Идентификация внутриклеточных сигнальных событий, наведенных в жизнеспособные клетки при взаимодействии с соседними сотами Проходят апоптотической гибели клеток
Summary
Here, we present a protocol for the determination of intracellular signaling events induced in viable cells by physical interaction with adjacent dead or dying cells. The protocol focuses on signaling events induced by receptor-mediated recognition of the dead cells, as opposed to their phagocytic uptake or release of soluble mediators.
Abstract
Клетки умирают путем апоптоза, также упоминается как регулируемом гибель клеток, приобретают несколько новых видов деятельности, которые позволяют им влиять на функцию смежных живых клеток. Жизнедеятельности, такие как выживание, пролиферации, роста и дифференцировки, являются одними из многих клеточных функций, модулированных апоптотических клеток. Способность распознавать и реагировать на апоптотических клеток, как представляется, является универсальным свойством всех клеток, независимо от происхождения или органа происхождения. Тем не менее, разнообразие и сложность ответа на апоптозе мандатов, которые большое внимание быть приняты в рассекает сигнальных событий и путей, ответственных за какой-либо конкретного результата. В частности, необходимо проводить различие между множеством механизмов, с помощью которых апоптотических клеток могут влиять на внутриклеточные сигнальные пути в пределах жизнеспособных иммунокомпетентных клеток, в том числе: признание рецептор-опосредованного апоптоза клетки, высвобождение растворимых медиаторов апоптоза клетки, и / или зацепление фагоcytic оборудование. Здесь мы приводим протокол для определения внутриклеточных событий сигнализации, которые индуцируются в жизнеспособных иммунокомпетентных клеток после их воздействия апоптотических клеток. Одним из основных преимуществ протокола заключается в том внимании, он платит рассечения механизма, с помощью которого апоптотических клеток модулировать сигнальных событий внутри отвечающих клеток. В то время как протокол является специфичным для условно увековеченную мыши почки проксимальной линии трубчатых элементов (BU.MPT клетки), он легко адаптируется к клеточных линий, которые не являются эпителиальные происхождения и / или полученный из материалов, отличных от почек органов. Использование мертвых клеток в качестве стимула вводит несколько уникальных факторов, которые могут препятствовать обнаружению внутриклеточных сигнальных событий. Эти проблемы, а также стратегии, чтобы максимально уменьшить или обойти их, обсуждаются в рамках протокола. Применение этого протокола должно помочь нашей расширяющейся знания широкого влияния, что мертвые или умирающие клетки оказывают на их живых соседей, как в здоровье и в diseaсе.
Introduction
Апоптоз, или регулируемая гибель клеток 1, способствует существенным образом на содержание и развитие тканей. Рассматриваемый наиболее просто, допускает апоптозом возрасте, поврежденные или лишние клетки должны быть устранены без вреда для окружающих тканей 2,3. Вклад апоптоза в гомеостазе ткани, однако, значительно более динамичным и разнообразным. Клетки умирают путем апоптоза приобретают несколько новых видов деятельности, как секретируется и связанную с клетками, которые позволяют им влиять на функцию смежных живых клеток 4-10. Более ранние исследования были сосредоточены на способности апоптотических клеток для подавления воспаления 11-16, но апоптотических клеток также модулировать широкий спектр клеточных функций, включая такие жизнедеятельности как выживание 4,9,10, пролиферации, дифференцировки 4,9,10 17, миграция 18, и рост 19. Более того, эти эффекты не ограничиваются профессиональными фагоцитами, как макрофагс, но распространяется на практически всех типов и линий клеток, в том числе традиционно не-фагоцитирующих клеток, таких как эпителиальные и эндотелиальные клетки 7,9,10,18-21.
