Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Design og implementering av en automatisert Illuminating, dyrking, og Sampling System for Microbial optogenetic Applications

Published: February 19, 2017 doi: 10.3791/54894
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biomedical Engineering, University of Wisconsin-Madison

Summary

Vi har konstruert en kontinuerlig dyrkingsapparat for bruk med optogenetic systemer for å belyse kulturer av mikrober og regelmessig bildet celler i avløpet med et invertert mikroskop. Dyrknings, prøvetaking, avbildning, og bildeanalyse er fullt automatisert, slik at dynamiske responser til belysning kan måles over flere dager.

Abstract

Optogenetic systemer benytter genetisk kodede proteiner som endrer konformasjon som svar på bestemte bølgelengder av lys for å endre cellulære prosesser. Det er et behov for dyrking og målesystemer som innlemme programmerte belysning og stimulering av optogenetic systemer. Vi presenterer en protokoll for å bygge og ved hjelp av en kontinuerlig dyrkingsapparat for å belyse mikrobielle celler med programmerte doser av lys, og automatisk hente og analysere bilder av celler i avløpsstrømmen. Driften av dette apparatet som et kjemostat gjør at vekstraten og den cellulære miljøet for å bli kontrollert. Avløpet fra den kontinuerlige cellekultur er regelmessig samplet og cellene blir avbildet ved flerkanals mikroskopi. Dyrknings, prøvetaking, avbildning, og bildeanalyse er fullt automatisert, slik at dynamiske responser i fluorescensintensiteten og cellulær morfologi av celler samplet fra kulturen avløpet måles over flere dageruten brukerens input. Vi demonstrerer nytten av denne dyrking apparat ved dynamisk å indusere proteinproduksjon i en stamme av Saccharomyces cerevisiae konstruert med et optogenetic system som aktiverer transkripsjon.

Introduction

Optogenetic systemer bruker lys til å styre en voksende liste av cellulære prosesser, inkludert genekspresjon, 1, 2, 3, 4, 5 protein lokalisering, 6 proteinaktivitet, 6, 7, 8-protein binding, 8, 9, 10 og proteinnedbrytning. 11 En fremgangsmåte for dyrking av celler i et kontrollert miljø med programmert optisk stimulering og for måling av deres respons over biologisk relevante tidsrammer er nødvendig for å utnytte potensialet til disse verktøy for forskning i cellebiologi og bioteknologi. Vår metode utnytter chemostasis å opprettholde en konstant cellevekst i en godt blandet, aevurdert, og temperaturregulert glassdyrkningsbeholder 12, 13 som er eksponert for programmert belysning. Vi bilde individuelle celler i kultur avløpet med et invertert mikroskop for å måle responsen av kulturen til programmerte belysning. Dyrknings, prøvetaking, avbildning, og bildeanalyse er helautomatisk, slik at det fluorescens-intensitet og cellulær morfologi av avløpet cellekulturen kan måles over flere dager uten at brukeren må.

Denne protokollen kan gjennomføres i de fleste laboratorier er kjent med økende cellekultur og mikroskopi, og apparaturen som anvendes er billig og fremstilt av lett tilgjengelige komponenter. Et gjennomsiktig dyrkningsbeholder plassert over en matrise av lysemitterende dioder (LED) som er i stand til å utsende en μW / cm2 -10 mW / cm 2 av lys. Mikrober dyrkes i dyrkningsbeholderen kontinuerlig; en peristaltiske pumpen brukes til å legge til media påfortynningshastighet, en annen brukes til å trekke tilbake kultur med en mindre hastighet til mikroskopet, og forskjellen slipper ut gjennom en overstrømsutløp. En varmepute opprettholder temperaturen. Luft blir kontinuerlig pumpet inn i dyrkningsbeholderen for å opprettholde et positivt trykk, så vel som å blande og lufte kulturen. Med unntak av luftpumpen, blir strømmen til disse enhetene regulert av en mikrokontroller som også mottar input fra et termometer og en tilkoblet datamaskin. Avløpet cellekultur pumpes til en mikrofluid enhet på scenen av et invertert mikroskop. Non-fluorescerende og fluorescerende bildene er ervervet automatisk. Cellene i bildene er kjennetegnet ved en algoritme som lokaliserer hver celle som en region av interesse (ROI) og måler egenskapene til hver ROI.

For å demonstrere en anvendelse av denne protokollen, vi målte respons til varierende lysintensitet av Saccharomyces cerevisiae celler konstruert med et blått lys responsive optogenetic system som styrer transkripsjonen av fluorescerende protein. S. cerevisiae, vanligvis kjent som bakegjær, ble valgt på grunn av flere optogenetic systemer for styring av genekspresjon i dette system som allerede eksisterer 14, 15, 16. Videre er dette modellorganisme som vanligvis benyttes for studier i systembiologi 17 og som et understell for bioteknologiske anvendelser 18, 19, 20. Våre representative resultater viser at denne protokollen kan brukes til å styre transkripsjonen av en kultur i løpet av flere dager ved å variere inngangs lysintensiteter og måle produksjonen av et fluorescerende reporter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Figur 1

Figur 1: Den kontinuerlige dyrkingen apparat. Denne forenklede diagram som viser hvordan anordningen skal settes sammen når den blir anvendt for å dyrke, belyse, og måle optiske egenskaper av mikrobene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2: Oversikt av protokollen. Trinnene i det skraverte området må gjentas hver gang protokollen brukes. Lukket reguleringssløyfe er mulig 34, men er ikke implementert i denne protokollen.

1. Monter termometer til kretskortet


Figur 3: Tilkoblinger for å lese termometer verdier. Dette diagrammet viser hvordan det digitale termometeret skal være koblet til kretskortet, slik at mikrokontrolleren kan få tilbakemelding for å kontrollere temperaturen av kulturen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

  1. Lodde Ground, Data og positiv spenning linjer av det digitale termometeret til sine respektive gjennomgående hull merket "GD + V."
  2. Klipp av en pin fra en kvinnelig 3-pinners hode og trimme de resterende 2 pins med tråd clippers, slik at den kan passe inn i de to gjennomgående hull merket "R2" og ikke hindre mikrokontroller. Loddetinn dette på plass. Koble de to loddet pinnene ved å sette inn en 4,7 kohm motstand i pinnen spissen.

2. Koble strøm Controll Komponenter til kretskortet

Figur 4
Figur 4: Tilkoblinger for å styre strøm til varmeputen. Dette diagrammet viser hvordan PCB og tilbehørsdeler skal settes sammen for å styre strøm til varmeputen. Delene å styre peristaltiske pumper er forbundet på en lignende måte. Merk at komponentene for termometeret har blitt fjernet for klarhet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

  1. Skjær av 1 cm fra pinnene fem kvinnelige 3-pin overskrifter. Lodde disse til posisjonene på kretskortet (PCB) merket som "# 1", "# 2", "# 3", "# 4" og "CB E."
  2. Skjær av 1 cm fra pinnene en kvinnelig 6-pin og 8-pin header. Lodd disse side ved side for åkolonnen gjennomgående hull merket K1 gjennom K14.
  3. Koble varmeputen til kretskortet.
    1. Sett endene av en 100 kQ motstand i de gjennomgående hullene merket K1 og K2 på kretskortet. Sette inn en metall-oksyd-halvlederfelteffekttransistor (MOSFET) i den stilling som er merket # 1 på kretskortet, med etiketten til MOSFET som vender mot K1 gjennom K14 gjennomgående hull, slik at kilden tappen er nærmest "# "etikett, og avløpet pin er lengst fra" # "etiketten.
    2. Skjær grunnlinjen av 5 V likestrøm (DC) strømforsyningskabelen og koble den til J2. Koble jordings linje av varmeputen til J1. Koble K3 til pin 3 med en 1 kohm motstand. Nåværende skal nå bare flyte fra J1 til J2 når pin 3 er satt til + 5V.z
      MERK: resistor / MOSFET set fungerer som en bryter som gjør det mulig for strøm å flyte fra tappen J1 J2 til når tappen 3 av mikrokontrolleren er satt til 5 V.
  4. Koblelangsom peristaltiske pumpen.
    1. Sett endene av en 100 kohm motstand i de gjennomgående hullene merket K4 og K5 på PCB. Sett inn en MOSFET i stillingen merket # 2 på PCB, med etiketten på MOSFET vendt mot K1 gjennom K14 gjennomgående hull, slik at kilden pin er nærmest "#" etikett, og avløpet pin er lengst fra "#" etikett.
    2. Skjær bakken linjen i 12 V DC strømkabelen fra den langsomme peristaltiske pumpen. Koble den peristaltiske pumpen vender slutt på J3 og veggen vorte vendt slutt på J4. Koble K6 til pin 4 med en 1 kW motstand. Nåværende skal nå bare flyte fra J3 til J4 når pin 4 er satt til 5 V.
  5. Koble raskt peristaltiske pumpen
    1. Sett endene av en 100 kohm motstand i de gjennomgående hullene merket K7 og K9 på PCB. Sett inn en MOSFET i stillingen merket # 3 på PCB, med etiketten på MOSFET vendt mot K1 gjennom K14 gjennom-hull s o at kilden pin er nærmest "#" etikett, og avløpet pin er lengst fra "#" etiketten.
    2. Skjær bakken linjen i 12 V DC strømkabelen av den raske peristaltiske pumpen. Koble den peristaltiske pumpen vender slutt J5 og veggen vorte vendt slutt på J6. Koble K9 til pin 5 med en 1 kW motstand. Nåværende skal nå bare flyte fra J5 til J6 når pinne 5 er satt til 5 V.

3. Koble LED Matrix til kretskortet

Figur 5
Figur 5: Tilkoblinger for å styre LED matrix. Dette diagrammet viser hvordan LED matrix skal kobles til PCB. Det viser også at PCB kan stables på mikrokontrolleren. Merk at komponentene for termometeret og for å kontrollere DC strøm til andre enheter har blitt fjernet for klarhet.es / ftp_upload / 54894 / 54894fig5large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

  1. Lodde 6-pin, 10-pin, og de to 8-pin kvinnelige pin overskrifter inn i gjennom-hull på sidene av PCB, slik at det kan stables på toppen av microcontroller.
  2. Lodde 100 nF og 10 uF kondensatorer til sine merkede posisjoner på PCB, og bemerker at den negative terminalen på 10 uF kondensator (kortere bly) skal kobles til den gjennomgående hull som er merket med et negativt fortegn.
  3. Loddetinn LED-driver til 2 ved 12 sett med gjennomgående hull, med hakket på driveren langt fra de gjennomgående hullene reservert for LED-matrisen.
  4. Lodd 2 kolonner med mannlige pin overskrifter til de gjennomgående hull som er merket for LED matrix, og trimme endene av disse under brødfjel slik at de ikke vil hindre mikrokontrolleren. Koble disse til to 8-tråds strimler av kvinnelige / kvinne jumper ledninger. Koble til et annet sett av mannligepin overskrifter til den andre enden av forbindelsesledninger.
  5. Sett inn LED matrix over medianen av breadboard, og deretter sette inn det andre settet med pin overskrifter til kolonnene på hver side av matrisen. Sikrer at de elektriske forbindelser er det samme som om den LED-matrisen hadde blitt direkte koblet til kretskortet med den merkede siden av matrisen som svarer til den merkede kolonne av gjennomgående hull.
  6. Klipp av en pin fra en kvinnelig 3-pinners hode og trimme de resterende 2 pins med tråd clippers, slik at den kan passe inn i de to gjennomgående hull merket "R1" og ikke hindre mikrokontroller. Lodde dette. Koble de to loddet pinnene ved å sette inn en 1 kW motstand i pinnen spissen.
    Merk: Dyrkingen Skipet vil bli stablet over LED matrix. Hvis trådbåndene hindrer fartøyet, forskjøvet dem fra matrisen. Deretter bruker solid kjerne ledning til å bygge bro over gapet mellom matrise pins og wire bånd pins, slik at CH de elektriske koblingene ikkeange.

4. Installer programvare og koble til Hardware

  1. Stable PCB på mikrokontrolleren.
  2. Følg linkene i listen materialer for å laste ned Integrated Development Environment (IDE) og egendefinert kode for mikrokontrolleren.
  3. Koble mikrokontroller til mikroskopet datamaskin via en Universal Serial Bus (USB) kabel AB. Kompilere og laste opp egendefinert kode til mikrokontrolleren.
  4. Last ned Micro-Manager 21, 22 og FIJI 23. Konfigurer Micro-Manager som en FIJI plugin ved å kopiere alle "DLL" filer, den "mmplugins" katalog, og "mmautofocus" katalog fra katalogen der Micro-manager ble lastet inn i den "Fiji.app" katalogen. Også kopiere "plugins / Micro-Manager" katalog i "Fiji.app/plugins" katalogen.
  5. Last ned "BioreactorController.jar" fil into "Fiji.app/mmplugins" katalogen.
  6. Åpen Micro-Manager fra FIJI> Plugins> Micro-Manager> Micro-Manager Studio. Bruk maskinvarekonfigurasjonsveiviseren til å konfigurere programvaren for å kontrollere mikroskop. Inkludere "FreeSerialPort" enhet i veiviseren med etiketten på porten som AB USB-kabelen er tilkoblet.

5. Lag og karakter Light-bevis Enclosure for dyrking Vessel

  1. Stable tre åtte pins IC-sokler som byggeklosser på brødfjel ved hvert hjørne av LED-matrisen slik at dyrkingen fartøyet kan hvile på dem over matrisen.
  2. Feste en del av diffusjon papir under det øverste laget av hylsene, slik at lyset som treffer dyrkingen fartøyet fra LED matrise er diffus.
  3. Klipp ut tre 8 "med 6" deler av svart skum. Skjær ut et parti som er av samme størrelse som den elektroniske brødfjel (2,3 "x 3,5") fra innsiden av den første two, og en del som er på størrelse med rektangelet laget av IC-stikkontakter (0,9 "x 1,8") fra innsiden av den tredje. Stable disse lagene over LED-matrisen, slik at det endelige laget som inneholder 0,9 "x 1,8" åpning ligger selv med toppen av IC fatninger, og omgir LED-matrisen.
  4. Skjær et ekstra ark med svart skum i to for å lage en 6 "med 24" rektangel. Rulle inn i en hul søyle av sort skum som dyrknings fartøyet kan passe inn med plass for rør og ledninger, slik at den vil termisk og optisk isolere dyrkningsbeholderen.
  5. Sentrerer hul søyle av svart skum over LED-matrisen, og markerer grensen av kolonnen på laget av svart skum under den. Denne grensen vil markere hvor det skal være sentrert i fremtiden.
  6. Klipp ut en 3 "x 3" delen av svart skum. Bruk dette senere som et lokk som kan tapet på toppen av kolonnen for å blokkere eksternt lys.
  7. Fest fotodioden makt sensor til th e dyrking fartøyets cap med tape, feste lokket, og sett dyrkning fartøy i kabinettet.
  8. I Micro-Manager, gå til Plugins> bioreaktor Controller. Still matrisen til å lyse ved en undergruppe av omfanget av mulige intensiteter med 30 s intervaller.
  9. Spill lys intensiteter som vises på strømmåleren konsollen koblet til strømsensoren. Disse målingene vil gi den faktiske intensiteten av lys for å bli kjent når antall lysdioder som lyser og pulsen bredde-modulert (PWM) strøm til disse LED er satt.

6. Klargjør Dyrking Vessel

Figur 6
Figur 6: Fartøy tilkoblinger. Dette diagrammet viser hvordan fartøyet og røret av anordningen skal kobles før den autoklaveres.blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

  1. Mark den høyde som tilsvarer hver 2 ml inkrement av væske i området fra 10 ml til 30 ml i dyrkningsbeholderen. Innsatsen 10 ml sterilt avionisert vann, merker vannivået, tilsett 2 ml, merk vannstand, og gjenta til 30 mL nivå er markert. Dekk markeringene med klar tape, slik at de ikke er lett å fjerne, og kast av væsken.
  2. Plasser den lange enden av aluminium port gjennom silikonpakning, inn i dyrkningsbeholderen. Skru på lokket.
  3. Dekk en kort aluminium port uttak med 1/16 "ID silisium slangen. Plugg den distale enden ved å sette inn en kvinnelig luer lock og deretter koble en hann-plugg. Dette uttaket er supplerende, og vil ikke bli brukt (tube 6 i Figur 6 ).
  4. Koble to korte segmenter av 1/16 "ID silikonslanger med mannlige og kvinnelige luer låser. Koble den ene enden til en kort aluminium port stikkontakt og plugg den distal slutten med en hann og hunn luer lock plugg. Fartøyet vil bli vaksinert gjennom dette røret (tube 7 / 7,1 i figur 6).
  5. Koble to 1/16 "ID-rør til endene av 1/16" ID-peristaltiske rør og koblinger. Koble den ene enden til en kort aluminium port og den andre (rør 4 i figur 6). Senere vil det bli koblet til medie kolben.

7. Forbered Media Flask

  1. Koble en 1/16 "innvendig diameter (ID) silikonrøret til den lengste aluminium port. Røret bør være lang nok til å nå media kolben. Treffe en 1/8" ID hann-til et kort segment av 1/16 " ID tubing, koble denne til den foregående rør ,, og deretter sette dette kort segment i gummiproppen på medie kolbe (rør 3 i figur 6).
  2. Klem røret. Denne forbindelsen gjør det mulig for luft å strømme fra kolben mediet til kulturen fartøyet. Når media kolbe senere pumpet med luft end dette rør er fastspent, vil kulturen bli blandet, luftet, og holdes på et positivt trykk av de innkommende luftbobler.
  3. Sette inn en 1/16 "ID-rør lenge nok til å nå bunnen av kolben inn i stopperen, gjennom hvilken mediet skal overføres. Koble en annen 1/16" ID-rør til denne, og deretter en 3/16 "ID-rør til det. plugg denne med en 3/16 "ID hunnluerlåsen og en hann-plugg (røret 1 / 1.1 i figur 6).
  4. Den tredje hull i proppen skal være fylt med et kort segment av 1/16 "ID-rør, forbundet med to andre segmenter av middels diameter rør og plugget ved den distale ende (rør 2 / 2,1 i figur 6). Dette vil bli tilkoblet til en vakuumpumpe og senere til et akvarium pumpe.
    MERK: Hvis slangen ikke lett kan passe gjennom hullene i gummiproppen, kuttet endene av slangen på skrå. Deretter kan skråstilt ende som skyves gjennom hullet brukes til å trekke resten gjennom.

  1. Sett inn en hann-til et segment av 1/16 "ID silikonslanger, og deretter fast sette inn 0.022" ID polytetrafluoretylen (PTFE) tubing. Separat, feste en hunnluerlåsen til en 1/16 "ID-rør. Deretter kan tråden ene ende langs PTFE-røret for å koble de låser og den andre til en kort aluminium-port (rør 5 i figur 6).
  2. Koble den eksponerte 1/50 "ID silikon tube til 1/50" ID peristaltiske rør og koblinger. For dette, må du koble tre segmenter av 1/50 "ID slange og to segmenter av 0.022" ID PTFE slange, alternerende dem. Koble denne til avløpet kolben via 1/16 "ID-røret (rør 5 i figur 6).
  3. Den ene enden av en 1/16 "ID silikonrøret til den nest lengste rør av aluminium port og den andre enden til avløpet kolben. Dette aluminiumsrøret setter kulturvolum, og overskudd av kultur flyter i avløpsstrømmen beholder (tube 8 i
  4. Autoklav dyrkningsenheten ved 121 ° C og 15 psi (generell sterilisering) i 30 minutter.
    Merk: Rørene gjennom hvilken mediet kolben er fylt, hvorigjennom mediet kolben støvsugd, og gjennom hvilken dyrkingen fartøyet inokuleres har flere segmenter av rør, slik at hvis det distale segment er forurenset, kan den fjernes for å avdekke en steril segmentet.

9. Forbered mikrofluid Channel

  1. Bland polydimetylsiloksan (PDMS) og herdemiddel i et 9: 1 forhold. Degas og hell på silikon mester mold.
  2. Kurere PDMS for to timer ved 65 ° C og deretter klippe det fra masken med et barberblad. Skjær rundt PDMS til den løsner fra formen. Unngå å skyve ned og bryte den skjøre wafer.
  3. Bruk en 1,2 mm ID biopsi hullemaskin å lage hull i begge ender av kanalen.
  4. Plasma obligasjon de PDMS til dekkglass 24.
  5. Tape lang ender av dekkglasset til støttealuminiumsramme slik at PDMS kanalen er sentrert på aluminiumsrammen, og deretter bake PDMS igjen i 2 timer ved 65 ° C.

10. Fyll Media Flask

Figur 7
Figur 7: Legge til media. Dette diagrammet viser hvordan mediene skal være vakuum filtrert i media kolbe. Det sikrer at media forblir sterile. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

  1. Gjøre riktige medier. Hvis den kontinuerlige dyrkingen systemet vil bli drevet som en kjemostat, bruker media begrenset til et bestemt næringsstoff.
    MERK: Eksempler på standard media sammensetning for studier med S. cerevisiae har tidligere blitt publisert 25,= "xref"> 26, 27, 28, 29.
  2. Fest vakuum filter til en 100 ml flaske, fjerne brystvorten dekselet, og fjern den hvite pluggen fra brystvorten av vakuum filter med sterile pinsetter.
  3. Forbinder 3/16 "ID-silikonrøret til nippelen, media kolbe øvrige fri rør til en vakuumpumpe (rørene 1 og 2 i figur 7, henholdsvis), og sikrer at røret som forbinder media kolben til dyrkningsbeholderen er fastklemt lukket (rør 3 i figur 7).
  4. Fyll filteret med medier, slå på vakuumpumpen, og deretter filtrere resten av media. Klem 1/16 "ID silikonslanger koblet til vakuum (rør 2 i Figur 7) og slå av vakuumpumpe.
  5. Fjern de leurs fra den mellomliggende segment av 1/16 "ID slange som er koblet til vakuumpumpen, slik at en forurenset enden av røret er tilgjengelig. Sett the blå enden av en steril sprøyte luftfilter inn i dette rør.
  6. Klem 3/16 "ID silikonslanger (tube 1 i figur 7) og koble den mannlige luer fra det. Koble pluggen fra den kvinnelige luer av dyrking fartøyets media innløpsrøret. Koble disse mannlige og kvinnelige luers å aktivere medie å være pumpes inn i dyrkningsbeholderen.
  7. Fjern vakuumfilter og cap 100 ml flaske med media som ble festet til vakuumfilteret.
  8. En dag før dyrkingen fartøyet skal inokuleres, inokulere en enkelt koloni av optogenetic mikrobe i et reagensrør med 4 ml av mediet som er samlet i det foregående trinn, og la det vokse over natten ved 30 ° C eller kulturens optimale temperatur veksttemperatur under omrøring.

11. Monter Apparatus Rundt mikroskop

  1. Angi den kontinuerlige dyrkingen sammenstillingen nær mikroskop med media kolbe høyere enn dyrkingen fartøyet og effluent kolbe lavere enn dyrkningsbeholderen, slik at røret består av segmenter av 0,022 "ID PTFE-slange (rør 5 i figur 6) kan nå objektbordet. sikkert tape nedover gummikorker på medie kolben og avløpsbeholder.
  2. Trekk endene av 0,022 "ID PTFE slangen fra 1/50" ID-silikonrøret som forbinder dem (rør 5 i figur 6), og koble disse ender inn i innløpet og utløpet av den mikrofluidanordningen.
  3. Må den hvite enden av sprøyten luftfilteret til akvariet pumpen. Lufttrykket vil presse medier i dyrknings fartøyet.
  4. Når materialet når nivået av avløpet port, vikle 1/16 "ID-media innløpsrøret og kontaktene rundt den langsomme peristaltisk pumpe (røret 4 i figur 6), og 1/50" ID prøveuttaket røret og kontaktene rundt rask peristaltisk pumpe (rør 5 i figur 6).
  5. Luft media ved unclamping luften tuvære mellom mediene kolben og dyrkning av fartøyet.
  6. Tape varmeputen og termometer til dyrkningsbeholderen, slik at dens temperatur kan kontrolleres. Kveil media røret rundt dyrkningsbeholderen slik at tømmes i mediet vil være ved den samme temperatur som fartøyet.
    MERK: PWM strøm til varmeputen er regulert av mikrokontrolleren som bruker inngangssignaler fra termometeret for å holde dyrkningsbeholderen ved dens settpunkttemperatur.
  7. Sett dyrkning fartøyet inn i det svarte skum kabinett over LED matrix, og sørge for at rørene ikke blir klemt.
  8. I Micro-Manager, gå til Plugins> bioreaktor Controller. Sett "Media pumpe ratio på" feltet til 0,1 og "Sample pumpe ratio på" feltet til 0. strømningshastigheten vil være svært lav, men høyere enn frekvensen av fordampning.
  9. Klem innkommende luftslangen mellom mediene kolben og dyrking fartøy. Fjern pluggen fra vaksinasjon tube (rør 7 i figur
  10. Dekk kabinettet slik at ikke lys kommer inn, og la kulturen vokse over natten.

12. kalibrere Pumping priser

  1. I Micro-Manager, gå til Plugins> bioreaktor Controller. Sett "Media pumpe ratio på" feltet til 0,5 og "Sample pumpe ratio på" feltet til 0.
  2. Koble fra overløpsrøret fra avløpet kolbe (røret 8 i figur 6) og prøvetagningsrøret fra avløpet kolbe (røret 8 i figur 6) og samle effluent i separate beholdere. Samle avløp for en time, begynner etter pumpene har vært på i 15 min.
  3. Beregn strømningshastigheten for mediet i dyrkningsbeholderen fra volumet samles i beholderen som:
  4. Juster verdien av "Media pumpe ratio på" feltet ved denne lineære anslag:
    Equaiton 2
    hvor
    Equaiton 3
  5. Iterere gjennom denne kalibreringsprosedyren til forskjellen mellom den ønskede strømningshastighet og den målte strømningshastighet er <0,2 ml / h, hvor strømningshastigheten er midlet over en periode av 1 time.
  6. Øke verdien av "sample ratio på" -feltet, og kalibrere den på en lignende måte inntil omtrent 4/5 th av volumet som forlater dyrkingen fartøyet pumpes ut av prøvetakingspumpen og omtrent 1/5 av volumet forlater via overløps port.
  7. La kulturen tetthet i den kontinuerlige dyrkingsapparatet i likevekt under disse betingelser over natten.
    MERK: Dersom målet strømningsrater ikke kan nås, endringden peristaltiske pumpe produksjonsrøret. Flytende pumpes til en høyere rente når større diameter brukes. Følg trinn 14 og deretter tilbake til trinn 8.4.

13. Samle mikroskop bilder av Kultur Mikrober

  1. Fyll Stage posisjonslisten i Micro-Manager med et sett av ikke-overlappende stillinger i hvilke bilder av celler pumpes inn i mikrofluidkanalen vil være i fokalplanet.
  2. Åpne "bioreaktor Controller" plugin. Velg ønsket LED matrix tid selvfølgelig, bildebehandling kanaler, og andre eksperimentelle innstillinger fra instruksjonene. Samle inn og analysere bildene.
  3. Mens forsøket går, sikre at media i media kolben forblir klart. Hvis det er overskyet, så det har blitt forurenset.

14. Post-eksperiment

  1. Kast media, overskytende cellekultur og avløp.
  2. Fyll opp media kolbe med 200 ml 20% EtOH blandet med avionisert vann. Kjør kjemostat som den hadde tidligerevært drevet under forsøket for å vaske ut celleavfall og media.
  3. Når alkoholen løsningen er tappet fra media kolbe, demontere kjemostat fullt.
  4. Vask glass og rør med varmt vann og mildt vaskemiddel, og skyll grundig med avionisert vann. La det tørke.
  5. Åpne "microcontrollerRecords.csv" filen for å gjennomgå temperatur og LED matrix status i løpet av forsøket, til "Summary.csv" -filen gjennom oppsummeringsdata fra hvert sett av bilder og "Resultater <n> .csv" filer som skriver en anmeldelse data oppsummerer hver ROI fra hver tidsperiode, der n er n th datasettet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Dette apparat ble brukt til å stimulere en kultur av S. cerevisiae som uttrykker gul fluorescerende protein (YFP) som reaksjon på blått-lys via en induserbar optogenetic transkripsjonssystem basert på CRY2 / CIB1 protein par 30. Celler ble dyrket chemostatically i fosfat-begrenset materiale med en gjennomsnittlig fortynningshastighet på 0,2 ± 0,008. Fosfat begrensning er vanligvis brukes i S. cerevisiae kjemostat eksperimenter for å kontrollere vekst og virkningene av fosfat begrensning er godt karakterisert. 31, 32, 33 Avløp fra den kontinuerlig fortynnede dyrkning kar ble tatt prøver til en mikrofluid enhet i et invertert mikroskop. Bildene ble automatisk analysert som vist i figur 8. Individuelle celler ble identifisert i bakgrunnen korrigert fase kontrast og deres YFP konsensjon ble beregnet fra deres fluorescens målt fra bakgrunns-subtrahert fluorescerende bilder.

Fluorescens 169,677 celler ble analysert fra 33.600 bilder av avløpsvann ervervet fra 28 steder i microfluidic enheten over 70 timer med forsøket. Vi brukte et invertert mikroskop utstyrt med en fluorescens-belysning system og en CMOS kamera. YFP bildene ble kjøpt med en 500/20 nm eksitasjon filter, en 535/30 nm utslipp filter, og en T515lp dichroic. Bilder ble tatt med et kontrast objektiv 40X fase, med Kohler belysning. Bilder ble tatt opp i 16-bits fargedybde med 87 piksler per mikrometer kvadrat. Kulturen ble utsatt for varierende intensitet av blått lys etter 6 timers mellomrom, etterfulgt av fullstendig mørke i 6 timers intervaller. Kulturen hadde blitt eksponert for lys før den første måling, og det er derfor dens fluorescens intensitet avtar i løpet av den første mørkeperioden. </ P>

Figur 9 viser fluorescens på grunn av YFP produksjon ved aktivering av den optogenetic system som reaksjon på belysning av dyrkningsbeholderen. Det demonstrerer nytten av encellete målinger av fluorescens over en befolkning gjennomsnittlig encellede målinger avslører befolkningen fordeling av fluorescens intensitet. Merk uteliggeren på 42 h 26 min. Etter gjennomgang av tilsvarende bilder, var det tydelig at det var klumper av cellene i de fleste av bildene som brukes til å generere det sammensatte bildet av bakgrunnen, hvilket resulterer i gjenstander som lignet celler i bakgrunnskorrigert bilde. Dessuten ble en boble fra dyrkningsbeholderen pumpet til mikrofluidkanalen og deler av sine kanter har tatt feil som celler ved bildeanalyse algoritmen. Siden verken boblen eller gjenstander fra å trekke bakgrunnen tilsvarte selve cellene, deres målt fluorescens intensiteter lavere enn den auto-fluorescens av cellene. Denne figuren viser kvaliteten på data som kan automatisk samlet inn over tre d. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 8
Figur 8: visuell beskrivelse av bildeanalyse algoritme. Disse bildene er beskåret og utvidet for enkel visning. (A) Seks bilder anskaffet for å generere bakgrunnskorrigert fasekontrastrikt bilde av cellekulturen. Etter at hovedbildet er ervervet, er fem flere bilder ervervet med avløpet-prøvetakingspumpe kort slått på mellom hvert kjøp for å sikre at cellene er på flukt. Et sammensatt bilde av bakgrunnen blir generert fra de fem komponentbilder. Verdien av hvert bildeelementi bakgrunnsbildet er medianverdien av det samme pixel over 5 komponent bilder. (B) Den bakgrunnskorrigert bilde blir deretter omdannet til et binært. Den binære blir så utvidet og hullene i sammenhengende deler av binære er fylt. De gule skisserer svarer til utvalgte områder av interesse (ROI), basert på størrelse og sirkularitet kriterier. (C) De ROI er kartlagt på fluoriserende bilde, hvor fluorescens i hver celle måles som verdien av den lyseste piksel innenfor ROI. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 9
Figur 9: Populasjons fordeling av fluorescens intensitet over tid. I disse subfigures logaritmen av målt fluorescence vises, følger standard praksis i flowcytometri. Den linje i A og B indikerer intensiteten av lys som absorberes eller diffraktert av kulturen, som er målt som forskjellen i intensitet mellom lys som sendes gjennom sterile medier og lys som overføres gjennom cellekultur i dyrkningsbeholderen. Det er plottet mot den andre ordinataksen. (A) En boks og whisker plot (5 persentilen, 25 persentilen, median, 75 persentilen, 95 th persentil) av logaritmen av den målte fluorescens av befolkningen over tid. (B) En to-dimensjonal histogram av de samme data, hvor farge tilsvarer den normaliserte frekvensen av celler med en målt fluorescens i området av den tilsvarende skuff. Fargene ble skalert til omfanget av data uten uteliggeren på 42 h 26 min inkludert. Den normaliserte frekvensen av det avvikende i den laveste fluorescens hyllener 0,7. (C) En dimensjonale histogrammer av logaritmen til den målte fluorescensen av befolkningen før den første registrerte eksponering for lys og etter å ha størst eksponering for lys. Det viser at det lys-indusert ekspresjon av YFP i denne stamme er bimodal. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi laget denne apparat med tanke på fleksibilitet. All kode som brukes er gratis og åpen kildekode. Standard bildeanalyseprosessen å segmentere celler er enkel og går raskt. Custom analyse kan gjennomføres ved å registrere brukerundersøkelser mens analysere et representativt bilde med FIJI grafisk brukergrensesnitt, konvertere innspill til en beanshell script, og deretter sette plugin for å ringe manuset. Når det er kalt, vil dette skriptet bli sendt en String utvalg kalt "bilder" som inneholder filbaner til den nyeste sett av bakgrunnskorrigert bilder. Bilder og data lagres som de er samlet, slik at de ikke går tapt hvis et eksperiment slutter brått. En blå LED matrise ble valgt for å fremkalle vår optogenetic systemet, men det kan bli erstattet med lysdioder i forskjellige farger. Det er flere input og output pins tilgjengelig på mikrokontrolleren samt gjennom-hull for en ekstra MOSFET bryter og relé bryteren på kretskortet som gjør det enkeltfor at dette systemet skal være tilpasset for mer komplekse formål. For eksempel, for å gjøre dette apparatet fungere som en turbidostat, bruker de ekstra pins på microcontroller å drive en LED og lese verdier fra en lys-sensor festet til dyrking fartøy, og deretter endre programvaren til å måle turbiditet og fortynne fartøyet tilsvar .

Hensyn må tas for å sikre at kulturen ikke er forurenset, for å beskytte sensitiv mikroskopi utstyr, og for å sikre at strømnings priser er konsekvent. Forurensninger før når dyrkingen fartøyet er med hensikt å inokuleres kan påvises ved å vente noen dager før inokulering av fartøyet og bekrefte at det ikke er noen vekst på innsiden. For å unngå å søle cellekultur på mikroskopet mål, kontroller at microfluidic enheten ikke vil lekke ved først pumping cellekultur gjennom det over en absorberende klut. Hvis flyten av media i dyrking fartøyet er inkonsekvent, er det vanligvis fordi rør rundtrullene på den peristaltiske pumpen er blitt for løs. Hvis luftstrømmen fra akvariet pumpen er inkonsekvent, sørge for at det ikke er noen U-formet bend i avløpsvannet rør hvor væske kan basseng og inkonsekvent motstå luftstrømmen. Hvis slangen blir tett etter et eksperiment fordi media har tørket opp på innsiden av det, suge tilstoppede rør i et varmt vannbad for å løse opp tette.

Det er iboende begrensninger i denne protokollen for å vurdere når du planlegger et eksperiment eller analysere resultatene. Avhengig av fortynningshastigheten og lengden av rør som brukes, er det en forsinkelse på omtrent 10 minutter i løpet av hvilken cellekulturen blir pumpet fra dyrkingen fartøyet til mikroskopet. Derfor er det ikke godt egnet til å studere hendelser som inntreffer over kortere tidsrammer. Også, mens et eksperiment kan kjøre kontinuerlig i ca ti dager, bare begrenset av volumet av media, utviklingen av cellekulturen må anses som varigheten av forsøket øker. den Limiting nærings av media har dyptgripende virkninger på stoffskiftet og genekspresjon 35, 36, 37, 38, 39 og bør derfor fastsettes basert på aspekter av fysiologi under studien. Når du analyserer resultatene, bildene, særlig bildene fra avsidesliggende datapunkter-bør gjennomgås for feil i måten ROIs ble identifisert ved bildeanalyse rutine. Det er mulig for bobler eller gjenstander for å forveksles med celler, og dermed forvrenger den målte fluorescens. En enkel måte å eliminere slike feilmålinger er å forkaste alle ROIs med fluorescensstyrkene under auto-fluorescens intensitet.

Denne protokollen vil være nyttig for måling av fluorescens-intensitet og / eller cellulær morfologi av avløpsvann cellekultur som reaksjon på lys i organismer som kan vokse i kontinuerlig kultur, setttle til en konsekvent fokusplanet når den ikke er rørt, og automatisk bli identifisert av en bildeanalyse algoritme. Standard celle identifikasjon algoritme som brukes her vil være mest direkte relevant for omtrent sfæriske mikrober som ligner spirende gjær. Et alternativ 40 til denne protokollen er å dyrke mikroorganismer i et sett av satskulturer, og deretter prøve en batch for hvert tidspunkt og karakterisere prøven ved strømningscytometri. Imidlertid, fordelene ved den protokoll som er beskrevet her er at prøver blir tatt fra samme kultur, kan mange prøver tas, og prosessen er automatisert. Denne protokollen forbedrer også på en lignende metode der optogenetic gjær ble kontinuerlig dyrket og avbildes under et mikroskop 34 ved å kjøpe flere bilder raskt og ikke spenn ROIs identifisering av fluorescens. En stor fordel med denne protokollen er at mange målinger av individuelle celler kan regelmessig samlet inn over flere dager uten huut brukerundersøkelser. Etter måling av responsen av den mikrobielle kultur til lyseksponering, kan et neste trinn være å gjennomføre i silico lukket-sløyfe styring av responsen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noe å avsløre.

Acknowledgments

Vi ønsker å takke Molly Lazar og Veronica Delgado for å få hjelp i å teste protokollen, Kieran Sweeney for nyttige diskusjoner og redigering, og Taylor Scott, My An-adirekkun, og Stephanie Geller for kritisk lesing av manuskriptet. Megan Nicole McClean, Ph.D. har en karriere Award på Scientific Interface fra Burroughs Wellcome fondet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Extensive lab manual GitHub NA An extensive, regularly updated lab manual is available in the “Optogenetic Chemostat Files” GitHub repository (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files). This also includes a description of the microfluidic mold used to generate the representative results.
Fritzing Design Viewer Fritzing NA The free, open-sourced software to view and edit the .fzz type circuit board designs is available at "http://fritzing.org/download/"
Arduino Uno R3 (Atmega328 - assembled) Adafruit 50 Microcontroller. 1 required.
Arduino Stackable Header Kit SparkFun Electronics 10007 Female pin headers for connecting PCB to microcontroller. 1 required.
Adjustable 30W 110V soldering iron - XY-258 110V Adafruit 180 For making electrical connections to the PCB. 1 required.
Soldering iron stand Adafruit 150 For making electrical connections to the PCB. 1 required.
Mini Solder spool - 60/40 lead rosin-core solder 0.031" diameter - 100g Adafruit 145 For making electrical connections to the PCB. 1 required.
0.1 μF capacitor SparkFun Electronics COM-08375 Stabilizes voltage in PCB. 1 required.
10 μF capacitor SparkFun Electronics COM-00523 Stabilizes voltage in PCB. 1 required.
MAX7219CNG LED Matrix/Digit Display Driver - MAX7219 Maxim MAX7219CNG LED driver. 1 required.
8 pin IC Socket Mouser Electronics 575-144308 16 required. These will be stacked on top of each other to support the culture vessel above the LED matrix.
24 Pin IC socket Mouser Electronics 535-24-3518-10 Optional. Use this to reversibly attach the MAXIM 7219CNG driver to the PCB.
Digital multimeter Adafruit 2034 For troubleshooting electronics. 1 required.
Break Away Headers - 40-pin Male (Long Centered, PTH, 0.1") SparkFun Electronics PRT-12693 Male pin headers for connected LED matrix to printed circuit board. Ends can be trimmed with wire cutters. 1 set required. 
Flush diagonal wire cutters Adafruit 152 For trimming long pin headers and cutting power cables. 1 required.
Premium Female/Female Jumper Wires - 40 x 12" (300mm) Adafruit 793 Wire ribbon for connecting breadboard to LED matrix. Can be connected end-to-end with male pin-headers to be longer. 1 required.
Half-size breadboard Adafruit 64 The LED matrix will connect to this and the culturing vessel will rest above it.
Miniature 8x8 Blue LED Matrix Adafruit 956 Light source. Dominant wavelength is 470nm (blue). 1 required. Alternative miniature LED matrices from the same vendor are available with dominant wavelengths: 624 nm (red), 588 nm (yellow), 525 nm (green), 572 nm (yellow-green), and white.
Stackable header-3 pin SparkFun Electronics 13875 8 required.
Resistor Kit - 1/4W (500 total) SparkFun Electronics 10969 For electronics. 1 required.
 IRL520N MOSFET International Rectifier IRL520N Voltage regulating switch for controlling DC current. 4 required.
Hook-Up Wire - Assortment (Solid Core, 22 AWG) SparkFun Electronics PRT 11367 Wire for electronics. 1 required.
5V 2A (2000mA) switching power supply - UL Listed Adafruit 276 Power supply for the heating pad and Arduino. 2 required.
12 VDC 1000mA regulated switching power adapter - UL listed Adafruit 798 For peristaltic pumps. 2 required.
Electric Heating Pad - 10cm x 5cm Adafruit 1481 For heating the bioreactor. 1 required.
Low flow variable flow peristaltic pump Fisher Scientific 13-876-1 For pumping media. 1 required
Medium flow variable flow peristaltic pump Fisher Scientific 13-876-2 For pumping culture. 1 required.
9 VDC 1000mA regulated switching power adapter - UL listed Adafruit 63 For microcontroller power supply. Order 1.
High Temp Waterproof DS18B20 Digital temperature sensor + extras Adafruit 642 Thermometer for the bioreactor. 1 required.
Micromanager Micromanager NA The free, open-sourced microscope control software is available at "https://micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release"
FIJI ImageJ NA The free, open-sourced image analysis software is available at "http://fiji.sc/"
Arduino Integrated Development Environment Arduino NA The free, open-sourced IDE is available at "https://www.arduino.cc/en/Main/Software"
Custom code GitHub NA The custom microcontroller code and "Bioreactor Controller" plugin are available in the “Optogenetic Chemostat Files” GitHub repository (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files).
USB Cable A to B - 6 Foot SparkFun Electronics CAB-00512 Used to download data to microcontroller. 1 required.
bioreactorTimecourse_example.csv GitHub NA The advantage of loading LED matrix values from a CSV file is that a program can be called by the plugin to update those values based on image analysis results, and those values can be reloaded to the microcontroller, enabling feed-back control. It is available from the “Optogenetic Chemostat Files” GitHub repository (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files).
Tota-frost gels (diffusion paper) B&H B&H # LOFSFTL
MFR # T1-72		 For LED matrix. 1 required.
Kitting Sheet Crosslink 1/4x12x24in Grainger, inc 20JL37 Black foam for culturing vessel enclosure. 4 required.
Standard Photodiode Power Sensor, Si, 200 - 1100 nm, 50 mW  Thorlabs S120VC For measuring light intensity. 1 required.
Labelling Tape Fisher Scientific 159015N For labelling and securing loose components. 1 required.
Compact Power and Energy Meter Console, Digital 4" LCD Thorlabs PM100D For measuring light intensity. 1 required.
100mL GL45 hybridization glass bottle Bellco Glass, Inc. (7910-40150) Bioreactor vessel. 1 required.
Six port assembly Bellco Glass, Inc. Custom  For the bioreactor vessel. Tubing Specs: .125" OD x .055"ID. Port A: 1.0" long above cap slug and to bottom of tube. Ports B,C,E,F: 1.0" long above cap slug, 33 mm long below. Port D: 1.0" long above cap slug, 65 mm  long below. 1 required. Includes 45 mm diameter polypropylene open top screw cap and a white silicone gasket to ensure a tight seal between the cap and the vessel. 
Scotch Magic Tape 3105, 3/4 x 300 Inches, Pack of 3 Amazon B0009F3P3U Clear scotch tape. This is available from many other vendors. It is used to cover markings on the culturing vessel and to secure the coverglass with the PDMS channel to the aluminum support frame.
1/16" ID x 3/16" OD x 1/16" Wall Tygon Sanitary Silicone Tubing United States Plastic Corp. 57288 Tubing. ~25' required.
Cole-Parmer Twistit white rubber stopper, size 10 Cole-Parmer EW-62992-32 Media flask stopper and effluent flask stopper. 2 required.
2L Laboratory Flask Pyrex 4980 Media flask and effluent flask. 2 required.
Day pinchcock Fisher Scientific 5867 For pinching tubes shut. 3 required.
Replacement tubing assembly 1/16" ID Traceable Products 3372 The peristaltic pumps come with a set of tubes, but they wear out after weeks of use.
Replacement tubing assembly 1/50" ID Traceable Products 3371 The peristaltic pumps come with a set of tubes, but they wear out after weeks of use.
Male luer with lock ring x 1/16" hose barb, Nylon, 25/pk Cole-Parmer EW-45505-00 Connectors. ~10 luers are required.
Male luer with lock ring x 1/8" hose barb, Nylon, 25/pk Cole-Parmer EW-45505-04 Connectors. 5 required, one for each rubber stopper hole to fill with tubing.
Female luer x 1/16" hose barb adapter, Nylon, 25/pk Cole-Parmer EW-45502-00 Connectors. ~10 luers required.
Female luer x 3/16" hose barb adapter Cole-Parmer EW-45502-08 Connectors. ~10 luers required.
Cole-Parmer Luer Accessory, Female Luer Cap, Nylon, 25/Pk Cole-Parmer SC-45502-28
Cole-Parmer Luer Accessory, Male Luer Lock Plug, Nylon, 25/Pk Cole-Parmer EW-45505-56
Microbore PTFE Tubing, 0.022"ID x 0.042"OD, 100 ft/roll Cole-Parmer EW-06417-21 Tubing. 1 roll required.
Masterflex platinum-cured silicone tubing, L/S 13, 25 ft Cole-Parmer EW-96410-13 Tubing. ~25' required.
3/16" ID x 1/4" OD x 1/32" Wall Tygon Sanitary Silicone Tubing United States Plastic Corp. 57293 Tubing. ~1' required.
Vacuum filter Fisher Scientific 974107 Nalgene vacuum filter for sterile filtering media.
Aquel Oxy-Boost 200 Rena Aquatic Supply AP200 Dual diaphram adjustable flow air pump for aerating and mixing media. 1 required. 
0.2 μm pore syringe filter Corning International 431229 This ensures that air from the aquarium pump does not contaminate the apparatus. 1 required.
Slygard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning Slygard 184 For microfluidic device. 1 required.
American Safety Razor GEM Scientific Single-Edge Razor Blades Fisher Scientific 17989000 For cutting tubes and PDMS. 1 blade required.
Harris Uni-Core hole puncher 1.2mm ID Sigma-Aldrich WHAWB100028 ALDRICH For punching inlet/outlet in microfluidic device. 1 required.
Microscope cover glass 22x60-1.5 Fisher Scientific 12-544-G For microfluidic device. 1 required.
Rectangular aluminum frame with a square window Custom Custom To support the microfluidic channel. Outer dimensions: 3 inches x 1.25 inches.
Inner dimmensions (cut out portion): 7/8 inches x 7/8 inches
Thickness: ~1/32 inches

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Motta-Mena, L. B., Reade, A., et al. An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics. Nature chemical biology. 10 (3), 196-202 (2014).
  2. Hughes, R. M., Bolger, S., Tapadia, H., Tucker, C. L. Light-mediated control of DNA transcription in yeast. Methods. 58 (4), 385-391 (2012).
  3. Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. A light-switchable gene promoter system. Nature biotechnology. 20 (10), 1041-1044 (2002).
  4. Polstein, L. R., Gersbach, C. a Light-inducible spatiotemporal control of gene activation by customizable zinc finger transcription factors. J Am Chem Soc. 134 (40), 16480-16483 (2012).
  5. Polstein, L. R., Gersbach, C. a A light-inducible CRISPR-Cas9 system for control of endogenous gene activation. Nature Chemical Biology. 11 (3), 198-200 (2015).
  6. Yang, X., Jost, A. P. T., Weiner, O. D., Tang, C. A light-inducible organelle-targeting system for dynamically activating and inactivating signaling in budding yeast. Molecular biology of the cell. 24 (15), 2419-2430 (2013).
  7. Lee, S., Park, H., et al. Reversible protein inactivation by optogenetic trapping in cells. Nature methods. 11 (6), 633-636 (2014).
  8. Kennedy, M. J., Hughes, R. M., Peteya, L. A., Schwartz, J. W., Ehlers, M. D., Tucker, C. L. Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells. Nature Methods. 7 (12), 973-975 (2010).
  9. Yazawa, M., Sadaghiani, A. M., Hsueh, B., Dolmetsch, R. E. Induction of protein-protein interactions in live cells using light. Nat Biotechnol. 27 (10), 941-945 (2009).
  10. Zoltowski, B. D., Motta-Mena, L. B., Gardner, K. H. Blue light-induced dimerization of a bacterial LOV-HTH DNA-binding protein. Biochemistry. 52 (38), 6653-6661 (2013).
  11. Renicke, C., Schuster, D., Usherenko, S., Essen, L. O., Taxis, C. A LOV2 Domain-Based Optogenetic Tool to Control Protein Degradation and Cellular Function. Chemistry & Biology. 20 (4), 619-626 (2013).
  12. Novick, A., Szilard, L. Description of the chemostat. Science (New York, N.Y.). 112 (2920), 715-716 (1950).
  13. Monod, J. La technique de culture continue. Théorie et applications. Ann. Inst. Pasteur. 79 (4), 390-410 (1950).
  14. Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. A light-switchable gene promoter system. Nature Biotechnology. 20, 1041-1044 (2002).
  15. Kennedy, M. J., Hughes, R. M., Peteya, L. A., Schwartz, J. W., Ehlers, M. D., Tucker, C. L. Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells. Nature Methods. 7, 973-975 (2010).
  16. Olson, E. J., Tabor, J. J. Optogenetic characterization methods overcome key challenges in synthetic and systems biology. Nature chemical biology. 10 (7), 502-511 (2014).
  17. Botstein, D., Fink, G. R. Yeast: An experimental organism for 21st century biology. Genetics. 189 (3), 695-704 (2011).
  18. Galanie, S., Smolke, C. D. Optimization of yeast-based production of medicinal protoberberine alkaloids. Microbial cell factories. 14 (1), 144 (2015).
  19. Gerngross, T. U. Advances in the production of human therapeutic proteins in yeasts and filamentous fungi. Nature biotechnology. 22 (11), 1409-1414 (2004).
  20. van Maris, A. J. A., Abbott, D. A., et al. Alcoholic fermentation of carbon sources in biomass hydrolysates by Saccharomyces cerevisiae: current status. Antonie van Leeuwenhoek. 90 (4), 391-418 (2006).
  21. Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. Computer control of microscopes using µManager. Curr Protoc Mol Biol. , Chapter 14 (2010).
  22. Edelstein, A. D., Tsuchida, M. A., Amodaj, N., Pinkard, H., Vale, R. D., Stuurman, N. Advanced methods of microscope control using µManager software. Journal of biological methods. 1 (2), (2014).
  23. Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  24. Bhattacharya, S., Datta, A., Berg, J. M., Gangopadhyay, S. Studies on surface wettability of poly(dimethyl) siloxane (PDMS) and glass under oxygen-plasma treatment and correlation with bond strength. Journal of Microelectromechanical Systems. 14 (3), 590-597 (2005).
  25. Saldanha, A. J., Brauer, M. J., Botstein, D. Nutritional homeostasis in batch and steady-state culture of yeast. Molecular Biology of the Cell. 15, 4089-4104 (2004).
  26. Boer, V. M., Tai, S. L., et al. Transcriptional responses of Saccharomyces cerevisaie to preferred and nonpreferred nitrogen sources in glucose-limited chemostat cultures. FEMS Yeast Research. 7, 604-620 (2007).
  27. Boer, V. M., Amini, S., Botstein, D. Influence of genotype and nutrition on survival and metabolism of starving yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 6930-6935 (2008).
  28. Brauer, M. J., Huttenhower, C., et al. Coordination of growth rate, cell cycle, stress response and metabolic activity in yeast. Molecular Biology of the Cell. 19, 352-367 (2008).
  29. Gresham, D., Dunham, M. J. The enduring utility of continuous culturing in experimental evolution. Genomics. 104 (6), 399-405 (2014).
  30. Liu, H., Yu, X., et al. Photoexcited CRY2 interacts with CIB1 to regulate transcription and floral initiation in Arabidopsis. Science (New York, N.Y.). 322 (5907), 1535-1539 (2008).
  31. McIsaac, R. S., Oakes, B. L., Wang, X., Dummit, K. A., Botstein, D., Noyes, M. B. Synthetic gene expression perturbation systems with rapid, tunable, single-gene specificity in yeast. Nucleic Acids Research. 41 (4), 1-10 (2013).
  32. McIsaac, R. S., Petti, A. A., Bussemaker, H. J., Botstein, D. Perturbation-based analysis and modeling of combinatorial regulation in the yeast sulfur assimilation pathway. Molecular biology of the cell. 23 (15), 2993-3007 (2012).
  33. McIsaac, R. S., Silverman, S. J., et al. Fast-acting and nearly gratuitous induction of gene expression and protein depletion in Saccharomyces cerevisiae. Molecular biology of the cell. 22 (22), 4447-4459 (2011).
  34. Melendez, J., Patel, M., Oakes, B. L., Xu, P., Morton, P., McClean, M. N. Real-time optogenetic control of intracellular protein concentration in microbial cell cultures. Integrative biology quantitative biosciences from nano to macro. 6 (3), 366-372 (2014).
  35. Brauer, M. J., Huttenhower, C., et al. Coordination of growth rate, cell cycle, stress response, and metabolic activity in yeast. Molecular biology of the cell. 19 (1), 352-367 (2008).
  36. Boer, V. M., Crutchfield, C. A., Bradley, P. H., Botstein, D., Rabinowitz, J. D. Growth-limiting intracellular metabolites in yeast growing under diverse nutrient limitations. Molecular biology of the cell. 21 (1), 198-211 (2010).
  37. Markham, B. E., Byrne, W. J., Methods, E. Uptake, storage and utilization of phosphate by yeast. Journal of the Institute of Brewing. 73, 271-273 (1967).
  38. Kazemi Seresht, A., Palmqvist, E. A., Olsson, L. The impact of phosphate scarcity on pharmaceutical protein production in S. cerevisiae: linking transcriptomic insights to phenotypic responses. Microbial cell factories. 10 (1), 104 (2011).
  39. Shimizu, K. Regulation Systems of Bacteria such as Escherichia coli in Response to Nutrient Limitation and Environmental Stresses. Metabolites. 4 (1), 1-35 (2013).
  40. Olson, E. J., Hartsough, L. A., Landry, B. P., Shroff, R., Tabor, J. J. Characterizing bacterial gene circuit dynamics with optically programmed gene expression signals. Nature methods. 11 (4), 449-455 (2014).

Tags

Bioteknologi Optogenetics mikrobiologi syntetisk biologi kjemostat, Spirende gjær kontroll systemidentifikasjon protein uttrykk
Design og implementering av en automatisert Illuminating, dyrking, og Sampling System for Microbial optogenetic Applications
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stewart, C. J., McClean, M. N.… More

Stewart, C. J., McClean, M. N. Design and Implementation of an Automated Illuminating, Culturing, and Sampling System for Microbial Optogenetic Applications. J. Vis. Exp. (120), e54894, doi:10.3791/54894 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter