Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

השרשה של תאורה אוטומטית, Culturing, מערכת דגימה עבור יישומים מיקרוביאלית optogenetic

Published: February 19, 2017 doi: 10.3791/54894
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biomedical Engineering, University of Wisconsin-Madison

Summary

עיצבנו מנגנון culturing רציפה לשימוש עם מערכות optogenetic להאיר תרבויות של חיידקים ותאים תמונה בקביעות הקולחים עם מיקרוסקופ הפוכה. Culturing, הדגימה, ההדמיה, וניתוח התמונה באופן אוטומטי לחלוטין, כך תגובות דינמיות תאורה ניתן למדוד על פני כמה ימים.

Abstract

מערכות optogenetic לנצל חלבונים גנטיים בקידוד משני קונפורמציה בתגובת אורכי גל מסוים של אור לשנות תהליכים תאיים. יש צורך culturing ומדידת מערכות המשלבות מתוכנת תאורה וגירוי של מערכות optogenetic. אנו מציגים פרוטוקול לבנייה באמצעות מנגנון culturing רציף להאיר תאים מיקרוביאליים עם מינונים מתוכנים של אור, ובאופן אוטומטי לרכוש ולנתח תמונות של תאי השפכים. המבצע של מנגנון זה בתור chemostat מאפשר קצב צמיחת הסביבה התאית להיות תחת פיקוח הדוק. השפכים של תרבית תאים הרציפה ידגמו בקביעות התאים הם צלמו על ידי מיקרוסקופ רב ערוצית. Culturing, הדגימה, ההדמיה, וניתוח התמונה באופן אוטומטי לחלוטין, כך תגובות דינמיות את עוצמת הקרינה ומורפולוגיה הסלולר של תאים שנדגמו הקולחים התרבות נמדדות לאורך ימים מרוביםללא קלט משתמש. אנו להדגים את התועלת של מנגנון culturing זה על ידי גרימת ייצור חלבון דינמית זן של שמר אפייה מהונדס עם מערכת optogenetic שמפעילה שעתוק.

Introduction

מערכות optogenetic להשתמש באור כדי לשלוט רשימה הולכת וגדלה של תהליכים תאיים כולל ביטוי גנים, 1, 2, 3, 4, לוקליזציה חלבון 5, פעילות חלבון 6, 6, 7, 8 חלבון מחייב, 8, 9, 10 ו פירוק חלבונים. 11 שיטה culturing תאים בסביבה מבוקרת עם גירוי אופטי ובעצם למדידת תגובתם על לוחות זמנים ביולוגיים רלוונטיים יש צורך לנצל את הפוטנציאל של כלים אלה למחקר בביולוגיה של תא וביוטכנולוגיה. השיטה שלנו מנצלת chemostasis לשמור על שיעור צמיחת תאים מתמיד בתוך מוּרבָּך, AEמדורג, וכלי culturing זכוכית בקרת טמפרטורה 12, 13, כי הוא חשוף תאורה מתוכנת. אנו תאים בודדים תמונה קולח התרבות עם מיקרוסקופ הפוכה כדי למדוד את התגובה של תרבות תאורה מתוכנת. Culturing, הדגימה, ההדמיה, וניתוח התמונה באופן אוטומטי לחלוטין, כך עוצמת הקרינה והמורפולוגיה הסלולר של תרבית תאים בשפכים יכולים להימדד לאורך ימים מרובים ללא קלט משתמש.

יכול להיות מיושם פרוטוקול זה ברוב המעבדות מכירות תרבות מיקרוסקופית תא גדלים, ואת המנגנון המשמש הוא זול עשויים רכיבים זמינים. כלי culturing שקוף ממוקם מעל מטריצה של דיודות פולטות אור (LEDs) מסוגל פולטות 1 μW / 2 ס"מ -10 mW / cm 2 של אור. חיידקים גדלים כלי culturing ברציפות; אחד משאבת peristaltic משמשת להוספת תקשורת בביתשיעור דילול, אחר משמש לסגת תרבות בקצב פחות המיקרוסקופ, וההבדל בורח דרך פורקן הצפה. כרית חימום שומרת על הטמפרטורה. האוויר נשאב ללא הרף לתוך כלי culturing כדי לשמור על לחץ חיובי כמו גם לערבב לאוורר את התרבות. פרט משאבת אוויר, חשמל למכשירים אלה מוסדר על ידי מיקרו כי גם מקבל קלט מתוך מדחום ומחשב שולחני מחובר. תרבות תא השפכים נשאבת למכשיר microfluidic על הבמה של מיקרוסקופ הפוכה. ללא פלורסנט ותמונות פלורסנט נרכשים באופן אוטומטי. התאמתי את התמונות מאופיינות אלגוריתם מאתר בכל תא כאזור של העניין (ROI) ומודד את המאפיינים של כל ROI.

כדי להדגים יישום של פרוטוקול זה, מדדנו את התגובה לעוצמות אור השונה של תאי שמר אפייה מהונדסות עם על אחריות כחולה-אורve מערכת optogenetic השולטת שעתוק של חלבון פלואורסצנטי. ס cerevisiae, הידוע בכינויו של שמרים בייקר, נבחר משום מערכות optogenetic מרובות לשליטת ביטוי גנים במערכת זו כבר קיימות 14, 15, 16. יתר על כן, אורגניזם מודל זה משמש בדרך כלל עבור מחקרים במערכות ביולוגיה 17 וכתוצאה שלדת יישומים ביוטכנולוגיים 18, 19, 20. תוצאות הנציג שלנו מראות כי פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לשלוט שעתוק של תרבות לאורך כמה ימים על ידי בעוצמות משתנות קלט אור ומדידת הייצור של כתב ניאון.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

איור 1

איור 1: מנגנון culturing הרציף. דיאגרמה פשוטה זו מראה כיצד המנגנון צריך להתגודד כשהיא משמשת לתרבות, להאיר, ולמדוד תכונות אופטיות של החיידקים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2: מבט כולל של הפרוטוקול. השלבים באזור המוצל יש לחזור בכל פעם הפרוטוקול משמש. שליטה לולאה סגורה היא 34 אפשרי, אך אינו מיושם פרוטוקול זה.

1. להרכיב את המדחום אל ללוחות

-page = "1"> איור 3
איור 3: חיבורים לקרוא ערכי מדחום. תרשים זה מראה כיצד המדחום הדיגיטלי צריך להיות מחובר ל- PCB כך המיקרו יכול לקבל משוב כדי לשלוט על הטמפרטורה של התרבות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

  1. הלחמת הקרקע, הנתונים, וקווי מתח חיוביים של המדחום הדיגיטלי כדי מיוחס להם דרך נקביים מסומנת "GD + V."
  2. קליפ את פין אחד מן נגיחה 3 פינים נקבה וקוצצים את הפינים 2 הנותרים עם קוצץ תיל, כך שהוא יכול להתאים לשתי דרך נקבי שכותרתו "R2" ולא לחסום את המיקרו-בקר. הלחמה זה במקום. חבר את שתי סיכות מולחמות על ידי החדרת נגד 4.7 קילו-אוהם בכותרת הסיכה.

