Summary
Se diseñó un aparato de cultivo continuo para uso con sistemas de optogenética para iluminar cultivos de microbios y periódicamente celdas de imagen en el efluente con un microscopio invertido. El cultivo, el muestreo, tratamiento de imágenes y análisis de imágenes son totalmente automatizadas para que las respuestas dinámicas a la iluminación pueden ser medidos durante varios días.
Abstract
optogenética sistemas utilizan proteínas codificadas genéticamente que cambian la conformación en respuesta a longitudes de onda específicas de luz para alterar los procesos celulares. Hay una necesidad para el cultivo y la medición de los sistemas que incorporan programados iluminación y la estimulación de los sistemas de optogenética. Se presenta un protocolo para la construcción y el uso de un aparato de cultivo continuo para iluminar las células microbianas con las dosis programadas de la luz, y automáticamente adquirir y analizar imágenes de las células en el efluente. El funcionamiento de este aparato como un quimiostato permite que la tasa de crecimiento y el medio ambiente celular para ser estrechamente controlados. El efluente del cultivo celular continua se muestrea regularmente y las células se imágenes de microscopía de múltiples canales. El cultivo, el muestreo, tratamiento de imágenes y análisis de imágenes son totalmente automatizadas para que las respuestas dinámicas de la intensidad de la fluorescencia y la morfología celular de células de la muestra del efluente de la cultura se miden a través de múltiples díassin intervención del usuario. Se demuestra la utilidad de este aparato de cultivo mediante la inducción de la producción de proteínas de forma dinámica en una cepa de Saccharomyces cerevisiae con un sistema de ingeniería optogenético que activa la transcripción.
Introduction
Sistemas Optogenética utilizan la luz para controlar una lista creciente de procesos celulares que incluyen la expresión génica, 1, 2, 3, 4, 5 la localización de proteínas, actividad de la proteína 6, 6, 7, 8 la proteína de unión, 8, 9, 10 y degradación de proteínas. 11 Un método para el cultivo de células en un entorno controlado con la estimulación óptica programada y para medir su respuesta en escalas de tiempo biológicamente relevantes es necesario para explotar el potencial de estas herramientas para la investigación en biología celular y biotecnología. Nuestro método se aprovecha de chemostasis para mantener una tasa de crecimiento constante de celda en un bien mezclada, aeclasificar y recipiente de cultivo de vidrio de temperatura controlada 12, 13 que está expuesto a la iluminación programado. Nosotros imagen células individuales en el efluente de cultivo con un microscopio invertido para medir la respuesta de la cultura a la iluminación programado. El cultivo, toma de muestras, imágenes y análisis de imágenes son totalmente automatizadas de manera que la intensidad de fluorescencia y la morfología celular del cultivo celular efluente se pueden medir a través de múltiples días sin intervención del usuario.
Este protocolo se puede implementar en la mayoría de laboratorios familiarizados con creciente cultivo celular y microscopía, y el aparato utilizado es barato y está hecho de componentes fácilmente disponibles. Un recipiente de cultivo transparente se coloca por encima de una matriz de diodos emisores de luz (LED) capaces de emitir 1 mW / cm 2 -10 mW / cm 2 de la luz. Los microbios se cultivan en el recipiente de cultivo de forma continua; una bomba peristáltica se utiliza para agregar los medios de comunicación en eltasa de dilución, otro se usa para retirar de cultivo a una tasa menor para el microscopio, y la diferencia se escapa a través de una salida de rebosamiento. Una almohadilla de calefacción mantiene la temperatura. Se bombea aire continuamente en el recipiente de cultivo para mantener una presión positiva, así como para mezclar y airear el cultivo. A excepción de la bomba de aire, la energía a estos dispositivos está regulado por un microcontrolador que también recibe la entrada desde un termómetro y un ordenador de sobremesa conectado. El cultivo celular efluente se bombea a un dispositivo de microfluidos de la etapa de un microscopio invertido. No fluorescente y las imágenes fluorescentes se adquieren automáticamente. Las células en las imágenes se caracterizan por un algoritmo que localiza cada célula como una región de interés (ROI) y mide las propiedades de cada ROI.
Para demostrar una aplicación de este protocolo, se midió la respuesta a diferentes intensidades de luz de células de Saccharomyces cerevisiae ingeniería con una responsa de luz azulve sistema optogenético que controla la transcripción de la proteína fluorescente. S. cerevisiae, comúnmente conocida como la levadura de panadero, se seleccionó debido a múltiples sistemas optogenética para controlar la expresión génica en este sistema ya existen 14, 15, 16. Además, este organismo modelo se utiliza comúnmente para estudios en la biología de sistemas 17 y como un chasis para aplicaciones biotecnológicas 18, 19, 20. Nuestros resultados representativos demuestran que este protocolo se puede utilizar para controlar la transcripción de un cultivo durante varios días mediante la variación de las intensidades de luz de entrada y la medición de la producción de un indicador fluorescente.
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Protocol
Figura 1: El aparato de cultivo continuo. Este diagrama simplificado muestra cómo el aparato debe ser montado cuando se utiliza para la cultura, iluminar, y medir las propiedades ópticas de los microbios. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Visión general del protocolo. Los pasos en la región sombreada se deben repetir cada vez que se utiliza el protocolo. Control de bucle cerrado 34 es posible, pero no se implementa en este protocolo.
1. Montar el termómetro al tablero de circuitos
Figura 3: Conexiones para leer los valores del termómetro. Este diagrama muestra cómo el termómetro digital debe estar conectado a la PCB de modo que el microcontrolador puede obtener retroalimentación para controlar la temperatura del cultivo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
- Soldar la tierra, los datos y las líneas de tensión positiva del termómetro digital para sus respectivos agujeros pasantes marcados "GD + V".
- Clip de un pin de un conector de 3 pines hembra y recortar los 2 pines restantes con máquinas de cortar el alambre, de manera que puede encajar en los dos agujeros pasantes de la etiqueta "R2" y no obstruir el microcontrolador. Soldar esto en su lugar. Conectar los dos pasadores soldadas mediante la inserción de una resistencia de 4,7 kW en la cabecera del pasador.
