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Immunology and Infection

Generazione di derivate da monociti cellule dendritiche umane da sangue intero

doi: 10.3791/54968 Published: December 24, 2016

Introduction

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Le cellule dendritiche (DC) sono le più importanti cellule specializzate che presentano l'antigene del nostro sistema immunitario. Immaturo DC (IDC) risiedono nella pelle o nei tessuti delle mucose e sono quindi tra le prime cellule immunitarie per interagire con gli agenti patogeni invasori. DC rappresentano il ponte tra l'innato e il sistema immunitario adattativo 1, dal momento che possono attivare T e cellule B risposte dopo il rilevamento degli agenti patogeni. Inoltre, contribuiscono a risposte immunitarie pro-infiammatorie causa della secrezione di elevate quantità di citochine, come IL-1β, IL-6 e IL-12. DC attivare anche le cellule NK e attirare altre cellule immunitarie al sito di infezione da parte di chemiotassi.

DC può essere diviso in cellule immature dendritiche (IDC) e cellule dendritiche mature (MDC) 2 sulla base della loro morfologia e funzione. Dopo il riconoscimento di antigeni estranei da uno dei molti recettori pattern recognition (ad esempio, recettori toll-like, tipo Clectine, o complemento recettori) abbondantemente espresso sulla superficie delle cellule, iDCs subiscono grandi cambiamenti e cominciano a maturare. Durante questo processo di maturazione, i recettori per la cattura di antigene sono down-regolati, mentre molecole essenziali per la presentazione dell'antigene sono regolate up-3. DC mature up-regolazione dei complesso maggiore di istocompatibilità I e II (MHC I e II), molecole co-stimolatorie come CD80 e CD86, che sono essenziali per la presentazione dell'antigene e l'attivazione dei linfociti T. Inoltre, l'espressione del recettore delle chemochine CCR7 sulla superficie cellulare viene indotta, che permette la migrazione delle DC dai tessuti periferici ai linfonodi. La migrazione è facilitata dalla "rolling" di DC lungo un ligando chemochina 19 (CCL19 / MIP-3b) e chemochine ligando 21 (CCL21 / SLC) gradiente ai linfonodi 4-6.

Dopo la migrazione, MDCS presentano l'antigene processato per naïve cellule CD4 + e CD8 +, quindi initiating una risposta immunitaria adattativa contro l'invasore patogeno 7. Questa interazione con le cellule T nei linfonodi è anche associato con la diffusione del virus 8. Altri studi in vitro hanno rivelato che le cellule dendritiche catturare e trasferire l'HIV a cellule T e che questo risultati di trasmissione in una infezione vigorosa 9-12 in modo efficiente. Questi esperimenti evidenziano che in vivo HIV sfrutta DC come navette dalla periferia ai linfonodi. Durante presentazione dell'antigene, DC secernono interleuchine chiave che determinano la differenziazione delle cellule T helper effettrici, e quindi il risultato della intera risposta immunitaria contro il microbo è determinata in questo interazione. Oltre a tipo 1 (Th1) e tipo 2 cellule (Th2) T effettrici, altri sottoinsiemi di cellule T CD4 + helper (ad esempio, il tipo 17 (Th17) e di tipo 22 (cellule Th22) T) sono state descritte, e la loro induzione e la funzione sono stati studiati a fondo. DC sono inoltre coinvolti inla generazione di cellule T regolatorie (Tregs) 13,14. Queste cellule sono immunosoppressiva e possono fermare o down-regolare l'induzione o la proliferazione delle cellule T effettrici e sono quindi di fondamentale importanza per lo sviluppo di immunità e la tolleranza.

DC convenzionali umani (CDC) comprendono diversi sottoinsiemi di cellule con una origine mieloide (vale a dire, Cellule di Langerhans (LCS) e per via cutanea e DC interstiziali) o di origine linfoide (ad esempio, cellule dendritiche plasmacitoidi (pDCs)). Per gli esperimenti in vitro o strategie di vaccinazione DC, DC derivate da monociti sono abitualmente utilizzati come modello per DC dermici. Queste cellule mostrano somiglianze nella fisiologia, la morfologia e la funzione di cellule dendritiche mieloidi convenzionali. Esse sono generate mediante aggiunta di interleuchina 4 (IL-4) e granulociti-macrofagi fattore stimolante le colonie (GM-CSF) di monociti isolati da donatori sani 12,15-18. Le cellule dendritiche possono anche essere isolati direttamente da cutanee o mucose biopsie, o può anche be sviluppato da cellule progenitrici ematopoietiche isolate da campioni di sangue del cordone ombelicale ottenuti ex utero CD34 +. Qui, si dimostra come i monociti sono isolati e stimolati dal sangue umano anti-coagulato dopo cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) di arricchimento mediante centrifugazione in gradiente di densità. Dopo incubazione per 5 giorni, monociti umani in condizioni specifiche sono differenziati in iDCs e sono pronti per le procedure sperimentali in un ambiente non clinico.

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Protocol

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Etica dichiarazione: consenso informato scritto è stato ottenuto da tutti i partecipanti donatori di sangue dall'Istituto Centrale per Blood Transfusion & Dipartimento immunologica, Innsbruck, Austria. L'uso di esemplari rimasti anonimi per scopi scientifici è stato approvato dal Comitato Etico della Medical University di Innsbruck.

1. Arricchimento delle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC)

  1. Concentrazione di PBMC mediante centrifugazione.
    1. Aprire il pacchetto sangue e diviso in provette da centrifuga da 50 ml sterili secondo la quantità di sangue ricevuta.
    2. Se necessario, regolare il volume a 50 ml per ogni tubo con sterile Dulbecco Phosphate-Buffered Saline (D-PBS).
    3. Porre i tubi in una centrifuga e girare a 400 xg per 15 min a temperatura ambiente (RT) senza freno.
    4. Disegnare lo strato superiore contenente plasma e piastrine con una sterile pipetta 10 ml sierologica, lasciando il boundary strato indisturbato.
      NOTA: Se plasma autologo invece di FCS è utilizzato per integrare il mezzo di coltura, il plasma deve essere raccolto e calore inattivato in questa fase.
    5. Raccogliere le cellule mononucleate (strati limite) da due 50 ml provette da centrifuga e trasferirli in una provetta sterile da 50 ml con una sterile 10 ml pipetta sierologica.
    6. Regolare il volume a 50 ml per ogni tubo con sterile D-PBS.
    7. Porre i tubi in una centrifuga e girare a 400 xg per 15 minuti a RT senza freno.
    8. Aspirare lo strato superiore contenente il plasma e piastrine utilizzando una pipetta sterile 10 ml sierologica, lasciando lo strato limite indisturbati.
    9. Raccogliere le cellule mononucleate (strati limite) dai tubi centrifuga da 50 ml e trasferirli in due provette sterili 50 ml di raccolta utilizzando una sterile 10 ml pipetta sierologica.
    10. Regolare il volume a 50 ml per ogni tubo con sterile D-PBS.
  2. Separazionedi PBMC di centrifugazione in gradiente di densità (Figura 1).
    1. Preparare quattro 50 ml tubi e pipetta 15 ml di terreno gradiente di densità in ogni provetta.
    2. Prendere 25 ml di pool cellule / sangue dal tubo di raccolta (fase 1.1.10) e sovrapporre con attenzione il gradiente di densità media.
    3. Porre i tubi in una centrifuga e girare a 700 xg per 30 min a RT senza freno.
  3. Raccolta e depurazione delle PBMC.
    1. Aspirare lo strato superiore contenente il plasma e piastrine utilizzando una pipetta sterile 10 ml sierologica, lasciando lo strato PBMC indisturbati.
    2. Raccogliere l'interfase PBMC da tutte le provette e in comune le cellule in due sterili provette da 50 ml con una sterile 25 ml pipetta sierologica.
    3. Regolare il volume a 50 ml per ogni tubo con sterile D-PBS. Porre i tubi in una centrifuga e girare a 400 xg per 15 min a 4 ° C con il freno.
    4. Aspirare il surnatante e risospendere ilcellule in sterili D-PBS. In comune le cellule da entrambi i tubi e regolare il volume a 50 ml con sterile D-PBS.
    5. Collocare le provette nella centrifuga e girare a 400 xg per 10 min a 4 ° C con freno.
    6. Aspirare il surnatante e risospendere le cellule in sterili D-PBS. Regolare il volume a 50 ml con sterile D-PBS e pipetta 50 microlitri di una provetta da 1,5 ml contenente 450 ml di D-PBS.
    7. Vortex la provetta da 1,5 ml vigorosamente e contare le cellule in una camera di Neubauer o qualsiasi altro strumento conteggio delle cellule.
    8. Porre i tubi 50 ml nella centrifuga e girare a 400 xg per 10 min a 4 ° C con freno.

2. Isolamento dei monociti da Anti-CD14 umani Particelle Magnetiche

  1. Etichettatura di PBMC con particelle magnetiche.
    1. Regolare la concentrazione PBMC di 8 x 10 7 cellule / ml utilizzando tampone di isolamento.
    2. Vortex le particelle magnetiche CD14 anti-umano thoroughly e aggiungere 50 ml di particelle per ogni 1 x 10 7 PBMC.
    3. Mescolare la sospensione cellulare particella accuratamente ed incubare a temperatura ambiente per 30 min.
  2. Separazione delle frazioni positive e negative.
    1. Regolare il volume fino a 12 ml utilizzando tampone di isolamento.
    2. Preparare sei tubi a fondo rotondo sterili e pipetta 2 ml di sospensione cellulare-particelle in ogni provetta.
    3. Porre immediatamente i tubi sul magnete. incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.
    4. Mantenere i tubi sul magnete e con attenzione disegnare il sopranatante. Il surnatante contiene la frazione negativa.
    5. Rimuovere il tubo dal magnete e aggiungere 2 ml di tampone di isolamento.
    6. Delicatamente risospendere le cellule pipettando su e giù.
    7. Posizionare i tubi di nuovo sul magnete. Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
    8. Mantenere i tubi sul magnete e con attenzione disegnare il sopranatante. Il surnatante contiene la frazione negativa.
    9. Rimuovere le provette dal magnete e aggiungere 2 ml di tampone di isolamento a ciascuna provetta. Delicatamente risospendere le cellule pipettando su e giù.
    10. Trasferire la frazione positiva ad una provetta sterile 50 ml e regolare il volume a 50 ml utilizzando sterile D-PBS.

3. La stimolazione dei monociti isolati con IL-4 e GM-CSF

  1. Posizionare il tubo nella centrifuga e centrifugata a 400 xg per 10 min a 4 ° C con freno.
  2. Aspirare il surnatante e risospendere le cellule in 50 ml di D-PBS.
  3. Pipettare 50 ml in una provetta da 1,5 ml contenente 450 ml di D-PBS. Vortex la provetta da 1,5 ml vigorosamente e contare le cellule in una camera di Neubauer o altro strumento conteggio delle cellule.
  4. Posizionare il tubo 50 ml nella centrifuga e centrifugata a 400 xg per 10 min a 4 ° C con freno.
    NOTA: Se la frazione negativo, contenente linfociti del sangue periferico (PBL) è necessaria anche,, eseguire il lavaggio e il conteggio dei passi simili a ttubo della frazione positiva (punti 3.1-3.5).
  5. Regolare la concentrazione cellulare a 1 x 10 6 / ml con terreno di coltura pre-riscaldato (terreno RPMI 1640 supplementato con 10% soluzione inattivato al calore FBS e 1% L-Glutammina) e pipetta da 3 ml / pozzetto in piastre da 6 pozzetti.
    NOTA: Se si utilizza il plasma autologo inattivato al calore, sostituire il FCS 10% con il 1-5% di plasma autologo, a seconda del set-up sperimentale.
  6. Stimolare i monociti con umana ricombinante IL-4 (250 U / ml) e ricombinante GM-CSF umano (1.000 U / ml) pipettando citochine direttamente nel mezzo di coltura. Incubare a 37 ° C e 5% CO 2.
  7. Re-stimolare le cellule con IL-4 (250 U / ml) e GM-CSF (1000 U / ml) dopo 48 ore pipettando citochine direttamente nel mezzo di coltura.
    NOTA: Se ci sono segni di acidificazione mostrato dall'indicatore di pH nel mezzo, sostituire la metà della media con terreno di coltura pre-riscaldato.
  8. Harvest immaturo cellule dendritiche il giorno 5 perdown-stream esperimenti pipettando le cellule coltivate su piastra da 6 pozzetti e in un tubo da centrifuga da 50 ml dopo pipettando mezzo di coltura su e giù alcune volte.
  9. Contare le cellule e macchiare un campione di monociti isolati con anticorpi anti-umani contro CD11b, CD11c, e DC-SIGN / CD209, insieme con un colorante vitalità cellulare. Per evitare legame aspecifico degli anticorpi durante la colorazione della superficie, l'uso di recettore Fc bloccare reagenti o siero bovino albumina buffer (BSA) è altamente raccomandato.
  10. Analizzare il campione utilizzando il colorante vitalità cellulare, secondo il protocollo del produttore, eseguendo citometria a flusso per valutare la purezza e la vitalità delle iDCs generati.

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Representative Results

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Dopo centrifugazione del sangue anti-coagulato con un cuscino di saccarosio, cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) sono arricchite in interfase sopra del mezzo gradiente di densità (Figura 1). Dopo che i PBMC sono disegnate fuori, analisi FACS viene eseguita per caratterizzare le diverse popolazioni di cellule all'interno delle PBMC utilizzando marcatori lignaggio (ad esempio, CD3 per i linfociti T, CD14 per i monociti, e CD19 per i linfociti B). La Figura 2A mostra i risultati di un'analisi FACS rappresentativi delle PBMC raccolti e macchiate dopo centrifugazione in gradiente di densità. Fuori della popolazione gated (Figura 2A, la trama superiore), abbiamo rilevato 4,03% linfociti B, 28.20% monociti e 67.62% di altre cellule (Figura 2A, trama centrale), di cui il 43.62% erano linfociti T (Figura 2a, la trama più bassa ).

PBMC vengono poi incubate wparticelle magnetiche ith CD14 e, dopo incubazione su un magnete, la frazione negativo contenente i linfociti del sangue periferico (PBL) è quindi analizzata mediante FACS utilizzando la selezione di marcatori lignaggio summenzionati. Rispetto a PBMC, abbiamo misurato percentuali simili di linfociti B (4,65%, figura 2b, trama centrale), percentuali più elevate di altre cellule (88.61%, figura 2b, trama centrale), e fortemente ridotte percentuali di monociti (6,59%, figura 2B , la trama centrale). Caratterizzazione della frazione positive (figura 3) ha dimostrato una elevata efficienza di separazione, poiché la purezza delle cellule isolate è oltre il 97% (Figura 3, diagramma di sinistra), di cui 99.56% (Figura 3, diagramma di destra) esprime elevati livelli di CD14 sulla superficie cellulare.

IL4 e GM-CSF stimolazione dei monociti per 5 giorni si traduce in differenziazione in cellule dendritiche derivate da monocitis, che sono paragonabili a quella cutanea cellule dendritiche nella morfologia, comportamento, e del recettore espressione 19. Analisi FACS di cellule dendritiche derivate da monociti il giorno 5 mostra una popolazione omologa (Figura 4, plot sinistra) che esprime elevati livelli di CD11b, CD11c (non mostrata), e la lectina di tipo C DC-SIGN. Nessuna espressione del CD83 marcatore maturazione DC viene rilevata (Figura 4, la trama destra), e le cellule perdono anche il CD14 marcatore monociti (non mostrato).

figura 2
Figura 1: Separazione dei componenti del sangue mediante gradiente di densità centrifugazione. PBMC sono arricchite in interfase sulla parte superiore del mezzo di separazione per centrifugazione in gradiente di densità. sono mostrati i livelli prima (a sinistra) e dopo (a destra) centrifugazione. per favoreclicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2: analisi citofluorimetrica delle PBMC (A) e PBL (B). (A) PBMC vengono raccolte, macchiato di marcatori lignaggio (topo anti-umani anticorpi CD3, CD14, CD19 e), e analizzati mediante citometria di flusso. sono mostrati Dot trame di un risultato rappresentativo. (B) La frazione negativo contenente PBL è caratterizzata da marcatori lignaggio (CD3 topo anti-umano, CD14, CD19 e gli anticorpi) e analizzati mediante citometria a flusso. sono mostrati Dot trame di un risultato rappresentativo. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3

Figura 4
Figura 4: citometria a flusso analisi delle cellule dendritiche derivate da monociti. I monociti sono stimolati per 5 giorni con IL4 e GM-CSF e colorate per caratteristici marcatori DC, come CD11b, CD11c (non mostrata), la lectina di tipo C DC-SIGN, e il CD83 marcatore di maturazione. sono mostrati Dot trame di un risultato rappresentativo.

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Discussion

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Questo protocollo descrive la generazione di cellule dendritiche derivate da monociti (MDDCs) attraverso l'isolamento di monociti umani da sangue anti-coagulato utilizzando un saggio a base di nanoparticelle magnetiche. In questo protocollo, le fasi di centrifugazione sono eseguite a monte della procedura di isolamento cellulare, che porta ad un arricchimento della frazione PBMC. Sebbene le cellule sono persi durante la centrifugazione, di sovrapporre il contenuto di un pacchetto di sangue intero sul mezzo gradiente di densità richiederebbe 200-300 ml del mezzo gradiente di densità e quindi non può essere considerato economicamente efficiente. Inoltre, l'arricchimento di PBMC da risultati centrifugazione in una popolazione cellulare più pulito, che influenza positivamente il fissaggio delle particelle magnetiche CD14 anti-umani durante il processo di isolamento. Isolamento magnetico-nanoparticelle dei monociti risultati in una popolazione di monociti vitale, che può essere ulteriormente utilizzati per la differenziazione in vitro per vari sottoinsiemi DC o macrofagi.

In alternativa, le cellule dendritiche possono essere isolate direttamente da via cutanea o biopsie della mucosa o possono essere sviluppate da cellule progenitrici ematopoietiche isolate da campioni di sangue del cordone ombelicale ottenuti ex utero CD34 +.

Tuttavia, MDDCs sono il modello più diffuso per le cellule dendritiche, poiché l'isolamento diretto delle DC da biopsie è più complessa da eseguire. Si può anche portare a numero di cellule inefficienti che spesso variare a causa di differenze nella qualità del donatore. Problemi simili si possono verificare quando le DC vengono generati da cellule CD34 + staminali isolate dal sangue del cordone ombelicale.

Per le applicazioni future, cellule staminali pluripotenti inducibile (iPSCs) potrebbero essere utilizzati al posto dei CD14-magnetico isolamento goccia di monociti dal sangue. I vantaggi di usare iPSCs sono non solo sottoinsiemi DC, ma tutte le cellule ematopoietiche di interesse, possono essere generati da un donatore (cellule T, cellule B e NK cells) e che iPSCs paziente-specifici possono essere usati per caratterizzare le interazioni delle cellule immunitarie autologhe in maniera personalizzata.

La fase più critica durante l'isolamento dei monociti è la fase di centrifugazione in gradiente di densità, poiché accurata separazione dei globuli rossi e bianchi si ottiene solo quando il freno della centrifuga è spento. Questo determina il risultato dell'efficienza isolamento a valle.

In conclusione, questo protocollo è un modo molto veloce, efficiente e conveniente per generare una popolazione di cellule dendritiche derivate da monociti vitale e omogenea attraverso l'isolamento di monociti umani da sangue anti-coagulato.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
APC Mouse Anti-Human CD19 Clone HIB19 BD Biosciences 555415
APC Mouse Anti-Human CD83 Clone HB15e BD Biosciences 551073
BD Imag Anti-Human CD14 Magnetic Particles BD Biosciences 557769
BD Imagnet BD Biosciences 552311
BSA (Albumin Fraction V) Carl Roth EG-Nr 2923225
Costar 6 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates Costar 3506
Density gradient media: Ficoll-Paque Premium GE Healthcare Bio-Sciences 17-5442-03
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (D-PBS) Sigma-Aldrich D8537
Falcon 10 ml Serological Pipet Corning 357551
Falcon 25 ml Serological Pipet Corning 357525
Falcon 50 ml High Clarity PP Centrifuge Tube Corning 352070
Falcon Round-Bottom Tubes Corning 352054
FITC Mouse Anti-Human CD3 Clone HIT3a BD Biosciences 555339
Ghost Dye Violet 510 (Cell Viability Reagent) Tonbo biosciences 13-0870
GM-CSF MACS Miltenyi Biotec 130-093-862
Heat Inactivated FBS (Fetal Bovine Serum), EU Approved Origin (South America) Gibco 10500-064
Hettich Rotanta 460R Hettich ---
IL-4 CC PromoKine C-61401
Isolation buffer: BD IMag Buffer (10x) BD Biosciences 552362
L-Glutamine solution Sigma-Aldrich G7513
Microcentrifuge tubes, 1.5 ml, SuperSpin VWR 211-0015
PE Mouse Anti-Human CD14 Clone M5E2 BD Biosciences 555398
PE Mouse Anti-Human CD209 Clone DCN46 BD Biosciences 551265
RPMI-1640 medium Sigma-Aldrich R0883
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 Invitrogen 15575020

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References

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Posch, W., Lass-Flörl, C., Wilflingseder, D. Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood. J. Vis. Exp. (118), e54968, doi:10.3791/54968 (2016).More

Posch, W., Lass-Flörl, C., Wilflingseder, D. Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood. J. Vis. Exp. (118), e54968, doi:10.3791/54968 (2016).

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