Summary
Concebemos um aparelho de cultura contínua para uso com sistemas de optogenetic para iluminar culturas de micróbios e regularmente células de imagem no efluente com um microscópio invertido. A cultura, a amostragem, de imagem e análise de imagem são totalmente automatizados para que as respostas dinâmicas a iluminação pode ser medida ao longo de vários dias.
Abstract
sistemas optogenética utilizar proteínas geneticamente codificados que mudam de conformação em resposta a determinados comprimentos de onda de luz para alterar os processos celulares. Existe uma necessidade para a cultura e os sistemas de medida que incorporam programados iluminação e estimulação dos sistemas optogenetic. Apresenta-se um protocolo para a construção e utilização de um aparelho de cultura contínua para iluminar as células microbianas com doses programadas de luz, e automaticamente aquisição e análise de imagens de células no efluente. A operação deste aparelho como um quimiostato permite que a taxa de crescimento e o ambiente celular a ser rigorosamente controlado. O efluente da cultura de células contínua é regularmente amostrado e as células são fotografadas por microscopia multi-canal. A cultura, a amostragem, de imagem e análise de imagem são totalmente automatizados de modo que as respostas dinâmicas na intensidade de fluorescência celular e morfologia das células da amostra do efluente de cultura são medidos ao longo de vários diassem entrada do usuário. Nós demonstrar a utilidade do aparelho de cultura de indução dinamicamente a produção de proteína numa estirpe de Saccharomyces cerevisiae com um sistema de engenharia optogenetic que activa a transcrição.
Introduction
Optogenetic sistemas utilizam a luz para controlar uma lista cada vez maior de processos celulares, incluindo a expressão do gene, 1, 2, 3, 4, 5 localização de proteínas, actividade de proteína de 6, 6, 7, 8, proteína de ligação, 8, 9, 10 e a degradação da proteína. 11 Um método para a cultura de células em um ambiente controlado com estimulação óptico programado e para medir a sua resposta em escalas de tempo biologicamente relevantes é necessário explorar o potencial dessas ferramentas para a investigação em biologia celular e biotecnologia. O nosso método aproveita chemostasis para manter uma taxa de crescimento constante de célula em um bem misturado, AEclassificado, e vaso de cultura de vidro com temperatura controlada 12, 13 que está exposta a iluminação programada. Nós imagem células individuais na cultura efluente com um microscópio invertido para medir a resposta da cultura de iluminação programado. A cultura, a amostragem, de imagem e análise de imagem são totalmente automatizada de modo que a intensidade da fluorescência e morfologia celular da cultura de células do efluente pode ser medido ao longo de vários dias, sem intervenção do utilizador.
Este protocolo pode ser implementada na maioria dos laboratórios familiarizados com a cultura celular em crescimento e microscopia, e o aparelho utilizado é barato e feito de componentes prontamente disponíveis. Um vaso de cultura transparente é colocada acima de uma matriz de diodos emissores de luz (LEDs), capazes de emitir um mW / cm 2 -10 mW / cm2 de luz. Os micróbios são cultivados em vaso de cultura continuamente; uma bomba peristáltica é utilizada para adicionar mídia aotaxa de diluição, uma outra é utilizada para retirar a cultura a uma velocidade menor ao microscópio, e a diferença escapa através de um orifício de descarga. A almofada de aquecimento mantém a temperatura. O ar é continuamente bombeada para dentro do vaso de cultura para manter uma pressão positiva, bem como para misturar e arejar a cultura. Excepto para a bomba de ar, a potência para esses dispositivos é regulada por um microcontrolador que também recebe a entrada a partir de um termómetro e de um computador de secretária ligado. A cultura de células efluente é bombeado para um dispositivo de microfluidos com a fase de um microscópio invertido. Não fluorescente e imagens fluorescentes são adquiridos automaticamente. As células nas imagens são caracterizados por um algoritmo que localiza cada célula como uma região de interesse (ROI) e mede as propriedades de cada ROI.
Para demonstrar uma aplicação deste protocolo, medimos a resposta a diferentes intensidades de luz de células de Saccharomyces cerevisiae por engenharia com uma responsa de luz azulve optogenetic sistema que controla a transcrição de proteína fluorescente. S. cerevisiae, comumente conhecido como fermento de padeiro, foi selecionado porque vários sistemas optogenética para controlar a expressão de genes neste sistema já existem 14, 15, 16. Além disso, este organismo modelo é comumente usado para estudos em biologia de sistemas 17 e como um chassis para aplicações biotecnológicas 18, 19, 20. Os resultados representativos demonstram que este protocolo pode ser utilizado para controlar a transcrição de uma cultura durante vários dias, variando as intensidades de luz de entrada e medir a produção de um repórter fluorescente.
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Protocol
Figura 1: O aparelho de cultura contínua. Este diagrama simplificado mostra como o aparelho deve ser montado quando ele é usado para a cultura, iluminar, e medir as propriedades ópticas dos micróbios. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Visão geral do protocolo. Os passos na região sombreada tem de ser repetido cada vez que o protocolo é utilizado. Controle de circuito fechado é possível 34, mas não é implementado neste protocolo.
1. Monte o termômetro para a placa de circuito
Figura 3: Conexões para ler os valores termômetro. Este diagrama mostra como o termómetro digital deve ser ligado à placa de circuito impresso de modo a que o microcontrolador pode obter feedback para controlar a temperatura da cultura. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Soldar o chão, Dados e linhas de tensão positiva do termómetro digital para seus respectivos furos de passagem marcada "GD + V".
- Cortaria um pino de uma cabeça de 3 pinos fêmea e aparar os restantes 2 pinos com cortadores de fio, de modo que pode encaixar nos dois furos de passagem rotulados como "R2" e não obstruir o microcontrolador. Soldar este no lugar. Ligue os dois pinos soldados, inserindo um kW resistor 4.7 no cabeçalho pin.
2. Ligue o Con PoderComponentes trolo à placa de circuito
Figura 4: Conexões para controlar o poder para a almofada de aquecimento. Este diagrama mostra como as partes de PCB e acessório deve ser montada a fim de controlar a potência para a almofada de aquecimento. As peças para controlar as bombas peristálticas são ligados de uma maneira semelhante. Note-se que os componentes para o termómetro foram removidos para maior clareza. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Aparar 1 cm dos pinos de cinco cabeçalhos de 3 pinos do sexo feminino. Solda-los para as posições na placa de circuito impresso (PCB) marcado como "# 1", "# 2", "# 3", "# 4", e "CB E."
- Aparar 1 cm com os pinos de uma fêmea cabeçalho 6 pinos e 8 pinos. Soldar estes lado a lado paraa coluna de furos de passagem marcado K1 a K14.
- Ligue a almofada de aquecimento para a placa de circuito.
- Inserir as extremidades de uma resistência de 100 kQ no K1 orifícios rotulados e K2 no PCB. Inserir um transistor de metal-óxido-semicondutor de efeito de campo (MOSFET) em posição marcada # 1 no PCB, com o rótulo do MOSFET virada para o K1 a K14 furos de passagem de modo a que o pino de fonte está mais próximo da "# "etiqueta, e o pino de drenagem está mais afastada da" etiqueta # ".
- Cortar o fio terra do cabo de 5 V de corrente contínua (DC) fonte de alimentação e conecte-o a J2. Ligue a linha de base da almofada de aquecimento para J1. Ligue K3 ao pino 3 com um kW resistor 1. Atual deve agora só fluir de J1 para J2 quando o pino 3 está definido para + 5V.z
NOTA: O conjunto de funções resistor / MOSFET como um interruptor que permite que a corrente flua do pino J1 a J2 quando o pino 3 do microcontrolador está definido para +5 V.
- Conectara bomba peristáltica lenta.
- Inserir as extremidades de uma resistência de 100 kQ no K4 orifícios marcados e K5 no PCB. Inserir um MOSFET na posição marcada # 2 no PCB, com o rótulo do MOSFET virada para o K1 a K14 furos de passagem de modo a que o pino de fonte está mais próximo da etiqueta "#", e o pino de drenagem está mais afastada da "#" rótulo.
- Cortar a linha de terra do DC cabo de alimentação de 12 V da bomba peristáltica lento. Ligue a bomba peristáltica frente para a extremidade de J3 e as verrugas parede em frente fim a J4. Ligue K6 ao pino 4 com uma kW resistor 1. Atual deve agora só fluir a partir J3 para J4 quando o pino 4 está definido para +5 V.
- Ligue a bomba peristáltica rápido
- Inserir as extremidades de uma resistência de 100 kQ na K7 orifícios marcados e K9 no PCB. Inserir um MOSFET na posição marcada # 3 na placa de circuito impresso, com o rótulo do MOSFET virada para o K1 a K14 furos de passagem s O que o pino de fonte está mais próximo da etiqueta "#", e o pino de drenagem está mais afastada da etiqueta "#".
- Cortar a linha de terra do DC cabo de alimentação de 12 V da bomba peristáltica rápido. Ligue a bomba peristáltica frente para a extremidade para J5 e as verrugas parede em frente fim a J6. Ligue K9 ao pino 5 com um kW resistor 1. Atual deve agora só fluir a partir J5 para J6 quando o pino 5 está definida para +5 V.
3. Conecte o Matrix LED à placa de circuito
Figura 5: As ligações para controlar a matriz de LED. Este diagrama mostra a forma como a matriz de LED deve ser ligada ao PCB. Ela também mostra que a PCB pode ser empilhado sobre o microcontrolador. Note-se que os componentes para o termómetro e para controlar a potência DC para outros dispositivos têm sido removidos para maior clareza.es / ftp_upload / 54894 / 54894fig5large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Soldar a 6 pinos, de 10 pinos, e os dois conectores de pino fêmea 8 pinos nos orifícios através-nos lados da placa de circuito impresso de tal modo que podem ser empilhados em cima do microcontrolador.
- Soldar o 100 nF e 10 capacitores uF às suas posições marcadas no PCB, observando que o terminal negativo da 10 uF capacitor (lead mais curto) deve ser ligado ao orifício de passagem marcada com um sinal negativo.
- Soldar o condutor de LED para a 2 por 12 conjunto de furos de passagem, com o recuo do condutor longe dos orifícios de passagem reservados para a matriz de LED.
- Soldar 2 colunas de pin headers do sexo masculino para os furos de passagem marcada para a matriz de LED, e aparar as extremidades destes debaixo da placa de ensaio de tal modo que eles não vão obstruir o microcontrolador. Conectá-los a duas tiras de 8 fios de fios jumper Mulher / Mulher. Conectar-se um segundo conjunto de machopin headers para a outra extremidade dos fios jumper.
- Insira a matriz de LED ao longo da mediana da placa de ensaio e, em seguida, insira o segundo conjunto de pin headers para as colunas em ambos os lados da matriz. Certifique-se de que as ligações eléctricas são as mesmas que se a matriz de LED tinha sido ligado directamente à placa de circuito impresso com o lado da etiqueta da matriz correspondente à coluna rotulada de furos de passagem.
- Cortaria um pino de uma cabeça de 3 pinos fêmea e aparar os restantes 2 pinos com cortadores de fio, de modo que pode encaixar nos dois furos de passagem rotulados "R1" e não obstruir o microcontrolador. Soldar isso. Ligar os dois pinos soldadas através da inserção de uma resistência de 1 kQ no cabeçalho pino.
Nota: O vaso de cultura serão empilhadas sobre a matriz de LED. Se as fitas de arame obstruir o vaso, compensá-los a partir da matriz. Em seguida, use fio de núcleo sólido para fazer a ponte entre os pinos de matriz e os pinos de fita de arame, de tal forma que as ligações eléctricas não change.
4. Instale Software e Conectar-se a Hardware
- Empilhar o PCB no microcontrolador.
- Siga os links na lista de materiais para baixar o Ambiente de Desenvolvimento Integrado (IDE) e código personalizado para o microcontrolador.
- Ligue o microcontrolador para o computador microscópio através de um cabo AB universal serial bus (USB). Compilar e carregar o código personalizado para o microcontrolador.
- Baixar Micro-Manager 21, 22 e 23 de FIJI. Configurar Micro-Manager como um plugin FIJI, copiando todos os arquivos ".dll", o "mmplugins" diretório eo diretório "mmautofocus" a partir do diretório onde Micro-Manager foi baixado para o diretório "Fiji.app". Além disso, copiar os "plugins / Micro-Manager" do diretório para o diretório "Fiji.app/plugins".
- Baixe o "BioreactorController.jar" int arquivoo diretório "Fiji.app/mmplugins".
- Abrir Micro-Manager de Fiji> Plugins> Micro-Manager> Micro-Manager Studio. Use o Assistente de Configuração de hardware para configurar o software para controlar o microscópio. Incluir o dispositivo "FreeSerialPort" no Assistente com a etiqueta da porta à qual está ligado o cabo USB AB.
5. Faça e caracterizar o cerco à prova de luz para o vaso de cultura
- Stack três tomadas IC 8 pinos como blocos de construção na placa de ensaio em cada um dos cantos da matriz de LED de tal modo que o vaso de cultura pode descansar em cima delas acima da matriz.
- Fixar uma porção de papel de difusão sob a camada superior das tomadas, de tal modo que a luz que atinge o vaso de cultura a partir da matriz de LED é difusa.
- Cortar três 8 "por 6" porções de espuma preta. Cortar uma porção que é do mesmo tamanho que a placa de ensaio electrónico (2,3 "x 3,5") a partir do interior da primeira TWO e uma porção que é o tamanho do rectângulo feito pelas tomadas de IC (0,9 "x 1,8") a partir do interior do terceiro. Empilhar essas camadas ao longo da matriz de LED de tal modo que a camada final contendo o "x 1,8" 0,9 abertura encontra-se, mesmo com a parte superior das tomadas IC, e rodeia a matriz de LED.
- Cortar uma folha adicional de espuma preta ao meio para fazer um rectângulo 6 "por 24". Este rolo em uma coluna oca de espuma preta que o vaso de cultura pode encaixar-se com o espaço para os tubos e fios, de tal modo que ele irá termicamente e opticamente isolar o vaso de cultura.
- Centralizar a coluna oca de espuma preta sobre a matriz de LED, e marcar o limite da coluna sobre a camada de espuma preta por baixo. Este limite vai marcar o local onde deve ser centrado no futuro.
- Corte um 3 "x 3" porção de espuma preta. Utilizar esta depois como uma tampa que pode ser gravada para o topo da coluna para bloquear a luz externa.
- Fixe o sensor de potência fotodiodo para th e cultura tampa do vaso com fita, coloque a tampa e coloque o vaso de cultura no recinto.
- Em Micro-Manager, vá para Plugins> biorreator Controller. Definir a matriz para iluminar a um subconjunto da gama de intensidades possíveis em intervalos de 30 s.
- Grave as intensidades de luz, como exibido no console do medidor de energia conectado ao sensor de potência. Estas medições irão permitir que a intensidade real da luz a ser conhecidos quando o número de LEDs que são iluminadas e o (PWM) de corrente de largura de pulso modulado aos LEDs é definido.
6. Prepare o vaso de cultura
Figura 6: Conexões do navio. Este diagrama mostra a forma como o recipiente e o tubo do aparelho deve ser ligado antes de ser autoclavado.blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Marque a altura correspondente a cada incremento de 2 ml de líquido na gama de 10 a 30 ml no vaso de cultura. Insira 10 mL de água deionizada estéril, marque o nível de água, adicione 2 mL, marque o nível da água, e repetir até que o nível de 30 mL é marcado. Cobrir as marcações com fita adesiva transparente para que eles não são facilmente removidos, e descartar o líquido.
- Coloque a ponta mais longa da porta de alumínio através da junta de silicone, para o vaso de cultura. Enrosque a tampa.
- Cobrir uma porta de saída curta de alumínio com tubos de silício ID 1/16 ". Ligue a extremidade distai através da inserção de um luer lock fêmea e, em seguida, ligar uma ficha de bloqueio Luer macho. Esta saída é complementar, e não vai ser usado (tubo 6 na Figura 6 ).
- Conectar dois segmentos curtos de 1/16 "tubo de silicone ID com fechaduras luer masculino e feminino. Conecte uma extremidade a uma tomada de porta curta alumínio e ligue o distal final com um luer macho e fêmea luer tampão de bloqueio. O navio irá ser inoculado através do tubo (tubo 7 / 7.1 na Figura 6).
- Conectar dois 1/16 "tubos de identificação para as extremidades do 1/16" tubulação peristáltica ID e conectores. Ligue uma extremidade a uma porta de alumínio curto e ligue a outra (tubo 4 na Figura 6). Mais tarde, este será ligado ao balão de meios de comunicação.
7. Prepare a garrafa de mídia
- Conectar um "tubo de diâmetro interno (ID) de silicone para a porta de alumínio mais longa. O tubo deve ser suficientemente longo para atingir o balão de meios. Conectar um 1/8" 1/16 luer lock macho ID para um segmento curto de 1/16 " tubulação de ID, ligue este ao tubo anterior ,, e, em seguida, inserir este pequeno segmento na tampa de borracha no frasco de mídia (tubo 3 na Figura 6).
- Prender o tubo. Esta ligação permite ao ar fluir a partir do balão de meios de comunicação para o vaso de cultura. Quando o frasco de meios é depois bombeada com um ard Este tubo é desapertada, a cultura vai ser misturado, gaseificado, e mantido a uma pressão positiva por as bolhas de entrada.
- Insira um "tubo de ID tempo suficiente para chegar ao fundo do frasco na rolha, através do qual a mídia será transferido. Ligue outro 1/16" 1/16 tubo de ID para este, e, em seguida, um tubo de 3/16 "ID para que. Ligue este com um "ID fêmea de bloqueio Luer 16/03 e de um tampão de bloqueio Luer macho (tubo 1 / 1.1 na Figura 6).
- O terceiro orifício da rolha deve ser preenchido com um segmento curto de 1/16 "ID tubagem, ligado a dois outros segmentos de tubagem de diâmetro médio e ligado na extremidade distal (tubo 2 / 2.1 na Figura 6). Este pode ser conectado a uma bomba de vácuo e depois de uma bomba de aquário.
NOTA: Se o tubo não pode facilmente ajustar através dos furos na rolha de borracha, cortar as extremidades da tubagem a uma inclinação. Em seguida, a extremidade inclinada que é empurrado através do orifício pode ser utilizado para puxar o resto através.
- Inserir um bloqueio luer macho em um segmento de 1/16 "tubo de silicone ID, e em seguida, insira firmemente 0,022" tubulação ID de politetrafluoretileno (PTFE). Separadamente, anexar um luer lock fêmea para um 1/16 "ID do tubo. Em seguida, um segmento de extremidade ao longo do tubo de PTFE para conectar os bloqueios e o outro a uma porta de alumínio curto (tubo 5 na Figura 6).
- Ligue o "tubo de ID de silicone para a 1/50" 1/50 exposta tubo peristáltico ID e conectores. Para isso, conecte três segmentos de 1/50 "tubulação ID e dois segmentos de 0,022" tubulação ID PTFE, alternando-as. Ligar esta ao frasco de efluente através de 1/16 "ID tubo (tubo 5 na Figura 6).
- Conectar uma extremidade de um tubo de 1/16 "ID de silicone para o segundo tubo mais longo do porto de alumínio e a outra extremidade ao balão de efluente. Este tubo de alumínio define o volume da cultura, e o excesso de cultura transborda para dentro do recipiente de efluentes (tubo de 8 em
- Autoclave a montagem de cultura a 121 ° C e 15 psi (esterilização geral) durante 30 min.
Nota: Os tubos através do qual o balão mídia está cheio, através da qual o balão de meio é aspirado, e através do qual o vaso de cultura é inoculado ter vários segmentos de tubo de modo que, se o segmento distai é contaminada, pode ser removida para revelar um estéril segmento. - Autoclave a montagem de cultura a 121 ° C e 15 psi (esterilização geral) durante 30 min.
9. Prepare o canal microfluídicos
- Mistura de polidimetilsiloxano (PDMS) e agente de cura numa proporção de 9: 1. Degas e despeje sobre o molde mestre de silício.
- Curar o PDMS durante 2 h a 65 ° C e, em seguida, cortá-la a partir da máscara com uma lâmina de barbear. Corte em torno do PDMS até liberar a partir do molde. Evite empurrar para baixo e quebrar o wafer frágil.
- Use um 1,2 mm de diâmetro furador biópsia para fazer furos em ambas as extremidades do canal.
- Vínculo Plasma PDMS para a tampa de vidro 24.
- Tape o tempo extremidades do vidro de cobertura à armação de alumínio de suporte de tal modo que o canal de PDMS é centrada sobre a moldura de alumínio, e depois cozer o PDMS novamente durante 2 h a 65 ° C.
10. Preencha a mídia Flask
Figura 7: Adicionando mídia. Este diagrama mostra como a mídia deve ser filtrada a vácuo para o balão de mídia. Ele garante que a mídia continua a ser estéril. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Faça mídia apropriada. Se o sistema de cultura contínua será operado como um quemostato, usar meios limitados para um nutriente específico.
NOTA: Exemplos de composição de mídia padrão para estudos com S. cerevisiae foram previamente publicados 25,= "xref"> 26, 27, 28, 29. - Fixe o filtro de vácuo para um frasco de 100 ml, retire a tampa do bocal, em seguida, retire a ficha branca do mamilo do filtro de vácuo com pinças estéreis.
- Ligue o tubo de silicone 3/16 "ID ao mamilo, outro tubo livre do balão de mídia a uma bomba de vácuo (tubos 1 e 2 na Figura 7, respectivamente), e garantir que o tubo que liga o balão mídia para o vaso de cultura é preso fechar (tubo 3 na Figura 7).
- Encha o filtro com a mídia, ligar a bomba de vácuo, e depois filtrar o resto da mídia. Prender a tubagem de silicone de 1/16 "ID ligado ao vácuo (tubo 2 na Figura 7) e desligar a bomba de vácuo.
- Remover os leurs do segmento intermédio de 1/16 "ID tubo ligado à bomba de vácuo de modo que uma extremidade não contaminada do tubo é acessível. Inserir the extremidade azul de um filtro de ar seringa estéril para este tubo.
- Prender o tubo 3/16 "ID de silicone (tubo 1 na Figura 7) e desligue o luer macho da mesma. Desligue a ficha do luer feminino do tubo de entrada de mídia do vaso de cultura. Ligue estas luers masculinos e femininos para habilitar mídia a ser bombeada para o vaso de cultura.
- Retire o filtro de vácuo e tampar a garrafa mL de meios de comunicação que foi anexado ao filtro de vácuo 100.
- Um dia antes do vaso de cultura serão inoculados, inocular uma única colónia do micróbio optogenetic num tubo de ensaio com 4 mL de os meios recolhidos na etapa anterior, e deixar crescer durante a noite a 30 ° C ou à temperatura óptima de crescimento a temperatura da cultura com agitação.
11. Montar o aparelho de Around the Microscope
- Definir o conjunto de cultura contínua perto do microscópio com a mídia garrafa maior que o vaso de cultura ea effluent balão inferior ao vaso de cultura, de modo a que o tubo composto por segmentos de 0,022 "ID tubagem de PTFE (tubo 5 na Figura 6) pode atingir a fase de microscópio. segurança fita para baixo as rolhas de borracha do frasco e meios recipiente efluente.
- Desligue as extremidades do "tubo de PTFE ID a partir do 1/50" ID de silicone 0,022 tubo conectando-(tubo 5 na Figura 6), e ligar estas extremidades para a entrada e a saída do dispositivo de microfluidos.
- Ligar a extremidade branca do filtro de ar de uma seringa à bomba de aquário. A pressão do ar vai empurrar mídia no vaso de cultura.
- Quando o suporte alcança o nível da porta de efluente, enrolar o tubo de "meios de entrada de ID e os conectores em torno da bomba peristáltica lenta (tubo 4 na Figura 6) e o 1/50" 1/16 tubagem de saída de ID da amostra e os conectores em torno do rápido bomba peristáltica (tubo 5 na Figura 6).
- Arejar a mídia por desclampeamento o ar tusituar-se entre o balão e meios vaso de cultura.
- Tape a almofada de aquecimento e um termómetro para o vaso de cultura de modo a que a sua temperatura pode ser controlada. Enrole a tubagem meios em torno do vaso de cultura de modo que os meios de comunicação que entram estará à mesma temperatura que o navio.
NOTA: A corrente de PWM para a almofada de aquecimento é regulada pelo microcontrolador que utiliza entradas do termómetro para manter o vaso de cultura a sua temperatura nominal. - Insira o vaso de cultura para dentro do gabinete espuma preta sobre a matriz de LED, e garantir que os tubos não fiquem presos.
- Em Micro-Manager, vá para Plugins> biorreator Controller. Defina o "rácio de mídia bomba em" campo para 0,1 e a "razão de bomba da amostra em" campo a 0. A taxa de fluxo será muito baixo, mas maior do que a taxa de evaporação.
- Prenda o tubo de ar de entrada entre o frasco de mídia e vaso de cultura. Remova o plugue do tubo de inoculação (tubo 7 na Figura
- Cubra o gabinete de modo que nenhuma luz entra, e deixe a cultura crescer durante a noite.
12. Calibrar o bombeamento Rates
- Em Micro-Manager, vá para Plugins> biorreator Controller. Defina o "rácio de mídia bomba em" campo para 0,5 e a "razão de bomba da amostra em" campo para 0.
- Desligue o tubo de descarga a partir do balão de efluente (tubo 8 na Figura 6) e o tubo de amostragem a partir do balão de efluente (tubo 8 na Figura 6) e recolher o efluente em vasos separados. Recolha de efluentes, durante 1 hora, começando depois das bombas de ter sido por 15 min.
- Calcula-se a taxa de fluxo dos meios de comunicação para o vaso de cultura a partir do volume recolhido no recipiente como:
- Ajuste o valor da "relação de compressão de mídia em" campo por esta estimativa linear:
Onde
- Iterar através deste procedimento de calibração até que a diferença entre a taxa de fluxo desejada e o caudal medido for <0,2 ml / h, em que a taxa de fluxo é feita a média durante um período de 1 h.
- O aumento do valor do "relação de amostra no" campo e calibrar de um modo semelhante, até cerca de 4/5 do volume th deixar o vaso de cultura é bombeado para fora pela bomba de amostragem e cerca de 1/5 do volume está saindo através a porta de transbordamento.
- Deixe que a densidade da cultura no aparelho de cultura contínua equilibrar durante a noite sob estas condições.
NOTA: Se as taxas de fluxo de destino não pode ser alcançado, a mudançaa tubulação da bomba peristáltica. O líquido é bombeado a uma taxa mais elevada quando tubos de maior diâmetro é usado. Siga o passo 14 e, em seguida, retornar para a etapa 8.4. - Ajuste o valor da "relação de compressão de mídia em" campo por esta estimativa linear:
13. Recolher Microscópio Imagens de micróbios cultivados
- Encha a Lista Posição Stage em Micro-Manager com um conjunto de posições não sobrepostos em que as imagens de células bombeado para dentro do canal microfluídicos estarão no plano focal.
- Abra o plugin "biorreator Controller". Selecione o curso desejado tempo de matriz de LED, canais de imagem e outras configurações experimentais dos prompts. Coletar e analisar imagens.
- Enquanto o experimento é executado, garantem que a mídia no frasco media permanece clara. Se estiver nublado, então, tem sido contaminada.
14. Pós-experimento
- Dispor de meios de comunicação, cultura de células em excesso e efluentes.
- Encher o balão com meios 200 mL de EtOH a 20% misturada com água desionizada. Execute o quemostato como tinha anteriormentesido executado durante o experimento para lavar restos de células e meios de comunicação.
- Quando a solução de álcool drenou do frasco mídia, desmontar o quemostato plenamente.
- Lavar copos e tubos com água morna e detergente neutro, e enxaguar abundantemente com água deionizada. Deixar secar.
- Abra o arquivo "microcontrollerRecords.csv" para rever a temperatura eo estado matriz de LED ao longo do experimento, o arquivo "Summary.csv" para revisar os dados de resumo de cada conjunto de imagens e os "Resultados <n> .csv" arquivos para revisar os dados que resumem cada ROI de cada período de tempo, onde n é o n º conjunto de dados.
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Representative Results
Este aparelho foi utilizado para estimular uma cultura de S. cerevisiae que expressam a proteína fluorescente amarela (YFP), em resposta à luz azul por meio de um sistema de transcrição indutível optogenetic com base no par de proteínas Cry2 / CIB1 30. As células foram cultivadas chemostatically em meios com limitação de fosfato com uma taxa média de diluição de 0,2 ± 0,008. Fosfato limitação é comumente utilizado em S. cerevisiae quimiostato experiências para controlar a taxa de crescimento e os efeitos de limitação de fosfato são bem caracterizado. 31, 32, 33 Efluente a partir do vaso de cultura continuamente diluída foi amostrada para um dispositivo de microfluidos de um microscópio invertido. As imagens foram analisadas automaticamente, como mostrado na Figura 8. As células individuais foram identificadas em imagens de contraste de fase ajustadas ao fundo e sua Concentra YFPção foi estimada a partir de sua fluorescência medida a partir das imagens fluorescentes ajustadas ao fundo.
A fluorescência de 169,677 células foi analisado a partir de 33.600 imagens de efluente adquiridos a partir de 28 locais no dispositivo de microfluidos sobre as 70 h da experiência. Foi utilizado um microscópio invertido equipado com um sistema de iluminação de fluorescência e uma câmara CMOS. As imagens foram adquiridas com YFP um 500/20 nm de excitação do filtro, um filtro de emissão de 535/30 nm, e uma dicroico T515lp. As imagens foram tiradas com uma objectiva de contraste de fase de 40x, sob iluminação Köhler. As imagens foram gravadas em profundidade de cor de 16 bits com 87 pixels por micrômetro quadrado. A cultura foi exposta a diferentes intensidades de luz azul para intervalos de 6 h, seguido de escuridão completa durante intervalos de 6 h. A cultura foi exposta à luz antes da primeira medição, que é por isso que a sua intensidade de fluorescência está a diminuir durante o primeiro período de escuro. </ P>
A Figura 9 mostra a fluorescência devido à produção de YFP após a activação do sistema optogenetic em resposta à iluminação do vaso de cultura. Isto demonstra a utilidade das medições de células únicas de fluorescência ao longo de uma população de células medições-média única revelar a distribuição da população da intensidade de fluorescência. Observe o outlier a 42 h 26 min. Depois de analisar as imagens correspondentes, foi evidente que houve aglomerados de células, na maioria das imagens usadas para gerar a imagem composta do fundo, resultando em artefactos que se assemelhavam células na imagem subtraída-fundo. Além disso, uma bolha a partir do vaso de cultura foi bombeado para o canal microfluídico e partes de suas bordas eram confundido como células por o algoritmo de análise de imagem. Uma vez que nem a bolha nem os artefatos da subtração do fundo correspondeu às células reais, a sua intensidade de fluorescência medidaé menor do que a auto-fluorescência das células. Esta figura demonstra a qualidade dos dados que pode ser obtido automaticamente ao longo de 3 d. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8: Visual descrição do algoritmo de análise de imagem. Estas imagens foram cortadas e expandidas para facilitar a visualização. (A) Seis imagens são adquiridas para gerar a imagem de contraste de fase ajustadas ao fundo da cultura celular. Depois que a imagem principal é adquirido, cinco imagens adicionais são adquiridos com a bomba de efluentes-sampling virou brevemente entre cada aquisição para garantir que as células são deslocadas. Uma imagem composta do fundo é gerada a partir das cinco imagens componentes. O valor de cada pixelna imagem de fundo é o valor médio de que mesmo pixel entre os 5 imagens componentes. (B) A imagem subtraída-fundo é então convertido a um binário. O binário é então dilatado e os buracos dentro de seções contínuas de binário são preenchidos. Os contornos amarelos correspondem a regiões selecionadas de interesse (ROI), com base em critérios de tamanho e de circularidade. (C) As ROI são mapeadas na imagem fluorescente, em que a fluorescência de cada célula é medida como o valor do pixel brilhante dentro da ROI. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 9: Distribuição da população de intensidades de fluorescência ao longo do tempo. Nestes subfiguras o logaritmo da medida fluorescence é exibida, seguindo uma prática padrão na citometria de fluxo. A linha A e B indica a intensidade da luz absorvida ou difratado pela cultura, que é mensurado como a diferença de intensidade entre a luz transmitida através de meios estéreis e luz transmitida através de cultura celular no vaso de cultura. Ela é representada graficamente contra o segundo eixo de ordenadas. (A) A caixa de e enredo suiça (percentil 5, 25 percentil, mediana, percentil 75, percentil 95) do logaritmo da fluorescência medida da população ao longo do tempo. (B) Um histograma 2-dimensional dos mesmos dados, onde a cor corresponde à frequência normalizada de células com uma fluorescência medida na gama do escaninho correspondente. As cores foram dimensionadas para o intervalo de dados sem a outlier a 42 h 26 min incluídos. A frequência normalizada do outlier no menor bin fluorescênciaé de 0,7. (C) Uma histogramas dimensionais do logaritmo da fluorescência medida da população antes da primeira exposição gravado à luz e após o maior exposição à luz. Isto demonstra que a expressão induzida pela luz de YFP nesta estirpe é bimodal. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Nós projetamos este aparelho com flexibilidade em mente. Todo o código usado é gratuito e de código aberto. O processo de análise de imagem padrão para as células do segmento é simples e funciona rapidamente. análise personalizada pode ser implementado através da gravação de entrada do usuário ao analisar uma imagem representativa com a interface gráfica de usuário FIJI, convertendo a entrada para um script beanshell, e então configurar o plugin para chamar o script. Quando é chamado, esse script será enviado um array de String chamado "imagens" que contêm os caminhos de arquivo com o mais recente conjunto de imagens ajustadas ao fundo. As imagens e os dados são guardados à medida que são recolhidos de modo a que eles não sejam perdidos se uma experiência termina abruptamente. Uma matriz de LED azul foi escolhido para induzir o nosso sistema optogenetic mas poderia ser substituído com LEDs de cores diferentes. Existem adicionais pinos de entrada e de saída disponíveis no microcontrolador, bem como furos de passagem para um interruptor MOSFET adicional e interruptor do relé no PCB que tornam mais fácilpara que este sistema ser adaptado para fins mais complexos. Por exemplo, para fazer o aparelho funcionar como um turbidostat, use os pinos adicionais sobre o microcontrolador para alimentar um LED e ler valores de uma luz sensor amarrado ao vaso de cultura, e, em seguida, modificar o software para medir a turbidez e diluir o navio em conformidade .
Deve ser tomado cuidado para assegurar que a cultura não está contaminada, para proteger o equipamento microscopia sensível, e para assegurar que as taxas de fluxo de fluido são consistentes. As contaminações antes de quando o vaso de cultura é intencionalmente inoculado pode ser detectado por esperar alguns dias antes de inocular o vaso e verificar que não há crescimento para dentro. Para evitar o derramamento de cultura celular na objetiva do microscópio, verifique se o dispositivo microfluídico não vai vazar pela cultura primeira célula de bombeamento através dele sobre um pano absorvente. Se o fluxo dos meios de comunicação para o vaso de cultura é inconsistente, é geralmente porque o tubo em tornoos rolos de bomba peristáltica tornou-se muito solto. Se o fluxo de ar da bomba de aquário é inconsistente, garantir que não há curvas em forma de U no tubo efluente onde o líquido pode piscina e inconsistente resistir fluxo de ar. Se a tubulação ficar entupido depois de uma experiência porque a mídia secou dentro dela, mergulhe os tubos entupidos em um banho de água quente para dissolver a obstrução.
Existem limitações intrínsecas a este protocolo a considerar ao planear uma experiência ou análise de resultados. Dependendo da taxa de diluição e o comprimento do tubo utilizado, existe um atraso de aproximadamente 10 minutos durante o qual a cultura de células é bombeada a partir do vaso de cultura ao microscópio. Por conseguinte, não está bem adequada para estudar os eventos que ocorrem ao longo de prazos mais curtos. Além disso, enquanto uma experiência pode funcionar continuamente durante cerca de 10 dias, limitadas apenas pelo volume do meio, a evolução da cultura celular deve ser considerada como a duração da experiência aumenta. o limiting de nutrientes dos meios de comunicação tem efeitos profundos sobre o metabolismo e expressão gênica 35, 36, 37, 38, 39 e deve, portanto, ser determinado com base no aspecto da fisiologia em estudo. Ao analisar os resultados, as imagens-especialmente as imagens a partir de dados periféricas pontos-deverá ser revisto por erros na maneira que ROIs foram identificados pela rotina de análise de imagem. É possível que bolhas ou artefatos para ser confundido com células, distorcendo assim a fluorescência medida. Uma maneira simples de eliminar tais medições erradas é descartar todas as ROIs com intensidades de fluorescência abaixo da intensidade auto-fluorescência.
Este protocolo irá ser útil para medir a intensidade da fluorescência e / ou a morfologia celular de cultura de células de efluentes em resposta à luz em organismos que podem crescer em cultura contínua, definidaTLE a um plano focal consistente quando não agitado, e ser identificado automaticamente por um algoritmo de análise de imagem. O algoritmo de identificação de célula padrão usado aqui será mais directamente aplicável aos micróbios aproximadamente esférico que se assemelham a brotação levedura. Uma alternativa 40 do presente protocolo é a crescer micróbios num conjunto de culturas em lote, e em seguida, uma amostra de lote para cada ponto de tempo e caracterizar a amostra por citometria de fluxo. No entanto, as vantagens de o protocolo aqui descrito são que as amostras são tomadas a partir da mesma cultura, muitas amostras podem ser recolhidas, e o processo é automatizado. Este protocolo também melhora a um método semelhante no qual a levedura optogenetic foram cultivadas continuamente e fotografada com um microscópio 34 através da aquisição de várias imagens rapidamente e não polarização identificação ROIs por fluorescência. A grande vantagem deste protocolo é que muitas medições de células individuais podem ser regularmente adquirida ao longo de vários dias withoentrada do usuário ut. Após a medição da resposta da cultura microbiana à exposição à luz, um próximo passo pode ser a aplicação in silico de controlo em malha fechada da resposta.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Gostaríamos de reconhecer Molly Lazar e Verónica Delgado de assistência em testar o protocolo, Kieran Sweeney para discussões úteis e edição e Taylor Scott, My An-adirekkun, e Stephanie Geller para a leitura crítica do manuscrito. Megan Nicole McClean, Ph.D. detém um Prémio Carreira na Interface Científica do Fundo Burroughs Wellcome.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Extensive lab manual | GitHub | NA | An extensive, regularly updated lab manual is available in the “Optogenetic Chemostat Files” GitHub repository (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files). This also includes a description of the microfluidic mold used to generate the representative results. |
| Fritzing Design Viewer | Fritzing | NA | The free, open-sourced software to view and edit the .fzz type circuit board designs is available at "http://fritzing.org/download/" |
| Arduino Uno R3 (Atmega328 - assembled) | Adafruit | 50 | Microcontroller. 1 required. |
| Arduino Stackable Header Kit | SparkFun Electronics | 10007 | Female pin headers for connecting PCB to microcontroller. 1 required. |
| Adjustable 30W 110V soldering iron - XY-258 110V | Adafruit | 180 | For making electrical connections to the PCB. 1 required. |
| Soldering iron stand | Adafruit | 150 | For making electrical connections to the PCB. 1 required. |
| Mini Solder spool - 60/40 lead rosin-core solder 0.031" diameter - 100g | Adafruit | 145 | For making electrical connections to the PCB. 1 required. |
| 0.1 μF capacitor | SparkFun Electronics | COM-08375 | Stabilizes voltage in PCB. 1 required. |
| 10 μF capacitor | SparkFun Electronics | COM-00523 | Stabilizes voltage in PCB. 1 required. |
| MAX7219CNG LED Matrix/Digit Display Driver - MAX7219 | Maxim | MAX7219CNG | LED driver. 1 required. |
| 8 pin IC Socket | Mouser Electronics | 575-144308 | 16 required. These will be stacked on top of each other to support the culture vessel above the LED matrix. |
| 24 Pin IC socket | Mouser Electronics | 535-24-3518-10 | Optional. Use this to reversibly attach the MAXIM 7219CNG driver to the PCB. |
| Digital multimeter | Adafruit | 2034 | For troubleshooting electronics. 1 required. |
| Break Away Headers - 40-pin Male (Long Centered, PTH, 0.1") | SparkFun Electronics | PRT-12693 | Male pin headers for connected LED matrix to printed circuit board. Ends can be trimmed with wire cutters. 1 set required. |
| Flush diagonal wire cutters | Adafruit | 152 | For trimming long pin headers and cutting power cables. 1 required. |
| Premium Female/Female Jumper Wires - 40 x 12" (300mm) | Adafruit | 793 | Wire ribbon for connecting breadboard to LED matrix. Can be connected end-to-end with male pin-headers to be longer. 1 required. |
| Half-size breadboard | Adafruit | 64 | The LED matrix will connect to this and the culturing vessel will rest above it. |
| Miniature 8x8 Blue LED Matrix | Adafruit | 956 | Light source. Dominant wavelength is 470nm (blue). 1 required. Alternative miniature LED matrices from the same vendor are available with dominant wavelengths: 624 nm (red), 588 nm (yellow), 525 nm (green), 572 nm (yellow-green), and white. |
| Stackable header-3 pin | SparkFun Electronics | 13875 | 8 required. |
| Resistor Kit - 1/4W (500 total) | SparkFun Electronics | 10969 | For electronics. 1 required. |
| IRL520N MOSFET | International Rectifier | IRL520N | Voltage regulating switch for controlling DC current. 4 required. |
| Hook-Up Wire - Assortment (Solid Core, 22 AWG) | SparkFun Electronics | PRT 11367 | Wire for electronics. 1 required. |
| 5V 2A (2000mA) switching power supply - UL Listed | Adafruit | 276 | Power supply for the heating pad and Arduino. 2 required. |
| 12 VDC 1000mA regulated switching power adapter - UL listed | Adafruit | 798 | For peristaltic pumps. 2 required. |
| Electric Heating Pad - 10cm x 5cm | Adafruit | 1481 | For heating the bioreactor. 1 required. |
| Low flow variable flow peristaltic pump | Fisher Scientific | 13-876-1 | For pumping media. 1 required |
| Medium flow variable flow peristaltic pump | Fisher Scientific | 13-876-2 | For pumping culture. 1 required. |
| 9 VDC 1000mA regulated switching power adapter - UL listed | Adafruit | 63 | For microcontroller power supply. Order 1. |
| High Temp Waterproof DS18B20 Digital temperature sensor + extras | Adafruit | 642 | Thermometer for the bioreactor. 1 required. |
| Micromanager | Micromanager | NA | The free, open-sourced microscope control software is available at "https://micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release" |
| FIJI | ImageJ | NA | The free, open-sourced image analysis software is available at "http://fiji.sc/" |
| Arduino Integrated Development Environment | Arduino | NA | The free, open-sourced IDE is available at "https://www.arduino.cc/en/Main/Software" |
| Custom code | GitHub | NA | The custom microcontroller code and "Bioreactor Controller" plugin are available in the “Optogenetic Chemostat Files” GitHub repository (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files). |
| USB Cable A to B - 6 Foot | SparkFun Electronics | CAB-00512 | Used to download data to microcontroller. 1 required. |
| bioreactorTimecourse_example.csv | GitHub | NA | The advantage of loading LED matrix values from a CSV file is that a program can be called by the plugin to update those values based on image analysis results, and those values can be reloaded to the microcontroller, enabling feed-back control. It is available from the “Optogenetic Chemostat Files” GitHub repository (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files). |
| Tota-frost gels (diffusion paper) | B&H | B&H # LOFSFTL MFR # T1-72 |
For LED matrix. 1 required. |
| Kitting Sheet Crosslink 1/4x12x24in | Grainger, inc | 20JL37 | Black foam for culturing vessel enclosure. 4 required. |
| Standard Photodiode Power Sensor, Si, 200 - 1100 nm, 50 mW | Thorlabs | S120VC | For measuring light intensity. 1 required. |
| Labelling Tape | Fisher Scientific | 159015N | For labelling and securing loose components. 1 required. |
| Compact Power and Energy Meter Console, Digital 4" LCD | Thorlabs | PM100D | For measuring light intensity. 1 required. |
| 100mL GL45 hybridization glass bottle | Bellco Glass, Inc. | (7910-40150) | Bioreactor vessel. 1 required. |
| Six port assembly | Bellco Glass, Inc. | Custom | For the bioreactor vessel. Tubing Specs: .125" OD x .055"ID. Port A: 1.0" long above cap slug and to bottom of tube. Ports B,C,E,F: 1.0" long above cap slug, 33 mm long below. Port D: 1.0" long above cap slug, 65 mm long below. 1 required. Includes 45 mm diameter polypropylene open top screw cap and a white silicone gasket to ensure a tight seal between the cap and the vessel. |
| Scotch Magic Tape 3105, 3/4 x 300 Inches, Pack of 3 | Amazon | B0009F3P3U | Clear scotch tape. This is available from many other vendors. It is used to cover markings on the culturing vessel and to secure the coverglass with the PDMS channel to the aluminum support frame. |
| 1/16" ID x 3/16" OD x 1/16" Wall Tygon Sanitary Silicone Tubing | United States Plastic Corp. | 57288 | Tubing. ~25' required. |
| Cole-Parmer Twistit white rubber stopper, size 10 | Cole-Parmer | EW-62992-32 | Media flask stopper and effluent flask stopper. 2 required. |
| 2L Laboratory Flask | Pyrex | 4980 | Media flask and effluent flask. 2 required. |
| Day pinchcock | Fisher Scientific | 5867 | For pinching tubes shut. 3 required. |
| Replacement tubing assembly 1/16" ID | Traceable Products | 3372 | The peristaltic pumps come with a set of tubes, but they wear out after weeks of use. |
| Replacement tubing assembly 1/50" ID | Traceable Products | 3371 | The peristaltic pumps come with a set of tubes, but they wear out after weeks of use. |
| Male luer with lock ring x 1/16" hose barb, Nylon, 25/pk | Cole-Parmer | EW-45505-00 | Connectors. ~10 luers are required. |
| Male luer with lock ring x 1/8" hose barb, Nylon, 25/pk | Cole-Parmer | EW-45505-04 | Connectors. 5 required, one for each rubber stopper hole to fill with tubing. |
| Female luer x 1/16" hose barb adapter, Nylon, 25/pk | Cole-Parmer | EW-45502-00 | Connectors. ~10 luers required. |
| Female luer x 3/16" hose barb adapter | Cole-Parmer | EW-45502-08 | Connectors. ~10 luers required. |
| Cole-Parmer Luer Accessory, Female Luer Cap, Nylon, 25/Pk | Cole-Parmer | SC-45502-28 | |
| Cole-Parmer Luer Accessory, Male Luer Lock Plug, Nylon, 25/Pk | Cole-Parmer | EW-45505-56 | |
| Microbore PTFE Tubing, 0.022"ID x 0.042"OD, 100 ft/roll | Cole-Parmer | EW-06417-21 | Tubing. 1 roll required. |
| Masterflex platinum-cured silicone tubing, L/S 13, 25 ft | Cole-Parmer | EW-96410-13 | Tubing. ~25' required. |
| 3/16" ID x 1/4" OD x 1/32" Wall Tygon Sanitary Silicone Tubing | United States Plastic Corp. | 57293 | Tubing. ~1' required. |
| Vacuum filter | Fisher Scientific | 974107 | Nalgene vacuum filter for sterile filtering media. |
| Aquel Oxy-Boost 200 | Rena Aquatic Supply | AP200 | Dual diaphram adjustable flow air pump for aerating and mixing media. 1 required. |
| 0.2 μm pore syringe filter | Corning International | 431229 | This ensures that air from the aquarium pump does not contaminate the apparatus. 1 required. |
| Slygard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | Slygard 184 | For microfluidic device. 1 required. |
| American Safety Razor GEM Scientific Single-Edge Razor Blades | Fisher Scientific | 17989000 | For cutting tubes and PDMS. 1 blade required. |
| Harris Uni-Core hole puncher 1.2mm ID | Sigma-Aldrich | WHAWB100028 ALDRICH | For punching inlet/outlet in microfluidic device. 1 required. |
| Microscope cover glass 22x60-1.5 | Fisher Scientific | 12-544-G | For microfluidic device. 1 required. |
| Rectangular aluminum frame with a square window | Custom | Custom | To support the microfluidic channel. Outer dimensions: 3 inches x 1.25 inches. Inner dimmensions (cut out portion): 7/8 inches x 7/8 inches Thickness: ~1/32 inches |
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