2. Conectar la alimentación de ConComponentes de control a la tarjeta de circuitos
Figura 4: Conexiones de control de potencia a la resistencia de calentamiento. Este diagrama muestra cómo las partes de PCB y los accesorios deben ser montados con el fin de controlar el poder de la resistencia de calentamiento. Las partes para el control de las bombas peristálticas están conectados de una manera similar. Tenga en cuenta que los componentes para el termómetro se han eliminado para mayor claridad. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
- Se quita a 1 cm de los pasadores de cinco cabeceras de 3 pines hembra. Soldar estos a las posiciones de la placa de circuito impreso (PCB) marcado como "# 1", "# 2", "# 3", "# 4", y "CB E."
- Se quita 1 cm de los pines de un encabezado de 6 pines y 8 pines hembra. Soldar éstas lado a lado parala columna de orificios pasantes a través de la etiqueta K1 K14.
- Conecte la resistencia de calentamiento de la placa de circuito.
- Inserte los extremos de una resistencia de 100 kW en el K1 orificios pasantes etiquetados y K2 en el PCB. Insertar un transistor de metal-óxido-semiconductor de efecto de campo (MOSFET) en la posición marcada # 1 en el PCB, con la etiqueta de la MOSFET que mira hacia el K1 a K14 a través de los orificios pasantes de manera que el pasador de fuente es más cercano a la "# "etiqueta, y la clavija de drenaje está más alejado de la" etiqueta # ".
- Cortar la línea de tierra del cable de 5 V de corriente continua (DC) fuente de alimentación y conectarlo a J2. Conectar la línea de tierra de la resistencia de calentamiento a J1. Conectar K3 al pin 3 con una resistencia de 1 kW. Corriente ahora solo debería fluir de J1 a J2 cuando el pin 3 se ajusta a + 5V.z
NOTA: Las funciones de ajuste de resistencia / MOSFET como un interruptor que permite que la corriente fluya desde J1 J2 pin para cuando el pin 3 del microcontrolador se establece en 5 V.
- Conectarla bomba peristáltica lento.
- Inserte los extremos de una resistencia de 100 kW en el K4 orificios pasantes etiquetados y K5 en el PCB. Insertar un MOSFET en la posición marcada # 2 en el PCB, con la etiqueta de la MOSFET que mira hacia el K1 a K14 a través de los orificios pasantes de manera que el pasador de fuente es la más cercana a la etiqueta "#", y el pasador de drenaje está más alejado del la etiqueta "#".
- Cortar la línea de tierra del cable de alimentación de 12 V CC de la bomba peristáltica lento. Conectar la bomba peristáltica mirando hacia el extremo de J3 y la verruga de la pared mirando hacia el extremo de J4. Conectar K6 al pin 4 con una resistencia de 1 kW. Corriente ahora solo debería fluir de J3 J4 que cuando el pin 4 está ajustado a +5 V.
- Conectar la bomba peristáltica rápida
- Inserte los extremos de una resistencia de 100 kW en el K7 orificios pasantes etiquetados y K9 en el PCB. Inserte un MOSFET en la posición marcada # 3 en el circuito impreso, con la etiqueta del MOSFET que mira hacia el K1 a K14 a través de los orificios pasantes s o que el pasador de fuente es la más cercana a la etiqueta "#", y el pasador de drenaje está más alejado de la etiqueta "#".
- Cortar la línea de tierra del cable de alimentación de 12 V CC de la bomba peristáltica rápido. Conectar la bomba peristáltica hacia fin a J5 y la verruga de la pared mirando hacia el extremo de J6. Conectar K9 al pin 5 con una resistencia de 1 kW. Corriente ahora solo debería fluir de J5 J6 cuando el pin 5 se establece en 5 V.
3. Conectar la matriz de LED a la tarjeta de circuitos
Figura 5: Conexiones para controlar la matriz de LED. Este diagrama muestra cómo la matriz de LED se debe conectar a la PCB. También muestra que la PCB se pueden apilar en el microcontrolador. Tenga en cuenta que los componentes para el termómetro y para controlar la potencia DC a otros dispositivos se han quitado para mayor claridad.en / ftp_upload / 54894 / 54894fig5large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
- Soldar el 6 pines, 10 pines, y los dos conectores macho hembra de 8 pines en los orificios pasantes en los lados de la PCB de modo que pueda ser apilados uno encima del microcontrolador.
- Soldar el 100 nF y los condensadores 10 mF a sus posiciones marcadas en el PCB, señalando que el terminal negativo del condensador de 10 mF (plomo más corto) debe estar conectado al agujero a través marcado con un signo negativo.
- Soldar el conductor del LED al 2 por 12 conjunto de orificios de paso, con la muesca del conductor lejos de los orificios pasantes reservados para la matriz de LED.
- Soldar 2 columnas de cabezales de pin macho a los agujeros pasantes marcados para la matriz de LED, y recortar los extremos de éstos por debajo del tablero de tal manera que no obstruyan el microcontrolador. Las conexiones a través de dos tiras de 8 hilos de cables hembra / hembra de los puentes. Conectar un segundo conjunto de machoconectores macho en el otro extremo de los cables de puente.
- Inserte la matriz de LED sobre la mediana de la placa, y luego insertar el segundo conjunto de conectores macho a las columnas a cada lado de la matriz. Asegúrese de que las conexiones eléctricas son los mismos que si la matriz de LED se ha conectado directamente a la PCB con la cara de la etiqueta de la matriz que corresponde a la columna con la etiqueta de orificios pasantes.
- Clip de un pin de un conector de 3 pines hembra y recortar los 2 pines restantes con máquinas de cortar el alambre, de manera que puede encajar en los dos orificios pasantes etiquetados con "R1" y no obstruir el microcontrolador. Soldar esto. Conectar los dos pasadores soldadas mediante la inserción de una resistencia de 1 kW en la cabecera del pasador.
Nota: El recipiente de cultivo se apilan sobre la matriz de LED. Si las cintas de alambre obstruyen el recipiente, ellos desplazamiento de la matriz. A continuación, utilice cable de núcleo sólido para cerrar la brecha entre los pasadores de la matriz y los pasadores de cinta de alambre, de tal manera que las conexiones eléctricas no CHange.
4. Instalar el software y conectar con el hardware
- Apilar el PCB en el microcontrolador.
- Sigue los enlaces en la lista de materiales para descargar el entorno de desarrollo integrado (IDE) y el código personalizado para el microcontrolador.
- Conectar el microcontrolador a la computadora mediante un cable microscopio AB bus serie universal (USB). Compilar y cargar el código personalizado para el microcontrolador.
