Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Mikrobiyal optogenetic Uygulamaları Tasarım ve Otomatik Aydınlatıcı, kültürleme ve Örnekleme Sistemi Uygulaması

Published: February 19, 2017 doi: 10.3791/54894
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biomedical Engineering, University of Wisconsin-Madison

Summary

Biz bir inverted mikroskop ile atık mikropların kültürler ve düzenli görüntü hücrelere aydınlatmak için Optogenetic sistemleri ile kullanım için sürekli bir kültür cihazı tasarlanmıştır. aydınlatma dinamik tepkiler birkaç gün içinde ölçülebilir, böylece kültür, örnekleme, görüntüleme ve görüntü analizi tam otomatik vardır.

Abstract

Optogenetic sistemleri hücresel prosesleri değiştirebilir ve ışık spesifik dalga boylarında yanıt olarak şekil değiştirirler genetik olarak kodlanmış proteinleri kullanılmaktadır. Optogenetic sistemlerin aydınlatma ve stimülasyon programlanan kullanan sistemler kültürlenmesi ve ölçülmesi için bir ihtiyaç vardır. Biz bina ve ışık programlanmış dozlarda mikrobiyal hücrelerin aydınlatmak ve otomatik olarak kazanmak ve atık hücrelerin görüntülerini analiz etmek için sürekli bir kültür cihazı kullanılarak bir protokol mevcut. Bir kemostat bu düzeneğin çalışması büyüme ve hücre ortamı sıkı bir şekilde kontrol edilmesini sağlar. sürekli hücre kültürü atık düzenli örneklenmiş ve hücreler çok kanallı mikroskobu ile görüntülenmiş. floresan yoğunluğu ve kültür mahsulünden örneklenen hücrelerin hücresel morfoloji dinamik tepkiler birden fazla gün boyunca ölçülen böylece kültür, örnekleme, görüntüleme ve görüntü analizi tam otomatik olankullanıcı girişi olmadan. Dinamik olarak transkripsiyonu aktive bir Optogenetic sistemi ile işlenmiş, Saccharomyces cerevisiae protein üretimini indükleyen bu kültürleme cihazının kullanımını göstermektedir.

Introduction

Optogenetic sistemleri gen ekspresyonu, 1, 2, 3, 4, 5 protein lokalizasyonu, 6 protein aktivitesini, 6, 7, 8 protein bağlama, 8, 9, 10 ve protein degradasyonunu da dahil olmak üzere hücresel süreçleri artan listesini kontrol etmek için ışık kullanır. Programlı optik stimülasyon ile kontrollü bir ortamda hücrelerin kültüre ve biyolojik ilgili zaman ölçekleri üzerindeki tepkisini ölçmek için 11 bir yöntem hücre biyolojisi ve biyoteknoloji araştırma için bu araçların potansiyelini gereklidir. Önerilen yöntem, AE, iyi karışmış sürekli bir hücre büyüme hızını sabitlemek için chemostasis yararlanırpuan ve programlanan aydınlatma maruz sıcaklık kontrollü cam kültürleme kabı 12, 13. bir inverted mikroskop ile kültür atık suyunda görsele tek tek hücreler programlanmış aydınlatma kültür tepkisini ölçmek için. floresan yoğunluğu ve atık hücre kültürünün hücresel morfoloji kullanıcı girişi olmadan birden fazla gün içinde ölçülebilir, böylece kültür, örnekleme, görüntüleme ve görüntü analizi tam otomatik vardır.

Bu protokol, büyüyen hücre kültürü ve mikroskopi aşina en laboratuvarlarında uygulanabilir ve kullanılan cihaz ucuz ve kolaylıkla temin edilebilen bileşenler yapılmıştır. Şeffaf bir kültürleme kabı ışık 1 uW / cm2 -10 mW / cm2 yayabilen ışık yayan diyotlar (LED), bir matris üzerine yerleştirilir. Mikroplar sürekli kültür kabında yetiştirilir; bir peristaltik pompa de medya eklemek için kullanılırseyrelme oranı, bir mikroskop daha az bir oranda kültür çekmek için kullanılır ve fark, taşma çıkışı kaçar. Bir ısıtma yastığı sıcaklığını koruyor. Hava sürekli pozitif basıncı muhafaza etmek ve karıştırmak ve havalandırmak için kültür kültür kabına pompalanır. Hava pompası dışında, bu cihazlar için güç aynı zamanda bir termometre ve bağlı masaüstü bilgisayardan giriş alır bir mikro denetleyici tarafından düzenlenir. atık hücre kültürü ters bir mikroskop sahnede bir mikroakışkan cihaz pompalanır. Floresan olmayan ve floresan görüntüler otomatik olarak elde edilir. Görüntülerde hücreler ilgi (ROI) bir bölge olarak her bir hücreyi bulur ve her ROI özelliklerini ölçen bir algoritma ile karakterizedir.

Bu protokolün bir uygulama göstermek için, bir mavi ışık responsi ile mühendislik Saccharomyces cerevisiae hücreleri değişen ışık şiddetlerinde yanıt ölçülenfloresan protein transkripsiyonunu kontrol eden Optogenetic Sistemi. Bu sistemde gen ekspresyonunu kontrol etmek için çok sayıda Optogenetic sistemleri zaten 14, 15, 16 bulunduğu için yaygın olarak ekmek mayası olarak bilinen, S. cerevisiae, seçilmiştir. Bundan başka, bu model organizma yaygın sistem biyolojisi 17 ve biyo teknolojik uygulamalarda 18, 19, 20 için bir şasi gibi çalışmaları için kullanılır. Bizim Örnek Sonuçlar Bu protokol, giriş ışık değişen yoğunluklarda ve flüoresan raportör üretimini ölçerek çok gün boyunca kültürü transkripsiyonunu kontrol etmek için kullanılabileceğini gösterir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Şekil 1

Şekil 1: Sürekli kültür aparatı. Bu basitleştirilmiş diyagramıdır cihazı lambası, kültür için kullanıldığında birleştirilmiş ve mikropların optik özelliklerini ölçmek nasıl olması gerektiğini gösterir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

şekil 2
Şekil 2: protokolün genel bakış. gölgeli bölgedeki adımlar protokol kullanıldığı her zaman yinelenmesi gerekir. Kapalı döngü kontrolü mümkündür 34 olduğunu, ancak bu protokol uygulanmadı.

1. Devre Kurulu Termometre birleştirin


Şekil 3: Bağlantılar termometre değerlerini okumak için. Bu diyagram mikro kültürünün sıcaklığını kontrol etmek geribildirim almak, böylece dijital termometre PCB bağlanması gerekir gösterir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

  1. delikler aracılığıyla işaretli kendi dijital termometre Ground, Veri ve pozitif gerilim hatları lehim "GD + V."
  2. Bir kadın 3 pinli başlığından bir pin off klibi ve "R2" etiketli iki geçiş delikleri içine sığacak ve mikrodenetleyici engel olamaz, öyle ki tel makasları ile kalan 2 işaretçilerine kırpın. yerinde bu lehim. pim başlığındaki 4,7 kÊ direnci takarak iki lehimli işaretçilerine bağlayın.