2. חבר את כוח Conרכיבי trol אל ללוחות

איור 4
איור 4: חיבורים לשלוט בצריכת חשמל של כרית החימום. טבלה זו מראה כיצד חלקי PCB אבזר צריכים להתגודד כדי לשלוט כוח כרית החימום. החלקים לשלוט משאבות פריסטלטיות מחוברים באופן דומה. ראוי לציין, כי הרכיבים עבור המדחום הוסרו לבהירות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

  1. חתוך 1 ס"מ מהפינים של חמש כותרות 3 פינים נקבה. הלחמה אלה לעמדות על המעגלים המודפסים (PCB) מסומן "# 1", "# 2", "# 3", "מס '4," ו "CB א"
  2. חתוך 1 ס"מ מהפינים של נגיחה 6 פינים ו 8 פינים נקבה. הלחמת לוואי אלה על ידי צדהטור של דרך-חורים שכותרתו K1 דרך K14.
  3. חבר את כרית חימום על המעגלים.
    1. הכנס את הקצוות של נגד 100 קילו-אוהם ב דרך נקבי שכותרתו K1 ו- K2 על PCB. הכנס טרנזיסטור אפקט שדה metal-oxide-מוליך למחצה (MOSFET) לתוך המיקום מסומן 1 # על PCB, עם התווית של MOSFET הפונה לכיוון K1 דרך K14 דרך חורים כך סיכת המקור קרובה אל "# "תווית, והפין לטמיון נמצאת במרחק מרבי" תווית # ".
    2. חותכים את קו הקרקע של כבל החשמל (DC) זרם חשמלי קבוע 5 V ולחבר אותו J2. חבר את קו הקרקע של כרית החימום כדי J1. חבר K3 להצמיד 3 עם נגד 1 קילו-אוהם. נוכחי צריך עכשיו רק לזרום J1 כדי J2 כאשר פינים 3 מוגדר + 5V.z
      הערה: פונקציות סט הנגד / MOSFET כמתג המאפשר לזרם לזרום מן J1 פינים J2 כאשר פינים 3 של מיקרו מוגדר +5 V.
  4. לְחַבֵּרמשאבת peristaltic האיטית.
    1. הכנס את הקצוות של נגד 100 קילו-אוהם ב דרך נקבי שכותרתו K4 ו K5 על PCB. הכנס MOSFET למצב מסומן 2 # על PCB, עם התווית של MOSFET הפונה לכיוון K1 דרך K14 דרך חורים כך סיכת המקור קרובה תווית "#", והפין לטמיון נמצא במרחק מרבי "#" תווית.
    2. חותך את קו הקרקע של כבל החשמל של 12 וולט DC של משאבת peristaltic האיטית. חבר את משאבת peristaltic מול קץ J3 ואת יבלת הקיר פונה קץ J4. חבר K6 להצמיד 4 עם נגד 1 קילו-אוהם. נוכחי צריך והיום הם קמים רק J3 כדי J4 כאשר 4 פינים מוגדר +5 V.
  5. חבר את המשאבה peristaltic מהר
    1. הכנס את הקצוות של נגד 100 קילו-אוהם ב דרך נקבי שכותרתו K7 ו K9 על PCB. הכנס MOSFET למצב מסומן 3 # על PCB, עם התווית של MOSFET הפונה לכיוון K1 דרך K14 דרך החורים של o כי סיכת המקור קרובה תווית "#", ופין ניקוז קליעה מהתווית "#".
    2. חותכים את קו הקרקע של כבל החשמל של 12 וולט DC של המשאבה peristaltic מהר. חבר את משאבת peristaltic מול קץ J5 ואת יבלת הקיר פונה קץ J6. חבר K9 להצמיד 5 עם נגד 1 קילו-אוהם. נוכחי צריכים והיום הם קמים רק J5 כדי J6 כאשר סיכה 5 מוגדרת +5 V.

3. חבר את מטריקס LED אל ללוחות

איור 5
איור 5: חיבורים לשלוט מטריקס LED. תרשים זה מראה כיצד מטריקס LED צריך להיות מחובר ל- PCB. הוא גם מראה כי PCB יכול להערם על מיקרו-בקר. ראוי לציין, כי הרכיבים עבור המדחום לשליטת כוח DC למכשירים אחרים הוסרו לבהירות.es / ftp_upload / 54,894 / 54894fig5large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

  1. הלחם את 6 פינים, 10 פינים, ושתיים כותרות הסיכה נשיות 8 הפינים לתוך דרך החורים בצדדים של PCB כזה שהוא יכול להיערם על גבי מייקרו.
  2. הלחמת 100 nF ואת 10 קבלי μF לעמדות המסומנות שלהם על PCB, וציינה כי הקוטב השלילי של 10 קבל μF (הספקה הקצרה) צריך להיות מחובר לאינטרנט-החור מסומן עם סימן שלילי.
  3. הלחם את הנהג LED אל 2 על ידי 12 סט של דרך-חורים, עם הכניסה על הנהג הרחק דרך נקבי שמורות עבור המטריצה ​​LED.
  4. הלחמה 2 טורים של כותרות פין זכר אל דרך-חורים המיועדים המטריצה ​​LED, וקוצצים את הקצוות של אלה מתחת לאמצעי כזה שהם לא יקשו על המיקרו-בקר. חבר אלה שתי רצועות 8-חוט של חוטי מגשר נקבה / נקבה. חבר קבוצה שנייה של גבריםכותרות סיכה אל הקצה השני של חוטי המגשר.
  5. הכנס את מטריקס LED מעל החציון של קרש החיתוך, ולאחר מכן הכנס את הסט השני של כותרות סיכה כדי העמודים משני צדי המטריצה. ודא כי חיבורים חשמליים זהים אם המטריצה ​​LED היה מחובר ישירות ל- PCB עם הצד שכותרתו של המטריצה ​​המתאים בעמודה שכותרתה של דרך-חורים.
  6. קליפ את פין אחד מן נגיחה 3 פינים נקבה וקוצצים את הפינים 2 הנותרים עם קוצץ תיל, כך שהוא יכול להתאים לשתי דרך נקבי שכותרתו "R1" ולא לחסום את המיקרו-בקר. הלחמה זה. חבר את שתי סיכות מולחמות על ידי החדרת נגד 1 קילו-אוהם בכותרת הסיכה.
    הערה: כלי culturing יהיה להערם מעל המטריצה ​​LED. אם סרטי החוט לחסום את כלי השיט, לקזז אותם מן מטריקס. לאחר מכן, השתמש חוט גרעין מוצק כדי לגשר על הפער בין פיני מטריקס ואת סיכות סרט חוט, כך את החיבורים החשמליים לא CHange.

4. התקן תוכנה ולהתחבר חומרה

  1. סטאק את PCB על מיקרו-בקר.
  2. עקוב אחר הקישורים ברשימת החומרים כדי להוריד את סביבת הפיתוח המשולבת (IDE) ואת קוד מותאם אישית עבור המיקרו-בקר.
  3. חבר את המיקרו-בקר למחשב מיקרוסקופ באמצעות אפיק טורי אוניברסלי AB (USB) כבל. לקמפל ולהעלות את הקוד המותאם אישית חזרה אל המעבד.
  4. הורד מיקרו-מנהל 21, 22 ופיג'י 23. הגדר מיקרו-מנהל בתור תוסף פיג'י ידי כל העתקת קבצים ".dll", בספריית "mmplugins", ואת ספריית "mmautofocus" מספריית שבו מנהל-מיקרו שהורד לתוך ספריית "Fiji.app". כמו כן, העתק את "plugins / מיקרו-מנהל" המדריך לתוך ספריית "Fiji.app/plugins".
  5. הורד את int קובץ "BioreactorController.jar"o בספרייה "Fiji.app/mmplugins".
  6. מנהל-מיקרו להרחיב מפיג'י> Plugins> מיקרו-מנהל> סטודיו מיקרו-מנהל. השתמש חומרה אשף תצורת כדי להגדיר את התוכנה כדי לשלוט המיקרוסקופ. כלול את המכשיר "FreeSerialPort" באשף עם תווית של היציאה שאליה כבל USB AB מחובר.