- Descargar Micro-Manager 21, 22 y 23 de FIJI. Configurar Micro-Manager como un plug-in FIJI copiando todos los archivos ".dll", el directorio "mmplugins", y el directorio "mmautofocus" desde el directorio en el Micro-Manager se descargó en el directorio "Fiji.app". También, copiar los "plugins / Micro-Manager" de directorio en el directorio "Fiji.app/plugins".
- Descargar el "BioreactorController.jar" int archivoo el directorio "Fiji.app/mmplugins".
- Abrir Micro-Manager desde Fiji> Plugins> Micro-Manager> Micro-Studio Manager. Utilice el asistente de configuración de hardware para configurar el software para controlar el microscopio. Incluir el dispositivo "FreeSerialPort" en el Asistente con la etiqueta del puerto al que está conectado el cable USB AB.
5. Hacer y caracterizar el recinto a prueba de luz para el recipiente de cultivo
- Apilar tres zócalos IC 8 pines como bloques de construcción en el tablero en cada esquina de la matriz de LED de tal manera que el recipiente de cultivo puede descansar sobre ellos por encima de la matriz.
- Fijar una porción de papel de difusión bajo la capa superior de las tomas de corriente, de tal manera que la luz que incide sobre el recipiente de cultivo de la matriz de LED es difusa.
- Cortar tres 8 "por 6" porciones de espuma negro. Recortar una parte que es del mismo tamaño que el tablero electrónico (2,3 "x 3,5") desde el interior de la primera two y una porción que es el tamaño del rectángulo hecha por los sockets IC (0,9 "x 1,8") desde el interior de la tercera. Pila de estas capas más de la matriz de LED de manera que la capa final que contiene la abertura de 0,9 "x 1,8" se encuentra con la parte superior de los zócalos IC, y rodea la matriz de LED.
- Cortar una hoja adicional de espuma de negro por la mitad para formar un rectángulo de 6 "por 24". Rollo de esto en una columna hueca de espuma negro que el recipiente de cultivo puede encajar en con espacio para tubos y cables, de manera que se térmicamente y ópticamente aislar el recipiente de cultivo.
- Centre la columna hueca de espuma negro sobre la matriz de LED, y marcar el límite de la columna de la capa de espuma negro debajo de ella. Este límite marcará donde debe estar centrado en el futuro.
- Recortar una parte de 3 "x 3" de espuma negro. Utilice esta tarde como una tapa que puede ser pegado en la parte superior de la columna para bloquear la luz externa.
- Coloque el sensor de potencia fotodiodo a th e cultivando una gorra de vaso con cinta, coloque la tapa e inserte el recipiente de cultivo en el recinto.
- En Micro-Manager, vaya a Complementos> Controlador biorreactor. Establecer la matriz para iluminar en un subconjunto de la gama de posibles intensidades en intervalos de 30 s.
- Registrar las intensidades de luz como se muestra en la consola metros de potencia conectado al sensor de potencia. Estas medidas permitirán a la intensidad real de la luz que se conocerá cuando se ajusta el número de LEDs que se encienden y la corriente (PWM) por ancho de pulso modulado a los LEDs.
6. Preparar el recipiente de cultivo
Figura 6: Conexiones del buque. Este diagrama muestra cómo el recipiente y el tubo del aparato deben conectarse antes de ser tratado en autoclave.blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
- Marcar la altura correspondiente a cada 2 ml de la subasta de líquido en el intervalo de 10 ml a 30 ml en el recipiente de cultivo. Introduzca 10 ml de agua desionizada estéril, marque el nivel de agua, añadir 2 ml, marque el nivel del agua, y repetir hasta que el nivel de 30 ml se marca. Cubrir las inscripciones con cinta adhesiva transparente para que no se eliminan fácilmente, y desechar el líquido.
- Coloque el extremo largo del puerto de aluminio a través de la junta de silicona, en el recipiente de cultivo. Tornillo en la tapa.
- Cubrir una salida de puerto de aluminio corto con tubo de silicona ID 1/16 ". Enchufe el extremo distal mediante la inserción de un luer hembra de bloqueo y, a continuación la conexión de un conector de bloqueo luer macho. Esta salida es complementaria, y no será utilizado (tubo 6 en la Figura 6 ).
- Conectar dos segmentos cortos de 1/16 "tubo de silicona ID con cerraduras Luer macho y hembra. Conectar un extremo a una toma de puerto de aluminio corto y conecte el distal finales con un luer macho y conector luer hembra. El recipiente se inocula a través de este tubo (tubo 7 / 7.1 en la Figura 6).
- Conectar dos tubos de 1/16 "de identificación a los extremos del 1/16" ID del tubo peristáltico y los conectores. Conecte un extremo a un puerto de aluminio corta y el otro (tubo 4 en la Figura 6). Más tarde, este será conectado al matraz de medios de comunicación.
7. Preparar el frasco de Medios
- Conectar un "tubo de diámetro interior (ID) de silicona en el puerto de aluminio más largo. El tubo debe ser lo suficientemente largo como para alcanzar el matraz de medios de comunicación. Conectar un 1/8" 1/16 de cierre luer macho Identificación de un segmento corto de 1/16 " Identificación tubo, conecte este al tubo anterior ,, y luego insertar este corto segmento en el tapón de goma del frasco de los medios de comunicación (tubo 3 en la Figura 6).
- Sujetar el tubo. Esta conexión permite que el aire fluya desde el matraz de medios de comunicación para el recipiente de cultivo. Cuando el matraz de medios de comunicación se bombea más tarde con un aired este tubo se suelta, la cultura será mezclado, aireado, y se mantiene a una presión positiva por las burbujas entrantes.
- Inserte un "tubo de Identificación el tiempo suficiente para llegar al fondo del vaso en el tapón, a través del cual se transferirán los medios de comunicación. Conecte otro 1/16" 1/16 tubo de ID a éste, y luego un tubo de 3/16 "Identificación de eso. el tapón esto con un "ID de bloqueo luer hembra de 3/16 y un conector de bloqueo luer macho (tubo de 1 / 1.1 en la Figura 6).
- El tercer agujero en el tapón debe estar lleno de un segmento corto de 1/16 "tubo de ID, conectado a otros dos segmentos de tubo de diámetro medio y conectado en el extremo distal (tubo 2 / 2.1 en la Figura 6). Este se conectará a una bomba de vacío y después a una bomba de acuario.
NOTA: Si el tubo no puede caber fácilmente a través de los agujeros en el tapón de goma, cortar los extremos de la tubería en una inclinación. Entonces, el extremo inclinado que se empuja a través del orificio se puede utilizar para tirar el resto a través.