2. Güç Con bağlayınDevre Kurulu kumanda Bileşenleri

Şekil 4,
Şekil 4: Bağlantılar ısıtma pedi güç kontrol etmek. Bu şema PCB ve aksesuar parçaları ısıtma yastığı güç kontrol etmek amacıyla monte edilmelidir gösterir. parça peristaltik pompalar benzer bir şekilde bağlanır kontrol etmek. termometre için bileşenler netlik için kaldırılmıştır unutmayın. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

  1. Beş kadın 3-pin başlıkları pimleri 1 cm keserek. (PCB) "# 1", "# 2", "3.", "4. olarak işaretlenen baskılı devre kartı üzerindeki pozisyonları bu lehim" ve "CB E."
  2. Bir kadın 6-pin ve 8-pin başlığının pimleri 1 cm keserek. için yan Bu yan Lehimgeçiş delikleri sütun K14 ile K1 etiketli.
  3. Devre kartına ısıtma yastığı bağlayın.
    1. PCB üzerinde geçiş delikleri etiketli K1 ve K2 içinde 100 kÊ direnç uçlarını takın. pozisyona bir metal-oksit yarıiletken alan etkili transistör (MOSFET) yerleştirin, böylece kaynak pimi "# en yakın geçiş delikleri K14 ile K1 doğru bakan MOSFET etiketi, PCB üzerindeki 1. işaretli # "etiketi" etiketi ve drenaj pimi uzak "dedi.
    2. 5 V doğru akım (DC) güç kaynağı kablosu Toprak hattını kesmek ve J2 bağlayın. J1 ısıtma yastığı toprak hattını bağlayın. 1 kÊ direnci ile 3 pin K3 bağlayın. pin 3 + 5V.z olarak ayarlandığında Güncel artık sadece J2 için J1 akmalıdır
      NOT: mikrodenetleyici pin 3 5 V. ayarlandığında J2 pin J1 dan akımın sağlayan bir anahtar olarak direnç / MOSFET set fonksiyonları
  4. bağlamakYavaş peristaltik pompa.
    1. PCB üzerinde geçiş delikleri etiketli K4 ve K5 içinde 100 kÊ direnç uçlarını takın. pozisyona bir MOSFET yerleştirin, böylece kaynak pimi "#" etiketi en yakın olan ve tahliye pimi uzak olduğunu geçiş delikleri K14 ile K1 doğru bakan MOSFET etiketi, PCB üzerindeki 2. işaretli "#" etiket.
    2. Yavaş peristaltik pompa 12 V DC güç kaynağı kablosunun toprak hattı kesti. J3 uca ve J4 uca bakan duvar siğil bakan peristaltik pompa bağlayın. 1 kÊ direnci ile 4 pin K6 bağlayın. pim 4 5 V. ayarlandığında Güncel artık sadece J4 için J3 akmalıdır
  5. Hızlı peristaltik pompa bağlayın
    1. PCB üzerinde geçiş delikleri etiketli K7 ve K9 içinde 100 kÊ direnç uçlarını takın. pozisyona bir MOSFET yerleştirin K14 geçiş delikleri s ile K1 doğru bakan MOSFET etiketi, PCB üzerindeki 3. işaretli Bu o kaynak pimi "#" etiketi en yakın olan ve tahliye pimi "#" etiketi uzak olduğunu.
    2. Hızlı peristaltik pompa 12 V DC güç kaynağı kablosunun toprak hattı kesti. J5 uca ve J6 uca bakan duvar siğil bakan peristaltik pompa bağlayın. 1 kÊ direnci ile 5 pin K9 bağlayın. pim 5 5 V. ayarlandığında Güncel artık sadece J6 için J5 akmalıdır

3. Devre Kurulu LED Matrix bağlayın

Şekil 5,
Şekil 5: Bağlantılar LED matris kontrol etmek. Bu diyagram LED matris PCB bağlanması gerekir gösterir. Aynı zamanda PCB mikrodenetleyici yığılmış olabileceğini göstermektedir. termometre ve diğer cihazlara DC gücünü kontrol etmek için bileşenler netlik için kaldırılmıştır unutmayın.es / ftp_upload / 54894 / 54894fig5large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

  1. bu mikrodenetleyici üst üste edilecek şekilde PCB tarafta boydan boya deliklere 6-pin, 10-pin ve iki 8-pin dişi pin başlıkları lehimleyin.
  2. 10 jxF kondansatör (kısa kurşun) negatif terminali negatif işareti ile geçiş deliğinin bağlı gerektiğini belirterek, PCB üzerindeki işaretli konumlara 100 NF ve 10 jxF kapasitörler lehimleyin.
  3. uzak sürücüye girinti ile, geçiş delikleri 2 12 ile kümesine LED sürücü lehim aracılığıyla delikleri LED matrisi için saklıdır.
  4. LED matris için işaretli geçiş delikleri erkek pin başlıkları 2 sütun lehimleyin ve onlar mikrodenetleyici engel olmayacak şekilde breadboard altında bu uçlarını kırpın. dişi / dişi bağlantı kabloları iki 8 telli şeritler bu bağlayın. erkek ikinci bir set bağlayınbağlantı kabloları diğer ucuna pin başlıkları.
  5. breadboard medyan üzerinde LED matris yerleştirin ve sonra matrisin iki tarafında kolonlara pin başlıkları ikinci seti yerleştirin. LED matris doğrudan geçiş delikleri etiketli sütunda karşılık gelen matris etiketli tarafı ile PCB bağlı sanki elektrik bağlantıları aynı olduğundan emin olun.
  6. Bir kadın 3 pinli başlığından bir pin off klibi ve "R1" etiketli iki geçiş delikleri içine sığacak ve mikrodenetleyici engel olamaz, öyle ki tel makasları ile kalan 2 işaretçilerine kırpın. Bu lehim. pim başlığındaki 1 kÊ direnci takarak iki lehimli işaretçilerine bağlayın.
    Not: kültür gemi LED matris üzerinden yığılır. tel şeritler gemi engel olursa, matristen onları ofset. Ardından, elektrik bağlantıları ch yok böyle matris pimleri ve telli şeritli pimleri arasındaki uçurumu katı çekirdek tel kullanmakange.

4. Yazılımı Yükle ve Donanım bağlanın

  1. mikrodenetleyici PCB yığını.
  2. mikroişlemci için tümleşik geliştirme ortamı (IDE) ve özel kod indirmek için malzeme listesinde bağlantıları izleyin.
  3. Bir AB evrensel seri veri yolu (USB) kablosu aracılığıyla mikroskop bilgisayara mikrodenetleyici bağlayın. Derleme ve mikrodenetleyiciye özel kod yükleyin.
  4. Mikro-Yöneticisi 21, 22 ve Fiji 23 indirin. Tüm ".dll" dosyaları "mmplugins" dizini kopyalayarak FIJI eklenti ve Mikro-Yöneticisi "Fiji.app" dizine indirilen dizinindeki "mmautofocus" dizini olarak Mikro-Yöneticisi yapılandırın. Ayrıca, "Fiji.app/plugins" dizine "eklentileri / Micro-Yöneticisi" dizinine kopyalayın.
  5. "BioreactorController.jar" dosya int indirin"Fiji.app/mmplugins" dizinine o.
  6. FIJI> Eklentiler> Mikro-Manager> Mikro-Manager Studio Açık Mikro-Yöneticisi. mikroskop kontrol yazılımı yapılandırmak için Donanım Yapılandırma Sihirbazı kullanın. AB USB kablosu bağlı olduğu liman etiketi ile Sihirbazı "FreeSerialPort" cihazı bulunmaktadır.