Конкретный ответ соседних живых клеток после воздействия апоптотических клеток зависит от множества факторов, которые имеют отношение к обоим жизнеспособных клеток и реагирующих самих апоптотических клеток. Например, несмотря на то воздействие апоптотических клеток ингибирует пролиферацию обоих мышиных макрофагов и почечных проксимальных канальцев эпителиальных клеток (PTECs), эти два типа клеток резко отличаются по их реакции на выживание в апоптотических клеток 4,6,9,10. Апоптотических клеток способствуют выживанию макрофагов, но индуцирует апоптоз в PTECs 4,6,9,10. Следует отметить, что реакция на апоптотических клеток может отличаться даже среди отвечающих клеток к той же линии, в зависимости от органа , Отвечающий клетки происхождения 10 (например, почек PTECs против молочных желез эпителиальныеклетки) или состояние активации 22 (например, нейтрофилы). И наоборот, апоптотических клеток может вызывать различные реакции в той же самой клетке в зависимости от характера Апоптические стимула 10,23 или стадию апоптоза 10,14.
Учитывая несходство и сложность ответа на апоптотических клеток, большое внимание должно быть принято в рассекает сигнальных событий и путей, ответственных за какой-либо конкретного результата. Во- первых, ответы , требующие непосредственного физического взаимодействия между жизнеспособными и апоптотических клеток следует отличать от тех , вызываемое растворимых медиаторов выпущенных или генерируемых апоптического ячейкой 3,6-10. Если требуется физическое взаимодействие, то дальнейшая дифференциация должна быть выполнена. Сигнальных событий может зависеть от распознавания рецептора-опосредованного апоптоза клетки, независимо от последующего охвате, или на фагоцитарную поглощение, независимо от специфического рецептора, который связывает клеток путем апоптоза 3-7,9,10,19. В последнем случае, ответ не является специфическим для апоптотических клеток, и могут быть вызваны любым фагоцитарной материала 4,6.
Важность этих различий может быть вновь оценены контрастные реакции макрофагов и PTECs почек. Для обоих типов клеток, воздействие апоптотических клеток изменяет активность киназы про выживание Akt. Модуляция зависит от физического взаимодействия, так как разделение реагирования и апоптотических клеток путем поликарбонатную мембрану 0,4 мкм ликвидирует реакцию 4,9,10,19. Тем не менее, реакция PTECs является рецептор-опосредованного и не зависит от фагоцитоза, в то время как реакция макрофагов управляется фагоцитоза 4,9,10,19. Этот вывод подтверждается тем фактом , что воздействие латексных шариков, нейтральный фагоцитарной стимул, не оказывает никакого влияния на активность Akt в PTECs, но имитирует эффект апоптотических клеток в макрофагах 4,9.
"> Несмотря на то, менее хорошо изучены, клетки гибнут некроз, или случайной гибели клеток 1, также модулировать функцию рядом жизнеспособных клеток 3-10,19. Как и апоптотических клеток, некротические клетки проявляют свое действие с помощью различных механизмов, в частности, утечки внутриклеточного содержимого через их разрыва клеточной мембраны 3,5,6,9,24. Многие клетки, в том числе PTECs и макрофагами, обладают различными неконкурентных рецепторы клетки умирают некрозом 5,9. Взаимодействие этих рецепторов вызывает сигнальные события, часто противоположные тем , индуцированный зацепление рецепторов для апоптотических клеток 4-10,19. Например, в PTECs, некротические клетки увеличивают фосфорилирование Akt, в то время как апоптотических клеток уменьшают фосфорилирование 9,10,19.Здесь мы опишем протокол для идентификации внутриклеточных сигнальных событий, индуцированные в жизнеспособных PTECs почек через признание опосредованного рецепторами соседних апоптотических PTECs <sup> 9,10,19. В то время как протокол является специфичным для условно иммортализованной клеточной линии PTEC известный как клетки BU.MPT 9,10,19,25,26, он легко адаптируется к клеточных линий , которые не являются эпителиальные происхождения и / или полученный из материалов, отличных органов почки. Важно отметить, что использование апоптотических клеток в качестве клеточного стимула создает определенные трудности, присущие экспериментальные нет с растворимыми лигандами. Наиболее важным из них является то, что апоптотических клеток должны быть добавлены в виде суспензии, а не в качестве решения. Эти трудности, а также стратегии, чтобы максимально уменьшить или обойти их, обсуждаются в рамках протокола. Почти все из методов, описанных в протоколе просты и стандарт клеточной культуре. Преимущество этого протокола заключается в его внимании к нескольким механизмам, с помощью которых апоптотических клеток модулировать трансдукцию сигнала в пределах отвечающих клеток. Эти механизмы включают связывание через поверхностные детерминанты или преодоление молекул со специфическими рецепторами на реветствующий клеток, высвобождение растворимых медиаторов, и / или привлечение фагоцитарной машин. Отмершие клетки включены во всех экспериментах, чтобы гарантировать, что результаты являются специфическими для режима гибели клеток, а не обобщенный ответ на мертвых клеток. Тщательный подход, в соответствии с рекомендациями в этом протоколе, имеет решающее значение для нашего понимания постоянно расширяющемся влиянии, которое умирающие клетки оказывают на их живых соседей, как в здоровье и болезни.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы предлагаем здесь протокол для определения характеристик внутриклеточных сигнальных событий, индуцированные в жизнеспособных клеток после их воздействия клеток, подвергающихся апоптозу, или другие формы клеточной гибели. Протокол подчеркивает несколько механизмов, с помощью кот?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported, in whole or in part, by institutional funds from Dr. José A. Arruda and the Section of Nephrology, University of Illinois at Chicago (to J. S. L.); and funding from the Department of Medicine of McGill University and the Research Institute of the McGill University Health Centre (to J. R.)
Materials
| Cell culture materials | |||
| DMEM, 1X with [4.5 g/L] glucose, L-glutamine & sodium-pyruvate | Mediatech (Manassas, VA) | 10-013-CV | |
| HyClone Fetal Clone II, fetal bovine serum | GE Healthcare (Logan, UT) | SH30066.03 | add 10% (v/v) to the culture medium A |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine, 100X | Life Technologies (Grand Island, NY) | 10378-016 | add 100 units/mL to the culture media A and B |
| γ-Interferon, mouse recombinant, from Escherichia coli | Calbiochem, Millipore (Billerica, MA) | 407303 | add 10 units/mL to the culture medium A |
| Falcon polystyrene tissue-culture treated dishes, non-pyrogenic | Corning (Durham, NC) | 353003 | sterile, 100 mm diameter |
| Falcon polystyrene centrifuge tubes, conical bottom | Corning (Durham, NC) | 352095 | sterile, 15 mL |
| Trypsin-EDTA, 0.05%, Gibco | Fisher (Waltham, MA) | 25300062 | sterile, 100 mL |
| Name | Company | Catalog | Comments |
| Chemicals and inhibitors | |||
| Staurosporine, from Streptomyces sp. | Sigma (St. Louis, MO) | S4400 | use at [1 μg/mL] for 3 h to induce apoptosis |
| Epidermal growth factor (EGF), [1 mg/ml] | Millipore (Billerica, MA) | EA140 | use at 50 nM to stimulate responder cells |
| UltraPure, 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Life Technologies (Grand Island, NY) | 15575-038 | use 5 mM to detach adherent cells |
| Trypan blue solution, 0.4% | MP Biomedicals (Santa Ana, CA) | 91691049 | for dead cells staining |
| Paraformaldehyde Solution, 4% in DPBS | Affymetrix (Santa Clara, CA) | 19943 | use 0.4% (v/v) in 1× DPBS for cell fixation |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS), 1×, Gibco | Life Technologies (Grand Island, NY) | 14040133 | stock solution |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS), Ca+2- and Mg+2-free, 1×, Gibco | Life Technologies (Grand Island, NY) | 14190367 | stock solution |
| Cytochalasin D, 4 mM in dimethyl sulfoxide (DMSO), from Zygosporium mansonii | Sigma (St. Louis, MO) | C8273 | use at [4 μg/mL] to inhibit phagocytosis |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma (St. Louis, MO) | D2650 | solvent for cytochalasin D |
| Name | Company | Catalog | Comments |
| Cell lysis buffer ingredients | |||
| Tris-buffered saline (TBS), 10×, pH 7.4 | BioRad (Hercules, CA) | 1706435 | for cell lysis buffer |
| Sodium pyrophosphate | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | 221368 | 10 mM for cell lysis buffer |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | D6750 | 0.5% w/v for cell lysis buffer |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | L3771 | 0.1% w/v for cell lysis buffer |
| Glycerol | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | G5516 | 10% for cell lysis buffer |
| Sodium fluoride | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | 450022 | 25 mM for cell lysis buffer |
| Complete mini EDTA-free protease inhibitor cocktail tablet | Roche Diagnostics (Indianapolis, IN) | 4693159001 | for cell lysis buffer, 1 tablet per 10 mL of buffer |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | T8787 | 10% for cell lysis buffer |
| Dithiothreitol (DTT) | MP Biomedicals (Santa Ana, CA) | 11DTT00005 | 1 mM for cell lysis buffer |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | MP Biomedicals (Santa Ana, CA) | 4800263 | 1 mM for cell lysis buffer |
| Sodium orthovandate | MP Biomedicals (Santa Ana, CA) | 2159664 | 10 mM for cell lysis buffer |
| Name | Company | Catalog | Comments |
| Equipment | |||
| Sorvall T6000B centrifuge | Du Pont (Wilmington, DE) | T6000B | |
| Fisher Tissuemat, water bath | Fisher (Waltham, MA) | ||
| Sonic Dismembrator (sonicator), model 100 | Fisher (Waltham, MA) | ||
| Miscellaneous | |||
| Cell counting chamber, Neubauer | Hawksley (Lancing, Sussex, UK) | AC2000 | |
| Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit II | Millipore (Billerica, MA) | CBA059 | for PI and Annexin V staining to determine the stage of apoptosis |
| Eppendorf microcntrifuge tubes, 1.5 ml | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | T9661 | |
| Transwell permeable support, 0.4 μm polycarbonate membrane | Corning (Corning, NY) | 3413 | sterile, polystyrene, tissue culture treated |
| Name | Company | Catalog | Comments |
| Antibodies | |||
| Phospho-glycogen synthase kinase-3α/β (GSK-3α/β) (Ser21/9), polyclonal antibody | Cell Signaling Technology | 9331 | rabbit polyclonal antibody |
| Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) monoclonal antobody ( (14C10) ) | Cell Signaling Technology | 2118 | rabbit monoclonal antibody |
References
- Galluzzi, L., et al. Essential versus accessory aspects of cell death: recommendations of the NCCD 2015. Cell Death Differ. 22, 58-73 (2015).
- Wallach, D., Kang, T. -. B., Kovalenko, A. Concepts of tissue injury and cell death in inflammation: a historical perspective. Nature Rev. Immunol. 14, 51-59 (2014).
- Hochreiter-Hufford, A., Ravichandran, K. S. Clearing the dead: Apoptotic cell sensing, recognition, engulfment, and digestion. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 5, a008748 (2013).
- Reddy, S. M., et al. Phagocytosis of apoptotic cells by macrophages induces novel signaling events leading to cytokine-independent survival and inhibition of proliferation: activation of Akt and inhibition of extracellular signal-regulated kinases 1 and 2. J. Immunol. 169, 702-713 (2002).
- Cvetanovic, M., Ucker, D. S. Innate immune discrimination of apoptotic cells: repression of proinflammatory macrophage transcription is coupled directly to specific recognition. J. Immunol. 172, 880-889 (2004).
- Patel, V. A., et al. Apoptotic cells, at all stages of the death process, trigger characteristic signaling events that are divergent from and dominant over those triggered by necrotic cells: implications for the delayed clearance model of autoimmunity. J. Biol. Chem. 281, 4663-4670 (2006).
- Cvetanovic, M., et al. Specific recognition of apoptotic cells reveals a ubiquitous and unconventional innate immunity. J. Biol. Chem. 281, 20055-20067 (2006).
- Birge, R. B., Ucker, D. S. Innate apoptotic immunity: the calming touch of death. Cell Death Differ. 15, 1096-1102 (2008).
- Patel, V. A., et al. Recognition of apoptotic cells by epithelial cells: conserved versus tissue-specific signaling responses. J. Biol. Chem. 285, 1829-1840 (2010).
- Patel, V. A., et al. Recognition-dependent signaling events in response to apoptotic targets inhibit epithelial cell viability by multiple mechanisms: implications for non-immune tissue homeostasis. J. Biol. Chem. 287, 13761-13777 (2012).
- Voll, R. E., Herrmann, M., Roth, E. A., Stach, C., Kalden, J. R., Girkontaite, I. Immunosuppressive effects of apoptotic cells. Nature. 390, 350-351 (1997).
- Fadok, V. A., Bratton, D. L., Konowal, A., Freed, P. W., Westcott, J. Y., Henson, P. M. Macrophages that have ingested apoptotic cells in vitro inhibit proinflammatory cytokine production through autocrine/ paracrine mechanisms involving TGF-β, PGE2, and PAF. J. Clin. Investig. 101, 890-898 (1998).
- Lucas, M., Stuart, L. M., Savill, J., Lacy-Hulbert, A. Apoptotic cells and innate immune stimuli combine to regulate macrophage cytokine secretion. J. Immunol. 171, 2610-2615 (2003).
- Ariel, A., et al. Apoptotic neutrophils and T cells sequester chemokines during immune response resolution through modulation of CCR5 expression. Nature Immunol. 7 (11), 1209-1216 (2006).
- Schwab, J. M., Chiang, N., Arita, M., Serhan, C. N. Resolvin E1 and protectin D1 activate inflammation-resolution programmes. Nature. 447, 869-874 (2007).
- Rothlin, C. V., Ghosh, S., Zuniga, E. I., Oldstone, M. B. A., Lemke, G. TAM receptors are pleiotropic inhibitors of the innate immune response. Cell. 131, 1124-1136 (2007).
- Li, F., et al. Apoptotic cells can activate the “phoenix rising” pathway to promote wound healing and tissue regeneration. Sci. Signal. 3, ra13 (2010).
- Peter, C., Wesselborg, S., Hermann, M., Lauber, K. Dangerous attraction: phagocyte recruitment and danger signals of apoptotic and necrotic cells. Apoptosis. 15 (2010), 1007-1028 (2010).
- Patel, V. A., et al. Apoptotic cells activate AMPK and inhibit epithelial cell growth without change in intracellular energy stores. J. Biol. Chem. 290, 22352-22369 (2015).
- Hess, K. L., Tudor, K. -. S. R. S., Johnson, J. D., Osati-Ashtiani, F., Askew, D. S. Cook-Mills J.M. Human and murine high endothelial venule cells phagocytose apoptotic leukocytes. Exp. Cell Res. 236, 404-411 (1997).
- Zernecke, A., et al. Delivery of microRNA-126 by apoptotic bodies induces CXCL12-dependent vascular protection. Sci. Signal. 2, ra51 (2009).
- Esmann, L., et al. Phagocytosis of apoptotic cells by neutrophil granulocytes: diminished proinflammatory neutrophil functions in the presence of apoptotic cells. J. Immunol. 184, 391-400 (2010).
- Obeid, M., et al. Calreticulin exposure dictates the immunogenicity of cancer cell death. Nature Med. 13, 54-61 (2007).
- Peter, C., Wesselborg, S., Hermann, M., Lauber, K. Dangerous attraction: phagocyte recruitment and danger signals of apoptotic and necrotic cells. Apoptosis. 15, 1007-1028 (2010).
- Sinha, D., et al. Lithium activates the Wnt and phosphatidylinositol 3-kinase Akt signaling pathways to promote cell survival in the absence of soluble survival factors. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 288, F703-F713 (2005).
- Jat, P. S., et al. Direct derivation of conditionally immortal cell lines from an H-2Kb-tsA58 transgenic mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 5096-5100 (1991).
- Wakasugi, K., Schimmel, P. Two distinct cytokines released from a human aminoacyl-tRNA-synthetase. Science. 284, 147-151 (1999).
