfde cultuur, vele monsters kunnen worden genomen, en het proces is geautomatiseerd. Dit protocol verbetert ook op een soortgelijke methode waarbij optogenetic gist waren continu gekweekt en onder een microscoop 34 afgebeeld door de overname van meerdere foto's snel en niet vertekenende ROI identificatie met behulp van fluorescentie. Een groot voordeel van dit protocol is dat veel metingen van afzonderlijke cellen regelmatig over meerdere dagen witho kan worden verkregenut gebruikersinvoer. Na meting van de respons van de microbiële kweek blootstelling aan licht, kan een volgende stap te implementeren in silico regeltraject van het antwoord.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We willen graag Molly Lazar en Verónica Delgado erkennen voor hulp bij het testen van het protocol, Kieran Sweeney voor nuttige discussies en bewerken, en Taylor Scott, My An-adirekkun en Stephanie Geller voor kritische lezing van het manuscript. Megan Nicole McClean, Ph.D. behaalde een Carrière Award op het Wetenschappelijk Interface van de Burroughs Wellcome Fonds.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Extensive lab manual | GitHub | NA | An extensive, regularly updated lab manual is available in the “Optogenetic Chemostat Files” GitHub repository (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files). This also includes a description of the microfluidic mold used to generate the representative results. |
| Fritzing Design Viewer | Fritzing | NA | The free, open-sourced software to view and edit the .fzz type circuit board designs is available at "http://fritzing.org/download/" |
| Arduino Uno R3 (Atmega328 - assembled) | Adafruit | 50 | Microcontroller. 1 required. |
| Arduino Stackable Header Kit | SparkFun Electronics | 10007 | Female pin headers for connecting PCB to microcontroller. 1 required. |
| Adjustable 30W 110V soldering iron - XY-258 110V | Adafruit | 180 | For making electrical connections to the PCB. 1 required. |
| Soldering iron stand | Adafruit | 150 | For making electrical connections to the PCB. 1 required. |
| Mini Solder spool - 60/40 lead rosin-core solder 0.031" diameter - 100g | Adafruit | 145 | For making electrical connections to the PCB. 1 required. |
| 0.1 μF capacitor | SparkFun Electronics | COM-08375 | Stabilizes voltage in PCB. 1 required. |
| 10 μF capacitor | SparkFun Electronics | COM-00523 | Stabilizes voltage in PCB. 1 required. |
| MAX7219CNG LED Matrix/Digit Display Driver - MAX7219 | Maxim | MAX7219CNG | LED driver. 1 required. |
| 8 pin IC Socket | Mouser Electronics | 575-144308 | 16 required. These will be stacked on top of each other to support the culture vessel above the LED matrix. |
| 24 Pin IC socket | Mouser Electronics | 535-24-3518-10 | Optional. Use this to reversibly attach the MAXIM 7219CNG driver to the PCB. |
| Digital multimeter | Adafruit | 2034 | For troubleshooting electronics. 1 required. |
| Break Away Headers - 40-pin Male (Long Centered, PTH, 0.1") | SparkFun Electronics | PRT-12693 | Male pin headers for connected LED matrix to printed circuit board. Ends can be trimmed with wire cutters. 1 set required. |
| Flush diagonal wire cutters | Adafruit | 152 | For trimming long pin headers and cutting power cables. 1 required. |
| Premium Female/Female Jumper Wires - 40 x 12" (300mm) | Adafruit | 793 | Wire ribbon for connecting breadboard to LED matrix. Can be connected end-to-end with male pin-headers to be longer. 1 required. |
| Half-size breadboard | Adafruit | 64 | The LED matrix will connect to this and the culturing vessel will rest above it. |