5. הפוך ולאפיין את מארז אור הוכחה עבור כלי Culturing

  1. סטאק ארובות IC שלוש 8 פינים כאבני בניין על קרש החיתוך בכל פינה של מטריקס LED כך כלי culturing יכול לנוח עליהם מעל מטריקס.
  2. הדק חלק מן נייר דיפוזיה מתחת לשכבה העליונה של השקעים, כך האור מכה את כלי culturing ממטריצת LED הוא מפוזר.
  3. לגזור שלוש 8 "ב -6" מנות של קצף שחור. לחתוך בה חור כי הוא באותו הגודל כמו קרש החיתוך האלקטרוני (2.3 "x 3.5") מבפנים של TW הראשוןo וחלק כי הוא בגודל של המלבן שנעשה על ידי ארובות IC (0.9 "x 1.8") מבפנים של השלישי. מחסנית שכבות אלה על מטריקס LED כך את השכבה האחרונה המכילה את הצמצם 0.9 "x 1.8" טמונה גם עם החלק העליון של ארובות IC, ומקיף את מטריקס LED.
  4. חותכים גיליון נוסף של קצף שחור לשניים כדי לעשות מלבן 6 "ב -24". מרדדים זה לתוך עמוד חלול של קצף שחור כי כלי culturing יכול להשתלב עם מקום צינורות וחוטי חשמל, כך שהוא יהיה תרמית אופטית לבודד את כלי culturing.
  5. מרכז את העמודה החלולה של קצף השחור מעל מטריקס LED, ולסמן את הגבול של הטור על שכבת הקצף השחור מתחתיה. גבול זה יציין איפה שהוא צריך להיות מרוכז בעתיד.
  6. לגזור חלק 3 "x 3" של קצף שחור. השתמש באפשרות זו מאוחר יותר כמו מכסה שיכול להיות מודבק לחלק העליון של העמודה כדי לחסום את האור החיצוני.
  7. חבר את חיישן כוח פוטו-דיודה כדי th דואר culturing כובע של כלי עם קלטת, לצרף את הכובע, והכניסו את כלי culturing במארז.
  8. בשנת מיקרו-מנהל, ללכת Plugins> בקר bioreactor. גדר מטריקס להאיר על קבוצת משנה של הטווח של עוצמות אפשריות ב 30 מרווחי ים.
  9. רשמו את עוצמות האור כמובא קונסולת מד הכוח מחובר חיישן כוח. מדידות אלו יאפשרו את עוצמת בפועל של האור להיות ידוע מתי מספר נוריות כי דולקים ואת הנוכחי ברוחב-מווסתת דופק (PWM) נוריות אלה מוגדר.

6. מכינים את כלי Culturing

איור 6
איור 6: חיבורי כלי. טבלה זו מראה שהקנקן צינורות של המנגנון צריך להיות מחובר בטרם autoclaved.blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

  1. סמן את הגובה המתאים לכל תוספת 2 מ"ל של נוזל בטווח של 10 מ"ל 30 מ"ל ב כלי culturing. הכנס 10 מ"ל מים סטריליים deionized, סמן את מפלס המים, להוסיף 2 מ"ל, סמן את מפלס המים, וחזור עד לרמה 30 מ"ל מסומן. מכסה את הסימונים עם קלטת ברורה, כך שהם אינם מוסרים בקלות, ועושה את הנוזל.
  2. מניחים את הקצה הארוך של נמל אלומיניום באמצעות אטם סיליקון, לתוך כלי culturing. בורג על הכובע.
  3. מכסים אחד לשקע יציאת אלומיניום קצר עם 1/16 "צינורות סיליקון ID. חבר את הקצה הדיסטלי ידי הוספת מנעול luer נקבה ולאחר מכן חיבור תקע מנעול luer זכר. שקע זה משלים, ולא לשמש (צינור 6 באיור 6 ).
  4. חיבור שני קטעים קצרים של 1/16 "צינורות סיליקון מזהה עם מנעולים luer זכר ונקבה. חבר קצה אחד לשקע יציאת אלומיניום קצר וחבר את distaסוף l עם luer זכר תקע מנעול luer הנשי. כלי השייט יהיה מחוסן דרך הצינור הזה (צינור 7 / 7.1 באיור 6).
  5. חיבור שני 1/16 "צינורות מזהה את הקצוות של 1/16" צינורות ומחברים peristaltic מזהה. חבר קצה אחד ליציאת אלומיניום קצרה וחבר את (הצינור 4 באיור 6) האחר. מאוחר יותר, זה יחובר אל בקבוק התקשורת.

7. מכינים את Flask מדיה

  1. חבר "שפופרת סיליקון בקוטר פנימי (ID) לנמל האלומיניום הארוך. הצינור צריך להיות ארוך מספיק כדי להגיע בקבוק התקשורת. חבר 1/8" 1/16 מנעול luer זכר מזהה קטע קצר של 1/16 " צינורות מזהים, להתחבר זה אל הצינור שקדם ,, ולאחר מכן כנס קטע קצר זה לתוך פקק הגומי על בקבוק התקשורת (שפופרת 3 באיור 6).
  2. הצמד את הצינור. חיבור זה מאפשר לאוויר לזרום מבקבוק התקשורת לכלי שיט התרבות. כאשר בקבוק התקשורת נשאב מאוחר בארשת ד הצינור הזה הוא unclamped, התרבות תהיה מעורבת, סודה, והמשיכה בלחץ חיובי על ידי הבועות הנכנסות.
  3. הכנס "צינור מזהה מספיק זמן כדי להגיע לתחתית של הבקבוק לתוך הפקק, שדרכו תקשורת תועבר. חבר 1/16 אחר" 1/16 צינור זהות זו אחת, ולאחר מכן צינור 3/16 "זהות כי. חבר זה עם מנעול luer נקבת 3/16 "מזהה ואת תוספת מנעול luer זכר (צינור 1 / 1.1 באיור 6).
  4. החור השלישי הפקק צריך להיות מלא עם קטע קצר של 1/16 "צינורות מזהים, מחובר לשני מגזרים אחרים של צינורות בקוטר בינוניים מחובר בקצה הדיסטלי (צינור 2 / 2.1 באיור 6). זה יהיה מחובר משאבת ואקום ובהמשך משאבת האקווריום.
    הערה: אם הצינורות לא יכולים להתאים בקלות דרך חורי פקק הגומי, לחתוך את הקצוות של הצינור בשיפוע. ואז, הסוף המלוכסן אשר נדחף דרך החור ניתן להשתמש כדי למשוך את שאר דרך.

ss = "jove_title"> 8. הכן את Flask הקולח

  1. הכנס מנעול luer זכר לתוך קטע של 1/16 "צינורות סיליקון זהות, ולאחר מכן בתוקף להכניס 0.022" מזהה polytetrafluoroethylene (PTFE) צינורות. בנפרד, לחבר מנעול luer נקבה לצינור 1/16 "מזהה. לאחר מכן, בסוף חוט אחד לאורך צינור PTFE להתחבר המנעולים והשני ליציאת אלומיניום קצר (צינור 5 באיור 6).
  2. חבר את "צינור סיליקון ID אל 1/50" 1/50 חשוף צינור ומחברים peristaltic מזהה. כדי זה, להתחבר בשלושת מקטעי 1/50 "צינורות מזהה ושני קטעים של 0.022" צינורות PTFE מזהה, לסירוגין אותם. חבר זה בקבוק השפכים באמצעות 1/16 "צינורות מזהים (צינור 5 באיור 6).
  3. חבר קצה אחד של צינור סיליקון 1/16 "זהות הצינור השנייה באורכו של נמל האלומיניום ואת הקצה השני אל בקבוק השפכים. צינור אלומיניום זו מגדיר את נפח התרבות, והתרבות עודפת גולשת לתוך מכל השפכים (צינור 8 ב
  4. חיטוי הרכבת culturing ב 121 ° C ו -15 psi (עיקור כללי) למשך 30 דקות.
    הערה: צינורות שדרכם הבקבוק התקשורת מלא, שדרכו את הבקבוק התקשורת הוא שאב, ושדרכה הספינה culturing הוא מחוסן יש ריבוי קטעים של צינורות כך שאם במגזר דיסטלי מזוהם, אותו ניתן להסיר כדי לחשוף סטרילי מִגזָר.

9. מכינים את ערוץ microfluidic

  1. מערבבים polydimethylsiloxane (PDMS) וסוכן ריפוי בתוך 9: יחס 1. דגה ויוצקים על התבנית מאסטר סיליקון.
  2. לרפא את PDMS עבור 2 שעות על 65 מעלות צלזיוס ולאחר מכן לחתוך אותו מן המסכה עם סכין גילוח. חותכים סביב PDMS עד שהוא משחרר מהתבנית. הימנע לדחוף למטה ולשבור את רקיק שברירי.
  3. השתמש מחורר ביופסיה 1.2 מ"מ מזהה לנקב חורים בשני הקצוות של הערוץ.
  4. אג"ח פלזמה את PDMS אל הזכוכית המכסה 24.
  5. קלטת הארוכה הקצוות של זכוכית המכסה על מסגרת אלומיניום התומכים כך PDMS הערוץ הוא מרוכז על מסגרת אלומיניום, ולאחר מכן אופים את PDMS שוב עבור 2 שעות על 65 מעלות צלזיוס.

