Summary

Identifizierung von intrazellulärer Induzierte in lebenden Zellen durch Interaktion Signalisierung mit Benachbarte Zellen, die eine programmierten Zelltods

Published: December 27, 2016
doi:

Summary

Here, we present a protocol for the determination of intracellular signaling events induced in viable cells by physical interaction with adjacent dead or dying cells. The protocol focuses on signaling events induced by receptor-mediated recognition of the dead cells, as opposed to their phagocytic uptake or release of soluble mediators.

Abstract

Die Zellen durch Apoptose sterben, auch bezeichnet als regulierte Zelltod, mehrere neue Aktivitäten zu erwerben, die es ihnen ermöglichen, die Funktion von benachbarten lebenden Zellen zu beeinflussen. Vitale Aktivitäten, wie das Überleben, die Proliferation, das Wachstum und die Differenzierung, gehören zu den vielen Zellfunktionen durch apoptotische Zellen moduliert. Die Fähigkeit, apoptotische Zellen zu erkennen und zu reagieren scheint ein universelles Merkmal aller Zellen zu sein, unabhängig von Lineage oder Organ des Ursprungs. Allerdings ist die Vielfalt und Komplexität der Reaktion auf apoptotischen Zellen vor, dass große Sorgfalt, die für ein bestimmtes Ergebnis in sezieren die Signalereignisse und Wege genommen werden. Insbesondere muß man unter den mehreren Mechanismen unterscheiden, durch die apoptotischen Zellen intrazelluläre Signalwege innerhalb tragfähige Responderzellen beeinflussen können, einschließlich: Rezeptor-vermittelte Erkennung der apoptotischen Zellen, die Freisetzung von löslichen Mediatoren durch die apoptotische Zelle und / oder Eingriff der phagocytic Maschinen. Hier stellen wir ein Protokoll zur Identifizierung von intrazellulären Signalereignissen, die lebensfähige Responderzellen nach ihrer Exposition gegenüber apoptotischen Zellen induziert werden. Ein Hauptvorteil des Protokolls liegt in der Aufmerksamkeit es Dissektion des Mechanismus zahlt, durch die apoptotischen Zellen Ereignisse innerhalb reagiert Zellen modulieren signalisiert. Während das Protokoll für eine konditional immortalisierten Mausniere proximalen röhrenförmigen Zelllinie (BU.MPT Zellen) spezifisch ist, ist es leicht zu Zelllinien, die angepasst Ursprungs und / oder abgeleitet von anderen Organen als der Niere nicht-epithelialen sind. Die Verwendung von toten Zellen als Stimulus stellt einige einzigartige Faktoren, die den Nachweis von intrazellulären Signalereignisse behindern. Diese Probleme sowie Strategien zu minimieren oder zu umgehen, sie werden innerhalb des Protokolls erörtert. Die Anwendung dieses Protokolls sollte unsere wachsenden Wissen der breiten Einfluss unterstützen, die toten oder sterbenden Zellen auf ihre Live-Nachbarn ausüben, sowohl in den Bereichen Gesundheit und in disease.

Introduction

Apoptosis oder regulierte Zelltod 1 trägt in wesentlicher Weise zur Erhaltung und Entwicklung von Geweben. Gesehen am einfachsten, Apoptose Genehmigungen im Alter, beschädigt oder überschüssige Zellen ohne Schaden für das umgebende Gewebe 2,3 beseitigt werden. Der Beitrag der Apoptose Gewebshomöostase jedoch wesentlich dynamischer und vielfältig. Die Zellen durch Apoptose erwerben mehrere neue Aktivitäten zu sterben, beide abgesondert und zellassoziierte, die es ihnen ermöglichen 4-10 die Funktion benachbarter lebenden Zellen zu beeinflussen. Frühere Untersuchungen über die Fähigkeit von apoptotischen Zellen konzentriert Entzündung 11-16, aber apoptotischen Zellen zu unterdrücken , auch ein breites Spektrum von Zellfunktionen modulieren, einschließlich solcher vital Aktivitäten als Überleben 4,9,10, 4,9,10 – Proliferation, Differentiation 17, Migration 18 und 19 das Wachstum. Außerdem sind diese Wirkungen nicht auf professionelle Phagozyten beschränkt ist, wie Makrophagens, aber auf praktisch allen Zelltypen und Abstammungslinien erstrecken, einschließlich traditionell nicht-phagozytische Zellen, wie Epithelzellen und Endothelzellen 7,9,10,18-21.

Die spezifische Reaktion benachbarter lebenden Zellen zu apoptotischen Zellen nach der Exposition, hängt von mehreren Faktoren, die sowohl die lebensfähigen reagierenden Zellen beziehen, und den apoptotischen Zellen selbst. Obwohl beispielsweise Exposition gegenüber apoptotischen Zellen hemmt , die Proliferation von sowohl murinen Makrophagen und Nieren proximalen tubulären Epithelzellen (ptecs), wobei diese beiden Zelltypen unterscheiden sich erheblich in ihrem Überleben Reaktion auf apoptotische Zellen 4,6,9,10. Apoptotischen Zellen fördern das Überleben von Makrophagen, aber der apoptotischen Tod von ptecs 4,6,9,10 induzieren. Bemerkenswert ist , kann die Reaktion auf apoptotische Zellen unterscheiden sich auch Zellen der gleichen Abstammungslinie, abhängig von der Reaktion Zelle Ursprungsorgan 10 (beispielsweise Nieren ptecs Vergleich Brustepithelzellen unter reagiertZellen) oder Zustand der Aktivierung 22 (zB Neutrophile). Umgekehrt kann apoptotischen Zellen unterschiedliche Antworten in der gleichen Zelle evozieren von der Art des apoptotischen Stimulus abhängig 10,23 oder das Stadium der Apoptose 10,14.

Da müssen die Verschiedenheit und Komplexität der Reaktion auf apoptotischen Zellen, große Sorgfalt in sezieren die Signalereignisse und Wege für einen bestimmten Ergebnis verantwortlich gemacht werden. Erstens Antworten direkte physikalische Interaktion zwischen lebens- und apoptotischen Zellen erfordern , müssen von den durch lösliche Mediatoren durch die apoptotische Zelle 3,6-10 freigesetzt oder erzeugt ausgelöst differenziert werden. Wenn physikalische Wechselwirkung erforderlich ist, dann sollte eine weitere Differenzierung vorgenommen werden. Signalisierungsereignisse können auf Rezeptor-vermittelte Erkennung der apoptotischen Zelle, unabhängig von nachfolgenden engulfment abhängen, oder Phagozytose, unabhängig von dem spezifischen Rezeptor, der die apoptotische Zelle bindet 3-7,9,10,19. Im letzteren Fall ist die Antwort auf apoptotischen Zellen nicht spezifisch, und kann von jedem Material phagozytischen 4,6 ausgelöst werden.

Die Bedeutung dieser Unterscheidung kann wiederum durch kontras die Antworten von Makrophagen und Nieren ptecs geschätzt. Für beide Zelltypen, Exposition gegenüber apoptotischen Zellen verändert die Aktivität des Pro-Überleben kinase Akt. Die Modulation ist abhängig von physikalischen Wechselwirkung, da die Trennung von Reaktion und apoptotischen Zellen durch eine 0,4 um Polycarbonatmembran hebt die Antwort 4,9,10,19. Jedoch ist die Reaktion von ptecs rezeptorvermittelten und unabhängig von Phagocytose, während die Reaktion der Makrophagen durch Phagozytose 4,9,10,19 angetrieben wird. Diese Schlussfolgerung wird durch die Tatsache verstärkt , dass die Exposition gegenLatexKügelchen, einem neutralen phagozytischen Reiz, keine Auswirkungen auf die Akt – Aktivität in ptecs hat, sondern ahmt die Wirkung von apoptotischen Zellen in Makrophagen 4,9.

"> Obwohl weniger gut untersucht, sterbende Zellen durch Nekrose oder zufälligen Zelltod 1, modulieren auch die Funktion der lebensfähigen Zellen in der Nähe 3-10,19. Wie apoptotischen Zellen, nekrotische Zellen üben ihre Wirkungen durch eine Vielzahl von Mechanismen, insbesondere der Leckage der intrazellulären Inhalte durch ihre geplatzten Zellmembran 3,5,6,9,24. Viele Zellen, einschließlich ptecs und Makrophagen besitzen ausgeprägte nicht-konkurrierende Rezeptoren für durch Nekrose 5,9 sterbende Zellen. Verpflichtungs dieser Rezeptoren signal~~POS=TRUNC induziert, die durch den Eingriff der Rezeptoren für apoptotische Zellen zu denen häufig entgegengesetzte 4-10,19 induziert , z. B. in ptecs erhöhen nekrotischen Zellen die Phosphorylierung von Akt, während apoptotischen Zellen Phosphorylierung 9,10,19 verringern.

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Identifizierung von intrazellulären Signalereignisse induziert in lebensfähige Niere ptecs durch Rezeptor-vermittelte Erkennung von benachbarten apoptotischen ptecs <sup> 9,10,19. Während das Protokoll für eine konditional immortalisierte Zellinie PTEC bekannt als BU.MPT Zellen 9,10,19,25,26 spezifisch ist, ist es leicht zu Zelllinien , die angepasst Ursprungs und / oder abgeleitet von anderen Organen nicht-epithelialen sind als die Niere. Wichtig ist, stellt die Verwendung von apoptotischen Zellen als Zell Reiz bestimmte inhärente experimentellen Schwierigkeiten nicht vorhanden mit löslichen Liganden. Der wichtigste davon ist, dass apoptotische Zellen als Suspension zugegeben werden müssen und nicht als eine Lösung. Diese Schwierigkeiten, sowie Strategien zu minimieren oder zu umgehen, sie werden innerhalb des Protokolls erörtert. Fast alle der in dem Protokoll beschriebenen Techniken sind einfach und Standard-Zellkultur. Der Vorteil dieses Protokolls liegt in seiner Aufmerksamkeit auf die mehrere Mechanismen, durch die apoptotischen Zellen Signaltransduktion innerhalb reagierenden Zellen modulieren. Diese Mechanismen schließen die Bindung über Oberflächendeterminanten oder Brückenmoleküle an spezifische Rezeptoren auf der Wiederchenden Zelle, die Freisetzung von löslichen Mediatoren und / oder der Eingriff der phagozytischen Maschinen. Nekrotische Zellen werden in allen Experimenten eingeschlossen, um sicherzustellen, dass die Ergebnisse sind spezifisch für die Art des Zelltods, und nicht eine verallgemeinerte Reaktion auf tote Zellen. Eine sorgfältige Ansatz, wie in diesem Protokoll empfohlen, ist von entscheidender Bedeutung für unser Verständnis von der stetig wachsenden Einfluss, den sterbenden Zellen auf ihre Live-Nachbarn ausüben, sowohl in Gesundheit und Krankheit.

Protocol

1. Vorbereitungen Anmerkung: In diesem Protokoll werden zwei oder mehrere Zelllinien oder primäre Zellkulturen werden unabhängig hergestellt unter spezifischen Bedingungen. Diese Präparate enthalten apoptotischen Zellen (Protokoll 1), nekrotische Zellen (Protokoll 2) und gesunden Responderzellen (Protokoll 3). Nach unabhängige Herstellung sind apoptotischen oder nekrotischen Zellen zu Responderzellen zugegeben und die erhaltene Signaltransduktion wird überwacht (Protocols 4, 5 und 6). </p…

Representative Results

In Abbildung 1 stellen wir eine schematische Darstellung der Timing- und kritischen Schritte bei der Herstellung von apoptotischen Zellen beteiligt (Protokoll 1) und nekrotischen Zellen (Protokoll 2) und die Stimulation von Responderzellen mit Suspensionen von apoptotischen und nekrotischen Zellen (Protokoll 4). In Figur 2 stellen wir repräsentative Ergebnisse , die Wirkung von apoptotischen …

Discussion

Wir stellen hier ein Protokoll, um die intrazelluläre Signalisierungsereignisse für die Charakterisierung in lebenden Zellen induziert nach ihrer Exposition gegenüber Zellen, die einer Apoptose unterliegen, oder anderen Formen von Zelltod. Das Protokoll betont die mehrere Mechanismen, durch die Exposition gegenüber apoptotischen Zellen intrazelluläre Signalwege innerhalb tragfähige Responderzellen modulieren können. Diese Mechanismen sind: die Interaktion (über Moleküle oder Oberflächendeterminanten auf die to…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported, in whole or in part, by institutional funds from Dr. José A. Arruda and the Section of Nephrology, University of Illinois at Chicago (to J. S. L.); and funding from the Department of Medicine of McGill University and the Research Institute of the McGill University Health Centre (to J. R.)

Materials

Cell culture materials
DMEM, 1X with [4.5 g/L] glucose, L-glutamine & sodium-pyruvate Mediatech (Manassas, VA) 10-013-CV
HyClone Fetal Clone II, fetal bovine serum GE Healthcare (Logan, UT) SH30066.03 add 10% (v/v)  to the culture medium A
Penicillin-Streptomycin-Glutamine, 100X Life Technologies (Grand Island, NY) 10378-016 add 100 units/mL to the culture media A and B
γ-Interferon, mouse recombinant, from Escherichia coli Calbiochem, Millipore (Billerica, MA) 407303 add 10 units/mL to the culture medium A
Falcon polystyrene tissue-culture treated dishes, non-pyrogenic Corning (Durham, NC) 353003 sterile, 100 mm diameter
Falcon polystyrene centrifuge tubes, conical bottom Corning (Durham, NC) 352095 sterile, 15 mL
Trypsin-EDTA, 0.05%, Gibco Fisher (Waltham, MA) 25300062 sterile, 100 mL
Name Company Catalog Comments
Chemicals and inhibitors
Staurosporine, from Streptomyces sp. Sigma (St. Louis, MO) S4400 use at [1 μg/mL] for 3 h to induce apoptosis
Epidermal growth factor (EGF), [1 mg/ml] Millipore (Billerica, MA) EA140 use at 50 nM to stimulate responder cells
UltraPure, 0.5 M EDTA, pH 8.0 Life Technologies (Grand Island, NY) 15575-038 use 5 mM to detach adherent cells
Trypan blue solution, 0.4% MP Biomedicals (Santa Ana, CA) 91691049 for dead cells staining
Paraformaldehyde Solution, 4% in DPBS Affymetrix (Santa Clara, CA) 19943 use 0.4% (v/v) in 1× DPBS for cell fixation
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS), 1×, Gibco Life Technologies (Grand Island, NY) 14040133 stock solution
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS), Ca+2- and Mg+2-free, 1×, Gibco Life Technologies (Grand Island, NY) 14190367 stock solution
Cytochalasin D, 4 mM in dimethyl sulfoxide (DMSO), from Zygosporium mansonii Sigma (St. Louis, MO) C8273 use at [4 μg/mL] to inhibit phagocytosis
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma (St. Louis, MO) D2650 solvent for cytochalasin D
Name Company Catalog Comments
Cell lysis buffer ingredients
Tris-buffered saline (TBS), 10×, pH 7.4 BioRad (Hercules, CA) 1706435 for cell lysis buffer
Sodium pyrophosphate Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) 221368 10 mM for cell lysis buffer
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) D6750 0.5% w/v for cell lysis buffer
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) L3771  0.1% w/v for cell lysis buffer
Glycerol Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) G5516 10% for cell lysis buffer
Sodium fluoride Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) 450022 25 mM for cell lysis buffer
Complete mini EDTA-free protease inhibitor cocktail tablet Roche Diagnostics (Indianapolis, IN) 4693159001 for cell lysis buffer, 1 tablet per 10 mL of buffer
Triton X-100 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) T8787 10% for cell lysis buffer
Dithiothreitol (DTT) MP Biomedicals (Santa Ana, CA) 11DTT00005 1 mM for cell lysis buffer
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) MP Biomedicals (Santa Ana, CA) 4800263 1 mM for cell lysis buffer
Sodium orthovandate MP Biomedicals (Santa Ana, CA) 2159664 10 mM for cell lysis buffer
Name Company Catalog Comments
Equipment
Sorvall T6000B centrifuge Du Pont (Wilmington, DE) T6000B
Fisher Tissuemat, water bath Fisher (Waltham, MA)
Sonic Dismembrator (sonicator), model 100 Fisher (Waltham, MA)
Miscellaneous
Cell counting chamber, Neubauer Hawksley (Lancing, Sussex, UK) AC2000
Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit II Millipore (Billerica, MA) CBA059 for PI and Annexin V staining to determine the stage of apoptosis
Eppendorf microcntrifuge tubes, 1.5 ml Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) T9661
Transwell permeable support, 0.4 μm polycarbonate membrane Corning (Corning, NY) 3413 sterile, polystyrene, tissue culture treated
Name Company Catalog Comments
Antibodies
Phospho-glycogen synthase kinase-3α/β (GSK-3α/β) (Ser21/9), polyclonal antibody Cell Signaling Technology 9331 rabbit polyclonal antibody
Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) monoclonal antobody ( (14C10) ) Cell Signaling Technology 2118 rabbit monoclonal antibody

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Vujicic, S., Feng, L., Antoni, A., Rauch, J., Levine, J. S. Identification of Intracellular Signaling Events Induced in Viable Cells by Interaction with Neighboring Cells Undergoing Apoptotic Cell Death. J. Vis. Exp. (118), e54980, doi:10.3791/54980 (2016).

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