| Miniature 8x8 Blue LED Matrix | Adafruit | 956 | Light source. Dominant wavelength is 470nm (blue). 1 required. Alternative miniature LED matrices from the same vendor are available with dominant wavelengths: 624 nm (red), 588 nm (yellow), 525 nm (green), 572 nm (yellow-green), and white. |
| Stackable header-3 pin | SparkFun Electronics | 13875 | 8 required. |
| Resistor Kit - 1/4W (500 total) | SparkFun Electronics | 10969 | For electronics. 1 required. |
| IRL520N MOSFET | International Rectifier | IRL520N | Voltage regulating switch for controlling DC current. 4 required. |
| Hook-Up Wire - Assortment (Solid Core, 22 AWG) | SparkFun Electronics | PRT 11367 | Wire for electronics. 1 required. |
| 5V 2A (2000mA) switching power supply - UL Listed | Adafruit | 276 | Power supply for the heating pad and Arduino. 2 required. |
| 12 VDC 1000mA regulated switching power adapter - UL listed | Adafruit | 798 | For peristaltic pumps. 2 required. |
| Electric Heating Pad - 10cm x 5cm | Adafruit | 1481 | For heating the bioreactor. 1 required. |
| Low flow variable flow peristaltic pump | Fisher Scientific | 13-876-1 | For pumping media. 1 required |
| Medium flow variable flow peristaltic pump | Fisher Scientific | 13-876-2 | For pumping culture. 1 required. |
| 9 VDC 1000mA regulated switching power adapter - UL listed | Adafruit | 63 | For microcontroller power supply. Order 1. |
| High Temp Waterproof DS18B20 Digital temperature sensor + extras | Adafruit | 642 | Thermometer for the bioreactor. 1 required. |
| Micromanager | Micromanager | NA | The free, open-sourced microscope control software is available at "https://micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release" |
| FIJI | ImageJ | NA | The free, open-sourced image analysis software is available at "http://fiji.sc/" |
| Arduino Integrated Development Environment | Arduino | NA | The free, open-sourced IDE is available at "https://www.arduino.cc/en/Main/Software" |
| Custom code | GitHub | NA | The custom microcontroller code and "Bioreactor Controller" plugin are available in the “Optogenetic Chemostat Files” GitHub repository (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files). |
| USB Cable A to B - 6 Foot | SparkFun Electronics | CAB-00512 | Used to download data to microcontroller. 1 required. |
| bioreactorTimecourse_example.csv | GitHub | NA | The advantage of loading LED matrix values from a CSV file is that a program can be called by the plugin to update those values based on image analysis results, and those values can be reloaded to the microcontroller, enabling feed-back control. It is available from the “Optogenetic Chemostat Files” GitHub repository (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files). |
| Tota-frost gels (diffusion paper) | B&H | B&H # LOFSFTL MFR # T1-72 |
For LED matrix. 1 required. |
| Kitting Sheet Crosslink 1/4x12x24in | Grainger, inc | 20JL37 | Black foam for culturing vessel enclosure. 4 required. |
| Standard Photodiode Power Sensor, Si, 200 - 1100 nm, 50 mW | Thorlabs | S120VC | For measuring light intensity. 1 required. |
| Labelling Tape | Fisher Scientific | 159015N | For labelling and securing loose components. 1 required. |
| Compact Power and Energy Meter Console, Digital 4" LCD | Thorlabs | PM100D | For measuring light intensity. 1 required. |
| 100mL GL45 hybridization glass bottle | Bellco Glass, Inc. | (7910-40150) | Bioreactor vessel. 1 required. |
| Six port assembly | Bellco Glass, Inc. | Custom | For the bioreactor vessel. Tubing Specs: .125" OD x .055"ID. Port A: 1.0" long above cap slug and to bottom of tube. Ports B,C,E,F: 1.0" long above cap slug, 33 mm long below. Port D: 1.0" long above cap slug, 65 mm long below. 1 required. Includes 45 mm diameter polypropylene open top screw cap and a white silicone gasket to ensure a tight seal between the cap and the vessel. |
| Scotch Magic Tape 3105, 3/4 x 300 Inches, Pack of 3 | Amazon | B0009F3P3U | Clear scotch tape. This is available from many other vendors. It is used to cover markings on the culturing vessel and to secure the coverglass with the PDMS channel to the aluminum support frame. |
| 1/16" ID x 3/16" OD x 1/16" Wall Tygon Sanitary Silicone Tubing | United States Plastic Corp. | 57288 | Tubing. ~25' required. |
| Cole-Parmer Twistit white rubber stopper, size 10 | Cole-Parmer | EW-62992-32 | Media flask stopper and effluent flask stopper. 2 required. |
| 2L Laboratory Flask | Pyrex | 4980 | Media flask and effluent flask. 2 required. |
| Day pinchcock | Fisher Scientific | 5867 | For pinching tubes shut. 3 required. |
| Replacement tubing assembly 1/16" ID | Traceable Products | 3372 | The peristaltic pumps come with a set of tubes, but they wear out after weeks of use. |
| Replacement tubing assembly 1/50" ID | Traceable Products | 3371 | The peristaltic pumps come with a set of tubes, but they wear out after weeks of use. |
| Male luer with lock ring x 1/16" hose barb, Nylon, 25/pk | Cole-Parmer | EW-45505-00 | Connectors. ~10 luers are required. |
| Male luer with lock ring x 1/8" hose barb, Nylon, 25/pk | Cole-Parmer | EW-45505-04 | Connectors. 5 required, one for each rubber stopper hole to fill with tubing. |
| Female luer x 1/16" hose barb adapter, Nylon, 25/pk | Cole-Parmer | EW-45502-00 | Connectors. ~10 luers required. |
| Female luer x 3/16" hose barb adapter | Cole-Parmer | EW-45502-08 | Connectors. ~10 luers required. |
| Cole-Parmer Luer Accessory, Female Luer Cap, Nylon, 25/Pk | Cole-Parmer | SC-45502-28 | |
| Cole-Parmer Luer Accessory, Male Luer Lock Plug, Nylon, 25/Pk | Cole-Parmer | EW-45505-56 | |
| Microbore PTFE Tubing, 0.022"ID x 0.042"OD, 100 ft/roll | Cole-Parmer | EW-06417-21 | Tubing. 1 roll required. |
| Masterflex platinum-cured silicone tubing, L/S 13, 25 ft | Cole-Parmer | EW-96410-13 | Tubing. ~25' required. |
| 3/16" ID x 1/4" OD x 1/32" Wall Tygon Sanitary Silicone Tubing | United States Plastic Corp. | 57293 | Tubing. ~1' required. |
| Vacuum filter | Fisher Scientific | 974107 | Nalgene vacuum filter for sterile filtering media. |
| Aquel Oxy-Boost 200 | Rena Aquatic Supply | AP200 | Dual diaphram adjustable flow air pump for aerating and mixing media. 1 required. |
| 0.2 μm pore syringe filter | Corning International | 431229 | This ensures that air from the aquarium pump does not contaminate the apparatus. 1 required. |
| Slygard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | Slygard 184 | For microfluidic device. 1 required. |
| American Safety Razor GEM Scientific Single-Edge Razor Blades | Fisher Scientific | 17989000 | For cutting tubes and PDMS. 1 blade required. |
| Harris Uni-Core hole puncher 1.2mm ID | Sigma-Aldrich | WHAWB100028 ALDRICH | For punching inlet/outlet in microfluidic device. 1 required. |
| Microscope cover glass 22x60-1.5 | Fisher Scientific | 12-544-G | For microfluidic device. 1 required. |
| Rectangular aluminum frame with a square window | Custom | Custom | To support the microfluidic channel. Outer dimensions: 3 inches x 1.25 inches. Inner dimmensions (cut out portion): 7/8 inches x 7/8 inches Thickness: ~1/32 inches |
References
- Motta-Mena, L. B., Reade, A., et al. An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics. Nature chemical biology. 10 (3), 196-202 (2014).
- Hughes, R. M., Bolger, S., Tapadia, H., Tucker, C. L. Light-mediated control of DNA transcription in yeast. Methods. 58 (4), 385-391 (2012).
- Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. A light-switchable gene promoter system. Nature biotechnology. 20 (10), 1041-1044 (2002).
- Polstein, L. R., Gersbach, C. a Light-inducible spatiotemporal control of gene activation by customizable zinc finger transcription factors. J Am Chem Soc. 134 (40), 16480-16483 (2012).
- Polstein, L. R., Gersbach, C. a A light-inducible CRISPR-Cas9 system for control of endogenous gene activation. Nature Chemical Biology. 11 (3), 198-200 (2015).
- Yang, X., Jost, A. P. T., Weiner, O. D., Tang, C. A light-inducible organelle-targeting system for dynamically activating and inactivating signaling in budding yeast. Molecular biology of the cell. 24 (15), 2419-2430 (2013).
- Lee, S., Park, H., et al. Reversible protein inactivation by optogenetic trapping in cells. Nature methods. 11 (6), 633-636 (2014).
- Kennedy, M. J., Hughes, R. M., Peteya, L. A., Schwartz, J. W., Ehlers, M. D., Tucker, C. L. Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells. Nature Methods. 7 (12), 973-975 (2010).
- Yazawa, M., Sadaghiani, A. M., Hsueh, B., Dolmetsch, R. E. Induction of protein-protein interactions in live cells using light. Nat Biotechnol. 27 (10), 941-945 (2009).
- Zoltowski, B. D., Motta-Mena, L. B., Gardner, K. H. Blue light-induced dimerization of a bacterial LOV-HTH DNA-binding protein. Biochemistry. 52 (38), 6653-6661 (2013).
- Renicke, C., Schuster, D., Usherenko, S., Essen, L. O., Taxis, C. A LOV2 Domain-Based Optogenetic Tool to Control Protein Degradation and Cellular Function. Chemistry & Biology. 20 (4), 619-626 (2013).
- Novick, A., Szilard, L. Description of the chemostat. Science (New York, N.Y.). 112 (2920), 715-716 (1950).
- Monod, J. La technique de culture continue. Théorie et applications. Ann. Inst. Pasteur. 79 (4), 390-410 (1950).
- Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. A light-switchable gene promoter system. Nature Biotechnology. 20, 1041-1044 (2002).
- Kennedy, M. J., Hughes, R. M., Peteya, L. A., Schwartz, J. W., Ehlers, M. D., Tucker, C. L. Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells. Nature Methods. 7, 973-975 (2010).
- Olson, E. J., Tabor, J. J. Optogenetic characterization methods overcome key challenges in synthetic and systems biology. Nature chemical biology. 10 (7), 502-511 (2014).
- Botstein, D., Fink, G. R. Yeast: An experimental organism for 21st century biology. Genetics. 189 (3), 695-704 (2011).
- Galanie, S., Smolke, C. D. Optimization of yeast-based production of medicinal protoberberine alkaloids. Microbial cell factories. 14 (1), 144 (2015).
- Gerngross, T. U. Advances in the production of human therapeutic proteins in yeasts and filamentous fungi. Nature biotechnology. 22 (11), 1409-1414 (2004).
- van Maris, A. J. A., Abbott, D. A., et al. Alcoholic fermentation of carbon sources in biomass hydrolysates by Saccharomyces cerevisiae: current status. Antonie van Leeuwenhoek. 90 (4), 391-418 (2006).
- Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. Computer control of microscopes using µManager. Curr Protoc Mol Biol. , Chapter 14 (2010).
- Edelstein, A. D., Tsuchida, M. A., Amodaj, N., Pinkard, H., Vale, R. D., Stuurman, N. Advanced methods of microscope control using µManager software. Journal of biological methods. 1 (2), (2014).
- Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Bhattacharya, S., Datta, A., Berg, J. M., Gangopadhyay, S. Studies on surface wettability of poly(dimethyl) siloxane (PDMS) and glass under oxygen-plasma treatment and correlation with bond strength. Journal of Microelectromechanical Systems. 14 (3), 590-597 (2005).
- Saldanha, A. J., Brauer, M. J., Botstein, D. Nutritional homeostasis in batch and steady-state culture of yeast. Molecular Biology of the Cell. 15, 4089-4104 (2004).
- Boer, V. M., Tai, S. L., et al. Transcriptional responses of Saccharomyces cerevisaie to preferred and nonpreferred nitrogen sources in glucose-limited chemostat cultures. FEMS Yeast Research. 7, 604-620 (2007).
- Boer, V. M., Amini, S., Botstein, D. Influence of genotype and nutrition on survival and metabolism of starving yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 6930-6935 (2008).
- Brauer, M. J., Huttenhower, C., et al. Coordination of growth rate, cell cycle, stress response and metabolic activity in yeast. Molecular Biology of the Cell. 19, 352-367 (2008).
- Gresham, D., Dunham, M. J. The enduring utility of continuous culturing in experimental evolution. Genomics. 104 (6), 399-405 (2014).
- Liu, H., Yu, X., et al. Photoexcited CRY2 interacts with CIB1 to regulate transcription and floral initiation in Arabidopsis. Science (New York, N.Y.). 322 (5907), 1535-1539 (2008).
- McIsaac, R. S., Oakes, B. L., Wang, X., Dummit, K. A., Botstein, D., Noyes, M. B. Synthetic gene expression perturbation systems with rapid, tunable, single-gene specificity in yeast. Nucleic Acids Research. 41 (4), 1-10 (2013).
- McIsaac, R. S., Petti, A. A., Bussemaker, H. J., Botstein, D. Perturbation-based analysis and modeling of combinatorial regulation in the yeast sulfur assimilation pathway. Molecular biology of the cell. 23 (15), 2993-3007 (2012).
- McIsaac, R. S., Silverman, S. J., et al. Fast-acting and nearly gratuitous induction of gene expression and protein depletion in Saccharomyces cerevisiae. Molecular biology of the cell. 22 (22), 4447-4459 (2011).
- Melendez, J., Patel, M., Oakes, B. L., Xu, P., Morton, P., McClean, M. N. Real-time optogenetic control of intracellular protein concentration in microbial cell cultures. Integrative biology quantitative biosciences from nano to macro. 6 (3), 366-372 (2014).
- Brauer, M. J., Huttenhower, C., et al. Coordination of growth rate, cell cycle, stress response, and metabolic activity in yeast. Molecular biology of the cell. 19 (1), 352-367 (2008).
- Boer, V. M., Crutchfield, C. A., Bradley, P. H., Botstein, D., Rabinowitz, J. D. Growth-limiting intracellular metabolites in yeast growing under diverse nutrient limitations. Molecular biology of the cell. 21 (1), 198-211 (2010).
- Markham, B. E., Byrne, W. J., Methods, E. Uptake, storage and utilization of phosphate by yeast. Journal of the Institute of Brewing. 73, 271-273 (1967).
- Kazemi Seresht, A., Palmqvist, E. A., Olsson, L. The impact of phosphate scarcity on pharmaceutical protein production in S. cerevisiae: linking transcriptomic insights to phenotypic responses. Microbial cell factories. 10 (1), 104 (2011).
- Shimizu, K. Regulation Systems of Bacteria such as Escherichia coli in Response to Nutrient Limitation and Environmental Stresses. Metabolites. 4 (1), 1-35 (2013).
- Olson, E. J., Hartsough, L. A., Landry, B. P., Shroff, R., Tabor, J. J. Characterizing bacterial gene circuit dynamics with optically programmed gene expression signals. Nature methods. 11 (4), 449-455 (2014).