מילוי 10. Flask מדיה

איור 7
איור 7: הוספת מדיה. טבלה זו מראה כיצד תקשורת צריכה להיות ואקום המסונן לתוך בקבוק התקשורת. זה מבטיח כי התקשורת נשארה סטרילי. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

  1. פוך המדיה מתאימה. אם מערכת culturing הרציפה תופעלה כמו chemostat, השתמש מדיה בע"מ עבור מזין ספציפי.
    הערה: דוגמאות של רכב מדיה סטנדרטי ללימודים עם ס cerevisiae פורסמו בעבר 25,= "Xref"> 26, 27, 28, 29.
  2. חבר את מסנן אבק כדי בקבוק 100 מ"ל, להסיר את כיסוי הפטמה, ולאחר מכן להסיר את התקע הלבן הפטמה של מסנן אבק עם פינצטה סטרילית.
  3. חבור את צינור סיליקון 3/16 "מזהה את הפטמה, הצינור החופשי האחר של מדיה בבקבוק משאבת ואקום (צינורות 1 ו -2 באיור 7, בהתאמה), ולהבטיח כי הצינור המחבר את בקבוק התקשורת לכלי שיט culturing הוא הדק לסגור (שפופרת 3 באיור 7).
  4. מלאו את המסנן עם התקשורת, להפעיל את משאבת ואקום, ואז לסנן את שאר כלי התקשורת. הצמד את צינורות סיליקון 1/16 "מזהה מחובר ואקום (צינור 2 באיור 7) ולכבות את משאבת ואקום.
  5. הסר את leurs ממגזר הביניים של 1/16 "צינורות מזהים מחובר משאבת הוואקום כך קץ מזוהם של הצינור יהיה נגיש. הכנס הסוף e הכחול של מסנן אוויר מזרק סטרילי לתוך הצינור הזה.
  6. הצמד את צינורות סיליקון 3/16 "מזהה (צינור 1 באיור 7) ונתק את luer זכר ממנו. נתק את התקע luer הנשי של צינור היניקה התקשורת של כלי culturing. חבר luers זכר ונקבה אלה כדי לאפשר התקשורת להיות שאוב לתוך כלי culturing.
  7. הסר את מסנן האבק מכסה את בקבוק מיליליטר 100 של תקשורת אשר צורפה מסנן האבק.
  8. יממה לפני כלי culturing יהיה מחוסן, לחסן מושבה אחת של חיידק optogenetic במבחנה עם 4 מיליליטר של התקשורת שנאספה בשלב הקודם, ולתת לו לגדול בין הלילה ב 30 מעלות צלזיוס או טמפרטורת צמיחת הטמפרטורה האופטימלית של התרבות עם תסיסה.

11. להרכיב את הציוד סביבה מיקרוסקופ

  1. הגדר את מכלול culturing הרציף ליד מיקרוסקופ עם תקשורת הבקבוקון גבוהה יותר מאשר כלי culturing ואת effluהבקבוק אף אוזן גרון נמוך כלי culturing, כך הצינור מורכב מקטעים של 0.022 "צינורות PTFE ID (צינור 5 באיור 6) יכול להגיע לשלב מיקרוסקופ. מאובטח קלטת במורד פקקים גומי על הבקבוק התקשורת מיכל השפכים.
  2. נתק את הקצוות של "צינורות PTFE המזוהה 1/50" 0.022 שפופרת סיליקון ID חיבורם (צינור 5 באיור 6), וחבר הקצוות הללו לתוך הכניסה והיציאה של המכשיר microfluidic.
  3. חבר את הקצה הלבן של מסנן אוויר מזרק משאבת האקווריום. לחץ האוויר ידחוף מדיה לתוך כלי culturing.
  4. כאשר התקשורת מגיעה לרמה של יציאת שפכים, לעטוף את 1/16 "צינורות יניקת תקשורת מזהה ומחברים סביב משאבת peristaltic האיטית (צינור 4 באיור 6) ואת 1/50" צינורות מוצא המדגם מזהה ומחברים סביב הצום משאבת peristaltic (צינור 5 באיור 6).
  5. לאוורר את התקשורת על ידי שחרור באוויר tuלהיות בין כלי culturing בבקבוק ומדיה.
  6. קלט את כרית חימום מדחום לכלי שיט culturing כך שהטמפרטורה שלה ניתן לשלוט. סליל צינורות התקשורת סביב כלי culturing כך בתקשורת ההזנה תהיה באותה הטמפרטורה כמו הכלי.
    הערה: זרם PWM אל כרית החימום מוסדר על ידי מייקרו המשתמש תשומות מן המדחום כדי לשמור על כלי culturing בטמפרטורת setpoint שלה.
  7. הכנס את כלי culturing לתוך מתחם הקצף השחור מעל מטריקס LED, ולהבטיח כי הצינורות הם לא סחבו.
  8. בשנת מיקרו-מנהל, ללכת Plugins> בקר bioreactor. בחר את "יחס משאבת מדיה על" שדה 0.1 ואת "יחס משאבה לדוגמא על" שדה ל -0 קצב הזרימה יהיה נמוך מאוד, אך בשיעור גבוה יותר מהשיעור של אידוי.
  9. קלאמפ צינור האוויר הנכנס בין בקבוק התקשורת וכלי culturing. הסר את התקע מצינור החיסון (שפופרת 7 באיור
  10. מכסים את המתחם כך שאף האור נכנס, ולתת התרבות לגדול בין לילה.

12. כיילו את המחירים לשואבים

  1. בשנת מיקרו-מנהל, ללכת Plugins> בקר bioreactor. בחר את "יחס משאבת מדיה על" שדה 0.5 ואת "יחס משאבה לדוגמא על" שדה 0.
  2. ניתקתי את צינור ההצפה מבקבוק השפכים (צינור 8 באיור 6) ואת צינור הדגימה מבקבוק השפכים (הצינור 8 באיור 6) ולאסוף שפכים בכלים נפרדים. אסוף בשפכים עבור שעה 1, המתחיל לאחר המשאבות כבר על במשך 15 דקות.
  3. חשבתי את קצב הזרימה של תקשורת לתוך כלי culturing מהכרך שנאסף הכלי כמו:
  4. התאם את הערך של "יחס משאבת מדיה על" שדה ידי אומדן ליניארי זה:
    Equaiton 2
    איפה
    Equaiton 3
  5. איטרציות הליך הכיול הזה עד להפרש שבין שיעור הזרימה הרצויה ואת קצב הזרימה הנמדד הוא <0.2 מ"ל / שעה, שם את קצב הזרימה הוא בממוצע על פני תקופה h 1.
  6. הגדל את הערך של "יחס המדגם על" שדה ולכייל אותו באופן דומה עד בערך 4/5 ה מנפח לעזוב את ספינת culturing נשאב החוצה על ידי משאבת הדגימה בערך 1/5 ה מהכרך לצאת דרך היציאה בגלישה.
  7. תן צפיפות התרבות במנגנון culturing הרציף לאזן בתנאים אלה לילה.
    הערה: אם ספיקות היעד לא ניתן להגיע, שינויצינורות משאבת peristaltic. נוזלים נשאבים בשיעור גבוה כאשר צינורות בקוטר גדולים יותר משמשים. בצע צעד 14 ולאחר מכן חזור לשלב 8.4.

13. תמונות מיקרוסקופ אסופות של חיידקים בתרבית

  1. מלא את רשימת עמדת הסטייג 'מייקרו-מנהל עם מערך העמדות שאינן חופפות שבו תמונות של תאים נשאבים לתוך ערוץ microfluidic תהיינה במישור המוקד.
  2. פתח את התוסף "בקר Bioreactor". בחר את מהלך זמן מטריקס LED הרצוי, ערוצי הדמיה, והגדרות ניסיוניות אחרות לפי ההנחיות. לאסוף ולנתח תמונות.
  3. אמנם הניסוי פועל, להבטיח שהתקשורת בבקבוק תקשורת שרידים ברורה. אם זה מעונן, אז זה כבר מזוהם.

