Identifizierung von intrazellulärer Induzierte in lebenden Zellen durch Interaktion Signalisierung mit Benachbarte Zellen, die eine programmierten Zelltods
Summary
Here, we present a protocol for the determination of intracellular signaling events induced in viable cells by physical interaction with adjacent dead or dying cells. The protocol focuses on signaling events induced by receptor-mediated recognition of the dead cells, as opposed to their phagocytic uptake or release of soluble mediators.
Abstract
Die Zellen durch Apoptose sterben, auch bezeichnet als regulierte Zelltod, mehrere neue Aktivitäten zu erwerben, die es ihnen ermöglichen, die Funktion von benachbarten lebenden Zellen zu beeinflussen. Vitale Aktivitäten, wie das Überleben, die Proliferation, das Wachstum und die Differenzierung, gehören zu den vielen Zellfunktionen durch apoptotische Zellen moduliert. Die Fähigkeit, apoptotische Zellen zu erkennen und zu reagieren scheint ein universelles Merkmal aller Zellen zu sein, unabhängig von Lineage oder Organ des Ursprungs. Allerdings ist die Vielfalt und Komplexität der Reaktion auf apoptotischen Zellen vor, dass große Sorgfalt, die für ein bestimmtes Ergebnis in sezieren die Signalereignisse und Wege genommen werden. Insbesondere muß man unter den mehreren Mechanismen unterscheiden, durch die apoptotischen Zellen intrazelluläre Signalwege innerhalb tragfähige Responderzellen beeinflussen können, einschließlich: Rezeptor-vermittelte Erkennung der apoptotischen Zellen, die Freisetzung von löslichen Mediatoren durch die apoptotische Zelle und / oder Eingriff der phagocytic Maschinen. Hier stellen wir ein Protokoll zur Identifizierung von intrazellulären Signalereignissen, die lebensfähige Responderzellen nach ihrer Exposition gegenüber apoptotischen Zellen induziert werden. Ein Hauptvorteil des Protokolls liegt in der Aufmerksamkeit es Dissektion des Mechanismus zahlt, durch die apoptotischen Zellen Ereignisse innerhalb reagiert Zellen modulieren signalisiert. Während das Protokoll für eine konditional immortalisierten Mausniere proximalen röhrenförmigen Zelllinie (BU.MPT Zellen) spezifisch ist, ist es leicht zu Zelllinien, die angepasst Ursprungs und / oder abgeleitet von anderen Organen als der Niere nicht-epithelialen sind. Die Verwendung von toten Zellen als Stimulus stellt einige einzigartige Faktoren, die den Nachweis von intrazellulären Signalereignisse behindern. Diese Probleme sowie Strategien zu minimieren oder zu umgehen, sie werden innerhalb des Protokolls erörtert. Die Anwendung dieses Protokolls sollte unsere wachsenden Wissen der breiten Einfluss unterstützen, die toten oder sterbenden Zellen auf ihre Live-Nachbarn ausüben, sowohl in den Bereichen Gesundheit und in disease.
Introduction
Apoptosis oder regulierte Zelltod 1 trägt in wesentlicher Weise zur Erhaltung und Entwicklung von Geweben. Gesehen am einfachsten, Apoptose Genehmigungen im Alter, beschädigt oder überschüssige Zellen ohne Schaden für das umgebende Gewebe 2,3 beseitigt werden. Der Beitrag der Apoptose Gewebshomöostase jedoch wesentlich dynamischer und vielfältig. Die Zellen durch Apoptose erwerben mehrere neue Aktivitäten zu sterben, beide abgesondert und zellassoziierte, die es ihnen ermöglichen 4-10 die Funktion benachbarter lebenden Zellen zu beeinflussen. Frühere Untersuchungen über die Fähigkeit von apoptotischen Zellen konzentriert Entzündung 11-16, aber apoptotischen Zellen zu unterdrücken , auch ein breites Spektrum von Zellfunktionen modulieren, einschließlich solcher vital Aktivitäten als Überleben 4,9,10, 4,9,10 – Proliferation, Differentiation 17, Migration 18 und 19 das Wachstum. Außerdem sind diese Wirkungen nicht auf professionelle Phagozyten beschränkt ist, wie Makrophagens, aber auf praktisch allen Zelltypen und Abstammungslinien erstrecken, einschließlich traditionell nicht-phagozytische Zellen, wie Epithelzellen und Endothelzellen 7,9,10,18-21.
Die spezifische Reaktion benachbarter lebenden Zellen zu apoptotischen Zellen nach der Exposition, hängt von mehreren Faktoren, die sowohl die lebensfähigen reagierenden Zellen beziehen, und den apoptotischen Zellen selbst. Obwohl beispielsweise Exposition gegenüber apoptotischen Zellen hemmt , die Proliferation von sowohl murinen Makrophagen und Nieren proximalen tubulären Epithelzellen (ptecs), wobei diese beiden Zelltypen unterscheiden sich erheblich in ihrem Überleben Reaktion auf apoptotische Zellen 4,6,9,10. Apoptotischen Zellen fördern das Überleben von Makrophagen, aber der apoptotischen Tod von ptecs 4,6,9,10 induzieren. Bemerkenswert ist , kann die Reaktion auf apoptotische Zellen unterscheiden sich auch Zellen der gleichen Abstammungslinie, abhängig von der Reaktion Zelle Ursprungsorgan 10 (beispielsweise Nieren ptecs Vergleich Brustepithelzellen unter reagiertZellen) oder Zustand der Aktivierung 22 (zB Neutrophile). Umgekehrt kann apoptotischen Zellen unterschiedliche Antworten in der gleichen Zelle evozieren von der Art des apoptotischen Stimulus abhängig 10,23 oder das Stadium der Apoptose 10,14.
Da müssen die Verschiedenheit und Komplexität der Reaktion auf apoptotischen Zellen, große Sorgfalt in sezieren die Signalereignisse und Wege für einen bestimmten Ergebnis verantwortlich gemacht werden. Erstens Antworten direkte physikalische Interaktion zwischen lebens- und apoptotischen Zellen erfordern , müssen von den durch lösliche Mediatoren durch die apoptotische Zelle 3,6-10 freigesetzt oder erzeugt ausgelöst differenziert werden. Wenn physikalische Wechselwirkung erforderlich ist, dann sollte eine weitere Differenzierung vorgenommen werden. Signalisierungsereignisse können auf Rezeptor-vermittelte Erkennung der apoptotischen Zelle, unabhängig von nachfolgenden engulfment abhängen, oder Phagozytose, unabhängig von dem spezifischen Rezeptor, der die apoptotische Zelle bindet 3-7,9,10,19. Im letzteren Fall ist die Antwort auf apoptotischen Zellen nicht spezifisch, und kann von jedem Material phagozytischen 4,6 ausgelöst werden.
Die Bedeutung dieser Unterscheidung kann wiederum durch kontras die Antworten von Makrophagen und Nieren ptecs geschätzt. Für beide Zelltypen, Exposition gegenüber apoptotischen Zellen verändert die Aktivität des Pro-Überleben kinase Akt. Die Modulation ist abhängig von physikalischen Wechselwirkung, da die Trennung von Reaktion und apoptotischen Zellen durch eine 0,4 um Polycarbonatmembran hebt die Antwort 4,9,10,19. Jedoch ist die Reaktion von ptecs rezeptorvermittelten und unabhängig von Phagocytose, während die Reaktion der Makrophagen durch Phagozytose 4,9,10,19 angetrieben wird. Diese Schlussfolgerung wird durch die Tatsache verstärkt , dass die Exposition gegenLatexKügelchen, einem neutralen phagozytischen Reiz, keine Auswirkungen auf die Akt – Aktivität in ptecs hat, sondern ahmt die Wirkung von apoptotischen Zellen in Makrophagen 4,9.
"> Obwohl weniger gut untersucht, sterbende Zellen durch Nekrose oder zufälligen Zelltod 1, modulieren auch die Funktion der lebensfähigen Zellen in der Nähe 3-10,19. Wie apoptotischen Zellen, nekrotische Zellen üben ihre Wirkungen durch eine Vielzahl von Mechanismen, insbesondere der Leckage der intrazellulären Inhalte durch ihre geplatzten Zellmembran 3,5,6,9,24. Viele Zellen, einschließlich ptecs und Makrophagen besitzen ausgeprägte nicht-konkurrierende Rezeptoren für durch Nekrose 5,9 sterbende Zellen. Verpflichtungs dieser Rezeptoren signal~~POS=TRUNC induziert, die durch den Eingriff der Rezeptoren für apoptotische Zellen zu denen häufig entgegengesetzte 4-10,19 induziert , z. B. in ptecs erhöhen nekrotischen Zellen die Phosphorylierung von Akt, während apoptotischen Zellen Phosphorylierung 9,10,19 verringern.Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Identifizierung von intrazellulären Signalereignisse induziert in lebensfähige Niere ptecs durch Rezeptor-vermittelte Erkennung von benachbarten apoptotischen ptecs <sup> 9,10,19. Während das Protokoll für eine konditional immortalisierte Zellinie PTEC bekannt als BU.MPT Zellen 9,10,19,25,26 spezifisch ist, ist es leicht zu Zelllinien , die angepasst Ursprungs und / oder abgeleitet von anderen Organen nicht-epithelialen sind als die Niere. Wichtig ist, stellt die Verwendung von apoptotischen Zellen als Zell Reiz bestimmte inhärente experimentellen Schwierigkeiten nicht vorhanden mit löslichen Liganden. Der wichtigste davon ist, dass apoptotische Zellen als Suspension zugegeben werden müssen und nicht als eine Lösung. Diese Schwierigkeiten, sowie Strategien zu minimieren oder zu umgehen, sie werden innerhalb des Protokolls erörtert. Fast alle der in dem Protokoll beschriebenen Techniken sind einfach und Standard-Zellkultur. Der Vorteil dieses Protokolls liegt in seiner Aufmerksamkeit auf die mehrere Mechanismen, durch die apoptotischen Zellen Signaltransduktion innerhalb reagierenden Zellen modulieren. Diese Mechanismen schließen die Bindung über Oberflächendeterminanten oder Brückenmoleküle an spezifische Rezeptoren auf der Wiederchenden Zelle, die Freisetzung von löslichen Mediatoren und / oder der Eingriff der phagozytischen Maschinen. Nekrotische Zellen werden in allen Experimenten eingeschlossen, um sicherzustellen, dass die Ergebnisse sind spezifisch für die Art des Zelltods, und nicht eine verallgemeinerte Reaktion auf tote Zellen. Eine sorgfältige Ansatz, wie in diesem Protokoll empfohlen, ist von entscheidender Bedeutung für unser Verständnis von der stetig wachsenden Einfluss, den sterbenden Zellen auf ihre Live-Nachbarn ausüben, sowohl in Gesundheit und Krankheit.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir stellen hier ein Protokoll, um die intrazelluläre Signalisierungsereignisse für die Charakterisierung in lebenden Zellen induziert nach ihrer Exposition gegenüber Zellen, die einer Apoptose unterliegen, oder anderen Formen von Zelltod. Das Protokoll betont die mehrere Mechanismen, durch die Exposition gegenüber apoptotischen Zellen intrazelluläre Signalwege innerhalb tragfähige Responderzellen modulieren können. Diese Mechanismen sind: die Interaktion (über Moleküle oder Oberflächendeterminanten auf die to…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported, in whole or in part, by institutional funds from Dr. José A. Arruda and the Section of Nephrology, University of Illinois at Chicago (to J. S. L.); and funding from the Department of Medicine of McGill University and the Research Institute of the McGill University Health Centre (to J. R.)
Materials
| Cell culture materials | |||
| DMEM, 1X with [4.5 g/L] glucose, L-glutamine & sodium-pyruvate | Mediatech (Manassas, VA) | 10-013-CV | |
| HyClone Fetal Clone II, fetal bovine serum | GE Healthcare (Logan, UT) | SH30066.03 | add 10% (v/v) to the culture medium A |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine, 100X | Life Technologies (Grand Island, NY) | 10378-016 | add 100 units/mL to the culture media A and B |
| γ-Interferon, mouse recombinant, from Escherichia coli | Calbiochem, Millipore (Billerica, MA) | 407303 | add 10 units/mL to the culture medium A |
| Falcon polystyrene tissue-culture treated dishes, non-pyrogenic | Corning (Durham, NC) | 353003 | sterile, 100 mm diameter |
| Falcon polystyrene centrifuge tubes, conical bottom | Corning (Durham, NC) | 352095 | sterile, 15 mL |
| Trypsin-EDTA, 0.05%, Gibco | Fisher (Waltham, MA) | 25300062 | sterile, 100 mL |
| Name | Company | Catalog | Comments |
| Chemicals and inhibitors | |||
| Staurosporine, from Streptomyces sp. | Sigma (St. Louis, MO) | S4400 | use at [1 μg/mL] for 3 h to induce apoptosis |
| Epidermal growth factor (EGF), [1 mg/ml] | Millipore (Billerica, MA) | EA140 | use at 50 nM to stimulate responder cells |
| UltraPure, 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Life Technologies (Grand Island, NY) | 15575-038 | use 5 mM to detach adherent cells |
| Trypan blue solution, 0.4% | MP Biomedicals (Santa Ana, CA) | 91691049 | for dead cells staining |
| Paraformaldehyde Solution, 4% in DPBS | Affymetrix (Santa Clara, CA) | 19943 | use 0.4% (v/v) in 1× DPBS for cell fixation |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS), 1×, Gibco | Life Technologies (Grand Island, NY) | 14040133 | stock solution |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS), Ca+2- and Mg+2-free, 1×, Gibco | Life Technologies (Grand Island, NY) | 14190367 | stock solution |
| Cytochalasin D, 4 mM in dimethyl sulfoxide (DMSO), from Zygosporium mansonii | Sigma (St. Louis, MO) | C8273 | use at [4 μg/mL] to inhibit phagocytosis |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma (St. Louis, MO) | D2650 | solvent for cytochalasin D |
| Name | Company | Catalog | Comments |
| Cell lysis buffer ingredients | |||
| Tris-buffered saline (TBS), 10×, pH 7.4 | BioRad (Hercules, CA) | 1706435 | for cell lysis buffer |
| Sodium pyrophosphate | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | 221368 | 10 mM for cell lysis buffer |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | D6750 | 0.5% w/v for cell lysis buffer |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | L3771 | 0.1% w/v for cell lysis buffer |
| Glycerol | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | G5516 | 10% for cell lysis buffer |
| Sodium fluoride | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | 450022 | 25 mM for cell lysis buffer |
| Complete mini EDTA-free protease inhibitor cocktail tablet | Roche Diagnostics (Indianapolis, IN) | 4693159001 | for cell lysis buffer, 1 tablet per 10 mL of buffer |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | T8787 | 10% for cell lysis buffer |
| Dithiothreitol (DTT) | MP Biomedicals (Santa Ana, CA) | 11DTT00005 | 1 mM for cell lysis buffer |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | MP Biomedicals (Santa Ana, CA) | 4800263 | 1 mM for cell lysis buffer |
| Sodium orthovandate | MP Biomedicals (Santa Ana, CA) | 2159664 | 10 mM for cell lysis buffer |
| Name | Company | Catalog | Comments |
| Equipment | |||
| Sorvall T6000B centrifuge | Du Pont (Wilmington, DE) | T6000B | |
| Fisher Tissuemat, water bath | Fisher (Waltham, MA) | ||
| Sonic Dismembrator (sonicator), model 100 | Fisher (Waltham, MA) | ||
| Miscellaneous | |||
| Cell counting chamber, Neubauer | Hawksley (Lancing, Sussex, UK) | AC2000 | |
| Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit II | Millipore (Billerica, MA) | CBA059 | for PI and Annexin V staining to determine the stage of apoptosis |
| Eppendorf microcntrifuge tubes, 1.5 ml | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | T9661 | |
| Transwell permeable support, 0.4 μm polycarbonate membrane | Corning (Corning, NY) | 3413 | sterile, polystyrene, tissue culture treated |
| Name | Company | Catalog | Comments |
| Antibodies | |||
| Phospho-glycogen synthase kinase-3α/β (GSK-3α/β) (Ser21/9), polyclonal antibody | Cell Signaling Technology | 9331 | rabbit polyclonal antibody |
| Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) monoclonal antobody ( (14C10) ) | Cell Signaling Technology | 2118 | rabbit monoclonal antibody |
References
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