- Insertar un cierre luer macho en un segmento de 1/16 "tubo de silicona ID, y luego inserte firmemente 0.022" tubo de politetrafluoroetileno ID (PTFE). Por separado, adjuntar un cierre luer hembra a un 1/16 "tubo de ID. A continuación, un extremo del hilo a lo largo del tubo de PTFE para conectar las cerraduras y el otro a un puerto de aluminio corto (tubo 5 en la Figura 6).
- Conectar el "tubo de silicona de identificación al 1/50" 1/50 expuesta tubo y conectores peristáltica ID. Para ello, conecte tres segmentos de 1/50 "tubo de Identificación y dos segmentos de 0.022" tubo de PTFE ID, alternándolos. Conectar esta al matraz de efluente a través de 1/16 "tubo de ID (tubo 5 en la Figura 6).
- Conectar un extremo de un tubo de 1/16 "silicona ID al tubo segundos más largo del puerto de aluminio y el otro extremo al matraz efluente. Este tubo de aluminio establece el volumen de cultivo, y el exceso de cultura desborda en el recipiente de efluente (tubo 8 en
- Esterilizar en autoclave el conjunto de cultivo a 121 ° C y 15 psi (esterilización general) durante 30 min.
Nota: Los tubos a través del cual se llena el matraz de medios de comunicación, a través del cual se aspira el matraz de medios de comunicación, y a través del cual se inocula el recipiente de cultivo tener múltiples segmentos de tubo de modo que si el segmento distal está contaminado, se puede retirar para revelar una estéril segmento. - Esterilizar en autoclave el conjunto de cultivo a 121 ° C y 15 psi (esterilización general) durante 30 min.
9. Preparar el canal de microfluidos
- Mezclar polidimetilsiloxano (PDMS) y agente de curado en una relación de 9: 1. Degas y vierta en el molde maestro de silicio.
- Curar los PDMS de 2 horas a 65 ° C y luego se corta a partir de la máscara con una hoja de afeitar. Corte alrededor de los PDMS hasta que se libere del molde. Evitar empujar hacia abajo y romper la oblea frágil.
- Use un 1,2 mm de diámetro interior perforadora biopsia para perforar agujeros en ambos extremos del canal.
- Vínculo plasma el PDMS en el cristal de la cubierta 24.
- Tape el tiempo extremos de la cubierta de vidrio a la estructura de aluminio de apoyo de manera que el canal de PDMS se centra en el marco de aluminio, y luego hornear el PDMS de nuevo durante 2 horas a 65 ° C.
10. Llenar el frasco de Medios
Figura 7: Adición de los medios de comunicación. Este diagrama muestra cómo los medios deberían ser filtró al vacío en el matraz medios de comunicación. Se asegura de que los medios de comunicación sigue siendo estéril. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
- Hacer los medios de comunicación apropiados. Si el sistema de cultivo continuo será operado como un quimiostato, utilizar medios limitados para un nutriente específico.
NOTA: Los ejemplos de la composición del medio estándar para los estudios con S. cerevisiae se han publicado previamente 25,= "xref"> 26, 27, 28, 29. - Coloque el filtro de vacío a una botella de 100 ml, retire la cubierta del pezón, luego retire el enchufe blanco del pezón del filtro de vacío con pinzas estériles.
- Conectar el tubo de silicona 3/16 "ID para el pezón, otro tubo libre del frasco de los medios de comunicación a una bomba de vacío (tubos 1 y 2 en la figura 7, respectivamente), y asegúrese de que el tubo que conecta el matraz de medios de comunicación para el recipiente de cultivo se sujeta cerrar (tubo 3 en la Figura 7).
- Llenar el filtro con los medios de comunicación, encender la bomba de vacío, y luego filtrar el resto de los medios de comunicación. Sujetar el tubo de silicona 1/16 "ID conectado al vacío (tubo 2 en la Figura 7) y apague la bomba de vacío.
- Quitar los leurs desde el segmento intermedio de 1/16 "tubo ID conectado a la bomba de vacío de modo que un extremo no contaminada del tubo es accesible. Inserte THextremo azul de correo de un filtro de aire de la jeringa estéril en este tubo.
- Cierre la tubería de 3/16 "de silicona ID (tubo 1 en la Figura 7) y desconectar el luer macho de la misma. Desconectar el enchufe de la clavija hembra del tubo de entrada de los medios de comunicación del recipiente de cultivo. Conecte estos luer macho y hembra para permitir que los medios de comunicación para ser bombeado en el recipiente de cultivo.
- Retire el filtro de vacío y la tapa de la botella ml de medios de comunicación que se adjuntan al filtro de vacío 100.
- Un día antes de que se inocula el recipiente de cultivo, inocular una única colonia del microbio optogenético en un tubo de ensayo con 4 ml de los medios de comunicación recogidos en el paso anterior, y se deja crecer durante la noche a 30 ° C o la temperatura de la temperatura de crecimiento óptima de la cultura con agitación.
11. Montar el aparato Alrededor del microscopio
- Coloque el montaje de cultivo continuo cerca del microscopio con los medios de comunicación frasco alto que el recipiente de cultivo y la efflumatraz ent más bajo que el recipiente de cultivo, de manera que el tubo compuesto de segmentos de 0,022 "tubo de PTFE ID (tubo 5 en la Figura 6) puede alcanzar la platina del microscopio. firmemente con cinta adhesiva los tapones de goma en el matraz de medios de comunicación y el contenedor de efluente.
- Desconectar los extremos del 0,022 "ID PTFE tubo del 1/50" tubo de silicona ID conectan (tubo 5 en la Figura 6), y conecte estos extremos en la entrada y la salida del dispositivo de microfluidos.
- Conecte el extremo blanco del filtro de aire de la jeringa a la bomba de acuario. La presión del aire empujará los medios de comunicación en el recipiente de cultivo.
- Cuando los medios de comunicación llega al nivel del puerto de efluentes, envolver el tubo "ID de medios de entrada y conectores alrededor de la bomba peristáltica lento (tubo 4 en la Figura 6) y el 1/50" 1/16 tubo de salida ID de la muestra y los conectores alrededor de la rápida bomba peristáltica (tubo 5 en la Figura 6).
- Airear los medios de comunicación por el desamarre del aire maser entre el matraz y los medios de comunicación recipiente de cultivo.
- Cinta de la resistencia de calentamiento y termómetro para el recipiente de cultivo de modo que su temperatura puede ser controlada. Enrolle el tubo de medios de todo el recipiente de cultivo por lo que los medios de comunicación que entran estarán a la misma temperatura que el buque.