14. שאחרי הניסוי

  1. השלך תקשורת, תרבית תאי עודף שפכים.
  2. למלא את הבקבוק התקשורת עם 200 מ"ל של 20% EtOH מעורבב עם מים ללא יונים. הפעל את chemostat כפי שהיה בעברהופעל במהלך הניסוי כדי לשטוף את לכלוך תקשורת תא.
  3. כאשר פתרון האלכוהול נקז מבקבוק מדיה, לפרק את chemostat מלא.
  4. לשטוף זכוכית וצינורות עם מים חמים וחומר ניקוי עדין, ולשטוף היטב במים deionized. ולהשאיר לייבוש.
  5. פתח את הקובץ "microcontrollerRecords.csv" לבחון מחדש את הטמפרטורה ומצב מטריקס LED במהלך הניסוי, את הקובץ "Summary.csv" לסקור את נתוני סיכום מכל סט של תמונות ואת "תוצאות <n> .csv" קבצים לסקור נתונים המסכמים כל ROI של כל פרק זמן, כאשר n הוא n th סט נתונים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מנגנון זה שימש כדי לעורר תרבות של ס cerevisiae לבטא חלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP) בתגובה-אור כחול באמצעות מערכת שעתוק optogenetic מושרה מבוסס על זוג חלבון CRY2 / CIB1 30. תאים גדלו chemostatically במדיה פוספט-מוגבל עם שיעור דילול ממוצע של 0.2 ± 0.008. הגבלת הפוספט משמשת מקובלות הרבה יותר בניסויי chemostat cerevisiae ס לשלוט בקצב צמיחה ואת ההשפעות של הגבלת פוספט מאופיינות היטב. 31, 32, 33 קולחים מספינת culturing בדילול ברציפות נדגמה למכשיר microfluidic על מיקרוסקופ הפוכה. התמונות נותחו באופן אוטומטי כפי שמוצג באיור 8. תאים בודדים זוהו תמונות רקע-מופחת שלב בניגוד ו Concentra YFP שלהםtion הוערך מתוך הקרינה שלהם, כפי שהיא נמדדת מתמונות הניאון מופחת ברקע.

הקרינה של 169,677 תאים נותחה מ 33,600 תמונות של שפכים רכשו מ -28 מיקומים במכשיר microfluidic מעל 70 השעות של הניסוי. השתמשנו מיקרוסקופ הפוכה מצוידת במערכת תאורת פלואורסצנטי ומצלמת CMOS. התמונות YFP נרכשו עם מסנן עירור 500/20 ננומטר, מסנן פליטה 535/30 ננומטר, וכן dichroic T515lp. תמונות צולמו עם מטרת 40X לעומת שלב, תחת תאורת קוהלר. תמונות נרשמו בעומק צבע של 16 סיביות עם 87 פיקסלים לאינץ מיקרומטר בריבוע. התרבות נחשפה בעוצמות משתנות של אור הכחול עבור 6 במרווחי h, ואחריו בחושך מוחלט במשך 6 במרווחי h. התרבות נחשפה להדליק לפני המדידה הראשונה, וזו הסיבה עוצמת הקרינה שלו פוחת והולכים במהלך התקופה הכהה הראשונה. </ P>

איור 9 מציג את הקרינה בשל ייצור YFP על הפעלת מערכת optogenetic בתגובה מאירים את כלי culturing. זה מדגים את השירות של מדידות תא בודדות של קרינה לאורך אוכלוסיית מדידות ממוצעת-תא בודד לחשוף את התפלגות האוכלוסייה של עוצמת קרינה. שים לב מהווה המקרה הקיצוני ב 42 h 26 דקות. לאחר בדיקת התמונות המקבילות, היה ברור כי היו גושים של תאים ברוב המכריע של התמונות השתמשו כדי ליצור את התמונה המורכבת של הרקע, וכתוצאה מכך חפצה שדמו תאים בתמונה-מופחת ברקע. כמו כן, בועה מספינת culturing נשאבה לערוץ microfluidic וחלקי הקצוות שלה טעו כתאים ידי אלגוריתם ניתוח תמונה. מכיוון ששני צדדים אינו הבועה ולא הממצאים מן הפחתת הרקע תואמת תאים בפועל, עוצמת הקרינה הנמדדת שלהםהוא נמוך יותר מאשר הקרינה האוטומטית של התאים. נתון זה ממחיש את איכות הנתונים שניתן לרכוש באופן אוטומטי מעל 3 ד. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

הספרה 8
איור 8: תיאור ויזואלי של אלגוריתם ניתוח תמונה. תמונות אלה הועברו קצוצים והרחיבו על מנת להקל על צפייה. (א) שש תמונות נרכשות על מנת ליצור את התמונה לעומת שלב-מופחת רקע של תרבות התא. לאחר צילום התמונה העיקרית היא רכש, חמש תמונות נוספות נרכשות עם משאבת שפכים המדגמית מופעלת בקצרה בין כל רכישה על מנת להבטיח כי תאים הם עקורים. תמונה המורכבת מתמונות הרקע מופקת חמש תמונות הרכיב. התמורה הכספית של כל פיקסלבתמונת הרקע הוא הערך החציוני של אותו פיקסל על פני 5 תמונות הרכיב. (ב) התמונה מופחתת הרקע אז מומרת בינארי. קובץ הבינארי הוא מורחב אז החורים בתוך מדורים רציפים של בינארי מלאים. קווי המתאר הצהובים מתאימים באזורים הנבחרים של עניין (ROI), על פי קריטריוני גודל מעגליים. (C) ROI אלה ממופים תמונת הניאון, שבו הקרינה של כל תא נמדדת כערך של הפיקסל המבריק בתוך ROI. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 9
איור 9: התפלגות אוכלוסייה של עוצמות קרינה לאורך זמן. בשנת subfigures אלה הלוגריתם של פלואוריד נמדדescence מוצג, בעקבות מקובל cytometry הזרימה. השורה ב A ו- B מציין את עוצמת האור נספג או מתפזר על ידי התרבות, הנמדד כהפרש בעוצמה בין קרני אור העוברות דרך התקשורת סטרילית קרני אור העוברות דרך תרבית תאים בתוך כלי culturing. זה זמם נגד הציר לתאם השני. (א) תיבה זיף עלילה (5 באחוזון ה, 25 לאחוזון ה, חציון, 75 לאחוזון ה 95 לאחוזון ה) של הלוגריתם של הקרינה הנמדדת של האוכלוסייה לאורך זמן. (ב) היסטוגרמה 2-ממדית של אותם נתונים, שבו צבע מתאים לתדר המנורמל של תאים עם קרינה נמדדת בטווח של הסל המקביל. הצבעים היו מדורגים על הטווח של נתונים ללא outlier ב 42 h 26 דק 'כלול. התדירות המנורמלת של outlier לפח הקרינה הנמוך ביותרהוא 0.7. (ג) אחת היסטוגרמות ממדי של הלוגריתם של הקרינה הנמדדת של האוכלוסייה לפני החשיפה הראשונה הידועה לנו אור לאחר החשיפה הגדולה ביותר אל אור. זה מוכיח כי הביטוי אור-induced של YFP בנימה זו הוא bimodal. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

עיצבנו את המכשיר תוך מחשבה על גמישות. כל הקוד בשימוש הוא בחינם, קוד פתוח. תהליך ניתוח תמונת ברירת מחדל לתאי קטע הוא פשוט רץ במהירות. ניתוח מותאם אישית יכול להיות מיושם על ידי הקלטה קלט משתמש תוך ניתוח תמונה מייצגת עם ממשק משתמש גרפי פיג'י, המרת קלט תסריט beanshell, ולאחר מכן להגדיר את התוסף כדי לקרוא את התסריט. כאשר הוא נקרא, התסריט הזה יישלח מערך מחרוזת בשם "תמונות" המכילות את נתיבי קובץ לאתר הצילומים האחרונים של תמונות מופחתות ברקע. תמונות ונתונים נשמרים כפי שהם נאספים, כך שהם לא הולכים לאיבוד אם ניסוי מסתיים בפתאומיות. מערך כחול LED נבחר גרימת מערכת optogenetic שלנו אבל זה יכול להיות מוחלף עם נוריות בצבעים שונים. יש קלט ופלט נוספים סיכות נגישות מיקרו וכן באמצעות חורים עבור מתג MOSFET נוסף מתג ממסר על PCB שמקליםעבור מערכת זו להיות מותאם למטרות מורכבות יותר. לדוגמא, כדי להפוך את המכשיר לפעול בתור turbidostat, השתמש סיכות נוספות על מייקרו לשלטון LED ו לקרוא ערכים מחיישן-אור שנישא על כלי culturing, ולאחר מכן לשנות את התוכנה כדי למדוד עכירות לדלל הספינה בהתאם .

יש להקפיד על מנת להבטיח כי התרבות אינה מזוהמת, כדי להגן על ציוד מיקרוסקופיה רגיש, ועל מנת להבטיח כי שיעורי זרימת הנוזל עולים בקנה אחד. זיהומים לפני שעה שכלי השיט culturing הוא מחוסן בכוונה יכול להיות מזוהים על ידי המתנה של מספר ימים לפני לחסן את כלי ואימות כי אין צמיחה פנימה. כדי למנוע שפיכת תרבית תאים על המטרה מיקרוסקופ, לבדוק כי מכשיר microfluidic לא ידלוף ידי תרבית תאי השאיבה הראשונה דרכו על פני בד סופג. אם את זרימת המדיה לתוך כלי culturing אינה עולה בקנה אחד, זה בדרך כלל בגלל הצינור סביבהגלילים של המשאבה peristaltic הפכו רפויים מדי. אם את זרימת האוויר מהמשאבה האקווריום אינה עולה בקנה אחד, להבטיח כי אין עיקולים בצורת U בצינור השפכים שבו נוזל עשוי ברכה ובלתי עקביים להתנגד זרימת אוויר. אם צינורות הופך סמיך לאחר ניסוי כי התקשורת התייבש בתוכו, להשרות את צינורות סתומים באמבט מים חמים כדי להמיס את סותמים.

ישנן מגבלות מהותיות לפרוטוקול זה להביא בחשבון בעת ​​תכנון ניסוי או בניתוח תוצאות. תלוי בקצב הדילול ואורך הצינור בשימוש, יש עיכוב של בערך 10 דקות שבמהלכו תרבית התאים נשאבת מספינת culturing המיקרוסקופ. לכן, זה לא מתאים גם לאירועים לומדים המתרחשים על פני טווחי זמן ארוכים קצרים. כמו כן, בעוד ניסוי יכול לרוץ ברציפות במשך כעשרה ימים, מוגבלים רק על ידי הנפח של תקשורת, את האבולוציה של תרבות התא חייבת להיחשב משך עליות הניסוי. limiיש מזין טינג של תקשורת השפעה עמוקה על חילוף חומרים ועל ביטוי גנים 35, 36, 37, 38, 39 ו ולכן צריך להיקבע על בסיס ההיבט של פיזיולוגיה נחקרת. כאשר מנתחים תוצאות, התמונות-בעיקר תמונות מנתונים הפריפריה נקודות-צריך להיבדק אחריות לטעויות שיחולו באופן ROIs אותרו על ידי שגרת ניתוח התמונה. זה אפשרי עבור בועות או חפצים יטעו בו תאים, ובכך שתשבש את הקרינה הנמדד. דרך אחת פשוטה לחסל מדידות שגויות כאלה להשליך כל ROIs עם עוצמות קרינה מתחת עוצמת פלואורסצנציה אוטומטית.

פרוטוקול זה יהיה שימושי למדידת עוצמת קרינה ו / או מורפולוגיה תאית של תרבית תאי שפכים בתגובה לאור באורגניזמים שיכול לצמוח בתרבות הרציפה, להגדירייתכנו למישור עקבי מוקדים כאשר לא זע, ולהיות מזוהה באופן אוטומטי על ידי אלגוריתם ניתוח תמונה. האלגוריתם נייד זיהוי ברירת המחדל משמש כאן יהיה ישים באופן ישיר ביותר לחיידקים כדוריים בקירוב דומה ניצני שמרים. אחת חלופי 40 לפרוטוקול זה הוא לגדול חיידקי קבוצה של תרבויות יצוו, ולאחר מכן לטעום תצווה אחת עבור כל נקודת זמן ולאפיין את המדגם על ידי cytometry זרימה. עם זאת, היתרונות של הפרוטוקול המתואר כאן הם כי דגימות הלקוחים אותה התרבות, דוגמאות רבות שניתן לנקוט, ואת התהליך הוא אוטומטי. פרוטוקול זה משפר גם על שיטה דומה שבו שמרים optogenetic היו ברציפות תרבותי צילמו תחת מיקרוסקופ 34 באמצעות רכישת מספר רב של תמונות במהירות ולא הטיית זיהוי ROIs ידי הקרינה. יתרון גדול של פרוטוקול זה הוא כי כל מידה של תאים בודדים ניתן לרכוש באופן קבוע על פני כמה ימים withoקלט משתמש ut. לאחר מדידת התגובה של תרבות החיידקים כדי חשיפה לאור, הצעד הבא עשוי להיות ליישם בשליטת לולאה סגורה סיליקון של התגובה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

החוקרים אין לי מה לחשוף.

Acknowledgments

ברצוננו להודות מולי לזר ורוניקה דלגאדו סיוע בבדיקת פרוטוקול, קיירן סוויני לדיונים מועילים ועריכה, וטיילור סקוט, שלי אן-adirekkun, וסטפני גלר לקריאה ביקורתית של כתב היד. מייגן ניקול McClean, Ph.D. מחזיק פרס קריירה בבית הממשק המדעי מהקרן בורוז Wellcome.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Extensive lab manual GitHub NA An extensive, regularly updated lab manual is available in the “Optogenetic Chemostat Files” GitHub repository (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files). This also includes a description of the microfluidic mold used to generate the representative results.
Fritzing Design Viewer Fritzing NA The free, open-sourced software to view and edit the .fzz type circuit board designs is available at "http://fritzing.org/download/"
Arduino Uno R3 (Atmega328 - assembled) Adafruit 50 Microcontroller. 1 required.
Arduino Stackable Header Kit SparkFun Electronics 10007 Female pin headers for connecting PCB to microcontroller. 1 required.
Adjustable 30W 110V soldering iron - XY-258 110V Adafruit 180 For making electrical connections to the PCB. 1 required.
Soldering iron stand Adafruit 150 For making electrical connections to the PCB. 1 required.
Mini Solder spool - 60/40 lead rosin-core solder 0.031" diameter - 100g Adafruit 145 For making electrical connections to the PCB. 1 required.
0.1 μF capacitor SparkFun Electronics COM-08375 Stabilizes voltage in PCB. 1 required.
10 μF capacitor SparkFun Electronics COM-00523 Stabilizes voltage in PCB. 1 required.
MAX7219CNG LED Matrix/Digit Display Driver - MAX7219 Maxim MAX7219CNG LED driver. 1 required.
8 pin IC Socket Mouser Electronics 575-144308 16 required. These will be stacked on top of each other to support the culture vessel above the LED matrix.
24 Pin IC socket Mouser Electronics 535-24-3518-10 Optional. Use this to reversibly attach the MAXIM 7219CNG driver to the PCB.
Digital multimeter Adafruit 2034 For troubleshooting electronics. 1 required.
Break Away Headers - 40-pin Male (Long Centered, PTH, 0.1") SparkFun Electronics PRT-12693 Male pin headers for connected LED matrix to printed circuit board. Ends can be trimmed with wire cutters. 1 set required. 
Flush diagonal wire cutters Adafruit 152 For trimming long pin headers and cutting power cables. 1 required.
Premium Female/Female Jumper Wires - 40 x 12" (300mm) Adafruit 793 Wire ribbon for connecting breadboard to LED matrix. Can be connected end-to-end with male pin-headers to be longer. 1 required.
Half-size breadboard Adafruit 64 The LED matrix will connect to this and the culturing vessel will rest above it.
Miniature 8x8 Blue LED Matrix Adafruit 956 Light source. Dominant wavelength is 470nm (blue). 1 required. Alternative miniature LED matrices from the same vendor are available with dominant wavelengths: 624 nm (red), 588 nm (yellow), 525 nm (green), 572 nm (yellow-green), and white.
Stackable header-3 pin SparkFun Electronics 13875 8 required.
Resistor Kit - 1/4W (500 total) SparkFun Electronics 10969 For electronics. 1 required.
 IRL520N MOSFET International Rectifier IRL520N Voltage regulating switch for controlling DC current. 4 required.
Hook-Up Wire - Assortment (Solid Core, 22 AWG) SparkFun Electronics PRT 11367 Wire for electronics. 1 required.
5V 2A (2000mA) switching power supply - UL Listed Adafruit 276 Power supply for the heating pad and Arduino. 2 required.
12 VDC 1000mA regulated switching power adapter - UL listed Adafruit 798 For peristaltic pumps. 2 required.
Electric Heating Pad - 10cm x 5cm Adafruit 1481 For heating the bioreactor. 1 required.
Low flow variable flow peristaltic pump Fisher Scientific 13-876-1 For pumping media. 1 required
Medium flow variable flow peristaltic pump Fisher Scientific 13-876-2 For pumping culture. 1 required.
9 VDC 1000mA regulated switching power adapter - UL listed Adafruit 63 For microcontroller power supply. Order 1.
High Temp Waterproof DS18B20 Digital temperature sensor + extras Adafruit 642 Thermometer for the bioreactor. 1 required.
Micromanager Micromanager NA The free, open-sourced microscope control software is available at "https://micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release"
FIJI ImageJ NA The free, open-sourced image analysis software is available at "http://fiji.sc/"
Arduino Integrated Development Environment Arduino NA The free, open-sourced IDE is available at "https://www.arduino.cc/en/Main/Software"
Custom code GitHub NA The custom microcontroller code and "Bioreactor Controller" plugin are available in the “Optogenetic Chemostat Files” GitHub repository (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files).
USB Cable A to B - 6 Foot SparkFun Electronics CAB-00512 Used to download data to microcontroller. 1 required.
bioreactorTimecourse_example.csv GitHub NA The advantage of loading LED matrix values from a CSV file is that a program can be called by the plugin to update those values based on image analysis results, and those values can be reloaded to the microcontroller, enabling feed-back control. It is available from the “Optogenetic Chemostat Files” GitHub repository (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files).
Tota-frost gels (diffusion paper) B&H B&H # LOFSFTL
MFR # T1-72		 For LED matrix. 1 required.
Kitting Sheet Crosslink 1/4x12x24in Grainger, inc 20JL37 Black foam for culturing vessel enclosure. 4 required.
Standard Photodiode Power Sensor, Si, 200 - 1100 nm, 50 mW  Thorlabs S120VC For measuring light intensity. 1 required.
Labelling Tape Fisher Scientific 159015N For labelling and securing loose components. 1 required.
Compact Power and Energy Meter Console, Digital 4" LCD Thorlabs PM100D For measuring light intensity. 1 required.
100mL GL45 hybridization glass bottle Bellco Glass, Inc. (7910-40150) Bioreactor vessel. 1 required.
Six port assembly Bellco Glass, Inc. Custom  For the bioreactor vessel. Tubing Specs: .125" OD x .055"ID. Port A: 1.0" long above cap slug and to bottom of tube. Ports B,C,E,F: 1.0" long above cap slug, 33 mm long below. Port D: 1.0" long above cap slug, 65 mm  long below. 1 required. Includes 45 mm diameter polypropylene open top screw cap and a white silicone gasket to ensure a tight seal between the cap and the vessel. 
Scotch Magic Tape 3105, 3/4 x 300 Inches, Pack of 3 Amazon B0009F3P3U Clear scotch tape. This is available from many other vendors. It is used to cover markings on the culturing vessel and to secure the coverglass with the PDMS channel to the aluminum support frame.
1/16" ID x 3/16" OD x 1/16" Wall Tygon Sanitary Silicone Tubing United States Plastic Corp. 57288 Tubing. ~25' required.
Cole-Parmer Twistit white rubber stopper, size 10 Cole-Parmer EW-62992-32 Media flask stopper and effluent flask stopper. 2 required.
2L Laboratory Flask Pyrex 4980 Media flask and effluent flask. 2 required.
Day pinchcock Fisher Scientific 5867 For pinching tubes shut. 3 required.
Replacement tubing assembly 1/16" ID Traceable Products 3372 The peristaltic pumps come with a set of tubes, but they wear out after weeks of use.
Replacement tubing assembly 1/50" ID Traceable Products 3371 The peristaltic pumps come with a set of tubes, but they wear out after weeks of use.
Male luer with lock ring x 1/16" hose barb, Nylon, 25/pk Cole-Parmer EW-45505-00 Connectors. ~10 luers are required.
Male luer with lock ring x 1/8" hose barb, Nylon, 25/pk Cole-Parmer EW-45505-04 Connectors. 5 required, one for each rubber stopper hole to fill with tubing.
Female luer x 1/16" hose barb adapter, Nylon, 25/pk Cole-Parmer EW-45502-00 Connectors. ~10 luers required.
Female luer x 3/16" hose barb adapter Cole-Parmer EW-45502-08 Connectors. ~10 luers required.
Cole-Parmer Luer Accessory, Female Luer Cap, Nylon, 25/Pk Cole-Parmer SC-45502-28
Cole-Parmer Luer Accessory, Male Luer Lock Plug, Nylon, 25/Pk Cole-Parmer EW-45505-56
Microbore PTFE Tubing, 0.022"ID x 0.042"OD, 100 ft/roll Cole-Parmer EW-06417-21 Tubing. 1 roll required.
Masterflex platinum-cured silicone tubing, L/S 13, 25 ft Cole-Parmer EW-96410-13 Tubing. ~25' required.
3/16" ID x 1/4" OD x 1/32" Wall Tygon Sanitary Silicone Tubing United States Plastic Corp. 57293 Tubing. ~1' required.
Vacuum filter Fisher Scientific 974107 Nalgene vacuum filter for sterile filtering media.
Aquel Oxy-Boost 200 Rena Aquatic Supply AP200 Dual diaphram adjustable flow air pump for aerating and mixing media. 1 required. 
0.2 μm pore syringe filter Corning International 431229 This ensures that air from the aquarium pump does not contaminate the apparatus. 1 required.
Slygard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning Slygard 184 For microfluidic device. 1 required.
American Safety Razor GEM Scientific Single-Edge Razor Blades Fisher Scientific 17989000 For cutting tubes and PDMS. 1 blade required.
Harris Uni-Core hole puncher 1.2mm ID Sigma-Aldrich WHAWB100028 ALDRICH For punching inlet/outlet in microfluidic device. 1 required.
Microscope cover glass 22x60-1.5 Fisher Scientific 12-544-G For microfluidic device. 1 required.
Rectangular aluminum frame with a square window Custom Custom To support the microfluidic channel. Outer dimensions: 3 inches x 1.25 inches.
Inner dimmensions (cut out portion): 7/8 inches x 7/8 inches
Thickness: ~1/32 inches

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Motta-Mena, L. B., Reade, A., et al. An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics. Nature chemical biology. 10 (3), 196-202 (2014).
  2. Hughes, R. M., Bolger, S., Tapadia, H., Tucker, C. L. Light-mediated control of DNA transcription in yeast. Methods. 58 (4), 385-391 (2012).
  3. Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. A light-switchable gene promoter system. Nature biotechnology. 20 (10), 1041-1044 (2002).
  4. Polstein, L. R., Gersbach, C. a Light-inducible spatiotemporal control of gene activation by customizable zinc finger transcription factors. J Am Chem Soc. 134 (40), 16480-16483 (2012).
  5. Polstein, L. R., Gersbach, C. a A light-inducible CRISPR-Cas9 system for control of endogenous gene activation. Nature Chemical Biology. 11 (3), 198-200 (2015).
  6. Yang, X., Jost, A. P. T., Weiner, O. D., Tang, C. A light-inducible organelle-targeting system for dynamically activating and inactivating signaling in budding yeast. Molecular biology of the cell. 24 (15), 2419-2430 (2013).
  7. Lee, S., Park, H., et al. Reversible protein inactivation by optogenetic trapping in cells. Nature methods. 11 (6), 633-636 (2014).
  8. Kennedy, M. J., Hughes, R. M., Peteya, L. A., Schwartz, J. W., Ehlers, M. D., Tucker, C. L. Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells. Nature Methods. 7 (12), 973-975 (2010).
  9. Yazawa, M., Sadaghiani, A. M., Hsueh, B., Dolmetsch, R. E. Induction of protein-protein interactions in live cells using light. Nat Biotechnol. 27 (10), 941-945 (2009).
  10. Zoltowski, B. D., Motta-Mena, L. B., Gardner, K. H. Blue light-induced dimerization of a bacterial LOV-HTH DNA-binding protein. Biochemistry. 52 (38), 6653-6661 (2013).
  11. Renicke, C., Schuster, D., Usherenko, S., Essen, L. O., Taxis, C. A LOV2 Domain-Based Optogenetic Tool to Control Protein Degradation and Cellular Function. Chemistry & Biology. 20 (4), 619-626 (2013).
  12. Novick, A., Szilard, L. Description of the chemostat. Science (New York, N.Y.). 112 (2920), 715-716 (1950).
  13. Monod, J. La technique de culture continue. Théorie et applications. Ann. Inst. Pasteur. 79 (4), 390-410 (1950).
  14. Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. A light-switchable gene promoter system. Nature Biotechnology. 20, 1041-1044 (2002).
  15. Kennedy, M. J., Hughes, R. M., Peteya, L. A., Schwartz, J. W., Ehlers, M. D., Tucker, C. L. Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells. Nature Methods. 7, 973-975 (2010).
  16. Olson, E. J., Tabor, J. J. Optogenetic characterization methods overcome key challenges in synthetic and systems biology. Nature chemical biology. 10 (7), 502-511 (2014).
  17. Botstein, D., Fink, G. R. Yeast: An experimental organism for 21st century biology. Genetics. 189 (3), 695-704 (2011).
  18. Galanie, S., Smolke, C. D. Optimization of yeast-based production of medicinal protoberberine alkaloids. Microbial cell factories. 14 (1), 144 (2015).
  19. Gerngross, T. U. Advances in the production of human therapeutic proteins in yeasts and filamentous fungi. Nature biotechnology. 22 (11), 1409-1414 (2004).
  20. van Maris, A. J. A., Abbott, D. A., et al. Alcoholic fermentation of carbon sources in biomass hydrolysates by Saccharomyces cerevisiae: current status. Antonie van Leeuwenhoek. 90 (4), 391-418 (2006).
  21. Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. Computer control of microscopes using µManager. Curr Protoc Mol Biol. , Chapter 14 (2010).
  22. Edelstein, A. D., Tsuchida, M. A., Amodaj, N., Pinkard, H., Vale, R. D., Stuurman, N. Advanced methods of microscope control using µManager software. Journal of biological methods. 1 (2), (2014).
  23. Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  24. Bhattacharya, S., Datta, A., Berg, J. M., Gangopadhyay, S. Studies on surface wettability of poly(dimethyl) siloxane (PDMS) and glass under oxygen-plasma treatment and correlation with bond strength. Journal of Microelectromechanical Systems. 14 (3), 590-597 (2005).
  25. Saldanha, A. J., Brauer, M. J., Botstein, D. Nutritional homeostasis in batch and steady-state culture of yeast. Molecular Biology of the Cell. 15, 4089-4104 (2004).
  26. Boer, V. M., Tai, S. L., et al. Transcriptional responses of Saccharomyces cerevisaie to preferred and nonpreferred nitrogen sources in glucose-limited chemostat cultures. FEMS Yeast Research. 7, 604-620 (2007).
  27. Boer, V. M., Amini, S., Botstein, D. Influence of genotype and nutrition on survival and metabolism of starving yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 6930-6935 (2008).
  28. Brauer, M. J., Huttenhower, C., et al. Coordination of growth rate, cell cycle, stress response and metabolic activity in yeast. Molecular Biology of the Cell. 19, 352-367 (2008).
  29. Gresham, D., Dunham, M. J. The enduring utility of continuous culturing in experimental evolution. Genomics. 104 (6), 399-405 (2014).
  30. Liu, H., Yu, X., et al. Photoexcited CRY2 interacts with CIB1 to regulate transcription and floral initiation in Arabidopsis. Science (New York, N.Y.). 322 (5907), 1535-1539 (2008).
  31. McIsaac, R. S., Oakes, B. L., Wang, X., Dummit, K. A., Botstein, D., Noyes, M. B. Synthetic gene expression perturbation systems with rapid, tunable, single-gene specificity in yeast. Nucleic Acids Research. 41 (4), 1-10 (2013).
  32. McIsaac, R. S., Petti, A. A., Bussemaker, H. J., Botstein, D. Perturbation-based analysis and modeling of combinatorial regulation in the yeast sulfur assimilation pathway. Molecular biology of the cell. 23 (15), 2993-3007 (2012).
  33. McIsaac, R. S., Silverman, S. J., et al. Fast-acting and nearly gratuitous induction of gene expression and protein depletion in Saccharomyces cerevisiae. Molecular biology of the cell. 22 (22), 4447-4459 (2011).
  34. Melendez, J., Patel, M., Oakes, B. L., Xu, P., Morton, P., McClean, M. N. Real-time optogenetic control of intracellular protein concentration in microbial cell cultures. Integrative biology quantitative biosciences from nano to macro. 6 (3), 366-372 (2014).
  35. Brauer, M. J., Huttenhower, C., et al. Coordination of growth rate, cell cycle, stress response, and metabolic activity in yeast. Molecular biology of the cell. 19 (1), 352-367 (2008).
  36. Boer, V. M., Crutchfield, C. A., Bradley, P. H., Botstein, D., Rabinowitz, J. D. Growth-limiting intracellular metabolites in yeast growing under diverse nutrient limitations. Molecular biology of the cell. 21 (1), 198-211 (2010).
  37. Markham, B. E., Byrne, W. J., Methods, E. Uptake, storage and utilization of phosphate by yeast. Journal of the Institute of Brewing. 73, 271-273 (1967).
  38. Kazemi Seresht, A., Palmqvist, E. A., Olsson, L. The impact of phosphate scarcity on pharmaceutical protein production in S. cerevisiae: linking transcriptomic insights to phenotypic responses. Microbial cell factories. 10 (1), 104 (2011).
  39. Shimizu, K. Regulation Systems of Bacteria such as Escherichia coli in Response to Nutrient Limitation and Environmental Stresses. Metabolites. 4 (1), 1-35 (2013).
  40. Olson, E. J., Hartsough, L. A., Landry, B. P., Shroff, R., Tabor, J. J. Characterizing bacterial gene circuit dynamics with optically programmed gene expression signals. Nature methods. 11 (4), 449-455 (2014).

Tags

Bioengineering גיליון 120 Optogenetics מיקרוביולוגיה ביולוגיה סינתטית chemostat, נבגי שמרים שליטה זיהוי המערכת ביטוי חלבון
השרשה של תאורה אוטומטית, Culturing, מערכת דגימה עבור יישומים מיקרוביאלית optogenetic
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stewart, C. J., McClean, M. N.… More

Stewart, C. J., McClean, M. N. Design and Implementation of an Automated Illuminating, Culturing, and Sampling System for Microbial Optogenetic Applications. J. Vis. Exp. (120), e54894, doi:10.3791/54894 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter