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Bioengineering

डिजाइन और माइक्रोबियल optogenetic अनुप्रयोगों के लिए एक स्वचालित रोशन, संवर्धन, और नमूना प्रणाली के कार्यान्वयन

Published: February 19, 2017 doi: 10.3791/54894
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biomedical Engineering, University of Wisconsin-Madison

Summary

हम optogenetic सिस्टम के साथ प्रयोग एक औंधा माइक्रोस्कोप के साथ प्रवाह में छवि कोशिकाओं रोगाणुओं की संस्कृतियों और नियमित रूप से रोशन करने के लिए एक सतत संवर्धन तंत्र बनाया गया है। संवर्धन, नमूने, इमेजिंग, और छवि विश्लेषण पूरी तरह से स्वचालित कर रहे हैं ताकि रोशनी करने के लिए गतिशील प्रतिक्रियाओं कई दिनों में मापा जा सकता है।

Abstract

Optogenetic सिस्टम आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग प्रोटीन है कि प्रकाश के विशिष्ट तरंग दैर्ध्य के जवाब में रचना बदल सेलुलर प्रक्रियाओं को बदलने के लिए उपयोग। संवर्धन और प्रणालियों है कि रोशनी और optogenetic सिस्टम की उत्तेजना क्रमादेशित शामिल करने को मापने के लिए एक की जरूरत है। हम निर्माण और प्रकाश का प्रोग्राम खुराक के साथ माइक्रोबियल कोशिकाओं रोशन करने के लिए, और स्वचालित रूप से हासिल करने और प्रवाह में कोशिकाओं की छवियों का विश्लेषण एक सतत संवर्धन उपकरण का उपयोग कर के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। एक chemostat के रूप में इस तंत्र के संचालन विकास दर और सेलुलर पर्यावरण कसकर नियंत्रित किया जा करने के लिए अनुमति देता है। निरंतर सेल संस्कृति के प्रवाह को नियमित रूप से जांचा जाता है और कोशिकाओं मल्टी चैनल माइक्रोस्कोपी द्वारा imaged हैं। संवर्धन, नमूने, इमेजिंग, और छवि विश्लेषण पूरी तरह से स्वचालित कर रहे हैं ताकि प्रतिदीप्ति तीव्रता और संस्कृति प्रवाह से जांचा कोशिकाओं के सेलुलर आकृति विज्ञान में गतिशील प्रतिक्रियाओं कई दिनों से अधिक मापा जाता हैउपयोगकर्ता इनपुट के बिना। हम गतिशील Saccharomyces cerevisiae के एक तनाव एक optogenetic प्रणाली है कि प्रतिलेखन को सक्रिय करता है के साथ इंजीनियर में प्रोटीन के उत्पादन उत्प्रेरण द्वारा इस संवर्धन तंत्र की उपयोगिता का प्रदर्शन।

Introduction

Optogenetic सिस्टम प्रकाश का उपयोग जीन अभिव्यक्ति, 1, 2, 3, 4, 5 प्रोटीन स्थानीयकरण, 6 प्रोटीन गतिविधि, 6, 7, 8 प्रोटीन बाध्यकारी, 8, 9, 10 और प्रोटीन गिरावट सहित सेलुलर प्रक्रियाओं की बढ़ती सूची को नियंत्रित करने के। 11 प्रोग्राम ऑप्टिकल उत्तेजना के साथ एक नियंत्रित वातावरण में संवर्धन कोशिकाओं के लिए और जैविक रूप से प्रासंगिक timescales पर उनकी प्रतिक्रिया को मापने के लिए एक विधि कोशिका जीव विज्ञान और जैव प्रौद्योगिकी के क्षेत्र में अनुसंधान के लिए इन उपकरणों की क्षमता का दोहन करने के लिए आवश्यक है। हमारे विधि, एक अच्छी तरह से मिश्रित में एक निरंतर सेल के विकास दर को बनाए रखने के लिए chemostasis का लाभ लेता है एईदर्ज़ा दिया गया है, और तापमान नियंत्रित कांच संवर्धन के पोत 12, 13 है कि क्रमादेशित रोशनी के संपर्क में है। हम छवि एक औंधा माइक्रोस्कोप के साथ संस्कृति प्रवाह में व्यक्ति की कोशिकाओं प्रोग्राम किया रोशनी करने के लिए संस्कृति की प्रतिक्रिया को मापने के लिए। संवर्धन, नमूने, इमेजिंग, और छवि विश्लेषण पूरी तरह से स्वचालित कर रहे हैं ताकि प्रतिदीप्ति तीव्रता और प्रवाह सेल संस्कृति के सेलुलर आकृति विज्ञान उपयोगकर्ता इनपुट के बिना कई दिनों से अधिक मापा जा सकता है।

इस प्रोटोकॉल सबसे बढ़ रही सेल संस्कृति और माइक्रोस्कोपी के साथ परिचित प्रयोगशालाओं में लागू किया जा सकता है और इस्तेमाल तंत्र सस्ती है और आसानी से उपलब्ध घटकों से बना है। एक पारदर्शी संवर्धन पोत प्रकाश उत्सर्जक डायोड (एलईडी) उत्सर्जन 1 μW / 2 सेमी -10 मेगावाट / प्रकाश के 2 सेमी के लिए सक्षम के एक मैट्रिक्स से ऊपर रखा गया है। रोगाणुओं संवर्धन पोत लगातार में बड़े हो रहे हैं; एक क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप पर मीडिया से जोड़ने के लिए प्रयोग किया जाता हैकमजोर पड़ने दर, एक और माइक्रोस्कोप के लिए एक कम दर पर संस्कृति वापस लेने के लिए प्रयोग किया जाता है, और अंतर एक अतिप्रवाह आउटलेट के माध्यम से निकल जाता है। एक हीटिंग पैड तापमान बनाए रखता है। एयर लगातार एक सकारात्मक दबाव बनाए रखने के साथ-साथ मिश्रण और संस्कृति aerate करने के लिए संवर्धन पोत में पंप है। वायु पंप के अलावा, इन उपकरणों के लिए बिजली एक microcontroller है कि यह भी एक थर्मामीटर और एक जुड़ा डेस्कटॉप कंप्यूटर से प्राप्त इनपुट के द्वारा नियंत्रित किया जाता है। प्रवाह सेल संस्कृति एक औंधा माइक्रोस्कोप के मंच पर एक microfluidic डिवाइस के लिए पंप है। गैर फ्लोरोसेंट और फ्लोरोसेंट छवियों को स्वचालित अर्जित कर रहे हैं। छवियों में कोशिकाओं को एक एल्गोरिथ्म है कि ब्याज (आरओआई) के एक क्षेत्र के रूप में प्रत्येक कोशिका रेखांकित और प्रत्येक रॉय के गुणों के उपाय की विशेषता है।

इस प्रोटोकॉल के एक आवेदन को प्रदर्शित करने के लिए, हम Saccharomyces cerevisiae कोशिकाओं की बदलती प्रकाश तीव्रता एक नीली बत्ती जिम्मेदारी के साथ इंजीनियर के जवाब मापाoptogenetic प्रणाली है जो फ्लोरोसेंट प्रोटीन का प्रतिलेखन को नियंत्रित किया है। एस cerevisiae, सामान्यतः बेकर की खमीर के रूप में जाना जाता है, का चयन किया गया है क्योंकि इस प्रणाली में जीन की अभिव्यक्ति को नियंत्रित करने के लिए कई optogenetic सिस्टम पहले से मौजूद 14, 15, 16। इसके अलावा, इस मॉडल जीव आमतौर पर सिस्टम जीव विज्ञान में 17 और जैव प्रौद्योगिकी अनुप्रयोगों के 18, 19, 20 के लिए एक हवाई जहाज़ के पहिये के रूप में अध्ययन के लिए प्रयोग किया जाता है। हमारे प्रतिनिधि परिणाम है कि इस प्रोटोकॉल इनपुट प्रकाश तीव्रता अलग-अलग और एक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर के उत्पादन को मापने के द्वारा कई दिनों से अधिक एक संस्कृति का प्रतिलेखन को नियंत्रित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है प्रदर्शित करता है।

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Protocol

आकृति 1

चित्रा 1: निरंतर संवर्धन उपकरण। इस सरलीकृत चित्र से पता चलता है कि कैसे तंत्र जब यह संस्कृति के लिए प्रयोग किया जाता है रोशन इकट्ठा किया जाना चाहिए, और रोगाणुओं के ऑप्टिकल गुणों को मापने। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: प्रोटोकॉल का अवलोकन। छायांकित क्षेत्र में कदम हर बार प्रोटोकॉल प्रयोग किया जाता है दोहराया जाना चाहिए। बंद लूप नियंत्रण संभव है 34 है, लेकिन इस प्रोटोकॉल में लागू नहीं किया है।

1. सर्किट बोर्ड से थर्मामीटर इकट्ठा


चित्रा 3: कनेक्शन थर्मामीटर मूल्यों को पढ़ने के लिए। इस चित्र से पता चलता है कि कैसे डिजिटल थर्मामीटर पीसीबी से जुड़े होने चाहिए ताकि microcontroller संस्कृति के तापमान को नियंत्रित करने के लिए प्रतिक्रिया प्राप्त कर सकते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

  1. उनके संबंधित करने के लिए ग्राउंड, डेटा, और डिजिटल थर्मामीटर के सकारात्मक वोल्टेज लाइनों मिलाप के माध्यम से छेद में चिह्नित "जीडी + V।"
  2. एक महिला 3 पिन हैडर से एक पिन बंद घड़ी और तार कतरनी के साथ शेष 2 पिन ट्रिम, ऐसी है कि यह दो के माध्यम से छेद लेबल "आर 2" में फिट कर सकते हैं और microcontroller नहीं बाधा डालती। जगह में इस मिलाप। पिन हैडर में एक 4.7 kΩ अवरोध डालने से दो soldered पिन कनेक्ट करें।

2. पावर कॉन कनेक्टसर्किट बोर्ड से trol अवयव

चित्रा 4
चित्रा 4: कनेक्शन हीटिंग पैड करने के लिए शक्ति को नियंत्रित करने के लिए। इस चित्र से पता चलता है कि कैसे पीसीबी और गौण भागों आदेश हीटिंग पैड करने की शक्ति को नियंत्रित करने में इकट्ठा किया जाना चाहिए। भागों क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप एक समान तरीके से जुड़े हुए हैं नियंत्रित करने के लिए। ध्यान दें कि थर्मामीटर के लिए घटकों स्पष्टता के लिए हटा दिया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

  1. पांच महिला 3 पिन हेडर के पिन से 1 सेमी बंद ट्रिम। मुद्रित सर्किट बोर्ड (पीसीबी) के रूप में "# 1", "# 2," "# 3," "# 4 चिह्नित पर पदों के लिए इन मिलाप," और "सीबी ई"
  2. एक महिला 6 पिन और 8 पिन हैडर के पिन से 1 सेमी बंद ट्रिम। कंधे से कंधा मिलाकर करने के लिए इन मिलापके माध्यम से छेद के स्तंभ K14 के माध्यम से लेबल K1।
  3. सर्किट बोर्ड के लिए हीटिंग पैड से कनेक्ट।
    1. के माध्यम से छेद लेबल K1 और K2 पीसीबी पर में 100 kΩ रोकनेवाला की छोर डालें। स्थिति में एक धातु ऑक्साइड अर्धचालक क्षेत्र प्रभाव ट्रांजिस्टर (MOSFET) डालें माध्यम से छेद K14 के माध्यम से पीसीबी पर # 1 चिह्नित, MOSFET K1 की ओर का सामना करना पड़ के लेबल के साथ इतना है कि स्रोत पिन "# के सबसे करीब है # "लेबल" लेबल, और नाली पिन से दूर है "।
    2. 5 वी प्रत्यक्ष वर्तमान (डीसी) बिजली की आपूर्ति केबल की जमीन लाइन कट और यह J2 से कनेक्ट। J1 के लिए हीटिंग पैड की जमीन लाइन कनेक्ट। एक 1 kΩ रोकनेवाला के साथ 3 पिन करने के लिए K3 कनेक्ट करें। वर्तमान अब केवल J2 के लिए J1 से प्रवाह चाहिए जब पिन 3 + 5V.z के लिए सेट है
      नोट: एक स्विच है कि J2 के लिए पिन J1 से प्रवाह करने के लिए जब microcontroller के 3 पिन 5 वी के लिए सेट है वर्तमान की अनुमति देता है के रूप में अवरोध / MOSFET निर्धारित कार्यों
  4. जुडियेधीमी गति से क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप।
    1. के माध्यम से छेद लेबल K4 और K5 पीसीबी पर में 100 kΩ रोकनेवाला की छोर डालें। स्थिति में एक MOSFET डालें पीसीबी पर # 2 चिह्नित, MOSFET K1 की ओर का सामना करना पड़ के लेबल के साथ के माध्यम से छेद K14 के माध्यम से इतना है कि स्रोत पिन "#" लेबल के सबसे करीब है, और नाली पिन से दूर है "#" लेबल।
    2. 12 वी डीसी धीमी गति से क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप की बिजली की आपूर्ति केबल की जमीन लाइन कट। जे 3 करने के लिए अंत और J4 करने के लिए अंत का सामना करना पड़ दीवार मस्सा सामना करना पड़ रहा क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप कनेक्ट करें। एक 1 kΩ रोकनेवाला के साथ 4 पिन करने K6 कनेक्ट करें। वर्तमान अब केवल J4 को जे 3 से प्रवाह चाहिए जब पिन 4 5 वी करने के लिए सेट किया गया है
  5. तेजी से क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप कनेक्ट
    1. के माध्यम से छेद लेबल K7 और K9 पीसीबी पर में 100 kΩ रोकनेवाला की छोर डालें। स्थिति में एक MOSFET डालें पीसीबी पर # 3 चिह्नित के माध्यम से K14 के माध्यम से छेद रों MOSFET K1 की ओर का सामना करना पड़ के लेबल के साथ, हे कि स्रोत पिन "#" लेबल के सबसे करीब है, और नाली पिन "#" लेबल से दूर है।
    2. 12 वी डीसी तेजी से क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप की बिजली की आपूर्ति केबल की जमीन लाइन कट। J5 करने के लिए अंत और J6 करने के लिए अंत का सामना करना पड़ दीवार मस्सा सामना करना पड़ रहा क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप कनेक्ट करें। एक 1 kΩ रोकनेवाला के साथ 5 पिन करने के लिए K9 कनेक्ट करें। वर्तमान अब केवल J6 को J5 से प्रवाह चाहिए जब पिन 5 5 वी करने के लिए सेट किया गया है

3. सर्किट बोर्ड से एलईडी मैट्रिक्स कनेक्ट

चित्रा 5
चित्रा 5: कनेक्शन एलईडी मैट्रिक्स नियंत्रित करने के लिए। इस चित्र से पता चलता है कि कैसे एलईडी मैट्रिक्स पीसीबी से जुड़ा होना चाहिए। यह भी पता चलता है कि पीसीबी microcontroller पर खड़ी हो सकती है। ध्यान दें कि थर्मामीटर के लिए और अन्य उपकरणों के लिए डीसी शक्ति को नियंत्रित करने के लिए घटकों स्पष्टता के लिए हटा दिया गया है।es / ftp_upload / 54894 / 54894fig5large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

  1. पीसीबी के पक्ष ऐसी है कि यह microcontroller के ऊपर खड़ी की जा सकती है पर के माध्यम से छेद में 6 पिन, 10-पिन, और दो 8 पिन महिला पिन हेडर मिलाप।
  2. पीसीबी पर उनकी चिह्नित पदों के लिए 100 NF और 10 μF capacitors मिलाप, ध्यान देने योग्य बात है कि 10 μF संधारित्र (छोटी नेतृत्व) के नकारात्मक टर्मिनल के माध्यम से छेद एक नकारात्मक संकेत के साथ चिह्नित करने के लिए जोड़ा जाना चाहिए।
  3. दूर से, के माध्यम से छेद के सेट 2 12 से करने के लिए एलईडी चालक मिलाप चालक पर खरोज के साथ के माध्यम से छेद एलईडी मैट्रिक्स के लिए सुरक्षित रख लिया।
  4. एलईडी मैट्रिक्स के लिए चिह्नित के माध्यम से छेद के लिए पुरुष पिन हेडर के 2 कॉलम मिलाप, और breadboard ऐसी है कि वे microcontroller में बाधा डालती नहीं होगा नीचे इन के सिरों ट्रिम। महिला / महिला जम्पर तारों की दो 8 तार स्ट्रिप्स करने के लिए इन कनेक्ट करें। पुरुष की एक दूसरे सेट कनेक्टजम्पर तारों के दूसरे छोर से पिन हेडर।
  5. breadboard की औसत से अधिक का नेतृत्व मैट्रिक्स डालें, और उसके मैट्रिक्स के दोनों तरफ स्तंभों के लिए पिन हेडर के दूसरे सेट डालें। सुनिश्चित करें कि बिजली के कनेक्शन ही हैं, जैसे कि एलईडी मैट्रिक्स सीधे माध्यम से छेद के लेबल स्तंभ के लिए इसी मैट्रिक्स के लेबल पक्ष के साथ पीसीबी से जुड़े हो गया था।
  6. एक महिला 3 पिन हैडर से एक पिन बंद घड़ी और तार कतरनी के साथ शेष 2 पिन ट्रिम, ऐसी है कि यह दो के माध्यम से छेद लेबल "R1" में फिट कर सकते हैं और microcontroller नहीं बाधा डालती। इस मिलाप। पिन हैडर में 1 kΩ अवरोध डालने से दो soldered पिन कनेक्ट करें।
    नोट: संवर्धन पोत एलईडी मैट्रिक्स के ऊपर खड़ी हो जाएगी। तार रिबन पोत में बाधा डालती हैं, तो उन्हें मैट्रिक्स से ऑफसेट। फिर, ठोस कोर तार का उपयोग मैट्रिक्स पिन और तार रिबन पिन, कि इस तरह के बिजली के कनेक्शन चर्चा नहीं है के बीच की खाई को पाटने के लिएAnge।

4. सॉफ्टवेयर स्थापित करें और हार्डवेयर के लिए कनेक्ट

  1. microcontroller पर पीसीबी हो चुकी है।
  2. microcontroller के लिए समन्वित विकास पर्यावरण (आईडीई) और कस्टम कोड डाउनलोड करने के लिए सामग्री सूची में लिंक का पालन करें।
  3. एक बिहारी यूनिवर्सल सीरियल बस (USB) केबल के माध्यम से माइक्रोस्कोप कंप्यूटर के लिए microcontroller कनेक्ट। संकलित करें और microcontroller के लिए कस्टम कोड अपलोड करें।
  4. डाउनलोड माइक्रो प्रबंधक 21, 22 और फिजी 23। माइक्रो प्रबंधक एक फिजी प्लगइन सभी ".dll" फाइलें, "mmplugins" निर्देशिका कॉपी करके, और निर्देशिका जहां सूक्ष्म प्रबंधक "Fiji.app" निर्देशिका में डाउनलोड किया गया था से "mmautofocus" निर्देशिका के रूप में विन्यस्त करें। इसके अलावा, "Fiji.app/plugins" निर्देशिका में "प्लगइन्स / माइक्रो प्रबंधक" निर्देशिका की नकल।
  5. डाउनलोड "BioreactorController.jar" फ़ाइल intओ "Fiji.app/mmplugins" निर्देशिका।
  6. फिजी> प्लगइन्स> माइक्रो-प्रबंधक> माइक्रो प्रबंधक स्टूडियो से माइक्रो प्रबंधक खोलें। माइक्रोस्कोप नियंत्रित करने के लिए सॉफ्टवेयर विन्यस्त करने के लिए हार्डवेयर विन्यास जादूगर का प्रयोग करें। जो करने के लिए एबी यूएसबी केबल जुड़ा हुआ है बंदरगाह के लेबल के साथ विज़ार्ड में "FreeSerialPort" डिवाइस को शामिल करें।

5. बनाओ और संवर्धन के लिए पोत प्रकाश प्रूफ संलग्नक विशेषताएँ

  1. एलईडी मैट्रिक्स कि इस तरह के संवर्धन पोत मैट्रिक्स ऊपर उन पर आराम कर सकते हैं के प्रत्येक कोने में breadboard पर इमारत ब्लॉकों के रूप में तीन 8 पिन आईसी कुर्सियां ​​हो चुकी है।
  2. कुर्सियां ​​के ऊपर परत के नीचे प्रसार कागज के एक हिस्से को जकड़ना, इस तरह के प्रकाश एलईडी मैट्रिक्स से संवर्धन पोत हड़ताली फैलाना है।
  3. बाहर कट तीन 8 काले फोम के कुछ भागों "6 से"। पहले TW के अंदर से एक हिस्से को इलेक्ट्रॉनिक breadboard के रूप में एक ही आकार है कि (2.3 "x 3.5") बाहर कटहे और एक हिस्से को तीसरे के अंदर से आयत आईसी कुर्सियां ​​द्वारा किए गए (0.9 "x 1.8") के आकार है। एलईडी मैट्रिक्स ऐसी है कि अंतिम परत 0.9 "x 1.8" एपर्चर युक्त भी आईसी कुर्सियां ​​के शीर्ष के साथ है, और एलईडी मैट्रिक्स चारों ओर से घेरे में इन परतों हो चुकी है।
  4. छमाही में काले फोम का एक अतिरिक्त चादर कट एक 6 "से 24" आयत बनाने के लिए। काले फोम का एक खोखले स्तंभ है कि संवर्धन पोत ट्यूब और तारों के लिए कमरे, ऐसी है कि यह thermally और ऑप्टिकली संवर्धन पोत को बचाने होगा साथ में फिट कर सकते में इस रोल।
  5. एलईडी मैट्रिक्स पर काले फोम के खोखले स्तंभ केंद्र, और इसके तहत काले फोम की परत पर स्तंभ की सीमा के निशान। इस सीमा को चिह्नित जहां यह भविष्य में केंद्रित किया जाना चाहिए होगा।
  6. एक 3 "एक्स 3" काला फोम के हिस्से को काट दिया। इस एक ढक्कन के उस स्तंभ के शीर्ष करने के लिए टेप किया जा सकता बाहरी प्रकाश को ब्लॉक करने के रूप में बाद में प्रयोग करें।
  7. photodiode बिजली सेंसर वें संलग्न ई टेप के साथ पोत की टोपी संवर्धन, टोपी देते हैं, और बाड़े में संवर्धन पोत डालें।
  8. माइक्रो-प्रबंधक में, प्लगइन्स> बायोरिएक्टर नियंत्रक के पास जाओ। 30 एस अंतराल पर संभव तीव्रता की सीमा के एक सबसेट पर रोशन करने के लिए मैट्रिक्स सेट करें।
  9. के रूप में बिजली मीटर बिजली सेंसर से जुड़ा सांत्वना पर प्रदर्शित रिकॉर्ड प्रकाश तीव्रता। इन मापों सक्षम हो जाएगा प्रकाश की तीव्रता वास्तविक जब उन एल ई डी एलईडी कि जला रहे हैं की संख्या और पल्स चौड़ाई संग्राहक (PWM) वर्तमान निर्धारित है जाना जाता है।

6. संवर्धन पोत तैयार

चित्रा 6
चित्रा 6: पोत कनेक्शन। इस चित्र से पता चलता है कि कैसे पोत और तंत्र की ट्यूबिंग से पहले autoclaved किया जा रहा से जुड़ा होना चाहिए।blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

  1. मार्क ऊंचाई हर 2 एमएल तरल के 10 एमएल की रेंज में 30 एमएल के लिए संवर्धन के बर्तन में वेतन वृद्धि के लिए इसी। बाँझ विआयनीकृत पानी के 10 एमएल डालें जल स्तर निशान, 2 एमएल जोड़ने के लिए, पानी के स्तर के निशान, और दोहराएँ जब तक 30 एमएल स्तर चिह्नित है। स्पष्ट टेप ताकि वे आसानी से नहीं हटा रहे हैं साथ चिह्नों कवर, और तरल के निपटान के।
  2. सिलिकॉन गैसकेट के माध्यम से एल्यूमीनियम बंदरगाह की लंबी अंत प्लेस, संवर्धन के बर्तन में। टोपी पर भाड़ में।
  3. 1/16 "आईडी सिलिकॉन टयूबिंग के साथ एक छोटे से एल्यूमीनियम बंदरगाह आउटलेट कवर। एक महिला Luer ताला डालने और फिर एक पुरुष Luer ताला प्लग जोड़ने से बाहर का अंत प्लग। इस दुकान पूरक है, और (चित्रा 6 में उपयोग नहीं किया जाएगा ट्यूब 6 )।
  4. पुरुष और महिला Luer ताले के साथ 1/16 "आईडी सिलिकॉन टयूबिंग के दो छोटे क्षेत्रों से कनेक्ट। एक छोटी एल्यूमीनियम बंदरगाह आउटलेट के लिए एक छोर से कनेक्ट और DISTA प्लगएक पुरुष और महिला Luer Luer ताला प्लग के साथ एल अंत। पोत इस ट्यूब (ट्यूब चित्रा 6 में 7 / 7.1) के माध्यम से टीका दिया जाएगा।
  5. आईडी क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला ट्यूबिंग और कनेक्टर्स "1/16 के छोर तक आईडी ट्यूब" दो 1/16 कनेक्ट करें। एक छोटी एल्यूमीनियम बंदरगाह के एक छोर से कनेक्ट और (चित्रा 6 में ट्यूब 4) अन्य प्लग। बाद में, इस मीडिया कुप्पी से जोड़ा जाएगा।

7. तैयार मीडिया फ्लास्क

  1. एक 1/16 "सबसे लंबे समय तक एल्यूमीनियम बंदरगाह के भीतरी व्यास (आईडी) सिलिकॉन ट्यूब। ट्यूब काफी लंबे समय से मीडिया कुप्पी तक पहुंचने के लिए होना चाहिए। एक 1/8 कनेक्ट" कनेक्ट 1/16 की एक छोटी खंड के लिए आईडी पुरुष Luer लॉक " आईडी ट्यूबिंग, पूर्ववर्ती ट्यूब के लिए इस कनेक्ट ,, और फिर मीडिया कुप्पी (चित्रा 6 में ट्यूब 3) पर रबर डाट में इस छोटे से खंड डालें।
  2. ट्यूब दबाना। इस संबंध हवा मीडिया कुप्पी से संस्कृति पोत के लिए प्रवाह करने की अनुमति देता है। मीडिया कुप्पी बाद में हवा के साथ एक पंप है जबघ इस ट्यूब unclamped है, संस्कृति, मिलाया जाएगा पदार्थो, और आने वाली बुलबुले से एक सकारात्मक दबाव में रखा।
  3. एक 1/16 "आईडी ट्यूब काफी लंबे समय डाट, जिसके माध्यम से मीडिया में स्थानांतरित कर दिया जाएगा कुप्पी के नीचे तक पहुँचने के लिए। एक और 1/16 से कनेक्ट करने के लिए" एक 3/16 "आईडी ट्यूब डालें इस एक के लिए आईडी ट्यूब, और उसके बाद कि। एक 3/16 "आईडी महिला Luer ताला और एक पुरुष Luer ताला प्लग (ट्यूब चित्रा 6 में 1 / 1.1) के साथ इस प्लग।
  4. डाट में तीसरे छेद 1/16 "आईडी टयूबिंग की एक छोटी खंड से भरा जाना चाहिए, मध्यम व्यास ट्यूबिंग के दो अन्य क्षेत्रों से जुड़ा है और बाहर अंत में खामियों को दूर किया (ट्यूब 2 चित्रा 6 में / 2.1)। यह जोड़ा जाएगा एक वैक्यूम पंप करने के लिए और बाद में एक मछलीघर पंप करने के लिए।
    नोट: ट्यूबिंग आसानी से रबर डाट में छेद के माध्यम से फिट नहीं कर सकते हैं, तो एक तिरछा पर ट्यूबिंग के सिरों में कटौती। फिर, slanted अंत में जो छेद के माध्यम से धक्का दिया है के माध्यम से बाकी खींचने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

  1. 1/16 के एक खंड में एक पुरुष Luer ताला डालें "आईडी सिलिकॉन टयूबिंग, और फिर मजबूती डालने 0.022" आईडी polytetrafluoroethylene (PTFE) टयूबिंग। उधर, ताले और (चित्रा 6 में ट्यूब 5) एक छोटी एल्यूमीनियम पोर्ट से कनेक्ट करने के लिए अन्य एक 1/16 "आईडी ट्यूब। फिर, धागा एक PTFE ट्यूब के साथ अंत करने के लिए एक महिला Luer ताला देते हैं।
  2. आईडी क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला ट्यूब और कनेक्टर्स "1/50 के लिए आईडी सिलिकॉन ट्यूब" उजागर 1/50 कनेक्ट करें। इस के लिए, 1/50 के तीन खंडों "आईडी ट्यूबिंग और 0.022 के दो खंडों" आईडी PTFE ट्यूबिंग कनेक्ट उन्हें बारी। 1/16 "आईडी ट्यूबिंग (ट्यूब 5 6 चित्र में) के माध्यम से प्रवाह कुप्पी के लिए इस कनेक्ट।
  3. एल्यूमीनियम बंदरगाह की दूसरी सबसे लंबी ट्यूब और प्रवाह कुप्पी के लिए दूसरे छोर से एक 1/16 "आईडी सिलिकॉन ट्यूब के एक छोर से कनेक्ट। यह एल्यूमीनियम ट्यूब संस्कृति मात्रा सेट, और प्रवाह कंटेनर (ट्यूब 8 में में अतिरिक्त संस्कृति overflows
  4. 30 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस और 15 साई (सामान्य नसबंदी) में संवर्धन विधानसभा आटोक्लेव।
    नोट: ट्यूबों के माध्यम से जो मीडिया कुप्पी भर जाता है, जिसके माध्यम से मीडिया कुप्पी vacuumed है, और जिसके माध्यम से संवर्धन पोत टीका है ताकि यदि बाहर का खंड दूषित कर रहा है, यह एक बाँझ प्रकट करने के लिए हटाया जा सकता है ट्यूबिंग के कई क्षेत्रों है खंड।

9. microfluidic चैनल तैयार

  1. : 1 के अनुपात एक 9 में polydimethylsiloxane (PDMS) और इलाज एजेंट मिलाएं। देगास और सिलिकॉन मास्टर मोल्ड पर डालना।
  2. 65 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए PDMS इलाज और फिर एक धार के साथ नकाब से यह कटौती। PDMS के आसपास कट जब तक यह आचारण से विज्ञप्ति। नीचे धक्का और कमजोर वेफर तोड़ने से बचने।
  3. चैनल के दोनों सिरों पर छेद पंच के लिए एक 1.2 मिमी आईडी बायोप्सी छेद छेदने का प्रयोग करें।
  4. प्लाज्मा बंधन कवर कांच से 24 PDMS।
  5. लंबे टेप समर्थन एल्यूमिनियम फ्रेम ऐसी है कि PDMS चैनल एल्यूमिनियम फ्रेम पर केंद्रित है को कवर कांच के समाप्त हो जाती है, और फिर 65 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए फिर से PDMS सेंकना।

10 भरण मीडिया फ्लास्क

चित्रा 7
चित्रा 7: मीडिया जोड़ना। इस चित्र से पता चलता है कि कैसे मीडिया मीडिया कुप्पी में फ़िल्टर वैक्यूम होना चाहिए। ऐसा नहीं है कि मीडिया बाँझ रहता है सुनिश्चित करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

  1. उचित मीडिया बनाओ। निरंतर संवर्धन प्रणाली एक chemostat के रूप में संचालित किया जाएगा, तो मीडिया एक विशिष्ट पोषक तत्व के लिए सीमित उपयोग करें।
    नोट: एस cerevisiae के साथ पढ़ाई के लिए मानक मीडिया रचना के उदाहरण पहले से प्रकाशित किया गया है 25,= "xref"> 26, 27, 28, 29।
  2. एक 100 मिलीलीटर की बोतल के लिए वैक्यूम फिल्टर संलग्न निपल कवर हटा, तो बाँझ चिमटी के साथ वैक्यूम फिल्टर के निप्पल से सफेद प्लग हटा दें।
  3. निप्पल को 3/16 "आईडी सिलिकॉन ट्यूब कनेक्ट, एक वैक्यूम पंप करने के लिए मीडिया कुप्पी के अन्य मुक्त ट्यूब (नलियों 1 और 7 चित्रा में 2, क्रमशः), और सुनिश्चित करें कि ट्यूब संवर्धन पोत को मीडिया कुप्पी को जोड़ने clamped है बंद (चित्रा 7 में ट्यूब 3)।
  4. मीडिया के साथ फिल्टर भरें वैक्यूम पंप पर बारी है, और फिर मीडिया के बाकी फिल्टर। 1/16 "आईडी सिलिकॉन निर्वात (चित्रा 7 में ट्यूब 2) से जुड़े ट्यूबिंग दबाना और वैक्यूम पंप बंद कर देते हैं।
  5. 1/16 "आईडी वैक्यूम पंप से जुड़ा है, ताकि ट्यूब के एक पवित्र अंत सुलभ है ट्यूबिंग के मध्यवर्ती क्षेत्र से leurs निकालें। वें डालेंई इस ट्यूब में एक बाँझ सिरिंज हवा फिल्टर के नीले अंत।
  6. 3/16 "आईडी सिलिकॉन टयूबिंग (चित्रा 7 में ट्यूब 1) दबाना और इसे से पुरुष Luer काट। संवर्धन पोत के मीडिया इनलेट ट्यूब की महिला Luer से प्लग डिस्कनेक्ट। होना करने के लिए मीडिया को सक्षम करने के लिए इन नर और मादा Luers कनेक्ट संवर्धन पोत में पंप।
  7. वैक्यूम फिल्टर निकालें और मीडिया जो वैक्यूम फिल्टर से जुड़ा था की 100 एमएल की बोतल टोपी।
  8. एक दिन पहले संवर्धन पोत टीका दिया जाएगा, मीडिया पिछले चरण में एकत्र की 4 एमएल के साथ एक टेस्ट ट्यूब में optogenetic सूक्ष्म जीव का एक भी कॉलोनी टीका लगाना, और यह 30 डिग्री सेल्सियस या संस्कृति का अधिकतम तापमान विकास तापमान में रात भर बढ़ने आंदोलन के साथ।

11. खुर्दबीन के आसपास इकट्ठा उपकरण

  1. माइक्रोस्कोप के पास निरंतर संवर्धन विधानसभा सेट के साथ मीडिया संवर्धन पोत और efflu की तुलना में अधिक फ्लास्कईएनटी कुप्पी संवर्धन पोत की तुलना में कम है, जैसे कि ट्यूब 0.022 "आईडी PTFE ट्यूबिंग (चित्रा 6 में ट्यूब 5) के क्षेत्रों से बना खुर्दबीन मंच तक पहुँच सकते हैं। सुरक्षित रूप से मीडिया कुप्पी और प्रवाह कंटेनर पर रबर डाट नीचे टेप।
  2. उन्हें (ट्यूब 5 6 चित्र में) को जोड़ने आईडी सिलिकॉन ट्यूब 0.022 "1/50 से आईडी PTFE ट्यूबिंग" के सिरों हाल चलाना, और इनलेट और microfluidic डिवाइस के आउटलेट में इन सिरों प्लग।
  3. मछलीघर पंप करने के लिए सिरिंज हवा फिल्टर की सफेद अंत कनेक्ट। हवा के दबाव संवर्धन के बर्तन में मीडिया धक्का होगा।
  4. मीडिया प्रवाह बंदरगाह के स्तर तक पहुँच जाता है, 1/16 "आईडी मीडिया इनलेट ट्यूबिंग और कनेक्टर्स धीमी गति से क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप (चित्रा 6 में ट्यूब 4) के आसपास है और 1/50" आईडी नमूना आउटलेट ट्यूबिंग और कनेक्टर्स तेजी से चारों ओर लपेट क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप (चित्रा 6 में ट्यूब 5)।
  5. हवा Tu unclamping द्वारा मीडिया Aerateमीडिया फ्लास्क और संवर्धन पोत के बीच हो।
  6. हीटिंग पैड और संवर्धन पोत इतना है कि इसका तापमान नियंत्रित किया जा सकता करने के लिए थर्मामीटर टेप। संवर्धन पोत के आसपास मीडिया ट्यूबिंग का तार इतने में प्रवेश मीडिया पोत के रूप में एक ही तापमान पर किया जाएगा।
    नोट: हीटिंग पैड करने के लिए PWM वर्तमान microcontroller जो थर्मामीटर से जानकारी का उपयोग करता है अपने setpoint तापमान पर संवर्धन पोत रखने के द्वारा नियंत्रित किया जाता है।
  7. एलईडी मैट्रिक्स पर काले फोम बाड़े में संवर्धन पोत डालें, और यह सुनिश्चित करें कि नलियों pinched नहीं कर रहे हैं।
  8. माइक्रो-प्रबंधक में, प्लगइन्स> बायोरिएक्टर नियंत्रक के पास जाओ। 0.1 करने के लिए मैदान पर "मीडिया पंप अनुपात" और 0 करने के लिए मैदान "पर नमूना पंप अनुपात" प्रवाह की दर बहुत कम हो जाएगा, लेकिन वाष्पीकरण की दर से अधिक सेट करें।
  9. मीडिया फ्लास्क और संवर्धन पोत के बीच आने वाली हवा ट्यूब दबाना। टीका ट्यूब (चित्रा में ट्यूब 7 से प्लग निकालें
  10. बाड़े कवर इतना है कि कोई प्रकाश में प्रवेश करती है, और संस्कृति रात भर बढ़ता है।

12. जांचना पम्पिंग दरें

  1. माइक्रो-प्रबंधक में, प्लगइन्स> बायोरिएक्टर नियंत्रक के पास जाओ। 0.5 करने के लिए मैदान पर "मीडिया पंप अनुपात" और 0 के लिए मैदान "पर नमूना पंप अनुपात" सेट करें।
  2. प्रवाह कुप्पी (चित्रा 6 में ट्यूब 8) और प्रवाह कुप्पी (चित्रा 6 में ट्यूब 8) से नमूना ट्यूब से अतिप्रवाह ट्यूब डिस्कनेक्ट और अलग वाहिकाओं में प्रवाह इकट्ठा। 1 घंटे के लिए प्रवाह लीजिए, बाद पंप 15 मिनट के लिए पर किया गया है शुरुआत।
  3. मात्रा के रूप में बर्तन में एकत्र से संवर्धन के बर्तन में मीडिया के प्रवाह की दर की गणना:
  4. इस रैखिक अनुमान से क्षेत्र 'पर मीडिया पंप अनुपात' का मूल्य समायोजित करें:
    Equaiton 2
    कहा पे
    Equaiton 3
  5. इस अंशांकन प्रक्रिया के माध्यम से पुनरावृति जब तक वांछित प्रवाह की दर और मापा प्रवाह की दर के बीच अंतर <0.2 एमएल / घंटा जहां प्रवाह की दर एक 1 घंटे की अवधि में औसत है।
  6. क्षेत्र "पर नमूना अनुपात" की मूल्य वृद्धि और जब तक मात्रा संवर्धन पोत को छोड़ने का लगभग 4/5 वें नमूना पंप से बाहर पंप है एक समान तरीके से यह जांचना और मात्रा का लगभग 1/5 वीं के माध्यम से जा रही है अतिप्रवाह बंदरगाह।
  7. निरंतर संवर्धन तंत्र में संस्कृति घनत्व रात भर इन परिस्थितियों में संतुलित करना।
    नोट: लक्ष्य प्रवाह दरों पहुँच नहीं किया जा सकता है, तो बदलेंक्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप ट्यूबिंग। तरल एक उच्च दर पर पंप है जब बड़े व्यास ट्यूबिंग प्रयोग किया जाता है। 14 कदम का पालन करें और फिर वापस करने के लिए कदम 8.4।

13. संवर्धित रोगाणुओं के लीजिए माइक्रोस्कोप छवियों

  1. गैर अतिव्यापी पदों पर जो microfluidic चैनल में पंप कोशिकाओं की छवियों फोकल हवाई जहाज़ में हो जाएगा का एक सेट के साथ माइक्रो-प्रबंधक में चरण की स्थिति सूची भरें।
  2. "बायोरिएक्टर नियंत्रक" प्लगइन खोलें। वांछित एलईडी मैट्रिक्स समय बेशक, इमेजिंग चैनलों, और संकेतों से अन्य प्रयोगात्मक सेटिंग का चयन करें। लीजिए और छवियों का विश्लेषण।
  3. प्रयोग चलाता है, यह सुनिश्चित करें कि मीडिया फ्लास्क में मीडिया साफ रहता है। यदि यह बादल है, तो यह दूषित कर दिया गया है।

14. पोस्ट-प्रयोग

  1. मीडिया, अतिरिक्त सेल संस्कृति और प्रवाह के निपटान के।
  2. 20% EtOH के 200 मिलीलीटर विआयनीकृत पानी के साथ मिश्रित के साथ मीडिया कुप्पी फिर से भरना। chemostat चलाने के रूप में यह पहले से थासेल मलबे और मीडिया बाहर धोने के लिए प्रयोग के दौरान चला गया।
  3. शराब समाधान मीडिया कुप्पी से सूखा है, जब chemostat पूरी तरह से अलग करना।
  4. गर्म पानी और हल्के साबुन के साथ कांच के बने पदार्थ और ट्यूबों धो लें, और विआयनीकृत पानी से अच्छी तरह कुल्ला। सूखने के लिए छोड़ दें।
  5. "MicrocontrollerRecords.csv" फ़ाइल तापमान और प्रयोग के पाठ्यक्रम पर एलईडी मैट्रिक्स स्थिति की समीक्षा करने के लिए खोलें, "Summary.csv" फ़ाइल छवियों के प्रत्येक सेट से सारांश डाटा और समीक्षा करने के लिए "परिणाम <n> .csv" हर बार की अवधि में, जहां एन वें डेटा सेट है से प्रत्येक रॉय सारांश डेटा की समीक्षा करने के लिए फ़ाइलों।

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Representative Results

इस तंत्र Cry2 / CIB1 प्रोटीन जोड़ी 30 के आधार पर एक inducible optogenetic प्रतिलेखन प्रणाली के माध्यम से नीली बत्ती के जवाब में पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन (YFP) व्यक्त एस cerevisiae की एक संस्कृति को प्रोत्साहित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। प्रकोष्ठों 0.2 ± 0.008 के एक औसत कमजोर पड़ने की दर के साथ फॉस्फेट सीमित मीडिया में chemostatically बड़े हो रहे थे। फास्फेट सीमा आमतौर पर विकास दर को नियंत्रित करने के एस cerevisiae chemostat प्रयोगों में इस्तेमाल किया जाता है और फॉस्फेट सीमा के प्रभाव को अच्छी तरह से विशेषता है। 31, 32, लगातार-पतला संवर्धन पोत से 33 प्रवाह एक microfluidic डिवाइस के लिए एक औंधा माइक्रोस्कोप पर नमूना था। के रूप में चित्रा 8 में दिखाया छवियों को स्वचालित रूप से विश्लेषण किया गया। व्यक्तिगत कोशिकाओं पृष्ठभूमि घटाया चरण विपरीत छवियों और उनके YFP concentra में पहचान की गईtion उनके प्रतिदीप्ति से अनुमान लगाया गया था के रूप में पृष्ठभूमि घटाया फ्लोरोसेंट छवियों से मापा जाता है।

169,677 कोशिकाओं के प्रतिदीप्ति प्रयोग के 70 घंटे से अधिक microfluidic युक्ति में 28 स्थानों से अर्जित प्रवाह के 33,600 छवियों से विश्लेषण किया गया था। हम एक औंधा एक प्रतिदीप्ति रोशनी प्रणाली और एक CMOS कैमरा के साथ सुसज्जित माइक्रोस्कोप का इस्तेमाल किया। YFP छवियों को एक 500/20 एनएम उत्तेजना फिल्टर, एक 535/30 एनएम उत्सर्जन फिल्टर, और एक T515lp dichroic के साथ हासिल किया गया। छवियाँ कोहलर रोशनी के तहत एक 40x चरण विपरीत उद्देश्य के साथ ले जाया गया। छवियाँ 87 पिक्सल के साथ 16-बिट रंग गहराई में दर्ज किए गए प्रति माइक्रोमीटर चुकता। संस्कृति 6 घंटे के अंतराल के लिए नीले रंग के प्रकाश की तीव्रता बदलती के संपर्क में था, 6 घंटे के अंतराल के लिए पूरी तरह अंधेरे द्वारा पीछा किया। संस्कृति पहली माप, यही वजह है कि इसकी प्रतिदीप्ति तीव्रता पहले अंधेरे की अवधि के दौरान कम हो रही है के लिए पहले प्रकाश के संपर्क में किया गया था। </ P>

9 चित्रा संवर्धन पोत रोशन के जवाब में optogenetic प्रणाली के सक्रियण पर YFP उत्पादन के कारण प्रतिदीप्ति पता चलता है। यह एक जनसंख्या औसत एकल कोशिका माप प्रतिदीप्ति तीव्रता की जनसंख्या वितरण प्रकट पर प्रतिदीप्ति के एकल कक्ष माप की उपयोगिता को दर्शाता है। 42 h 26 मिनट पर ग़ैर ध्यान दें। इसी छवियों समीक्षा करने के बाद, यह वहाँ पृष्ठभूमि के समग्र छवि उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया छवियों के बहुमत में कोशिकाओं के झुरमुटों थे कि, कलाकृतियों कि पृष्ठभूमि घटाया छवि में कोशिकाओं मची है, जिसके परिणामस्वरूप स्पष्ट किया गया था। इसके अलावा, संवर्धन पोत से एक बुलबुला microfluidic चैनल के लिए लगाया गया था और इसके किनारों के कुछ हिस्सों छवि विश्लेषण एल्गोरिथ्म द्वारा कोशिकाओं के रूप में गलत थे। क्योंकि न तो है और न ही बुलबुला पृष्ठभूमि घटाकर से कलाकृतियों वास्तविक कोशिकाओं को corresponded, उनके मापा प्रतिदीप्ति तीव्रताकोशिकाओं के ऑटो प्रतिदीप्ति की तुलना में कम है। यह आंकड़ा डेटा की गुणवत्ता है कि स्वचालित रूप से अधिक 3 डी हासिल किया जा सकता दर्शाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

आंकड़ा 8
8 चित्रा: छवि विश्लेषण एल्गोरिथ्म के दृश्य चित्रण। इन छवियों को फसली और देखने में आसानी के लिए विस्तारित किया गया है। (ए) छह छवियों सेल संस्कृति की पृष्ठभूमि घटाया चरण विपरीत छवि उत्पन्न करने के लिए अर्जित कर रहे हैं। बाद मुख्य छवि हासिल कर ली है, पांच अतिरिक्त छवियों प्रवाह नमूना पंप संक्षेप में प्रत्येक अधिग्रहण के बीच चालू सुनिश्चित करने के लिए कि कोशिकाओं को विस्थापित कर रहे हैं के साथ हासिल किया है। पृष्ठभूमि का एक समग्र छवि पाँच घटक छवियों से उत्पन्न होता है। प्रत्येक पिक्सेल का मूल्यपृष्ठभूमि छवि में 5 घटक छवियों के पार है कि एक ही पिक्सेल की औसत मूल्य है। (बी) पृष्ठभूमि घटाया छवि तो एक द्विआधारी में बदल जाती है। बाइनरी तो फैली हुई है और बाइनरी के निरंतर वर्गों के भीतर छेद भर रहे हैं। पीले रंग की रूपरेखा (आरओआई) ब्याज के चयनित क्षेत्रों, आकार और घेरा मानदंडों के आधार पर के अनुरूप हैं। (सी) उन रॉय फ्लोरोसेंट छवि है, जहां प्रत्येक कोशिका के प्रतिदीप्ति रॉय के भीतर प्रतिभाशाली पिक्सेल के मूल्य के रूप में मापा जाता है, पर मैप किया जाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

9 चित्रा
चित्रा 9: समय के साथ प्रतिदीप्ति तीव्रता की जनसंख्या वितरण। इन subfigures में मापा स्त्राव के लघुगणकescence प्रदर्शित किया जाता है, से फ्लो में मानक अभ्यास के बाद। ए और बी में रेखा प्रकाश अवशोषित या संस्कृति है, जो बाँझ मीडिया और प्रकाश संवर्धन के बर्तन में सेल संस्कृति के माध्यम से प्रेषित के माध्यम से प्रेषित प्रकाश के बीच तीव्रता में अंतर के रूप में मापा जाता है के द्वारा diffracted की तीव्रता को इंगित करता है। यह दूसरा तालमेल अक्ष के खिलाफ साजिश रची है। (ए) एक बॉक्स और गलमुच्छा साजिश (5 वें प्रतिशतक, 25 वें प्रतिशतक, मंझला, 75 वें प्रतिशतक, 95 वें शतमक) समय के साथ आबादी की मापी प्रतिदीप्ति के लघुगणक की। (बी) एक ही डेटा, जहां रंग इसी बिन की रेंज में एक मापा प्रतिदीप्ति के साथ कोशिकाओं की सामान्यीकृत आवृत्ति से मेल खाती है की एक 2-आयामी हिस्टोग्राम। रंगों 42 h 26 मिनट पर शामिल ग़ैर बिना डेटा की श्रेणी के लिए बढ़ाया गया था। सबसे कम प्रतिदीप्ति बिन में ग़ैर की सामान्यीकृत आवृत्ति0.7 है। (सी) प्रकाश को पहले दर्ज जोखिम से पहले आबादी का मापा प्रतिदीप्ति के लघुगणक में से एक आयामी histograms और प्रकाश के लिए सबसे बड़ा प्रदर्शन के बाद। यह दर्शाता है कि इस तनाव में YFP के प्रकाश प्रेरित अभिव्यक्ति bimodal है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

हम मन में लचीलेपन के साथ इस तंत्र बनाया गया है। सभी इस्तेमाल कोड स्वतंत्र और खुला स्रोत है। खंड कोशिकाओं को डिफ़ॉल्ट छवि विश्लेषण की प्रक्रिया आसान है और जल्दी से चलाता है। कस्टम विश्लेषण उपयोगकर्ता इनपुट जबकि रिकॉर्डिंग, फिजी ग्राफिक यूजर इंटरफेस के साथ एक प्रतिनिधि छवि का विश्लेषण एक BeanShell स्क्रिप्ट के लिए इनपुट परिवर्तित करने, और फिर प्लगइन स्क्रिप्ट कॉल करने के लिए सेटिंग से लागू किया जा सकता है। जब यह कहा जाता है, इस स्क्रिप्ट एक स्ट्रिंग सरणी "छवियों" पृष्ठभूमि घटाया छवियों का सबसे हाल के सेट करने के लिए फ़ाइल पथ युक्त कहा जाता भेजा जाएगा। छवियाँ और डेटा सहेज कर रहे हैं के रूप में वे एकत्र कर रहे हैं, ताकि वे नहीं खो रहे हैं एक प्रयोग अचानक समाप्त होता है। एक नीले एलईडी सरणी हमारे optogenetic प्रणाली उत्प्रेरण के लिए चुना गया था, लेकिन यह अलग अलग रंग के एल ई डी के साथ बदला जा सकता है। वहाँ अतिरिक्त इनपुट और आउटपुट है कि यह आसान बनाने के लिए एक अतिरिक्त MOSFET स्विच और पीसीबी पर रिले स्विच के लिए microcontroller पर साथ ही साथ के माध्यम से छेद उपलब्ध पिन कर रहे हैंइस प्रणाली के लिए और अधिक जटिल उद्देश्यों के लिए अनुकूलित किया जाना है। उदाहरण के लिए, इस तंत्र एक turbidostat के रूप में काम करने के लिए, microcontroller पर अतिरिक्त पिन का उपयोग एक एलईडी शक्ति के लिए और एक हल्के सेंसर संवर्धन पोत के लिए पैसे की कमी से मूल्यों को पढ़ा है, और फिर सॉफ्टवेयर में गंदगी को मापने के लिए संशोधित करने और उसके अनुसार पोत पतला ।

देखभाल सुनिश्चित करने के लिए कि संस्कृति दूषित नहीं है, संवेदनशील माइक्रोस्कोपी उपकरणों की रक्षा करने के लिए, और यह सुनिश्चित करना है कि तरल पदार्थ के प्रवाह की दर लगातार कर रहे हैं लिया जाना चाहिए। जब संवर्धन पोत जानबूझकर टीका है संदूषण से पहले पोत inoculating और पुष्टि कोई विकास अंदर यह है कि वहाँ से पहले कुछ दिनों के इंतजार के द्वारा पता लगाया जा सकता है। खुर्दबीन उद्देश्य पर सेल संस्कृति spilling से बचने के लिए, जाँच करें कि microfluidic युक्ति एक शोषक कपड़े के ऊपर के माध्यम से यह पहला पंप सेल संस्कृति से रिसाव नहीं होगा। अगर मीडिया के प्रवाह संवर्धन के बर्तन में असंगत है, यह आमतौर पर है क्योंकि ट्यूब के आसपासक्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप के रोलर्स भी ढीली हो गई है। अगर मछलीघर पंप से हवा का प्रवाह असंगत है, जहां तरल पूल सकते और असंगत हवा का प्रवाह का विरोध प्रवाह ट्यूब में कोई यू के आकार झुकता देखते हैं कि सुनिश्चित करते हैं। ट्यूबिंग एक प्रयोग के बाद भरा हो जाता है क्योंकि मीडिया के अंदर यह सूख गया है, एक गर्म पानी से स्नान में भरा नलियों सोख रोकना भंग करने के लिए।

इस प्रोटोकॉल के लिए आंतरिक सीमाओं जब एक प्रयोग की योजना बना या परिणामों का विश्लेषण करने पर विचार कर रहे हैं। कमजोर पड़ने दर और इस्तेमाल ट्यूब की लंबाई पर निर्भर करता है, वहाँ लगभग 10 मिनट के दौरान जो सेल संस्कृति माइक्रोस्कोप के लिए संवर्धन पोत से पंप है की देरी है। इसलिए, यह अच्छी तरह से कम timescales पर होने वाली घटनाओं का अध्ययन करने के लिए अनुकूल नहीं है। इसके अलावा, एक प्रयोग के बारे में दस दिन, केवल मीडिया की मात्रा के आधार पर सीमित करने के लिए लगातार चला सकते हैं, सेल संस्कृति के विकास का प्रयोग बढ़ जाती है की अवधि के रूप में विचार किया जाना चाहिए। Limiमीडिया के टिंग पोषक तत्व चयापचय और जीन अभिव्यक्ति 35, 36, 37, 38, 39 पर गहरा असर पड़ता है और इसलिए अध्ययन के तहत शरीर क्रिया विज्ञान के पहलू के आधार पर निर्धारित किया जाना चाहिए। जब परिणामों का विश्लेषण, छवियों, विशेष रूप से दूरस्थ डेटा से छवियों अंक चाहिए जिस तरह से कि ROIs छवि विश्लेषण दिनचर्या द्वारा की पहचान की गई में त्रुटियों के लिए समीक्षा की। यह संभव है बुलबुले या कलाकृतियों के लिए कोशिकाओं के लिए गलत हो सकता है, जिससे मापा प्रतिदीप्ति skewing। इस तरह के गलत माप समाप्त करने के लिए एक आसान तरीका ऑटो प्रतिदीप्ति तीव्रता नीचे प्रतिदीप्ति तीव्रता के साथ सभी ROIs त्यागने के लिए है।

इस प्रोटोकॉल, जीवों कि निरंतर संस्कृति में विकसित कर सकते हैं में प्रकाश के जवाब में प्रतिदीप्ति तीव्रता और / या प्रवाह सेल संस्कृति के सेलुलर आकृति विज्ञान को मापने के लिए उपयोगी हो जाएगा सेटएक सुसंगत फोकल हवाई जहाज़ जब हड़कंप मच गया नहीं करने के लिए टीएलई, और स्वचालित रूप से एक छवि विश्लेषण एल्गोरिथ्म से पहचाना जा। डिफ़ॉल्ट सेल पहचान यहां इस्तेमाल किया एल्गोरिथ्म सबसे सीधे मोटे तौर पर गोलाकार रोगाणुओं कि नवोदित खमीर के समान लागू होगा। एक वैकल्पिक 40 इस प्रोटोकॉल के लिए बैच संस्कृतियों का एक सेट में रोगाणुओं बढ़ती है, और फिर हर समय बिंदु के लिए एक बैच नमूना और प्रवाह cytometry द्वारा नमूना चिह्नित करने के लिए है। हालांकि, यहां वर्णित प्रोटोकॉल का लाभ है कि नमूने एक ही संस्कृति से लिया जाता है, कई नमूने ले जाया जा सकता है, और इस प्रक्रिया को स्वचालित है कर रहे हैं। इस प्रोटोकॉल भी इसी तरह की एक विधि है जिसमें optogenetic खमीर लगातार सुसंस्कृत और जल्दी नहीं है और कई छवियों को प्राप्त प्रतिदीप्ति द्वारा ROIs पहचान biasing द्वारा एक माइक्रोस्कोप 34 के तहत imaged थे पर सुधार। इस प्रोटोकॉल का एक बड़ा लाभ यह है कि व्यक्ति की कोशिकाओं के कई माप नियमित रूप से witho कई दिनों में प्राप्त किया जा सकता हैकेन्द्र शासित प्रदेशों के उपयोगकर्ता इनपुट। प्रकाश जोखिम के लिए माइक्रोबियल संस्कृति की प्रतिक्रिया को मापने के बाद, एक अगले कदम की प्रतिक्रिया का सिलिको बंद लूप नियंत्रण में लागू करने के लिए हो सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

हम उपयोगी विचार विमर्श और संपादन के लिए प्रोटोकॉल, कीरन स्वीनी परीक्षण में सहायता के लिए मौली Lazar और वेरोनिका डेलगाडो स्वीकार करना चाहते हैं, और टेलर स्कॉट, मेरे एक-adirekkun, और पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए स्टेफ़नी गेलर। मेगन निकोल McClean, पीएच.डी. बरोज़ वेलकम कोष से वैज्ञानिक इंटरफेस में एक कैरियर पुरस्कार रखती है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Extensive lab manual GitHub NA An extensive, regularly updated lab manual is available in the “Optogenetic Chemostat Files” GitHub repository (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files). This also includes a description of the microfluidic mold used to generate the representative results.
Fritzing Design Viewer Fritzing NA The free, open-sourced software to view and edit the .fzz type circuit board designs is available at "http://fritzing.org/download/"
Arduino Uno R3 (Atmega328 - assembled) Adafruit 50 Microcontroller. 1 required.
Arduino Stackable Header Kit SparkFun Electronics 10007 Female pin headers for connecting PCB to microcontroller. 1 required.
Adjustable 30W 110V soldering iron - XY-258 110V Adafruit 180 For making electrical connections to the PCB. 1 required.
Soldering iron stand Adafruit 150 For making electrical connections to the PCB. 1 required.
Mini Solder spool - 60/40 lead rosin-core solder 0.031" diameter - 100g Adafruit 145 For making electrical connections to the PCB. 1 required.
0.1 μF capacitor SparkFun Electronics COM-08375 Stabilizes voltage in PCB. 1 required.
10 μF capacitor SparkFun Electronics COM-00523 Stabilizes voltage in PCB. 1 required.
MAX7219CNG LED Matrix/Digit Display Driver - MAX7219 Maxim MAX7219CNG LED driver. 1 required.
8 pin IC Socket Mouser Electronics 575-144308 16 required. These will be stacked on top of each other to support the culture vessel above the LED matrix.
24 Pin IC socket Mouser Electronics 535-24-3518-10 Optional. Use this to reversibly attach the MAXIM 7219CNG driver to the PCB.
Digital multimeter Adafruit 2034 For troubleshooting electronics. 1 required.
Break Away Headers - 40-pin Male (Long Centered, PTH, 0.1") SparkFun Electronics PRT-12693 Male pin headers for connected LED matrix to printed circuit board. Ends can be trimmed with wire cutters. 1 set required. 
Flush diagonal wire cutters Adafruit 152 For trimming long pin headers and cutting power cables. 1 required.
Premium Female/Female Jumper Wires - 40 x 12" (300mm) Adafruit 793 Wire ribbon for connecting breadboard to LED matrix. Can be connected end-to-end with male pin-headers to be longer. 1 required.
Half-size breadboard Adafruit 64 The LED matrix will connect to this and the culturing vessel will rest above it.
Miniature 8x8 Blue LED Matrix Adafruit 956 Light source. Dominant wavelength is 470nm (blue). 1 required. Alternative miniature LED matrices from the same vendor are available with dominant wavelengths: 624 nm (red), 588 nm (yellow), 525 nm (green), 572 nm (yellow-green), and white.
Stackable header-3 pin SparkFun Electronics 13875 8 required.
Resistor Kit - 1/4W (500 total) SparkFun Electronics 10969 For electronics. 1 required.
 IRL520N MOSFET International Rectifier IRL520N Voltage regulating switch for controlling DC current. 4 required.
Hook-Up Wire - Assortment (Solid Core, 22 AWG) SparkFun Electronics PRT 11367 Wire for electronics. 1 required.
5V 2A (2000mA) switching power supply - UL Listed Adafruit 276 Power supply for the heating pad and Arduino. 2 required.
12 VDC 1000mA regulated switching power adapter - UL listed Adafruit 798 For peristaltic pumps. 2 required.
Electric Heating Pad - 10cm x 5cm Adafruit 1481 For heating the bioreactor. 1 required.
Low flow variable flow peristaltic pump Fisher Scientific 13-876-1 For pumping media. 1 required
Medium flow variable flow peristaltic pump Fisher Scientific 13-876-2 For pumping culture. 1 required.
9 VDC 1000mA regulated switching power adapter - UL listed Adafruit 63 For microcontroller power supply. Order 1.
High Temp Waterproof DS18B20 Digital temperature sensor + extras Adafruit 642 Thermometer for the bioreactor. 1 required.
Micromanager Micromanager NA The free, open-sourced microscope control software is available at "https://micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release"
FIJI ImageJ NA The free, open-sourced image analysis software is available at "http://fiji.sc/"
Arduino Integrated Development Environment Arduino NA The free, open-sourced IDE is available at "https://www.arduino.cc/en/Main/Software"
Custom code GitHub NA The custom microcontroller code and "Bioreactor Controller" plugin are available in the “Optogenetic Chemostat Files” GitHub repository (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files).
USB Cable A to B - 6 Foot SparkFun Electronics CAB-00512 Used to download data to microcontroller. 1 required.
bioreactorTimecourse_example.csv GitHub NA The advantage of loading LED matrix values from a CSV file is that a program can be called by the plugin to update those values based on image analysis results, and those values can be reloaded to the microcontroller, enabling feed-back control. It is available from the “Optogenetic Chemostat Files” GitHub repository (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files).
Tota-frost gels (diffusion paper) B&H B&H # LOFSFTL
MFR # T1-72		 For LED matrix. 1 required.
Kitting Sheet Crosslink 1/4x12x24in Grainger, inc 20JL37 Black foam for culturing vessel enclosure. 4 required.
Standard Photodiode Power Sensor, Si, 200 - 1100 nm, 50 mW  Thorlabs S120VC For measuring light intensity. 1 required.
Labelling Tape Fisher Scientific 159015N For labelling and securing loose components. 1 required.
Compact Power and Energy Meter Console, Digital 4" LCD Thorlabs PM100D For measuring light intensity. 1 required.
100mL GL45 hybridization glass bottle Bellco Glass, Inc. (7910-40150) Bioreactor vessel. 1 required.
Six port assembly Bellco Glass, Inc. Custom  For the bioreactor vessel. Tubing Specs: .125" OD x .055"ID. Port A: 1.0" long above cap slug and to bottom of tube. Ports B,C,E,F: 1.0" long above cap slug, 33 mm long below. Port D: 1.0" long above cap slug, 65 mm  long below. 1 required. Includes 45 mm diameter polypropylene open top screw cap and a white silicone gasket to ensure a tight seal between the cap and the vessel. 
Scotch Magic Tape 3105, 3/4 x 300 Inches, Pack of 3 Amazon B0009F3P3U Clear scotch tape. This is available from many other vendors. It is used to cover markings on the culturing vessel and to secure the coverglass with the PDMS channel to the aluminum support frame.
1/16" ID x 3/16" OD x 1/16" Wall Tygon Sanitary Silicone Tubing United States Plastic Corp. 57288 Tubing. ~25' required.
Cole-Parmer Twistit white rubber stopper, size 10 Cole-Parmer EW-62992-32 Media flask stopper and effluent flask stopper. 2 required.
2L Laboratory Flask Pyrex 4980 Media flask and effluent flask. 2 required.
Day pinchcock Fisher Scientific 5867 For pinching tubes shut. 3 required.
Replacement tubing assembly 1/16" ID Traceable Products 3372 The peristaltic pumps come with a set of tubes, but they wear out after weeks of use.
Replacement tubing assembly 1/50" ID Traceable Products 3371 The peristaltic pumps come with a set of tubes, but they wear out after weeks of use.
Male luer with lock ring x 1/16" hose barb, Nylon, 25/pk Cole-Parmer EW-45505-00 Connectors. ~10 luers are required.
Male luer with lock ring x 1/8" hose barb, Nylon, 25/pk Cole-Parmer EW-45505-04 Connectors. 5 required, one for each rubber stopper hole to fill with tubing.
Female luer x 1/16" hose barb adapter, Nylon, 25/pk Cole-Parmer EW-45502-00 Connectors. ~10 luers required.
Female luer x 3/16" hose barb adapter Cole-Parmer EW-45502-08 Connectors. ~10 luers required.
Cole-Parmer Luer Accessory, Female Luer Cap, Nylon, 25/Pk Cole-Parmer SC-45502-28
Cole-Parmer Luer Accessory, Male Luer Lock Plug, Nylon, 25/Pk Cole-Parmer EW-45505-56
Microbore PTFE Tubing, 0.022"ID x 0.042"OD, 100 ft/roll Cole-Parmer EW-06417-21 Tubing. 1 roll required.
Masterflex platinum-cured silicone tubing, L/S 13, 25 ft Cole-Parmer EW-96410-13 Tubing. ~25' required.
3/16" ID x 1/4" OD x 1/32" Wall Tygon Sanitary Silicone Tubing United States Plastic Corp. 57293 Tubing. ~1' required.
Vacuum filter Fisher Scientific 974107 Nalgene vacuum filter for sterile filtering media.
Aquel Oxy-Boost 200 Rena Aquatic Supply AP200 Dual diaphram adjustable flow air pump for aerating and mixing media. 1 required. 
0.2 μm pore syringe filter Corning International 431229 This ensures that air from the aquarium pump does not contaminate the apparatus. 1 required.
Slygard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning Slygard 184 For microfluidic device. 1 required.
American Safety Razor GEM Scientific Single-Edge Razor Blades Fisher Scientific 17989000 For cutting tubes and PDMS. 1 blade required.
Harris Uni-Core hole puncher 1.2mm ID Sigma-Aldrich WHAWB100028 ALDRICH For punching inlet/outlet in microfluidic device. 1 required.
Microscope cover glass 22x60-1.5 Fisher Scientific 12-544-G For microfluidic device. 1 required.
Rectangular aluminum frame with a square window Custom Custom To support the microfluidic channel. Outer dimensions: 3 inches x 1.25 inches.
Inner dimmensions (cut out portion): 7/8 inches x 7/8 inches
Thickness: ~1/32 inches

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References

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Stewart, C. J., McClean, M. N. Design and Implementation of an Automated Illuminating, Culturing, and Sampling System for Microbial Optogenetic Applications. J. Vis. Exp. (120), e54894, doi:10.3791/54894 (2017).

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