NOTA: La corriente PWM a la resistencia de calentamiento se regula por el microcontrolador que utiliza entradas desde el termómetro para mantener el recipiente de cultivo a su temperatura de punto de ajuste. - Insertar el recipiente de cultivo en el recinto de espuma negro sobre la matriz de LED, y asegurarse de que los tubos no queden atrapados.
- En Micro-Manager, vaya a Complementos> Controlador biorreactor. Establecer la "relación de los medios de comunicación de la bomba en el" campo a 0.1 y la "relación de muestra de la bomba en el" campo a 0. El caudal será muy baja, pero mayor que la velocidad de evaporación.
- Sujetar el tubo de entrada de aire entre el matraz y los medios de comunicación recipiente de cultivo. Retire el tapón del tubo de la inoculación (tubo 7 en la figura
- Cubrir el recinto de manera que la luz no entra, y dejar que el cultivo crezca durante la noche.
12. Calibre los gastos de bombeo
- En Micro-Manager, vaya a Complementos> Controlador biorreactor. Establecer la "relación de los medios de comunicación de la bomba en el" campo a 0,5 y la "relación de muestra de la bomba en el" campo a 0.
- Desconectar el tubo de desbordamiento del matraz efluente (tubo 8 en la Figura 6) y el tubo de toma de muestras del matraz efluente (tubo 8 en la Figura 6) y recoger efluente en recipientes separados. Recoger el efluente durante 1 hora, comenzando después de que las bombas han estado en marcha durante 15 min.
- Calcular la velocidad de flujo de medios de comunicación en el recipiente de cultivo a partir del volumen recogido en el recipiente como:
- Ajuste el valor de la "relación de compresión de medios en" campo de esta estimación lineal:
dónde
- Iterar a través de este procedimiento de calibración hasta que la diferencia entre el caudal deseado y el caudal medido es <0,2 ml / h, en donde la velocidad de flujo se promedia durante un período de 1 h.
- Aumentar el valor de la "relación de muestra en" campo y calibrar de una manera similar hasta aproximadamente 4/5 del volumen TH dejando el recipiente de cultivo se bombea por la bomba de toma de muestras y aproximadamente 1/5 del volumen abandona a través el puerto de desbordamiento.
- Deje que la densidad de cultivo en el aparato de cultivo continuo equilibre en estas condiciones durante la noche.
NOTA: Si los caudales deseados no pueden ser alcanzados, el cambioel tubo de la bomba peristáltica. El líquido se bombea a una tasa más alta cuando se utiliza la tubería de mayor diámetro. Siga el paso 14 y luego volver al paso 8.4. - Ajuste el valor de la "relación de compresión de medios en" campo de esta estimación lineal:
13. Recoger Microscopio Imágenes de microbios cultivados
- Llene la Lista Posición etapa en Micro-Manager con un conjunto de posiciones que no se solapan en el que las imágenes de las células inyectado en el canal de microfluidos estarán en el plano focal.
- Abrir el plugin "biorreactor Controller". Seleccione el curso deseado tiempo de matriz de LED, canales de imagen, y otros parámetros experimentales de las indicaciones. Recoger y analizar imágenes.
- Si bien el experimento funciona, asegúrese de que los medios de comunicación en el matraz de comunicación sigue siendo clara. Si está nublado, entonces se ha contaminado.
14. Post-experimento
- Disponer de medios de comunicación, el exceso de cultivo celular y efluentes.
- Llenar el matraz de medios de comunicación con 200 ml de 20% EtOH se mezcla con agua desionizada. Ejecutar el quimiostato como lo había hecho anteriormenteha ejecutado durante el experimento para lavar los restos celulares y los medios de comunicación.
- Cuando la solución de alcohol se haya drenado del matraz medios, desmontar el quimiostato totalmente.
- Lavar la cristalería y los tubos con agua tibia y un detergente suave y enjuagar bien con agua desionizada. Dejar secar.
- Abra el archivo "microcontrollerRecords.csv" para revisar la temperatura y el estado de la matriz de LED en el transcurso del experimento, el archivo "Summary.csv" para revisar los datos de resumen de cada conjunto de imágenes y los "Resultados <n> .csv" para revisar los archivos de datos que resumen cada ROI de cada período de tiempo, donde n es el enésimo conjunto de datos.
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Representative Results
Este aparato se utiliza para estimular un cultivo de S. cerevisiae que expresa la proteína fluorescente amarilla (YFP) en respuesta a la luz azul a través de un sistema de transcripción optogenético inducible basado en el par de proteínas CRY2 / CIB1 30. Las células fueron cultivadas en medios limitados chemostatically-fosfato con una tasa de dilución media de 0,2 ± 0,008. Limitación de fosfato se utiliza comúnmente en experimentos de S. cerevisiae chemostat para controlar la tasa de crecimiento y los efectos de la limitación de fosfato son bien caracterizado. 31, 32, 33 efluente del recipiente de cultivo diluido continuamente se tomaron muestras a un dispositivo microfluídico en un microscopio invertido. Las imágenes se analizaron automáticamente como se muestra en la Figura 8. Se identificaron células individuales en el fondo-resta imágenes de contraste de fase y su concentración YFPción se estimó a partir de su fluorescencia, medida de las imágenes fluorescentes de fondo-resta.
La fluorescencia de 169,677 células se analizó de 33.600 imágenes de efluente adquiridos de 28 lugares en el dispositivo de microfluidos en los 70 h del experimento. Se utilizó un microscopio invertido equipado con un sistema de iluminación de fluorescencia y una cámara CMOS. Las imágenes fueron adquiridas con YFP un 500/20 nm de excitación de filtro, un filtro de 535/30 nm de emisión, y un dicroico T515lp. Las imágenes fueron tomadas con un objetivo de contraste de fase 40X, bajo iluminación Köhler. Las imágenes se registraron en profundidad de color de 16 bits con 87 píxeles por micrómetro cuadrado. El cultivo se expone a diferentes intensidades de luz azul para intervalos de 6 h, seguido por la oscuridad completa para intervalos de 6 h. La cultura había sido expuesto a la luz antes de la primera medición, por lo que su intensidad de fluorescencia disminuye durante el primer período oscuro. </ P>
La Figura 9 muestra la fluorescencia debido a la producción YFP tras la activación del sistema de optogenético en respuesta a la iluminación de la recipiente de cultivo. Se demuestra la utilidad de las mediciones de células individuales de fluorescencia sobre una población mediciones de un solo de células promedio revelan la distribución de la población de la intensidad de fluorescencia. Tenga en cuenta el valor atípico a 42 h 26 min. Después de revisar las imágenes correspondientes, era evidente que había grupos de células en la mayoría de las imágenes utilizadas para generar la imagen compuesta de los antecedentes, lo que resulta en artefactos que se parecían a las células en la imagen de fondo-resta. Además, una burbuja desde el recipiente de cultivo se bombeó al canal microfluídico y partes de sus bordes estaban equivocados como células por el algoritmo de análisis de imágenes. Puesto que ni la burbuja ni los artefactos de restar el fondo correspondían a las células reales, su intensidad de fluorescencia medidaes menor que la auto-fluorescencia de las células. Esta cifra demuestra la calidad de los datos que se pueden adquirir de forma automática durante 3 d. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8: Visual representación del algoritmo de análisis de imágenes. Estas imágenes se han recortado y ampliado para facilitar la visualización. (A) Seis imágenes se adquieren para generar la imagen de contraste de fase de fondo-resta del cultivo celular. Después de que la imagen principal se adquiere, cinco imágenes adicionales se adquieren con la bomba de efluente-muestreo convertido brevemente en entre cada adquisición para asegurar que están desplazados células. Una imagen compuesta del fondo se genera a partir de las cinco imágenes de componentes. El valor de cada pixella imagen de fondo en es el valor de la mediana de ese mismo pixel a través de las 5 imágenes componentes. (B) La imagen de fondo-resta se convierte después en un binario. El binario es entonces dilatado y los agujeros dentro de las secciones continuas de los binarios están llenos. Los contornos amarillos corresponden a las regiones seleccionadas de interés (ROI), con base en criterios de tamaño y redondez. (C) Los ROI se mapean en la imagen fluorescente, donde la fluorescencia de cada célula se mide como el valor del píxel más brillante dentro de la ROI. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 9: Distribución de la población de la intensidad de fluorescencia con el tiempo. En estos subfiguras el logaritmo de fluor medidoSe muestra escence, siguiendo la práctica habitual en la citometría de flujo. La línea en A y B indica la intensidad de la luz absorbida o difractada por la cultura, que se mide como la diferencia de intensidad entre la luz transmitida a través de medios estériles y luz transmitida a través del cultivo celular en el recipiente de cultivo. Se traza contra el segundo eje de ordenadas. (A) Un diagrama de caja y bigotes (5 percentil 25, percentil, mediana, percentil 75, percentil 95) del logaritmo de la fluorescencia medida de la población a través del tiempo. (B) Un histograma 2-dimensional de los mismos datos, donde el color corresponde a la frecuencia normalizada de células con una fluorescencia medida en el rango de la bandeja correspondiente. Los colores se escalaron a la gama de los datos sin el valor atípico en 42 h 26 min incluido. La frecuencia normalizada del valor atípico en el cubo de la fluorescencia más bajoes 0,7. (C) Una histogramas dimensionales del logaritmo de la fluorescencia medida de la población antes de la primera exposición a la luz registrado y después de la mayor exposición a la luz. Esto demuestra que la expresión inducida por la luz de YFP en esta cepa es bimodal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Hemos diseñado este aparato pensando en la flexibilidad. Todo el código utilizado es libre y de código abierto. El proceso de análisis de imagen por defecto en las células del segmento es simple y funciona rápidamente. Análisis personalizado podría ser implementado mediante el registro de entrada del usuario, mientras que el análisis de una imagen representativa con la interfaz gráfica de usuario FIJI, la conversión de la entrada a un guión beanshell y después configurar el plugin para llamar al script. Cuando se le llama, este script se enviará una matriz de cadenas llamada "imágenes" que contienen las rutas de archivos a la más reciente serie de imágenes de fondo-resta. Imágenes y datos se guardan como se recogen de modo que no se pierden si un experimento termina abruptamente. Una matriz de LED azul fue elegido para la inducción de nuestro sistema optogenético pero podría ser reemplazado con LEDs de diferentes colores. Hay pines de entrada y salida adicionales disponibles en el microcontrolador, así como a través de los orificios pasantes para un interruptor MOSFET adicional y el interruptor de relé en el circuito impreso que hacen que sea fácilpara este sistema que adaptarse para los propósitos más complejos. Por ejemplo, para hacer de este aparato funcionar como un turbidostat, utilizar los pasadores adicionales en el microcontrolador para accionar un LED y leer los valores de una luz-sensor atado al recipiente de cultivo, y luego modificar el software para medir la turbidez y diluir el recipiente en consecuencia .
Se debe tener cuidado para asegurar que el cultivo no está contaminada, para proteger el equipo de microscopía sensible, y para asegurar que las velocidades de flujo de fluido son consistentes. Contaminaciones antes de cuando el recipiente de cultivo se inocula intencionalmente pueden ser detectados por esperar unos días antes de inocular el recipiente y verificar que no hay crecimiento interior. Para evitar que se derrame el cultivo de células en el objetivo del microscopio, compruebe que el dispositivo de microfluidos no se escape por el primer cultivo de células de bombeo a través de él sobre un paño absorbente. Si el flujo de los medios de comunicación en el recipiente de cultivo es incompatible, por lo general es debido a que el tubo alrededorlos rodillos de la bomba peristáltica se ha convertido en demasiado floja. Si el flujo de aire de la bomba de acuario es inconsistente, asegurar que no hay curvas en forma de U en el tubo de efluente donde el líquido puede acumularse y de manera incompatible resistir el flujo de aire. Si se obstruye la tubería después de un experimento porque los medios de comunicación se ha secado en el interior de la misma, remojar las trompas obstruidas en un baño de agua caliente para disolver la obstrucción.
Existen limitaciones intrínsecas a este protocolo a considerar al planear un experimento o análisis de los resultados. Dependiendo de la tasa de dilución y la longitud del tubo utilizado, hay un retraso de aproximadamente 10 min durante el cual el cultivo de células se bombea desde el recipiente de cultivo al microscopio. Por lo tanto, no se adapta bien a los acontecimientos que ocurren estudian en escalas de tiempo más cortos. También, mientras que un experimento puede funcionar continuamente durante unos diez días, limitado solamente por el volumen de medios de comunicación, la evolución del cultivo celular debe ser considerado como la duración de los aumentos del experimento. el Limiting de nutrientes de los medios de comunicación tiene profundos efectos en el metabolismo y la expresión génica 35, 36, 37, 38, 39 y, por tanto, debe ser determinado con base en el aspecto de la fisiología en estudio. Al analizar los resultados, las imágenes -en especial las imágenes de datos periféricas puntos-deben ser revisados por los errores en la forma en que los ROIs fueron identificados por la rutina de análisis de imágenes. Es posible que las burbujas o artefactos que pueden confundir con las células, sesgando así la fluorescencia medida. Una manera sencilla de eliminar este tipo de mediciones erróneas es para descartar todos los ROIs con intensidades de fluorescencia por debajo de la intensidad de autofluorescencia.
Este protocolo será útil para medir la intensidad de la fluorescencia y / o la morfología celular de cultivo de células de efluentes en respuesta a la luz en organismos que pueden crecer en cultivo continuo, establecerTLE a un plano focal consistente cuando no agitó, y ser identificado automáticamente por un algoritmo de análisis de imágenes. El algoritmo de identificación de celda por defecto utilizado aquí será más directamente aplicable a los microbios más o menos esféricas que se asemejan a la levadura en ciernes. 40 Una alternativa a este protocolo es crecer los microbios en un conjunto de cultivos discontinuos, y luego degustar un solo lote para cada punto de tiempo y caracterizar la muestra mediante citometría de flujo. Sin embargo, las ventajas del protocolo descrito aquí son que las muestras son tomadas de la misma cultura, muchos se pueden tomar muestras, y el proceso es automatizado. Este protocolo también mejora en un método similar en el que la levadura optogenético eran continuamente culta y fotografiado bajo el microscopio 34 mediante la adquisición de múltiples imágenes de forma rápida y no sesgar la identificación ROI mediante fluorescencia. Una gran ventaja de este protocolo es que muchas mediciones de las células individuales se pueden adquirir con regularidad durante varios días without entrada del usuario. Después de medir la respuesta del cultivo microbiano de exposición a la luz, un siguiente paso puede ser la implementación in silico de control de bucle cerrado de la respuesta.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Nos gustaría reconocer Molly Lazar y Verónica Delgado para la asistencia en la prueba del protocolo, Kieran Sweeney útil para los debates y la edición, y Taylor Scott, My An-adirekkun, y Stephanie Geller para la lectura crítica del manuscrito. Megan Nicole McClean, Ph.D. posee una concesión de carrera en la interfaz de la Ciencia del Fondo Burroughs Wellcome.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Extensive lab manual | GitHub | NA | An extensive, regularly updated lab manual is available in the “Optogenetic Chemostat Files” GitHub repository (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files). This also includes a description of the microfluidic mold used to generate the representative results. |
| Fritzing Design Viewer | Fritzing | NA | The free, open-sourced software to view and edit the .fzz type circuit board designs is available at "http://fritzing.org/download/" |
| Arduino Uno R3 (Atmega328 - assembled) | Adafruit | 50 | Microcontroller. 1 required. |
| Arduino Stackable Header Kit | SparkFun Electronics | 10007 | Female pin headers for connecting PCB to microcontroller. 1 required. |
| Adjustable 30W 110V soldering iron - XY-258 110V | Adafruit | 180 | For making electrical connections to the PCB. 1 required. |
| Soldering iron stand | Adafruit | 150 | For making electrical connections to the PCB. 1 required. |
| Mini Solder spool - 60/40 lead rosin-core solder 0.031" diameter - 100g | Adafruit | 145 | For making electrical connections to the PCB. 1 required. |
| 0.1 μF capacitor | SparkFun Electronics | COM-08375 | Stabilizes voltage in PCB. 1 required. |
| 10 μF capacitor | SparkFun Electronics | COM-00523 | Stabilizes voltage in PCB. 1 required. |
| MAX7219CNG LED Matrix/Digit Display Driver - MAX7219 | Maxim | MAX7219CNG | LED driver. 1 required. |
| 8 pin IC Socket | Mouser Electronics | 575-144308 | 16 required. These will be stacked on top of each other to support the culture vessel above the LED matrix. |
| 24 Pin IC socket | Mouser Electronics | 535-24-3518-10 | Optional. Use this to reversibly attach the MAXIM 7219CNG driver to the PCB. |
| Digital multimeter | Adafruit | 2034 | For troubleshooting electronics. 1 required. |
| Break Away Headers - 40-pin Male (Long Centered, PTH, 0.1") | SparkFun Electronics | PRT-12693 | Male pin headers for connected LED matrix to printed circuit board. Ends can be trimmed with wire cutters. 1 set required. |
| Flush diagonal wire cutters | Adafruit | 152 | For trimming long pin headers and cutting power cables. 1 required. |
| Premium Female/Female Jumper Wires - 40 x 12" (300mm) | Adafruit | 793 | Wire ribbon for connecting breadboard to LED matrix. Can be connected end-to-end with male pin-headers to be longer. 1 required. |
| Half-size breadboard | Adafruit | 64 | The LED matrix will connect to this and the culturing vessel will rest above it. |
| Miniature 8x8 Blue LED Matrix | Adafruit | 956 | Light source. Dominant wavelength is 470nm (blue). 1 required. Alternative miniature LED matrices from the same vendor are available with dominant wavelengths: 624 nm (red), 588 nm (yellow), 525 nm (green), 572 nm (yellow-green), and white. |
| Stackable header-3 pin | SparkFun Electronics | 13875 | 8 required. |
| Resistor Kit - 1/4W (500 total) | SparkFun Electronics | 10969 | For electronics. 1 required. |
| IRL520N MOSFET | International Rectifier | IRL520N | Voltage regulating switch for controlling DC current. 4 required. |
| Hook-Up Wire - Assortment (Solid Core, 22 AWG) | SparkFun Electronics | PRT 11367 | Wire for electronics. 1 required. |
| 5V 2A (2000mA) switching power supply - UL Listed | Adafruit | 276 | Power supply for the heating pad and Arduino. 2 required. |
| 12 VDC 1000mA regulated switching power adapter - UL listed | Adafruit | 798 | For peristaltic pumps. 2 required. |
| Electric Heating Pad - 10cm x 5cm | Adafruit | 1481 | For heating the bioreactor. 1 required. |
| Low flow variable flow peristaltic pump | Fisher Scientific | 13-876-1 | For pumping media. 1 required |
| Medium flow variable flow peristaltic pump | Fisher Scientific | 13-876-2 | For pumping culture. 1 required. |
| 9 VDC 1000mA regulated switching power adapter - UL listed | Adafruit | 63 | For microcontroller power supply. Order 1. |
| High Temp Waterproof DS18B20 Digital temperature sensor + extras | Adafruit | 642 | Thermometer for the bioreactor. 1 required. |
| Micromanager | Micromanager | NA | The free, open-sourced microscope control software is available at "https://micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release" |
| FIJI | ImageJ | NA | The free, open-sourced image analysis software is available at "http://fiji.sc/" |
| Arduino Integrated Development Environment | Arduino | NA | The free, open-sourced IDE is available at "https://www.arduino.cc/en/Main/Software" |
| Custom code | GitHub | NA | The custom microcontroller code and "Bioreactor Controller" plugin are available in the “Optogenetic Chemostat Files” GitHub repository (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files). |
| USB Cable A to B - 6 Foot | SparkFun Electronics | CAB-00512 | Used to download data to microcontroller. 1 required. |
| bioreactorTimecourse_example.csv | GitHub | NA | The advantage of loading LED matrix values from a CSV file is that a program can be called by the plugin to update those values based on image analysis results, and those values can be reloaded to the microcontroller, enabling feed-back control. It is available from the “Optogenetic Chemostat Files” GitHub repository (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files). |
| Tota-frost gels (diffusion paper) | B&H | B&H # LOFSFTL MFR # T1-72 |
For LED matrix. 1 required. |
| Kitting Sheet Crosslink 1/4x12x24in | Grainger, inc | 20JL37 | Black foam for culturing vessel enclosure. 4 required. |
| Standard Photodiode Power Sensor, Si, 200 - 1100 nm, 50 mW | Thorlabs | S120VC | For measuring light intensity. 1 required. |
| Labelling Tape | Fisher Scientific | 159015N | For labelling and securing loose components. 1 required. |
| Compact Power and Energy Meter Console, Digital 4" LCD | Thorlabs | PM100D | For measuring light intensity. 1 required. |
| 100mL GL45 hybridization glass bottle | Bellco Glass, Inc. | (7910-40150) | Bioreactor vessel. 1 required. |
| Six port assembly | Bellco Glass, Inc. | Custom | For the bioreactor vessel. Tubing Specs: .125" OD x .055"ID. Port A: 1.0" long above cap slug and to bottom of tube. Ports B,C,E,F: 1.0" long above cap slug, 33 mm long below. Port D: 1.0" long above cap slug, 65 mm long below. 1 required. Includes 45 mm diameter polypropylene open top screw cap and a white silicone gasket to ensure a tight seal between the cap and the vessel. |
| Scotch Magic Tape 3105, 3/4 x 300 Inches, Pack of 3 | Amazon | B0009F3P3U | Clear scotch tape. This is available from many other vendors. It is used to cover markings on the culturing vessel and to secure the coverglass with the PDMS channel to the aluminum support frame. |
| 1/16" ID x 3/16" OD x 1/16" Wall Tygon Sanitary Silicone Tubing | United States Plastic Corp. | 57288 | Tubing. ~25' required. |
| Cole-Parmer Twistit white rubber stopper, size 10 | Cole-Parmer | EW-62992-32 | Media flask stopper and effluent flask stopper. 2 required. |
| 2L Laboratory Flask | Pyrex | 4980 | Media flask and effluent flask. 2 required. |
| Day pinchcock | Fisher Scientific | 5867 | For pinching tubes shut. 3 required. |
| Replacement tubing assembly 1/16" ID | Traceable Products | 3372 | The peristaltic pumps come with a set of tubes, but they wear out after weeks of use. |
| Replacement tubing assembly 1/50" ID | Traceable Products | 3371 | The peristaltic pumps come with a set of tubes, but they wear out after weeks of use. |
| Male luer with lock ring x 1/16" hose barb, Nylon, 25/pk | Cole-Parmer | EW-45505-00 | Connectors. ~10 luers are required. |
| Male luer with lock ring x 1/8" hose barb, Nylon, 25/pk | Cole-Parmer | EW-45505-04 | Connectors. 5 required, one for each rubber stopper hole to fill with tubing. |
| Female luer x 1/16" hose barb adapter, Nylon, 25/pk | Cole-Parmer | EW-45502-00 | Connectors. ~10 luers required. |
| Female luer x 3/16" hose barb adapter | Cole-Parmer | EW-45502-08 | Connectors. ~10 luers required. |
| Cole-Parmer Luer Accessory, Female Luer Cap, Nylon, 25/Pk | Cole-Parmer | SC-45502-28 | |
| Cole-Parmer Luer Accessory, Male Luer Lock Plug, Nylon, 25/Pk | Cole-Parmer | EW-45505-56 | |
| Microbore PTFE Tubing, 0.022"ID x 0.042"OD, 100 ft/roll | Cole-Parmer | EW-06417-21 | Tubing. 1 roll required. |
| Masterflex platinum-cured silicone tubing, L/S 13, 25 ft | Cole-Parmer | EW-96410-13 | Tubing. ~25' required. |
| 3/16" ID x 1/4" OD x 1/32" Wall Tygon Sanitary Silicone Tubing | United States Plastic Corp. | 57293 | Tubing. ~1' required. |
| Vacuum filter | Fisher Scientific | 974107 | Nalgene vacuum filter for sterile filtering media. |
| Aquel Oxy-Boost 200 | Rena Aquatic Supply | AP200 | Dual diaphram adjustable flow air pump for aerating and mixing media. 1 required. |
| 0.2 μm pore syringe filter | Corning International | 431229 | This ensures that air from the aquarium pump does not contaminate the apparatus. 1 required. |
| Slygard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | Slygard 184 | For microfluidic device. 1 required. |
| American Safety Razor GEM Scientific Single-Edge Razor Blades | Fisher Scientific | 17989000 | For cutting tubes and PDMS. 1 blade required. |
| Harris Uni-Core hole puncher 1.2mm ID | Sigma-Aldrich | WHAWB100028 ALDRICH | For punching inlet/outlet in microfluidic device. 1 required. |
| Microscope cover glass 22x60-1.5 | Fisher Scientific | 12-544-G | For microfluidic device. 1 required. |
| Rectangular aluminum frame with a square window | Custom | Custom | To support the microfluidic channel. Outer dimensions: 3 inches x 1.25 inches. Inner dimmensions (cut out portion): 7/8 inches x 7/8 inches Thickness: ~1/32 inches |
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