5. olun ve Kültürleme Gemi Işık geçirmez Muhafaza karakterize

  1. kültür damar matrisinin üstünde onlara dinlenme öyle ki LED matrisin her köşesinde breadboard yapı taşları olarak üç 8 pinli IC yuva Stack.
  2. prizler üst tabakasının altında difüzyon kağıt bir kısmını sabitleyin, LED matris kültür gemi çarpıcı ışık dağınık böyle olduğunu.
  3. siyah köpük bölümleri "6 ile" üç 8 kesiniz. İlk tw içinden elektronik breadboard aynı boyutta bir kısmını (2.3 "x 3.5") Keso ve üçüncü içinden IC prizleri tarafından yapılan dikdörtgen (0.9 "x 1.8") boyutu bir kısmı. 0.9 "x 1.8" diyafram içeren son kat bile IC soketleri üst aittir ve LED matris çevreleyen şekilde LED matris üzerinden bu katmanları Stack.
  4. 6 "24" dikdörtgen yapmak için yarıda siyah köpük ek bir levha kesti. kültür gemi o termal ve optik kültür gemi izole edecek şekilde boru ve teller için oda ile sığabilir siyah köpük içi boş bir sütuna bu yuvarlayın.
  5. LED matris üzerinden siyah köpük içi boş sütun ortalayın ve altında siyah köpük tabakası üzerinde sütun sınırını işaretleyin. gelecekte merkezli olması gereken yerde, bu sınır işareti olacaktır.
  6. siyah köpük 3 "x 3" kısmını kesip. Harici ışık engellemek için sütunun üst bantlanmış edilebilir bir kapak olarak daha kullanın.
  7. inci fotodiyot güç sensörü takın e bantla geminin kap kültüre, kapağı takmak ve muhafazaya kültür gemi yerleştirin.
  8. Mikro-Yöneticisi'nde, Eklentiler> Biyoreaktör Kontrolörü gidin. 30 s aralıklarla olası yoğunluklarının aralığının bir alt kümesine aydınlatmak için matris olarak ayarlayın.
  9. Güç sensörüne bağlı güç ölçer konsolda görüntülenen ışık şiddetlerinde kaydedin. Bu ölçümler, bu LED'ler yaktı LED'lerin sayısı ve darbe genişliği modülasyonlu (PWM) akım ayarlandığında ışık gerçek yoğunluğu bilinen sağlayacaktır.

6. Kültürleme Gemi hazırlayın

Şekil 6,
Şekil 6: Gemi bağlantıları. Bu şema düzeneğinin kap ve boru önce otoklavlanmıştır olan bağlanmalıdır gösterir."Blank> Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

  1. Mark kültürleme kabı içinde, 30 mL, 10 mL aralığında sıvının her 2 ml artışına karşılık gelen yüksekliği. Steril deiyonize su 10 ml takın su seviyesini işaretleyiniz 2 mL ekleyin, su seviyesini işaretleyin ve 30 ml düzeyinde işaretlenmiş kadar tekrarlayın. kolayca kaldırılır ve böylece şeffaf bir bantla işaretler Kapak ve sıvı atmayın.
  2. kültür kabına, silikon conta yoluyla alüminyum bağlantı uzun ucu yerleştirin. kapağını tekrar.
  3. . 1/16 "ID silikon boru ile kısa bir alüminyum bağlantı çıkışı Kapak bir dişi luer kilit ekleme ve sonra bir erkek luer kilit fişi bağlayarak uzak ucunu. Bu çıkış tamamlayıcı ve Şekil 6'da (tüp 6 kullanılmayacaktır ).
  4. . Erkek ve dişi luer kilit ile 1/16 "ID silikon boru iki kısa kesimleri bağlayın kısa bir alüminyum bağlantı çıkışına bir ucunu ve Dista fişBir erkek luer ve dişi luer kilit fişi ile l sonu. Gemi bu tüp (tüp Şekil 6'da 7 / 7.1) ile inoküle edilecektir.
  5. Kimlik peristaltik boru ve konektörler "1/16 uçlarına kimlik tüpleri" İki 1/16 bağlayın. Kısa bir alüminyum bağlantı noktasına bir ucunu ve (Şekil 6 tüp 4) diğer takın. Daha sonra, bu ortam şişeye bağlanır.

7. Medya Flask hazırlayın

  1. 1/16 "uzun alüminyum bağlantı noktasına iç çapı (ID) silikon tüp. tüp medya şişesi ulaşmak için yeterli uzunlukta olmalıdır. 1/8 bağlayın" Connect 1/16 kısa bir kesimine Kimlik erkek luer kilidi " kimlik tüp, önceki tüp bu bağlantı ,, ve daha sonra medya balona (Şekil 6 tüp 3) üzerinde lastik tıpa içine bu kısa segment yerleştirin.
  2. tüp kelepçe. Bu bağlantı, hava kültür kabına medya şişesi akmasına izin verir. Medya şişesi daha sonra havanın bir ile pompalanır zamanBu tüp kelepçelenmemiş olan d, kültür gazbeton, karışık ve gelen baloncuklar olumlu bir basınçta tutulacaktır.
  3. Bir 3/16 "ID tüp sonra". Medya transfer edilecek hangi aracılığıyla stoper, içine şişenin dibine ulaşmak için yeterince uzun kimliği tüp başka 1/16 bağlayın "1/16 takın bu bir kimlik tüp ve söyledi. bir 3/16 "ID dişi luer kilit ve bir erkek luer kilit fişi (tüp Şekil 6'da 1 / 1.1) ile bu takın.
  4. Stoper üçüncü delik uzak ucunda orta çaplı boru iki diğer kesimleri bağlı ve takılı, 1/16 "ID boru kısa bir segment ile doldurulmalıdır (tüp 2 Şekil 6'da / 2.1). Bu bağlanacaktır bir vakum pompasına ve daha sonra bir akvaryum pompası.
    NOT: boru kolayca lastik tıpa deliklerden sığmıyorsa, eğik boru uçlarını kesin. Daha sonra, delik içine itildiğinde eğimli uç aracılığıyla diğer parçalarını yakalamasına kullanılabilir.

  1. 1/16 bir segmentine bir erkek luer kilit takın "ID silikon tüp, ve sonra sıkıca 0.022 eklemek" Kimlik politetrafloroetilen (PTFE) boru. Ayrı, kilitler ve (Şekil 6 tüp 5) kısa bir alüminyum bağlantı noktasına, diğer bağlamak için PTFE tüp boyunca 1/16 "ID tüp. Sonra, iplik bir ucuna bir dişi luer kilit takın.
  2. Kimlik peristaltik tüp ve konnektörleri "1/50 ID silikon tüp" maruz 1/50 bağlayın. Bu amaçla, onları alternatif, 1/50 üç segment "Kimlik boru ve 0.022 iki segment" Kimlik PTFE tüp bağlayın. 1/16 "ID boru (Şekil 6 tüp 5) yoluyla atık balona bu bağlayın.
  3. Alüminyum port ikinci en uzun tüp ve atık balona diğer ucunu 1/16 "ID silikon tüpün bir ucunu. Bu alüminyum tüp kültür ses seviyesini ayarlar ve aşırı kültür atık konteyner (tüp 8 içine taşmaları
  4. 30 dakika süre ile 121 ° C ve 15 psi'de (genel sterilizasyon) kültürlendikten grubunu otoklava.
    Ortam Şişe vakum edilmesini sağlayan ortam şişe doldurulma ile tüpler, ve hangi kültürleme kabı aşılanmış uzak kademeli bir kirlenmiş olan, steril ortaya çıkarılabilir, böylece boru birden fazla segment: Not segmenti.

9. mikroakışkan Kanal hazırlayın

  1. : 1 oranında bir 9 polidimetilsiloksan (PDMS) ve sertleştirme ajanı karıştırılır. Degas ve silikon ana kalıp üzerine dökün.
  2. 65 ° C'de 2 saat boyunca PDMS tedavi etmek ve daha sonra bir jilet ile maskeden kesin. kalıptan serbest bırakana kadar PDMS etrafında kesti. aşağı iterek ve kırılgan gofret kesmekten kaçının.
  3. kanalın her iki uçta da delikler 1.2 mm İD biyopsi delgeç kullanın.
  4. Plazma bağ kapak cam 24 PDMS.
  5. uzun Bant PDMS kanalı alüminyum çerçeve üzerine ortalanması için, destekleyen alüminyum çerçeveye, cam biter ve daha sonra 65 ° C'de 2 saat boyunca daha PDMS fırında.

10. Dolgu Medya Flask

Şekil 7,
Şekil 7: medya ekleme. Bu diyagram ortam ortam şişeye süzüldü, vakum nasıl olması gerektiğini gösterir. Bu medya steril kalmasını sağlar. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

  1. Uygun ortamı olun. Sürekli kültür sistemi kemostat olarak ameliyat olacak olursa, belirli bir besin sınırlı ortamları kullanın.
    S. cerevisiae ile çalışmalar için standart medya kompozisyon örnekleri daha önce 25 yayınlanmıştır: NOT= "xref"> 26, 27, 28, 29.
  2. daha sonra steril cımbız ile vakum filtre meme ucundan beyaz fişi, 100 ml'lik şişe vakum filtresi takın meme kapağını çıkarın.
  3. Meme için 3/16 "ID silikon tüp iletişime, bir vakum pompasına ortam şişeye diğer serbest boru (tüp sırasıyla 1 ve Şekil 7 'de 2) ve kültür kabına ortam balon bağlantı borusu sıkıştırıldığı sağlamak (Şekil 7 tüp 3) kapattı.
  4. , Medya ile filtreyi doldurun vakum pompası açın ve sonra da medyanın geri kalanını filtre. vakum (Şekil 7'de tüp 2) bağlanan 1/16 "ID silikon tüp Kelepçe ve vakum pompası kapatın.
  5. borunun kirlenmemiş bir ucu erişilebilir, böylece vakum pompasına bağlı 1/16 "Kimlik boru ara kesimden leurs çıkarın. th yerleştirinBu tüp içine steril bir şırınga hava filtresinin e mavi sonu.
  6. 3/16 "ID silikon tüp (Şekil 7'de tüp 1) Kelepçe ve ondan erkek luer ayırın. Kültürleme geminin medya giriş borusunun kadın luer olan bağlantısını kesin. Olmaya medyayı etkinleştirmek için bu erkek ve kadın dişlerde bağlayın kültür kabına pompalanır.
  7. Vakum filtresini çıkarın ve vakumlu filtreye takıldı medyanın 100 mL şişe kapağı.
  8. kültür gemi inoküle olacak bir gün önce, önceki adımda toplanan medya 4 mL test tüpünde optogenetic mikrobun tek bir koloni aşılamak ve 30 ° C veya kültürün optimum sıcaklık artışı sıcaklığında gece büyümesine izin çalkalanarak.

11. Mikroskop Çevresi Aparatı monte

  1. Ortam kültür kabı ve efflu daha yüksek şişe mikroskop yakınındaki sürekli kültürleme grubunu ayarlama0.022 "ID PTFE tüp (Şekil 6 tüp 5) segmentleri oluşan tüp mikroskop aşamaya ulaşmak öyle ki kültür kabından daha düşük ent şişesi. Güvenli ortam şişesi ve atık konteyner lastik tıpaları aşağı bantlayın.
  2. (Şekil 6 tüp 5) onları bağlayan ID silikon tüp 0.022 "1/50 dan kimliği PTFE tüp" uçlarını çıkarın ve mikroakışkan cihazın giriş ve çıkış içine bu biter takın.
  3. akvaryum pompası şırınga hava filtresinin beyaz ucunu. Hava basıncı kültür kabına medyayı itecektir.
  4. Medya atık liman seviyesine ulaştığında, hızlı etrafında 1/16 "ID medya giriş tüp ve konnektörleri (Şekil 6 tüp 4) yavaş peristaltik pompa ve çevresinde 1/50" ID örnek çıkış boruları ve konnektörleri sarmak peristaltik pompa (Şekil 6 boru 5).
  5. Hava tu çözülmesini ile medya havalandırınOrtam şişeye ve kültürleme kabı arasında.
  6. sıcaklığı kontrol edilebilir, böylece kültür kabına ısıtma yastığı ve termometre kaydet. giren ortam kabı ile aynı sıcaklıkta olacak şekilde kültür kabına yaklaşık ortam boru sarmalı.
    NOT: ısıtma pedi PWM akım kendi set sıcaklığında kültür damarı tutmak için termometre girdileri kullanan mikro denetleyici tarafından düzenlenir.
  7. LED matris üzerinden siyah köpük muhafazanın içine kültür kabı yerleştirin ve tüpler sıkışmak değil emin olun.
  8. Mikro-Yöneticisi'nde, Eklentiler> Biyoreaktör Kontrolörü gidin. buharlaşma hızından 0.1 alanda "Medya pompa oranını" ve debisi çok düşük olacaktır 0'a alanında "konulu örnek pompa oranını", ama daha ayarlayın.
  9. Medya şişesi ve kültürleme geminin arasında gelen hava borusunu kelepçe. Şekil aşılama tüp (tüp 7 prizden çekin
  10. hiçbir ışık girer, böylece muhafaza Kapak ve kültür gecede büyümesine izin.

12. Kalibre Pompalama Oranları

  1. Mikro-Yöneticisi'nde, Eklentiler> Biyoreaktör Kontrolörü gidin. 0,5 sahada "Medya pompa oranını" ve 0 alanında "konulu örnek pompa oranını" olarak ayarlayın.
  2. Çıkış maddesi bir şişede (Şekil 6 boru 8) ve çıkış şişeye (Şekil 6'da boru 8) işletmeye alma tüpü taşma borusunu ayırın ve ayrı kaplarda çıkış maddesinin toplanması. pompa, 15 dakika açık kaldıktan sonra başlayan, 1 saat boyunca dışan akanı topla.
  3. kap olarak toplanan birimden kültür kabına ortamının akış hızı hesaplanır:
  4. Bu doğrusal tahmin tarafından sahada "Medya pompa oranı" değerini ayarlayın:
    Equaiton 2
    nerede
    Equaiton 3
  5. İstenen akış oranı ve ölçülen akış oranı arasındaki fark akış hızı 1 saatlik bir süre boyunca ortalama olarak <0.2 ml / saat, kadar bu kalibrasyon prosedürü yineleyin.
  6. Sahada "örnek oranı" değerini artırmak ve kültür kabını terkeden hacminin yaklaşık 4/5 inci örnekleme pompası tarafından pompalanan kadar benzer bir şekilde kalibre ve hacim yaklaşık 1/5 inci yoluyla bırakıyor taşma noktası.
  7. Sürekli kültür cihazı içinde kültür yoğunluğu gece bu şartlar altında dengelenmeye olsun.
    NOT: Hedef debileri ulaşılamazsa, değişiklikperistaltik pompa hortumu. büyük çaplı boru kullanıldığında sıvı daha yüksek bir pompalanır. adım 14 izleyin ve sonra 8.4 adıma geri dönün.

Kültür Mikroplar 13. toplayın Mikroskop Görüntüleri

  1. mikroakışkan kanal içine pompalanır hücrelerin görüntüleri odak düzlemi olacak hangi örtüşmeyen pozisyonlarda bir dizi mikro-Manager Sahne Pozisyon Listesini doldurun.
  2. "Biyoreaktör Kontrolör" eklentisi açın. istemleri istenen LED matris zamanlı kurs, görüntüleme kanalları ve diğer deneysel ayarları seçin. Toplayın ve görüntüleri analiz.
  3. Deney çalışırken, medya şişesi medya açık kalmasını sağlamak. bulutlu ise, o zaman kontamine olmuş.

14. Post-deney

  1. medya, aşırı hücre kültürü ve atık imha edin.
  2. iyonu giderilmiş su ile karıştırılarak% 20 EtOH 200 mL ortam şişesi doldurun. daha önce olduğu gibi kemostat çalıştırınHücre artıkları ve medya yıkamak için deney sırasında işletilmektedir.
  3. alkol çözeltisi medya şişeden boşaldığında, tamamen kemostat sökmeye.
  4. ılık su ve yumuşak bir deterjanla cam ve tüpler yıkayın ve deiyonize su ile iyice durulayın. kurumaya bırakın.
  5. Deney boyunca sıcaklık ve LED matris durumunu gözden geçirmek için "microcontrollerRecords.csv" dosyasını açın, "Summary.csv" dosya görüntülerin her setten özet verileri ve yorumlayan "Sonuçları <n> .csv" dosyaları n veri setindeki inci n her zaman dilimi, her ROI özetleme verileri gözden geçirmek.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bu aygıt, cry2 / CIB1 proteini çifti 30 göre, indüklenebilir kopyalama Optogenetic sistemi ile mavi ışığa karşılık olarak sarı floresan protein (YFP) ifade S. cerevisiae'nin kültürü teşvik etmek için kullanıldı. Hücreler 0.2 ± 0.008 ortalama seyrelme oranı ile fosfat sınırlı medyada chemostatically yetiştirilmiştir. Fosfat sınırlama genel olarak büyüme oranını kontrol etmek için, S. cerevisiae kemostat deneylerde kullanılan ve fosfat sınırlı etkileri de karakterize edilir. 31, 32, sürekli seyreltilmiş kültür kabından 33 Atık, bir inverted mikroskop ile mikroakışkan cihaza örneklendi. Şekil 8'de gösterildiği gibi resim otomatik olarak analiz edildi. Bireysel hücreler arka plan çıkarılır faz-kontrast görüntüleri ve YFP konsantrasyonları tespit edilmiştirarka plan çıkarılır fluoresan görüntüleri ölçülen tion fluoresansları tahmin edilmiştir.

169.677 hücre floresan deneyi 70 saat boyunca mikro sıvısal tertibat 28 yerle elde çıkış maddesinin 33,600 edilmiş görüntülerden analiz edildi. Bir floresan aydınlatma sistemi ve CMOS kamera ile donatılmış bir ters mikroskop kullanılır. YFP görüntüleri 500/20 nm eksitasyon filtre, 535/30 nm emisyon filtre ve T515lp dikroik ile elde edildi. Görüntüler Köhler aydınlatma altında, 40X faz kontrast amacı ile alınmıştır. mikrometre kare başına Görüntüler 87 piksel 16-bit renk derinliğinde kaydedildi. kültür 6 saat aralıklarla tam karanlık, ardından 6 saat aralıklarla mavi değişen ışık yoğunluklarına maruz kalmıştır. kültürünün floresan yoğunluğu ilk karanlık döneminde azalmaya neden olan ilk ölçüm, önce ışık maruz kalmış. </ P>

Şekil 9, kültürleme kabı aydınlatıcı yanıt olarak bağlı Optogenetic sistemi harekete geçirildiğinde YFP üretimine floresans sergilenmektedir. Bu ortalama-tek hücreli ölçümleri floresan yoğunluğu nüfus dağılımını ortaya nüfusu üzerinde floresan tek hücre ölçümlerinin faydasını ortaya koyar. 42 saat 26 dk aykırı değer unutmayın. İlgili görüntüleri inceledikten sonra, arka plan çıkarılır görüntüde hücreleri andıran eserler sonuçlanan arka kompozit görüntü oluşturmak için kullanılan görüntülerin çoğunda hücre kümeleri olduğunu belli oldu. Ayrıca, kültür kabından bir baloncuk mikroakışkan kanal pompalanır ve kenarları parçaları görüntü analizi algoritması tarafından hücreleri gibi yanıldılar. kabarcık ne de arka plan çıkarılarak gelen eserler ne gerçek hücrelere karşılık beri, onların ölçülen floresan yoğunluğuhücrelerin bir oto-floresan daha düşüktür. Bu rakam, otomatik olarak 3 gün boyunca elde edilebilir verilerin kalitesini gösteriyor. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 8,
Şekil 8: görüntü analizi algoritması görsel tasviri. Bu görüntüler kırpılmış ve izleme kolaylığı için genişletildi. (A) Altı görüntüleri hücre kültürünün arka plan çıkarılır faz kontrast görüntü oluşturmak için elde edilir. ana görüntü elde edildikten sonra, beş ek görüntüler kısaca hücrelerin yerinden emin olmak için her edinimi arasındaki açık atık örnekleme pompası ile elde edilir. arka plan bir kompozit görüntü beş parça görüntü oluşturulur. Her pikselin değeriArka plan görüntüsü 5 bileşen görüntüleri arasında aynı pikselin medyan değeridir. (B) arka plan çıkarılır görüntü daha sonra bir ikili dönüştürülür. İkili daha sonra dilate ve ikili sürekli bölümlerinde delikler doldurulur. Sarı özetliyor boyut ve dairesellik kriterlerine göre faiz seçilmiş bölgelerde (YG), karşılık gelmektedir. (C) Bu ROI her bir hücrenin floresan ROI içinde parlak piksel değeri olarak ölçülür floresan görüntü üzerine eşlenir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 9,
Şekil 9: zamanla floresan yoğunlukları Nüfus dağılımı. ölçülen flor Bu subfigures içinde logaritmaEscence akış sitometrisi standart pratik izlenerek gösterilir. A ve B hattı ışık absorbe edildiği veya kültürleme kabı içinde hücre kültürü aracılığıyla iletilen steril ortam ve ışık iletilen ışık arasındaki yoğunluk farkı olarak ölçülür kültüründen kırınım yoğunluğunu gösterir. İkinci ordinat ekseni karşı çizilir. (A) kutu ve bıyık arsa zamanla nüfusun ölçülen floresan logaritmasının (5. yüzdelik, 25. yüzdelik, medyan, 75. yüzdelik, 95 inci persentil). (B) renk gelen bin aralığı içinde ölçülen floresan hücre normalize frekansına karşılık gelen, aynı verilerin bir 2 boyutlu histogram. Renkler 26 dk dahil 42 saatte outlier olmadan veri aralığına ölçekli bulundu. en düşük floresan bin outlier normalize frekans0.7 olduğunu. (C) tek boyutlu ışığa kaydedilmiş ilk maruz kalmadan önce nüfusun ölçülen floresan logaritmasının histogramlar ve ışığa maruz bırakıldıktan sonra en fazla. Bu suşta YFP ışık kaynaklı ekspresyon bimodal olduğunu gösterir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Biz esneklik düşünülerek bu cihazı tasarladı. Kullanılan tüm kod ücretsiz ve açık kaynak. Segment hücrelere varsayılan görüntü analizi süreci basit ve hızlı bir şekilde çalışır. Özel analizi, FIJI grafik kullanıcı arayüzü ile temsili bir görüntüsünü analiz eden bir Beanshell komut girişini dönüştürme ve sonra komut dosyasını çağırmak için eklenti ayarlarken kullanıcı girişi kayıt ile uygulanabilir. o çağrıldığında, bu komut arka plan çıkarılır görüntülerin en son setine dosya yollarını içeren "resimler" olarak adlandırılan bir String dizisi gönderilecektir. Görüntüler ve veriler, bir deneme aniden sona ererse, onlar kayıp değil böylece toplanan olarak kaydedilir. Mavi LED dizisi bizim optogenetic sistemini uyaran için seçildi ama farklı renklerde LED'ler ile değiştirilebilir. kolaylaştırır PCB üzerinde ek bir MOSFET anahtarı ve röle anahtarı için mikro denetleyici yanı sıra geçiş delikleri mevcut ek giriş ve çıkış pinleri vardırBu sistem için daha karmaşık amacıyla adapte edilmesi gerekmektedir. Örneğin, bir LED güç ve kültür kabına sarılı bir ışık sensörü değerlerini okumak ve ardından bulanıklık ölçmek için yazılım üzerinde değişiklik ve buna göre gemiyi sulandırmak için mikrodenetleyici ek işaretçilerine kullanın turbidostat olarak faaliyet Bu cihazı yapmak .

Bakım duyarlı mikroskopi ekipmanları korumak için ve sıvı akış hızları tutarlı olmasını sağlamak için, kültür kontamine olmadığından emin olmak için dikkat edilmelidir. kültürleme kabı kasıtlı inoküle edildiğinde önce kontaminasyonlar balonun aşılanması ve iç üreme olup olmadığını gösteren birkaç gün önce bekleyerek tespit edilebilir. Mikroskop objektif hücre kültürü dökülmesini önlemek için, mikroakışkan cihaz emici bir bez üzerine içinden birinci pompalama hücre kültürü sızıntısı olmayacak emin olun. kültür kabına ortamının akış tutarsız, genellikle bir tüp etrafında içinperistaltik pompa silindirleri çok gevşek hale gelmiştir. akvaryum pompası hava akışı tutarsız ise, sıvı havuz ve tutarsız bir hava akışını karşı olabilir atık tüp içinde hiçbir U-şekilli dirsekler var olduğundan emin olun. Medya bunun içinde kurudu çünkü boru bir deney sonrasında tıkandığında, yapışmasına neden eritmek için bir sıcak su banyosu içinde tıkanmış tüpleri ıslatın.

Bir denemeyi planlıyor veya sonuçları analiz ederken dikkate bu protokole içsel sınırlamalar vardır. seyrelme oranı ve ikinci tup uzunluğuna bağlı olarak, hücre kültürü mikroskop kültür kabına pompalanır sırasında yaklaşık 10 dakikalık bir gecikme olur. Bu nedenle, iyi kısa zaman dilimlerinde üzerinde meydana okuyan olaylar için uygun değildir. Bir deneme ortam hacmi ile sınırlıdır, yaklaşık on gün için sürekli olarak çalışır; aynı zamanda da, hücre kültürü gelişimi deney süresine bağlı olarak düşünülmelidir. limiortam ting besin metabolizma ve gen ifadesi 35, 36, 37, 38, 39 üzerinde derin etkilere sahiptir ve bu yüzden çalışma kapsamında fizyolojisi açısından göre belirlenmelidir. Sonuçları analiz ederken, görüntüler özellikle kenar veri görüntüleri noktaları-olmalıdır ROI görüntü analiz rutin tarafından tespit edilmiştir bu şekilde hataları gözden geçirilmelidir. kabarcıklar veya eserler, böylece ölçülen floresan skewing, hücreler için karıştırılabilir için mümkündür. Böyle hatalı ölçümler ortadan kaldırmak için basit bir yolu otomatik floresan yoğunluğu altında floresan yoğunlukları tüm İB'leri atmak etmektir.

Bu protokol, sürekli kültür büyüyebilir organizmalarda ışığa karşılık olarak floresans yoğunluğunu ve / ya da çıkış maddesi, hücre kültürünün hücre morfolojisini ölçmek için yararlı olabilir koyacaktırkarıştırılan bir tutarlı odak düzlemine TLE ve otomatik bir görüntü analiz algoritması tarafından tespit. Burada kullanılan varsayılan hücre tanıma algoritması maya tomurcuklanan andı- kabaca küresel mikropların en doğrudan uygulanabilir olacaktır. Alternatif 40 Bu protokol için bir toplu kültürler bir dizi mikrop büyür ve daha sonra her zaman noktası için bir toplu örnek ve akış sitometrisi ile örnek nitelendirilmesidir. Ancak, burada tarif edilen protokol avantajları aynı kültürden alınan örnekler, bir çok örnekleri alınabilir ve işlem otomatik olduğunu bulunmaktadır. Bu protokol, aynı zamanda Optogenetic maya sürekli kültürlenen ve floresan ROI kimlik eğimlendirme hızlı olup birden fazla görüntü elde edilecek şekilde bir mikroskop 34 altında görüntülendi olduğu benzer bir yöntem geliştirir. Bu protokolün bir büyük avantajı, tek tek hücrelerin bir çok ölçüm düzenli witho birkaç gün içinde elde edilebilir olmasıdırut kullanıcı girişi. Işığa maruz kalma mikrobiyal kültür yanıtının ölçülmesi sonra, bir sonraki adım tepkisinin siliko kapalı çevrim kontrolü uygulamak için olabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Acknowledgments

Biz yararlı tartışmalar ve düzenleme için protokol, Kieran Sweeney test yardım için Molly Lazar ve Verónica Delgado kabul etmek ister ve yazının eleştirel okuma Taylor Scott, My An-adirekkun ve Stephanie Geller olacaktır. Megan Nicole McClean, Ph.D. Burroughs Wellcome Fonu Bilimsel Arayüz bir Kariyer Ödülü sahibidir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Extensive lab manual GitHub NA An extensive, regularly updated lab manual is available in the “Optogenetic Chemostat Files” GitHub repository (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files). This also includes a description of the microfluidic mold used to generate the representative results.
Fritzing Design Viewer Fritzing NA The free, open-sourced software to view and edit the .fzz type circuit board designs is available at "http://fritzing.org/download/"
Arduino Uno R3 (Atmega328 - assembled) Adafruit 50 Microcontroller. 1 required.
Arduino Stackable Header Kit SparkFun Electronics 10007 Female pin headers for connecting PCB to microcontroller. 1 required.
Adjustable 30W 110V soldering iron - XY-258 110V Adafruit 180 For making electrical connections to the PCB. 1 required.
Soldering iron stand Adafruit 150 For making electrical connections to the PCB. 1 required.
Mini Solder spool - 60/40 lead rosin-core solder 0.031" diameter - 100g Adafruit 145 For making electrical connections to the PCB. 1 required.
0.1 μF capacitor SparkFun Electronics COM-08375 Stabilizes voltage in PCB. 1 required.
10 μF capacitor SparkFun Electronics COM-00523 Stabilizes voltage in PCB. 1 required.
MAX7219CNG LED Matrix/Digit Display Driver - MAX7219 Maxim MAX7219CNG LED driver. 1 required.
8 pin IC Socket Mouser Electronics 575-144308 16 required. These will be stacked on top of each other to support the culture vessel above the LED matrix.
24 Pin IC socket Mouser Electronics 535-24-3518-10 Optional. Use this to reversibly attach the MAXIM 7219CNG driver to the PCB.
Digital multimeter Adafruit 2034 For troubleshooting electronics. 1 required.
Break Away Headers - 40-pin Male (Long Centered, PTH, 0.1") SparkFun Electronics PRT-12693 Male pin headers for connected LED matrix to printed circuit board. Ends can be trimmed with wire cutters. 1 set required. 
Flush diagonal wire cutters Adafruit 152 For trimming long pin headers and cutting power cables. 1 required.
Premium Female/Female Jumper Wires - 40 x 12" (300mm) Adafruit 793 Wire ribbon for connecting breadboard to LED matrix. Can be connected end-to-end with male pin-headers to be longer. 1 required.
Half-size breadboard Adafruit 64 The LED matrix will connect to this and the culturing vessel will rest above it.
Miniature 8x8 Blue LED Matrix Adafruit 956 Light source. Dominant wavelength is 470nm (blue). 1 required. Alternative miniature LED matrices from the same vendor are available with dominant wavelengths: 624 nm (red), 588 nm (yellow), 525 nm (green), 572 nm (yellow-green), and white.
Stackable header-3 pin SparkFun Electronics 13875 8 required.
Resistor Kit - 1/4W (500 total) SparkFun Electronics 10969 For electronics. 1 required.
 IRL520N MOSFET International Rectifier IRL520N Voltage regulating switch for controlling DC current. 4 required.
Hook-Up Wire - Assortment (Solid Core, 22 AWG) SparkFun Electronics PRT 11367 Wire for electronics. 1 required.
5V 2A (2000mA) switching power supply - UL Listed Adafruit 276 Power supply for the heating pad and Arduino. 2 required.
12 VDC 1000mA regulated switching power adapter - UL listed Adafruit 798 For peristaltic pumps. 2 required.
Electric Heating Pad - 10cm x 5cm Adafruit 1481 For heating the bioreactor. 1 required.
Low flow variable flow peristaltic pump Fisher Scientific 13-876-1 For pumping media. 1 required
Medium flow variable flow peristaltic pump Fisher Scientific 13-876-2 For pumping culture. 1 required.
9 VDC 1000mA regulated switching power adapter - UL listed Adafruit 63 For microcontroller power supply. Order 1.
High Temp Waterproof DS18B20 Digital temperature sensor + extras Adafruit 642 Thermometer for the bioreactor. 1 required.
Micromanager Micromanager NA The free, open-sourced microscope control software is available at "https://micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release"
FIJI ImageJ NA The free, open-sourced image analysis software is available at "http://fiji.sc/"
Arduino Integrated Development Environment Arduino NA The free, open-sourced IDE is available at "https://www.arduino.cc/en/Main/Software"
Custom code GitHub NA The custom microcontroller code and "Bioreactor Controller" plugin are available in the “Optogenetic Chemostat Files” GitHub repository (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files).
USB Cable A to B - 6 Foot SparkFun Electronics CAB-00512 Used to download data to microcontroller. 1 required.
bioreactorTimecourse_example.csv GitHub NA The advantage of loading LED matrix values from a CSV file is that a program can be called by the plugin to update those values based on image analysis results, and those values can be reloaded to the microcontroller, enabling feed-back control. It is available from the “Optogenetic Chemostat Files” GitHub repository (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files).
Tota-frost gels (diffusion paper) B&H B&H # LOFSFTL
MFR # T1-72		 For LED matrix. 1 required.
Kitting Sheet Crosslink 1/4x12x24in Grainger, inc 20JL37 Black foam for culturing vessel enclosure. 4 required.
Standard Photodiode Power Sensor, Si, 200 - 1100 nm, 50 mW  Thorlabs S120VC For measuring light intensity. 1 required.
Labelling Tape Fisher Scientific 159015N For labelling and securing loose components. 1 required.
Compact Power and Energy Meter Console, Digital 4" LCD Thorlabs PM100D For measuring light intensity. 1 required.
100mL GL45 hybridization glass bottle Bellco Glass, Inc. (7910-40150) Bioreactor vessel. 1 required.
Six port assembly Bellco Glass, Inc. Custom  For the bioreactor vessel. Tubing Specs: .125" OD x .055"ID. Port A: 1.0" long above cap slug and to bottom of tube. Ports B,C,E,F: 1.0" long above cap slug, 33 mm long below. Port D: 1.0" long above cap slug, 65 mm  long below. 1 required. Includes 45 mm diameter polypropylene open top screw cap and a white silicone gasket to ensure a tight seal between the cap and the vessel. 
Scotch Magic Tape 3105, 3/4 x 300 Inches, Pack of 3 Amazon B0009F3P3U Clear scotch tape. This is available from many other vendors. It is used to cover markings on the culturing vessel and to secure the coverglass with the PDMS channel to the aluminum support frame.
1/16" ID x 3/16" OD x 1/16" Wall Tygon Sanitary Silicone Tubing United States Plastic Corp. 57288 Tubing. ~25' required.
Cole-Parmer Twistit white rubber stopper, size 10 Cole-Parmer EW-62992-32 Media flask stopper and effluent flask stopper. 2 required.
2L Laboratory Flask Pyrex 4980 Media flask and effluent flask. 2 required.
Day pinchcock Fisher Scientific 5867 For pinching tubes shut. 3 required.
Replacement tubing assembly 1/16" ID Traceable Products 3372 The peristaltic pumps come with a set of tubes, but they wear out after weeks of use.
Replacement tubing assembly 1/50" ID Traceable Products 3371 The peristaltic pumps come with a set of tubes, but they wear out after weeks of use.
Male luer with lock ring x 1/16" hose barb, Nylon, 25/pk Cole-Parmer EW-45505-00 Connectors. ~10 luers are required.
Male luer with lock ring x 1/8" hose barb, Nylon, 25/pk Cole-Parmer EW-45505-04 Connectors. 5 required, one for each rubber stopper hole to fill with tubing.
Female luer x 1/16" hose barb adapter, Nylon, 25/pk Cole-Parmer EW-45502-00 Connectors. ~10 luers required.
Female luer x 3/16" hose barb adapter Cole-Parmer EW-45502-08 Connectors. ~10 luers required.
Cole-Parmer Luer Accessory, Female Luer Cap, Nylon, 25/Pk Cole-Parmer SC-45502-28
Cole-Parmer Luer Accessory, Male Luer Lock Plug, Nylon, 25/Pk Cole-Parmer EW-45505-56
Microbore PTFE Tubing, 0.022"ID x 0.042"OD, 100 ft/roll Cole-Parmer EW-06417-21 Tubing. 1 roll required.
Masterflex platinum-cured silicone tubing, L/S 13, 25 ft Cole-Parmer EW-96410-13 Tubing. ~25' required.
3/16" ID x 1/4" OD x 1/32" Wall Tygon Sanitary Silicone Tubing United States Plastic Corp. 57293 Tubing. ~1' required.
Vacuum filter Fisher Scientific 974107 Nalgene vacuum filter for sterile filtering media.
Aquel Oxy-Boost 200 Rena Aquatic Supply AP200 Dual diaphram adjustable flow air pump for aerating and mixing media. 1 required. 
0.2 μm pore syringe filter Corning International 431229 This ensures that air from the aquarium pump does not contaminate the apparatus. 1 required.
Slygard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning Slygard 184 For microfluidic device. 1 required.
American Safety Razor GEM Scientific Single-Edge Razor Blades Fisher Scientific 17989000 For cutting tubes and PDMS. 1 blade required.
Harris Uni-Core hole puncher 1.2mm ID Sigma-Aldrich WHAWB100028 ALDRICH For punching inlet/outlet in microfluidic device. 1 required.
Microscope cover glass 22x60-1.5 Fisher Scientific 12-544-G For microfluidic device. 1 required.
Rectangular aluminum frame with a square window Custom Custom To support the microfluidic channel. Outer dimensions: 3 inches x 1.25 inches.
Inner dimmensions (cut out portion): 7/8 inches x 7/8 inches
Thickness: ~1/32 inches

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Motta-Mena, L. B., Reade, A., et al. An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics. Nature chemical biology. 10 (3), 196-202 (2014).
  2. Hughes, R. M., Bolger, S., Tapadia, H., Tucker, C. L. Light-mediated control of DNA transcription in yeast. Methods. 58 (4), 385-391 (2012).
  3. Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. A light-switchable gene promoter system. Nature biotechnology. 20 (10), 1041-1044 (2002).
  4. Polstein, L. R., Gersbach, C. a Light-inducible spatiotemporal control of gene activation by customizable zinc finger transcription factors. J Am Chem Soc. 134 (40), 16480-16483 (2012).
  5. Polstein, L. R., Gersbach, C. a A light-inducible CRISPR-Cas9 system for control of endogenous gene activation. Nature Chemical Biology. 11 (3), 198-200 (2015).
  6. Yang, X., Jost, A. P. T., Weiner, O. D., Tang, C. A light-inducible organelle-targeting system for dynamically activating and inactivating signaling in budding yeast. Molecular biology of the cell. 24 (15), 2419-2430 (2013).
  7. Lee, S., Park, H., et al. Reversible protein inactivation by optogenetic trapping in cells. Nature methods. 11 (6), 633-636 (2014).
  8. Kennedy, M. J., Hughes, R. M., Peteya, L. A., Schwartz, J. W., Ehlers, M. D., Tucker, C. L. Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells. Nature Methods. 7 (12), 973-975 (2010).
  9. Yazawa, M., Sadaghiani, A. M., Hsueh, B., Dolmetsch, R. E. Induction of protein-protein interactions in live cells using light. Nat Biotechnol. 27 (10), 941-945 (2009).
  10. Zoltowski, B. D., Motta-Mena, L. B., Gardner, K. H. Blue light-induced dimerization of a bacterial LOV-HTH DNA-binding protein. Biochemistry. 52 (38), 6653-6661 (2013).
  11. Renicke, C., Schuster, D., Usherenko, S., Essen, L. O., Taxis, C. A LOV2 Domain-Based Optogenetic Tool to Control Protein Degradation and Cellular Function. Chemistry & Biology. 20 (4), 619-626 (2013).
  12. Novick, A., Szilard, L. Description of the chemostat. Science (New York, N.Y.). 112 (2920), 715-716 (1950).
  13. Monod, J. La technique de culture continue. Théorie et applications. Ann. Inst. Pasteur. 79 (4), 390-410 (1950).
  14. Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. A light-switchable gene promoter system. Nature Biotechnology. 20, 1041-1044 (2002).
  15. Kennedy, M. J., Hughes, R. M., Peteya, L. A., Schwartz, J. W., Ehlers, M. D., Tucker, C. L. Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells. Nature Methods. 7, 973-975 (2010).
  16. Olson, E. J., Tabor, J. J. Optogenetic characterization methods overcome key challenges in synthetic and systems biology. Nature chemical biology. 10 (7), 502-511 (2014).
  17. Botstein, D., Fink, G. R. Yeast: An experimental organism for 21st century biology. Genetics. 189 (3), 695-704 (2011).
  18. Galanie, S., Smolke, C. D. Optimization of yeast-based production of medicinal protoberberine alkaloids. Microbial cell factories. 14 (1), 144 (2015).
  19. Gerngross, T. U. Advances in the production of human therapeutic proteins in yeasts and filamentous fungi. Nature biotechnology. 22 (11), 1409-1414 (2004).
  20. van Maris, A. J. A., Abbott, D. A., et al. Alcoholic fermentation of carbon sources in biomass hydrolysates by Saccharomyces cerevisiae: current status. Antonie van Leeuwenhoek. 90 (4), 391-418 (2006).
  21. Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. Computer control of microscopes using µManager. Curr Protoc Mol Biol. , Chapter 14 (2010).
  22. Edelstein, A. D., Tsuchida, M. A., Amodaj, N., Pinkard, H., Vale, R. D., Stuurman, N. Advanced methods of microscope control using µManager software. Journal of biological methods. 1 (2), (2014).
  23. Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  24. Bhattacharya, S., Datta, A., Berg, J. M., Gangopadhyay, S. Studies on surface wettability of poly(dimethyl) siloxane (PDMS) and glass under oxygen-plasma treatment and correlation with bond strength. Journal of Microelectromechanical Systems. 14 (3), 590-597 (2005).
  25. Saldanha, A. J., Brauer, M. J., Botstein, D. Nutritional homeostasis in batch and steady-state culture of yeast. Molecular Biology of the Cell. 15, 4089-4104 (2004).
  26. Boer, V. M., Tai, S. L., et al. Transcriptional responses of Saccharomyces cerevisaie to preferred and nonpreferred nitrogen sources in glucose-limited chemostat cultures. FEMS Yeast Research. 7, 604-620 (2007).
  27. Boer, V. M., Amini, S., Botstein, D. Influence of genotype and nutrition on survival and metabolism of starving yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 6930-6935 (2008).
  28. Brauer, M. J., Huttenhower, C., et al. Coordination of growth rate, cell cycle, stress response and metabolic activity in yeast. Molecular Biology of the Cell. 19, 352-367 (2008).
  29. Gresham, D., Dunham, M. J. The enduring utility of continuous culturing in experimental evolution. Genomics. 104 (6), 399-405 (2014).
  30. Liu, H., Yu, X., et al. Photoexcited CRY2 interacts with CIB1 to regulate transcription and floral initiation in Arabidopsis. Science (New York, N.Y.). 322 (5907), 1535-1539 (2008).
  31. McIsaac, R. S., Oakes, B. L., Wang, X., Dummit, K. A., Botstein, D., Noyes, M. B. Synthetic gene expression perturbation systems with rapid, tunable, single-gene specificity in yeast. Nucleic Acids Research. 41 (4), 1-10 (2013).
  32. McIsaac, R. S., Petti, A. A., Bussemaker, H. J., Botstein, D. Perturbation-based analysis and modeling of combinatorial regulation in the yeast sulfur assimilation pathway. Molecular biology of the cell. 23 (15), 2993-3007 (2012).
  33. McIsaac, R. S., Silverman, S. J., et al. Fast-acting and nearly gratuitous induction of gene expression and protein depletion in Saccharomyces cerevisiae. Molecular biology of the cell. 22 (22), 4447-4459 (2011).
  34. Melendez, J., Patel, M., Oakes, B. L., Xu, P., Morton, P., McClean, M. N. Real-time optogenetic control of intracellular protein concentration in microbial cell cultures. Integrative biology quantitative biosciences from nano to macro. 6 (3), 366-372 (2014).
  35. Brauer, M. J., Huttenhower, C., et al. Coordination of growth rate, cell cycle, stress response, and metabolic activity in yeast. Molecular biology of the cell. 19 (1), 352-367 (2008).
  36. Boer, V. M., Crutchfield, C. A., Bradley, P. H., Botstein, D., Rabinowitz, J. D. Growth-limiting intracellular metabolites in yeast growing under diverse nutrient limitations. Molecular biology of the cell. 21 (1), 198-211 (2010).
  37. Markham, B. E., Byrne, W. J., Methods, E. Uptake, storage and utilization of phosphate by yeast. Journal of the Institute of Brewing. 73, 271-273 (1967).
  38. Kazemi Seresht, A., Palmqvist, E. A., Olsson, L. The impact of phosphate scarcity on pharmaceutical protein production in S. cerevisiae: linking transcriptomic insights to phenotypic responses. Microbial cell factories. 10 (1), 104 (2011).
  39. Shimizu, K. Regulation Systems of Bacteria such as Escherichia coli in Response to Nutrient Limitation and Environmental Stresses. Metabolites. 4 (1), 1-35 (2013).
  40. Olson, E. J., Hartsough, L. A., Landry, B. P., Shroff, R., Tabor, J. J. Characterizing bacterial gene circuit dynamics with optically programmed gene expression signals. Nature methods. 11 (4), 449-455 (2014).

Tags

Biyomühendislik Sayı 120 optogenetics mikrobiyoloji sentetik biyoloji kemostat, Maya kontrol sistem tanımlama tomurcuklanan protein ekspresyonu
Mikrobiyal optogenetic Uygulamaları Tasarım ve Otomatik Aydınlatıcı, kültürleme ve Örnekleme Sistemi Uygulaması
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stewart, C. J., McClean, M. N.… More

Stewart, C. J., McClean, M. N. Design and Implementation of an Automated Illuminating, Culturing, and Sampling System for Microbial Optogenetic Applications. J. Vis. Exp. (120), e54894, doi:10.3791/54894 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter