Study of Endoplasmic Reticulum and Mitochondria Interactions by In Situ Proximity Ligation Assay in Fixed Cells

Emily Tubbs; Jennifer Rieusset

doi:10.3791/54899

JoVE Journal > Biology

Biology

Undersøgelse af endoplasmatisk reticulum og Mitokondrier interaktioner med In Situ Proximity ligeringsassayet i faste celler

Published: December 10, 2016

doi:

10.3791/54899

Emily Tubbs, Jennifer Rieusset

¹Lund University Diabetes Centre,Lund University, ²INSERM UMR-1060, CarMeN Laboratory, Lyon 1 University, INRA U1235, INSA of Lyon,Rockefeller and Charles Merieux Lyon-Sud Medical Universities

Summary

Her beskriver vi en fremgangsmåde til at visualisere og kvantificere med høj følsomhed de endogene interaktioner mellem det endoplasmatiske reticulum og mitokondrier i fikserede celler. Protokollen har en optimeret in situ nærhed ligeringsassayet målretning inositol 1,4,5-triphosphat receptor / glucose-reguleret protein 75 / spændingsafhængig anion kanal / cyclophilin D kompleks ved mitokondrierne-associerede membran interface.

Abstract

Structural interactions between the endoplasmic reticular (ER) and mitochondrial membranes, in domains known as mitochondria-associated membranes (MAM), are crucial hubs for cellular signaling and cell fate. Particularly, these inter-organelle contact sites allow the transfer of calcium from the ER to mitochondria through the voltage-dependent anion channel (VDAC)/glucose-regulated protein 75 (GRP75)/inositol 1,4,5-triphosphate receptor (IP3R) calcium channeling complex. While this subcellular compartment is under intense investigation in both physiological and pathological conditions, no simple and sensitive method exists to quantify the endogenous amount of ER-mitochondria contact in cells. Similarly, MAMs are highly dynamic structures, and there is no suitable approach to follow modifications of ER-mitochondria interactions without protein overexpression. Here, we report an optimized protocol based on the use of an in situ proximity ligation assay to visualize and quantify endogenous ER-mitochondria interactions in fixed cells by using the close proximity between proteins of the outer mitochondrial membrane (VDAC1) and of the ER membrane (IP3R1) at the MAM interface. Similar in situ proximity ligation experiments can also be performed with the GRP75/IP3R1 and cyclophilin D/IP3R1 pairs of antibodies. This assay provides several advantages over other imaging procedures, as it is highly specific, sensitive, and suitable to multiple-condition testing. Therefore, the use of this in situ proximity ligation assay should be helpful to better understand the physiological regulations of ER-mitochondria interactions, as well as their role in pathological contexts.

Introduction

Mitokondrier og endoplasmatisk reticulum (ER) er ikke selvstændige organeller i cellen, men de interagerer strukturelt og funktionelt på kontaktsteder defineret som mitochondrier-associeret endoplasmatisk reticulum membraner (MAM). Faktisk MAMS svarer til områder, hvor membranerne af ER og mitokondrier er tæt apposed, så interaktioner mellem proteiner fra begge sider. Ikke desto mindre har de membraner disse organeller ikke smelte inden for disse regioner, så de bevarer deres selvstændige enheder. De mams spiller en afgørende rolle i calcium (Ca ²⁺⁾ og phospholipid overførsel fra ER til mitokondrier, påvirker stofskiftet energi og celleoverlevelse ^1-3.

Associationen mellem ER og mitokondrier blev først visualiseret i 1970'erne med elektronmikroskopi. Siden da, transmission elektronmikroskopi ^4,5, elektron tomografi ^6,7 eller immuno-lokalisering af ER og mitokondrier-specifikke fluorophors / fluorescerende proteiner ⁸ blev klassisk anvendt til at undersøge ER-mitochondrier interaktioner. Et andet nyttigt værktøj til analyse af MAM er baseret på anvendelsen af subcellulær fraktionering. Den tillader isolering af MAM fraktioner ved differentiel ultracentrifugering koblet til en Percoll-gradient ^9. Imidlertid indeholder berigede MAM fraktioner, snarere end rene fraktioner, det endelige produkt. Tilsammen er disse strategier ikke særlig følsom og / eller kvantitative, og de er ikke let modtagelig for stor screening. Alternativt er genetiske metoder, der anvender lægemiddel-inducerbar fluorescerende inter-organel linkere opstået, men de tillader ikke analysen af organel interaktioner på de endogene ekspressionsniveauer af proteiner ^10.

Baseret på Szabadkai opdagelse af IP3R / Grp75 / VDAC kompleks ved MAM ^11, udviklede vi en kvantitativ metode til at analysere ER-mitokondrier interaktioner. Vi brugte den in situ nærhed ligatipå assay til påvisning og kvantificering af interaktioner mellem VDAC1 og IP3R1, to organel-overflade proteiner involveret i Ca2 ⁺ -channeling kompleks ved MAM grænsefladen i fikserede celler ^12. Kort fortalt, vi probet VDAC1 ved den ydre mitokondrielle membran (muse-anti-VDAC1 primært antistof) og IP3R1 på ER-membranen (kanin-anti-IP3R1 primært antistof) (figur 1, panel a). Så ifølge assayet, vi tilføjet både anti-muse og anti-kanin IgG (mus og kanin nærhed ligering assayprober), som er konjugeret til komplementært oligonukleotid extensions. Hvis de to målrettede proteiner er i en afstand under 40 nm, kan oligonukleotiderne hybridisere med de senere tilføjes stik oligoer at tillade dannelse af et cirkulært DNA-template (figur 1, felt B). Denne cirkulært DNA-molekyle ligeres og forstærkes, hvilket skaber en enkeltstrenget DNA produkt covalent bundet til en af de proximity prober (figur 1, felt C) . Da afstanden mellem ER og mitokondrier ved MAM grænsefladen ligger i området fra 10 nm til 25 nm ^6, kan nærhed ligering og amplifikation udføres, hvilket fører til efterfølgende påvisning på grund af hybridisering af Texas Red-mærket oligonukleotidprober (figur 1, felt D ). Hver fluorescerende prik repræsenterer interaktioner mellem VDAC1 / IP3R1, hvilket således tillader kvantificering af in situ ER-mitochondria interaktioner i individuelle celler.

Figur 1: Skematisk illustration af påvisning af endoplasmatisk reticulum-mitokondrier interaktioner ved in situ Proximity ligeringsassayet. a) En mus primært antistof rettet mod VDAC1 og et kanin-primært antistof rettet mod IP3R1 kan binde til deres epitoper i nærhed heraf på MAM interface, b) Tilsætning af et par proximity ligeringsprodukter proberrettet mod mus og kanin IgG. Disse prober har vedhæftet DNA-strenge, som kan danne skabeloner til ligering af stik oligoer. c) Den cirkulære DNA-streng dannet efter ligering kan forstærkes og d) visualiseret ved mikroskopi som en fluorescerende prik ved hjælp Texas Red-mærket oligonukleotider. Klik her for at se en større version af dette tal.

Tilsvarende in situ nærhed ligeringsassayet eksperimenter kan udføres med Grp75 / IP3R1 par antistoffer, samt cyclophilin D (CypD) / IP3R1 antistoffer, i betragtning af at CypD blev vist at interagere med IP3R / Grp75 / VDAC kompleks ved MAM grænsefladen ^12-14.

Protocol

1. Fremstilling af opløsninger Forbered 10% formaldehyd i PBS (lavt saltindhold) ved at fortynde 5,5 ml 37% formaldehyd i 14,5 ml PBS. Forberede 1 M glycin, pH 8,0, ved at opløse 3,8 g glycin i 50 ml PBS; fortyndes denne opløsning til opnåelse 100 mM glycin i 1X PBS. Forbered 0,1% Triton-X100 i 1x PBS. Forbered 20x Saline natriumcitrat (SSC) ved anvendelse af 3,0 M natriumchlorid og 0,30 M trinatriumcitrat fremstillet på en deioniseret vand puffer med pH 7,0 ved 25 ° C. Fortynd denne buffer ti…

Representative Results

Baseret på vores erfaring med at bruge denne protokol, kan vi trygt anbefale denne metode til visualisering og kvantificering af ER-mitokondrier interaktioner i faste celler. Repræsentative billeder af in situ nærhed ligeringsassayet-visualiseret ER-mitochondrier interaktioner i HuH7 leverkarcinom cellelinie, der anvender flere par antistoffer, er vist. Som vist i figur 2 ved fluorescerende mikroskopi, hver rød prik repræsenterer en interaktion mellem de to…

Discussion

Collectively, our studies indicate that the in situ proximity ligation assay is truly a relevant strategy to follow and quantify endogenous ER-mitochondria interactions in fixed cells, without the need for using organelle-specific fluorophores or fluorescent proteins. The specific use of VDAC1/IP3R1 antibodies has been adapted to study ER-mitochondria interactions in HuH7 cells. However, alternative isoforms of VDAC and IP3R may be used, depending on the cell type. In this case, antibodies need to be validated b…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi takker alle de mennesker i vores laboratorium, der har bidraget til at optimere og validere protokollen. Dette arbejde blev støttet af INSERM og det nationale forsknings- agentur (ANR-09-JCJC-0116 OG ANR-11-BSV1-033-02). ET blev støttet under hendes ph.d. af en forskergruppe stipendium fra den franske ministerium for videregående uddannelse og forskning.

Materials

Formaldehyde	Sigma	F-8775
Glycine	Sigma	G-8898
Triton	Sigma	T8532
35mm Glass bottom culture dishes	MatTeK corporation	P35G-0-14-C
Blocking solution	Sigma	DUO-92004 or DUO-92002	provided in the Duolink PLA probes, Sigma
VDAC1 antibody	Abcam	ab14734
IP3R1-H80 antibody	Santa Cruz	sc28614
CypD antibody	Abcam	ab110324
Grp75 antibody	Santa Cruz	sc13967
TBS 10X	euromedex	ET220	Dilute to obtain 1X
Tween 100X	euromedex	2001-B	dilute in TBS to obtain 0,01%
PLA Probes Mouse MINUS	Sigma	DUO-92004	Duolink, Sigma
PLA Probes Rabbit PLUS	Sigma	DUO-92002	Duolink, Sigma
Duolink detection reagents red	Sigma	DUO-92008	Duolink, Sigma
Ligation solution	Sigma	DUO-92008	Part of the Duolink detection reagents red, Sigma
Ligase	Sigma	DUO-92008	Part of the Duolink detection reagents red, Sigma
Amplification solution	Sigma	DUO-92008	Part of the Duolink detection reagents red, Sigma
Polymerase	Sigma	DUO-92008	Part of the Duolink detection reagents red, Sigma
Duolink Mounting Medium	Sigma	DUO80102	Duolink, Sigma
Softwares:
Blob-finder software			BlobFinder is a freely distributed software that can perform calculations on cells from fluorescence microscopy images. This software can be downloaded for free from The Centre for Image Analysis at Uppsala University who have developed the software and the work was supported by the EU FP6 Project ENLIGHT and Olink Bioscience. http://www.cb.uu.se/~amin/BlobFinder/index_files/Page430.htm
ImageJ software			Can be downloaded for free from: http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html

References

Bravo-Sagua, R., et al. Organelle communication: signaling crossroads between homeostasis and disease. The international journal of biochemistry & cell biology. 50, 55-59 (2014).
Giorgi, C., et al. Mitochondria-associated membranes: composition, molecular mechanisms, and physiopathological implications. Antioxidants & redox signaling. 22, 995-1019 (2015).
Phillips, M. J., Voeltz, G. K. Structure and function of ER membrane contact sites with other organelles. Nature reviews. Molecular cell biology. 17, 69-82 (2016).
Cosson, P., et al. The RTM resistance to potyviruses in Arabidopsis thaliana: natural variation of the RTM genes and evidence for the implication of additional genes. PLoS One. 7, 39169 (2012).
Mannella, C. A. Structure and dynamics of the mitochondrial inner membrane cristae. Biochim Biophys Acta. 1763, 542-548 (2006).
Csordas, G., et al. Structural and functional features and significance of the physical linkage between ER and mitochondria. The Journal of cell biology. 174, 915-921 (2006).
Mannella, C. A., Buttle, K., Rath, B. K., Marko, M. Electron microscopic tomography of rat-liver mitochondria and their interaction with the endoplasmic reticulum. Biofactors. 8, 225-228 (1998).
Rizzuto, R., et al. Close contacts with the endoplasmic reticulum as determinants of mitochondrial Ca2+ responses. Science. 280, 1763-1766 (1998).
Wieckowski, M. R., Giorgi, C., Lebiedzinska, M., Duszynski, J., Pinton, P. Isolation of mitochondria-associated membranes and mitochondria from animal tissues and cells. Nat Protoc. 4, 1582-1590 (2009).
Csordas, G., et al. Imaging interorganelle contacts and local calcium dynamics at the ER-mitochondrial interface. Mol Cell. 39, 121-132 (2010).
Szabadkai, G., et al. Chaperone-mediated coupling of endoplasmic reticulum and mitochondrial Ca2+ channels. J Cell Biol. 175, 901-911 (2006).
Tubbs, E., et al. Mitochondria-associated endoplasmic reticulum membrane (MAM) integrity is required for insulin signaling and is implicated in hepatic insulin resistance. Diabetes. 63, 3279-3294 (2014).
Paillard, M., et al. Depressing Mitochondria-Reticulum Interactions Protects Cardiomyocytes From Lethal Hypoxia-Reoxygenation Injury. Circulation. 128, 1555-1565 (2013).
Rieusset, J., et al. Disruption of calcium transfer from ER to mitochondria links alterations of mitochondria-associated ER membrane integrity to hepatic insulin resistance. Diabetologia. 59, 614-623 (2016).
Allalou, A., Wahlby, C. BlobFinder, a tool for fluorescence microscopy image cytometry. Computer methods and programs in biomedicine. 94, 58-65 (2009).
Theurey, P., et al. Mitochondria-associated endoplasmic reticulum membranes allow adaptation of mitochondrial metabolism to glucose availability in the liver. Journal of molecular cell biology. , (2016).
de Brito, O. M., Scorrano, L. Mitofusin 2 tethers endoplasmic reticulum to mitochondria. Nature. 456, 605-610 (2008).
Soderberg, O., et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nature methods. 3, 995-1000 (2006).
De Pinto, V., Messina, A., Lane, D. J., Lawen, A. Voltage-dependent anion-selective channel (VDAC) in the plasma membrane. FEBS letters. 584, 1793-1799 (2010).
Kaul, S. C., Taira, K., Pereira-Smith, O. M., Wadhwa, R. Mortalin: present and prospective. Experimental gerontology. 37, 1157-1164 (2002).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Tubbs, E., Rieusset, J. Study of Endoplasmic Reticulum and Mitochondria Interactions by In Situ Proximity Ligation Assay in Fixed Cells. J. Vis. Exp. (118), e54899, doi:10.3791/54899 (2016).