Summary
高解像度の呼吸計測は、ミトコンドリアの酸素消費量を決定するために使用されます。これは、ミトコンドリア呼吸鎖複合体」（I-IV）呼吸数、最大のミトコンドリアの電子伝達系の能力、およびミトコンドリア外膜の完全性を決定するための簡単な技術です。
Introduction
ミトコンドリアは、特に、アデノシン三リン酸（ATP）を生成するために酸素を使用することにより、細胞エネルギー代謝において重要な役割を果たす。それらは、細胞死を、いくつかのヒト疾患に関与しています。ミトコンドリアの酸化的リン酸化（OXPHOS）の酸素消費量とATP合成に電子伝達鎖に沿った電子の移動を組み合わせます。ミトコンドリアのトリカルボン酸（TCA）サイクルは、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NADH）およびフラビンアデニンジヌクレオチドなどのエネルギーの豊富な化合物（FADH 2）へのタンパク質、炭水化物と脂肪の変換に関与しています。ミトコンドリア内膜に位置NADH及びFADH 2の電子その後（私はIVに）呼吸電子伝達鎖のタンパク質複合体に転写されます。また、他の二つの酸化還元経路は、トランスポート・チェーンを電子するために電子を転送することができた：i）ミトコンドリアの電子伝達フラビンタンパク質（ETF）の内側水戸のマトリックス面に配置されています脂肪酸β酸化からchondrial膜、および消耗品の電子;及びii）ジヒドロキシアセトンリン酸とグリセロホスフェートを酸化及びミトコンドリアの電子伝達鎖に電子を供給するミトコンドリアグリセロリン酸デヒドロゲナーゼ。複合体IV（最終的な電子受容体）は、水2分子に酸素を変換し、一つの酸素分子に電子を転送します。私はIVに呼吸電子伝達鎖複合体からの電子の移動は、ミトコンドリア内膜を横切る電気化学的勾配を確立する間腔へのミトコンドリアマトリックスからのプロトンの流れに結合されています。その後、ミトコンドリア複合体V（ATP合成酵素）が戻ってミトコンドリアマトリックスへの水素イオンを往復し、ATP分子を合成します。 OXPHOS機能を得ることができる種々の技術および種々のミトコンドリアの呼吸状態を用いて、in vivoおよびin vitroで評価することができます。単離ミトコンドリアにおける次respiratoRYの状態を測定することができた：i）基底ミトコンドリア呼吸（状態1）ミトコンドリア呼吸鎖複合体の特異的基質を添加した後、ii）の酸素消費量（状態2）、iii）の最大のミトコンドリアの酸素消費の飽和濃度の添加後アデノシン二リン酸（ADP）（状態3）と、ATPに変換ADP消費（後iv）の安静時の呼吸）（状態4）。無傷の細胞では、次の呼吸の状態を測定することができた：i）基底細胞性酸素消費内在性基質及びADPの存在下で、ⅱ）オリゴマイシンの存在下での基底の細胞の酸素消費量（オリゴマイシン非感受性呼吸）とオリゴマイシン感受性の呼吸（ATPターンオーバー）アンチマイシンAおよびロテノンを添加した後、III）FCCP脱共役呼吸、およびiv）非ミトコンドリア呼吸。透過性細胞、電子伝達系複合体およびADPを添加することができ、最大の複雑な依存性呼吸数秒の特異的基質でUCHのような複雑なI-は、II-およびIV-依存呼吸数を測定することができます。
細胞呼吸の測定は、複合体I-IV、ミトコンドリアの完全性およびエネルギー代謝1、2、3に固有のミトコンドリア呼吸容量重要な洞察を提供しています。高精度、分解能と感度のミトコンドリアの酸素消費量の測定を可能にする装置の一つは、高解像度oxygraph 4です。高解像度oxygraph装置は、注入ポートを有する2つのチャンバを含み、各チャンバはポーラログラフ酸素センサを備えています。携帯電話または単離されたミトコンドリア懸濁液は、呼吸計で連続的に攪拌されています。ミトコンドリア機能を評価するために、ミトコンドリア複合体活性の基質および阻害剤は、標準的なプロトコールに従って添加することができます。基質および阻害剤は、注射INTにより滴定することができますoxygraphのチャンバーO、および酸素消費速度は、ソフトウェアを用いて計算し、細胞数当たり毎秒ピコモルとして表されます。高解像度の呼吸計測は、感受性の増加や、無傷または透過性細胞のような生物学的サンプル数が少ないと連携する機能など、伝統的な従来のポーラログラフ酸素電極装置に比べていくつかの利点を提供しています。さらに、各デバイスは、2つのチャンバを含み、呼吸数、酸素濃度の比較のために同時に記録することができます。高解像度oxygraphは、従来のポーラログラフィー酸素電極装置に比べ機器室からの酸素の減少漏れの利点を有します。最近、細胞の酸素消費量を測定するために開発された他の装置は、96ウェルの細胞外フラックス分析器5です。細胞外フラックスアナライザーは、蛍光の代わりにポーラログラフセンサーが装備されています。細胞外の利点高解像度oxygraph Iである）は、II）は、24とハイスループットスクリーニングのために96ウェルプレート中に酸素消費量を測定することが可能であり、大部分が自動化されたデバイスであると比べてフラックス分析器は、従って、生物学的サンプルの低い量を必要とします及びiii）細胞の解糖フラックスの追加の測定が可能です。高解像度oxygraphと比較して細胞外フラックスアナライザーの欠点は、i）は、非再利用可能であり、装置のと、蛍光プレートなどの消耗品のコスト高、であり、およびii）アッセイ/ウェル当たりのみ4つの化合物は、注射可能です、したがって、システムは、基板脱共役剤 - 阻害剤滴定プロトコルのための現実的ではありません。
本研究では、我々は、ミトコンドリア呼吸を決定するために、高解像度の呼吸計測を使用します。細胞の酸素消費量の実験のために、細胞をCOMPLEXEに電子を供給するための外因性ADPおよび被酸化性ミトコンドリア基質の進入を可能にするために透過処理されています呼吸器系のS。このアプローチは、無傷の細胞（多くの基質が細胞非透過性である）に比べて明確な利点である個々のミトコンドリア複合体の呼吸能力の解剖を可能にします。しかし、細胞膜の透過性は、細胞外培地で平衡化され、サイトゾルおよび細胞外空間とメディア（サイトゾル溶質から洗い出さ）と細胞内空間の組成物との間の障壁を破壊します。無傷の細胞上の透過性細胞の欠点の一つは、洗浄剤の過剰量は、細胞透過の際に使用される場合、ミトコンドリア外膜が損傷することができることです。無傷細胞において、基礎、結合および無傷の細胞の脱共役呼吸を測定することができます。この方法は、統合された細胞中の呼吸機能を再現し、また、最大のミトコンドリア電子transpoに関する情報を提供する、外因性の基質およびADPを添加せずに無傷の細胞の酸素消費量を評価しますRT容量6、7。透過性細胞上無傷の細胞の利点の一つは、細胞環境が破壊されておらず、ミトコンドリアは、細胞の全構成要素に接触していることです。細胞の原形質膜を透過するために、例えば、ジギトニンなどの界面活性剤は、8使用されています。ジギトニンの過剰な量が使用される場合は、ミトコンドリア外膜の完全性が損なわれる可能性があります。透過性細胞で損なわれないミトコンドリア外膜の完全性を確認するために、ジギトニン滴定は、細胞透過性のための最適濃度を決定するために行われます。これらの実験のために、細胞を、呼吸培地中に再懸濁し、ジギトニン濃度は、ミトコンドリアの基質及びADPの存在下での呼吸計測により滴定され、呼吸速度を測定します。無傷の、非透過性細胞の呼吸はmitochoの存在下で刺激されていませんndrial基板とADP。しかし、その後の段階的なジギトニン滴定は、原形質膜の漸進的な透過性をもたらすであろうし、最適なジギトニン濃度が得られます。これは、完全な透過への呼吸までの増加により示されています。ミトコンドリアの品質と外膜の完全性は、外因性のシトクロムc 2,9を追加することによって確認することができます。シトクロムcは、ミトコンドリア電子伝達系10、11、12の12 kDaの電子運搬タンパク質です。これは、複合体IVへの複合体IIIから電子を運ぶ、ミトコンドリアの膜間空間に局在し、酸素消費に関与しています。ミトコンドリアの外膜が損傷されると、シトクロムcが放出され、ミトコンドリアの酸素消費量が低減されます。外因性のシトクロムcの添加時に、ミトコンドリアの呼吸の任意の増強は、指標となりますミトコンドリア外膜を破壊しました。
透過処理した細胞では、ミトコンドリア複合体活性の基質および阻害剤は、さまざまなプロトコル3、9以下の追加されます。例えば、ミトコンドリア複合駆動型呼吸率を調べるために、以下のプロトコルを使用することができます。細胞の透過処理した後、最初の複合体Iは呼吸鎖の基質としてNADHを生成し、その後、ADPがATP（状態3、アクティブに変換するために追加された複雑なIの活性化を引き起こす基板リンゴ酸およびグルタミン酸によって刺激され、複合体I-依存呼吸）。安定した信号が到達した後、ロテノンは、（ミトコンドリア複合体I阻害剤）ロテノンはFADH 2にコハク酸が続いている複雑なIを阻害するために、複雑なII（状態3、活性複合体II依存呼吸）を活性化するために投与されます。複雑なIV-依存呼吸を測定するために、最初の複合体III依存性呼吸は、アンチマイシンA（ミトコンドリア複合体III阻害剤）を添加することにより阻害されます。その後、複雑なIV-依存呼吸はアスコルビン酸とtetramethylphenylendiamine（TMPD）を投与することにより刺激されます。 TMPDは、呼吸バッファーで自動酸化することができ、したがって、最大錯体IV依存性の呼吸速度（状態3）のアジ化ナトリウム、ミトコンドリア複合体IVの阻害剤の添加前および後の呼吸速度を減算することにより計算されます。呼吸実験は、コントロール（非刺激細胞）としてパラレル一oxygraphの二つのチャンバ、刺激された細胞を含む、他の中で行うことができます。明らかに、細胞は、それらの酸素消費はoxygraph室で測定される前に薬剤が、ミトコンドリアの機能に影響を与えて、 例えば 、様々な方法で前処理することができます。このプロトコルは、個々のミトコンドリア呼吸鎖複合体の機能的な検査を可能にします。また、一方が最大のADP刺激性を測定することができます透過性細胞の呼吸（状態3）、パルミチン酸の形で外因性の脂肪酸を用いて。 （1：1のモル比のパルミテート：BSA 6）このプロトコルでは、パルミチン酸ナトリウムの濃縮ストックを超脂肪酸フリーのウシ血清アルブミン（BSA）と結合しています。その後、最初のジギトニンとミトコンドリアの呼吸で浸透している細胞はカルニチンを添加することによって評価され、ADP（状態3、最大呼吸）を添加したパルミチン酸。そして、オリゴマイシン、状態4（状態40）を模倣するために追加され、呼吸調節比（RCR値）状態3 /状態40のように計算されます。 β酸化が（TCAサイクルに入る）アセチル-CoAの産生およびFADH 2及びNADHの生成を促進するの電子は、電子伝達フラビンタンパク質及びβヒドロキシアシル-CoAデヒドロゲナーゼによって電子伝達鎖に渡されます。ミトコンドリア脂肪酸代謝の中心であり、パルミチン酸-BSAプロトコルを記載する脂肪を調べる研究者によって使用することができTY酸酸化。無傷細胞において、活性化剤およびミトコンドリア複合体活性の阻害剤は、異なるプロトコル6、9以下を添加します。これらの実験のために、外因性基質の非存在下での非透過性細胞の第1の酸素消費量は、（呼吸速度をリン酸化）を測定します。そして、非リン酸化呼吸数は、ミトコンドリアATP合成酵素の阻害剤であるオリゴマイシンの添加後に測定します。その後、プロトノフォアカルボニルシアニドp型trifluoromethoxyphenylhydrazone（FCCP）を種々の濃度で投与され、最大のミトコンドリアの脱共役呼吸数を測定します。例えば、FCCPとしてProtonophoresは化学浸透勾配を放散するプロトンの受動的な動きを可能にする、内膜のプロトン透過性の増大を誘導することができます。プロトン透過性の増加は、酸化呼吸（無ATP産生）を脱共役し、Oの増加を誘導しxygen消費。その後、ロテノン及びアンチマイシンAは、ミトコンドリア呼吸を阻害するために添加され、そして非ミトコンドリア呼吸は、他のすべての呼吸数から減算されます。
酸素消費速度は、IO 2 [ピコモルX秒-1×10 -6細胞（閉酸素室で）体積固有の酸素フラックスを割ることによって計算される（細胞百万個当たりの酸素の流れ）、JV、Oのように表すことができます。細胞チャンバ内の細胞濃度（体積当たりの細胞数[10 6細胞∙ミリリットル1]）15によって2 [ピコモルのx秒-1のxミリリットル-1]。細胞質量固有の酸素フラックス、JO 2 [X秒ピコモル-1 Xミリグラム-1]は、セル当たりの流れ、IO 2 [ピコモルのx秒-1×10 -6細胞】細胞当たりの質量で割った、[MG∙10 6セル];または体積固有フラックス、JV、O 2 [ピコモルのx秒-1のxミリリットル-1]、体積当たりの質量で割った値梅【MG∙ミリリットル1]。 JO 2は、細胞タンパク質、乾燥重量または細胞体積あたりの酸素流量です。
高解像度の呼吸計測を用いた本研究では、我々は私を決定するためのプロトコルを記述）は、完全な携帯形質膜透過性（ジギトニン滴定アッセイ）のための最適なジギトニン濃度、外因性のシトクロムcを用いて、ⅱ）ミトコンドリア外膜の完全性、iii）はミトコンドリア呼吸鎖複合体I外因性基質を添加することなく、外因性ADPとミトコンドリア呼吸鎖基質、および無傷の細胞のiv）の基礎、結合され、最大の脱共役呼吸（最大電子輸送容量）の存在下でのジギトニン透過処理HepG2細胞における、IIおよびIV最大呼吸数そしてADPは、統合された細胞内の呼吸機能を再現します。
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Protocol
1.細胞培養
- 培養ヒト肝癌のHepG2セル6から25cmでインキュベーター（5％CO 2中37℃で10％熱不活化ウシ胎児血清（FBS）および1％ペニシリン-ストレプトマイシンを含有するダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中で2細胞培養フラスコ2、95％空気）（播種密度：1×10 6細胞あたり25 cm 2の細胞培養フラスコ、37℃インキュベーター中でのインキュベーション時間：48時間、密集度でセル密度：25センチメートルあたり4-5×10 6細胞2細胞培養フラスコ）。
- 細胞は、90％〜95％コンフルエントである場合に実験を行います。
ポーラログラフ酸素センサーの2.高解像度の呼吸計測キャリブレーション
- ピペット2.1 oxygraph室に呼吸バッファーmlの安定酸素フラックス信号まで1時間37℃でチャンバー内に存在する磁気撹拌棒（700 rpm）を用いて連続的にバッファをかき混ぜますポーラログラフ酸素センサが得られます。
注：各oxygraph室対策の酸素濃度内のポーラログラフ酸素電極と各チャンバ内の酸素消費量（フラックス）を計算します。酸素濃度と酸素消費速度（フラックス）は、データ収集および分析のためのソフトウェアを使用してコンピュータにオンラインでリアルタイムに表示されます。 - 製造業者のプロトコル14に従ってポーラログラフ酸素センサのエアキャリブレーションを実行します。
注意：空気飽和実験温度で培地中の呼吸媒体と酸素濃度のポーラログラフの酸素センサーの較正は一度だけ、毎日午前中に行われます。その後、培地を新鮮な呼吸培地に再懸濁チャンバ、細胞から除去することができるoxygraphチャンバーに添加し、呼吸数を測定します。最初の実験の後、チャンバを洗浄することができ、実験の付加的な一連のTで行うことができますさらに校正せずに彼と同じチャンバー。
細胞を計数する接着細胞の3トリプシン処理、
- 実験の日に、25cm 2の細胞培養フラスコからDMEMを吸引します。
- リン酸緩衝生理食塩水（PBS）5mlで培養フラスコにおける細胞培養単層をすすぎます。
- ピペット0.5培養フラスコ中の細胞単層に（37℃の水浴中で37℃に予熱）トリプシン溶液を25mg / mlのmlのインキュベーター（5％CO 2中で37℃で5分間インキュベート、95％空気）。
- DMEMは、細胞培養フラスコ中で剥離した細胞に10％FBSを含有し、ピペッティングにより細胞を懸濁するピペット5 mlです。
- 室温で350×gで5分間、15mlの遠心チューブと遠心分離機に再懸濁した細胞を移し、上清をデカント。
- 呼吸バッファ13（T できる1）1mlに細胞ペレットを再懸濁します。
4.高解像度呼吸計測
- 空気校正（2.1~2.2ステップ、一度だけ、毎日行われる）後、oxygraphのチャンバーから呼吸培地を吸引し、チャンバーにステップ3.7から細胞懸濁液（1×10 6細胞/ ml）の2.1ミリリットルを追加します。
- ストッパーの挿入によってoxygraph室を閉じます。
- 連続的に37℃のチャンバー内に存在する磁気撹拌棒（700 rpm）を用いて細胞を攪拌し、安定した酸素流量信号が達成されるまで、5〜10分間、細胞呼吸を記録します。
注：酸素濃度と酸素流量信号は、データ収集および分析のためのソフトウェアを用いてコンピュータでオンラインリアルタイムで表示されていますS = "外部参照"> 14。 - その後、次のプロトコルを使用して、ストッパのチタン注入ポートを介してミトコンドリアの呼吸のための基質と阻害剤を注入します。
呼吸計測によって無傷の細胞における5ジギトニン滴定
- 手順プロトコルの4.3から4.1に記載の手順に従ってoxygraph室含む細胞懸濁液（1×10 6 / ml）を準備します。
- 注射器を用いてチャンバストッパーのチタン注入ポートを介して細胞懸濁液を含むoxygraph室に0.2 mMのロテノン（0.2μM）「注意」の2μLを注入し、安定した酸素フラックス信号が達成されるまで5〜10分間、細胞呼吸を記録。
注：以下の手順のすべての注射は注射器を使用してストッパーのチタン注入ポートを介して実行されます。ロテノンの添加は任意である（これは、逆電子流を阻止する）およびジギトニン滴定実験のために省略することができ、参照ステップ6.3。 - oxygraph室に1 Mコハク酸（10 mM）の20μlのを注入し、安定した酸素フラックス信号が達成されるまで5〜10分間、細胞呼吸を記録。
- oxygraph室に0.5 M ADP（2.5 mM）の10μlのを注入し、安定した酸素フラックス信号が達成されるまで5〜10分間、細胞呼吸を記録。
- oxygraph室に2mMのジギトニン（2μM）の2μLを注入し、安定した酸素信号が達成されるまで2-5分間細胞呼吸を記録。
- 再びジギトニンoxygraph室に2 mMと2μLを注入し、安定した酸素信号が達成されるまで2-5分間細胞呼吸を記録。
注：細胞へのジギトニンの段階的添加は、細胞の酸素消費量の増加を誘発し、酸素流量信号が増大します。 - 室内への2mMのジギトニン段階的に（2-4μM各ステップ）の2-4μLを注入し続けます。各ステップの後2〜5メートル細胞呼吸を記録安定した酸素流量信号が達成されるまでです。
注：酸素流量信号が最大レベルに到達し、ジギトニンのさらなる注射が呼吸速度を増加させないときジギトニン注入を停止します。読者は自分の試薬および使用を使用して、自分の研究室で最適なジギトニン濃度を決定する必要がありますステップ6.2と彼らの実験のために、以下のプロトコルの7.2で最適なジギトニン濃度を得ました。
シトクロムC：ミトコンドリア外膜インテグリティの6評価
- 手順プロトコルの4.3から4.1に記載の手順に従ってoxygraph室含む細胞懸濁液（1×10 6 / ml）を準備します。
- 細胞懸濁液（1×10 6 / ml）を含むoxygraph室に8 mMのジギトニン（8μM）の2μLを注入し、5分間、細胞を透過性。
- oxygraph室に1 Mコハク酸（10 mM）の20μlのを注入し、携帯respiratを記録安定した酸素フラックス信号が達成されるまで、5〜10分間イオン。
- oxygraph室に0.5 M ADP（2.5 mM）の10μlのを注入し、安定した酸素フラックス信号が達成されるまで5〜10分間、細胞呼吸を記録。
注：細胞へのADPの添加は、複合体Iを刺激し、酸素消費量の増加を誘発し、酸素流量信号が増加し、安定化するであろう。 - oxygraph室に4mMのシトクロムc（10μM）の5μLを注入し、安定した酸素フラックス信号が達成されるまで5〜10分間、細胞呼吸を記録。
- 最後に、4 mg / mlでオリゴマイシン（2 / mlの）の1μLを注入し、安定した酸素フラックス信号が達成されるまで、細胞呼吸を記録。
透過処理したHepG2細胞の7最大ADP-刺激呼吸（状態3）
- 手順プロトコルの4.3から4.1に記載の手順に従ってoxygraph室含む細胞懸濁液（1×10 6 / ml）を準備します。
- 細胞懸濁液を含むoxygraph室に8 mMのジギトニン（8μM）の2μLを注入し、5分間、細胞を透過性。
- リンゴ酸の0.8 M（5ミリモル）の12.5μlのとoxygraph室へのグルタミン酸の2 M（10 mM）の10μlのを注入します。レコードの細胞呼吸安定した酸素流量信号が達成されるまで。
- oxygraph室に0.5 M ADP（2.5 mM）の10μlのを注入し、酸素フラックス信号が増加するまで、細胞呼吸を記録し、安定化させます。
注：細胞へのADPの添加は、酸素消費量の増加と増加する酸素フラックスシグナルを誘発します。 - oxygraph室に0.2 mMのロテノン（0.2μM）「注意」の2μLを注入し、酸素フラックス信号が減少するまで、細胞呼吸を記録し、安定化させます。
- その後、oxygraph室に1 Mコハク酸（10 mM）の20μlのを注入し、酸素フラックス信号が増加するまで、細胞呼吸を記録そして、安定します。
- そして、oxygraph室に5 mMのアンチマイシンA（5μM）「注意」の2μLを注入し、酸素フラックス信号が減少するまで、細胞呼吸を記録し、安定化させます。
- その後、0.8 mMのアスコルビン酸（1ミリモル）の2.5μLを注入し、直後oxygraph室に0.2 mMのTMPD（0.25ミリモル）の2.5μLを注入し、酸素フラックス信号が増加するまで、細胞呼吸を記録し、安定化させます。
- 最後にoxygraph室に1 Mアジ化ナトリウム（5 mM）の「警告」の10μLを注入し、酸素フラックス信号が減少するまで、細胞呼吸を記録し、安定化させます。
無傷の細胞の8酸素消費量
- 手順プロトコルの4.3から4.1に記載の手順に従ってoxygraph室含む細胞懸濁液（1×10 6 / ml）を準備します。
- 細胞懸濁液のANを含むoxygraph室に4 mg / mlでオリゴマイシン（2 / mlの）の1μLを注入します安定した酸素フラックス信号が達成されるまで、細胞呼吸を記録dは。
- その後oxygraph室にFCCPの0.2 mMの（0.1μM）「注意」の1μLを注入し、酸素フラックス信号が増加するまで、細胞呼吸を記録し、安定化させます。
- oxygraph室にFCCPの0.2 mMの（0.4μM）の3μLを注入し、さらに酸素フラックス信号が増加するまで、細胞呼吸を記録し、安定化させます。
- その後、酸素流量信号がその最大レベルであり、更なる増加に達するまでoxygraph室に0.2〜1 mMのFCCP（チャンバー内の0.1μM2への最終濃度）の1-3μLを注入することにより、0.1〜0.3μmでステップでFCCPを滴定し、減少を開始します。
注：酸素信号が最大レベルに達すると減少開始時にFCCPを注入停止します。 - その後、チャンバー内に0.2 mMのロテノンの2μL（0.2μM）および5 mMのアンチマイシンA（5μM）の2μLを注入します。レコード呼吸トンまで彼酸素フラックス信号が減少し、安定化します。
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Representative Results
ジギトニン滴定実験：携帯透過処理のための最適なジギトニン濃度の決意
ジギトニン滴定は、HepG2細胞の透過化のための最適濃度を決定するために行われます。これらの実験のために、ジギトニンがロテノン、コハク酸（ミトコンドリア複合体II基板）とADPの飽和量の存在下で無傷の細胞中で滴定され、呼吸数、ベースライン時とそれぞれの後に測定された（複合体II-依存状態3を誘導します）滴定（ 図1Aおよび1B）。この実験の結果は、ジギトニンの非存在下で、細胞の呼吸が非常に低く、無傷の非透過性細胞の呼吸は、ミトコンドリアの基質及びADPの存在下で刺激されていないことを示しています。しかし、ジギトニンの段階的添加の際に、携帯原形質膜は、透過性とmitochonされますコハク酸とADPが細胞に入るときdrial呼吸（複合体II-依存状態3）が完全な透過性にまで増加します。結果は8-12μMのジギトニン濃度の透過性は、HepG2細胞のADP刺激性の呼吸のために最適であることを示しています。ジギトニンの過剰な量が使用される場合は、ミトコンドリア外膜の完全性が損なわれる可能性があります。 図1に示すように 、ジギトニンの過剰量が損なわれ、ミトコンドリア外膜の完全性を示す複合体II依存状態3呼吸の減少を誘導しました。
現在および次のプロトコルでは、すべての酸素消費速度を閉じるに（体積固有の酸素フラックスを割ることによって計算されるIO 2 [ピコモルのX秒-1×10 -6細胞（細胞百万個当たりの酸素流）として表されます酸素室）、JV、O 2 [ピコモルのx秒-1のxミリリットル-1】細胞concentratによって細胞チャンバ内のイオン（体積当たりの細胞の数[10 6細胞のxミリリットル-1]）15。
図1：HepG2 細胞の透過処理のための最適濃度を決定するために、ジギトニン滴定。青い線は、酸素濃度を表します。赤い線は、酸素流（酸素濃度の勾配）を表します。細胞が利用可能な酸素を使用するように酸素濃度が経時的に減少します。酸素消費量は、ピコモル/（細胞の秒x個）のように表されます。 （A）ミトコンドリア複合体のための基質II依存呼吸（1実験）としてジギトニン、ADPおよびコハク酸を用いた高解像度の呼吸計測からの追跡。 （B）±SDとして提示4個別の実験からミトコンドリア呼吸速度。/ 54985 / 54985fig1large.jpg "ターゲット=" _空白」をアップロード>この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
最適ジギトニン濃度を用いてミトコンドリア外膜完全性の評価
ミトコンドリア外膜の完全性に最適なジギトニン濃度（8μM）の効果を評価するために、細胞をジギトニンおよびミトコンドリア外膜の完全性と透過処理されたコハク酸のその後の添加後のミトコンドリア呼吸の測定によってテストされている（ミトコンドリア複合体II依存休止状態2 ADPの非存在下での呼吸）、ADP（ADPが複雑にII-依存状態3呼吸を刺激）とオリゴマイシンを添加したシトクロムc（ADPは、シトクロムcの存在下でII-依存状態3呼吸複合体を刺激し）、（阻害剤図2に示すように、状態4を模倣するATP合成酵素）の
図2：シトクロムcはジギトニン（8μM）で処理した細胞の呼吸を増強しません。高解像度の呼吸計測を使用してシトクロムcの試験のための代表的な呼吸トレース。細胞は存在下で10mMのコハク酸（状態2）、2.5 mMのADP（状態3）および10μMシトクロムc（状態3のその後の添加後に呼吸数を測定することによってテストされている8μMのジギトニンとミトコンドリア外膜の完全性で浸透しています状態4呼吸速度を模倣するために2μg/ mlのオリゴマイシンを加えシトクロムc）は、ピコモル/（秒として表されるX millio）細胞Nです。 CII：複合体II。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
ジギトニンの高濃度を用いてミトコンドリア外膜完全性の評価
ジギトニンの非常に高い濃度は、ミトコンドリア外膜の完全性を損なうことができることを実証するために、我々は、ジギトニンの高用量を使用して実験を行いました。この実験では、細胞は40μMのジギトニンの代わりに8μM、およびミトコンドリア外膜の完全性で浸透しているが、コハク酸のその後の添加後のミトコンドリア呼吸の測定によってテストされている（ミトコンドリア複合体ADPの非存在下での状態2呼吸休止II依存） 、ADPおよびシトクロムc（ADPは、複合体II-依存状態3呼吸を刺激し）（ADPは、複合体II-dの刺激しましたシトクロムcの存在下でependent状態3呼吸）、オリゴマイシンの存在（ 図3）状態4を模倣するオリゴマイシンを添加しました。この実験の結果は、シトクロムcが損なわれ、ミトコンドリア外膜の完全性を示す、ミトコンドリア外膜からのシトクロムcの損失を示し、ジギトニンの高用量で処理した細胞の呼吸作用を増強することを示しています。
図3：ジギトニンの高用量（40μM）は、ミトコンドリア外膜の完全性を損ないます。基質としてコハク酸を用いて高解像度の呼吸計測からの追跡。青い線は、酸素濃度を表します。赤い線は、酸素流（酸素濃度の勾配）を表します。細胞が利用可能な酸素を使用するように酸素濃度が経時的に減少します。酸素消費量は、次のように表現されていますピコモル/（秒セルのx個）。 40μMのジギトニン、コハク酸（10mMの）、ADP（2.5 mM）の、シトクロムc（10μM）およびオリゴマイシン（2 / mlの）のその後の添加が示されています。 CII：複合体II。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
過剰な外因性基質を用いて透過処理したHepG2細胞の最大ADP-刺激呼吸（状態3）、
複合I-は、透過性HepG2細胞（1×10 6細胞/ ml）のII-及びIVに依存する最大のADP刺激性呼吸（状態3）が正常に過剰な外因性基質（ 図4）を用いて測定されます。この実験では、細胞は、に記載されているように基質および阻害剤のその後の添加後に測定されたジギトニン及びミトコンドリアの酸素消費率で透過されています 透過処理したHepG2細胞の最大ADP-刺激呼吸（状態3）の失敗した測定 複合I-は、II-及びIVに依存する最大のADP刺激性呼吸透過性HepG2細胞（1×10 6細胞/ ml）の（状態3）が正常に過剰な外因性基質（ 図5）を用いて測定されていません。この実験では、細胞をジギトニン及びミトコンドリアの酸素消費率で透過され、 図5で説明したように基質と阻害剤のその後の添加後に測定されます。 図5に示すように図4に示された結果と比較して透過性細胞中で非常に低いです。減少、呼吸のレベルについての可能な説明は、以前の実験からミトコンドリア阻害剤とoxygraph室の汚染です。このようなアンチマイシンおよびロテノンなどのミトコンドリア阻害剤は、エタノールに可溶性であり、oxygraph室とストッパーに固執することができます。したがって室とストッパーoxygraph各実験の後に十分に洗浄する必要があります。 結合され、無傷の細胞の非結合呼吸 HepG2細胞」基礎酸素消費量は、オリゴ（オリゴマイシン非感受性呼吸）とFCCPの逐次付加（ 図6）の存在下で測定されます。バサL細胞の呼吸速度は、内因性の細胞基質の存在下で、無傷のHepG2細胞の酸素消費を示し、細胞のATP要求に応じて変更することができます。オリゴマイシン非感受性呼吸速度は、細胞呼吸および細胞ATPターンオーバーを示し、基底内因性の呼吸速度のオリゴマイシン非感受性呼吸速度を減算することにより算出されるオリゴマイシン感受性呼吸リーク表します。 FCCP化学的脱共役剤は、順次記録し、異なる濃度および最大脱共役呼吸に追加されます。この実験条件のための最大のミトコンドリアの脱共役呼吸速度（最大電子輸送システム容量）が0.9〜1.2μMのFCCPで得られます。結果は、無傷のHepG2細胞におけるFCCPの二相性活性を示します。従って、各実験条件について、FCCPが最大の脱共役呼吸速度を得るために滴定されます。脱共役呼吸調節比（uRCR）はFCCPを割ることによって計算されますオリゴマイシンの存在下での呼吸速度によって脱共役呼吸速度。オリゴマイシン感受性呼吸（ATP代謝回転）は、基底内因性の呼吸からのオリゴマイシン非感受性呼吸速度を減算することにより計算されます。 ATPを合成するために使用されるミトコンドリアの酸素消費の割合を表すカップリング効率は、基礎呼吸速度によってオリゴマイシン感受性呼吸数を割ることによって計算されます。実験の最後に、非ミトコンドリアの呼吸速度を得るために、ミトコンドリアの電子伝達系阻害剤を添加し、非ミトコンドリアの呼吸速度は、すべての結果から差し引かれます。 図6に示す実験では、非ミトコンドリア呼吸率は、基礎呼吸速度が48ピコモル/（秒X百万個の細胞）、オリゴマイシン非感受性呼吸数7ピコモル/（秒26ピコモル/（秒X万個の細胞）でありますX百万個の細胞）、オリゴマイシン感受性の呼吸（ATPターンオーバー）41ピコモル/ X百万個の細胞（秒）とcouplinグラム効率0.85。 表1：呼吸バッファーの組成物。 
図4：透過処理HepG2細胞の最大のADP-刺激呼吸（状態3）の測定に成功。呼吸数は、ピコモル/（X万細胞秒）として表されます。細胞は、8μMのジギトニンで透過性にされ、ミトコンドリア呼吸速度は複合体IIIを阻害するために複合体I、コハク酸（状態3、複合体II）、アンチマイシンAを阻害するために、グルタミン酸とリンゴ酸（状態3、複合体I）、ロテノンのその後の添加の後に測定されていますおよびアスコルビン酸/ TMPDとアジ化ナトリウムは、複雑なIVを阻害します。複合体IVの呼吸（状態3）アジ化ナトリウムの添加の前と後の酸素消費量を減算することによって解釈されます。 CI：複合体I、CII：複合体II、CIV：複雑なIV。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 
図5：透過処理HepG2細胞の最大のADP-刺激呼吸（状態3）の失敗測定。高解像度の呼吸計測を使用して透過性HepG2細胞の複雑なI、II-およびIV-駆動最大ADP-刺激呼吸（状態3）の失敗した実験の代表的な呼吸痕跡。呼吸数は、次のように表現されていますピコモル/（秒X万個の細胞）。細胞は、8μMのジギトニンで透過性にされ、ミトコンドリア呼吸速度は複合体IIIを阻害するために複合体I、コハク酸（状態3、複合体II）、アンチマイシンAを阻害するために、グルタミン酸とリンゴ酸（状態3、複合体I）、ロテノンのその後の添加の後に測定されていますおよびアスコルビン酸/ TMPDとアジ化ナトリウムは、複雑なIVを阻害します。複合体IV呼吸（状態3）のアジ化ナトリウムを添加する前と後の酸素消費量を減算することによって解釈されます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 
図6：結合および無傷細胞の脱共役呼吸。 HepG2細胞」オリゴマイシンの存在下で測定された基礎酸素消費量（オリゴマイシン非感受性呼吸）および高解像度呼吸計測を用いFCCPの逐次付加を表す呼吸トレース。安定した信号が到達すると、その後、呼吸がロテノン及びアンチマイシンAの添加により阻害され、残りの背景呼吸（非ミトコンドリア呼吸）は、すべての結果から減算されます。酸素消費量は、ピコモル/（細胞の秒x個）のように表されます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 呼吸バッファ13 化学物質 濃度 スクロース 110 mMの EGTA 0.5 mMの MgCl 2 3.0 mMの 塩化カリウム 80 mMの K-ラクトビオン 60 mMの KH 2 PO 4 10 mMの タウリン 20 mMの ヘペス 20 mMの BSA 1.0g / L pHは 7.1
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Discussion
本プロトコルの目的は、ミトコンドリア呼吸鎖複合体」（I-IV）呼吸数、最大のミトコンドリアの電子伝達系の能力およびミトコンドリア外膜の完全性を測定するための高解像度呼吸計測を使用することでした。
現在のプロトコル内のいくつかの重要なステップがあります。まず、細胞の酸素消費速度は、通常、細胞の数に正規化される（ピコモル/ [セルの秒x個]）。したがって、細胞の酸素消費量を監視する前に、細胞数の正確で信頼性の高い測定を可能にする装置を使用することが重要です。現在のプロトコルでは、自動セルカウンターは、（材料のプロトコルとテーブルのステップ3.7）を使用されてきました。特に透過性細胞における第二の重要なステップは、細胞を透過処理した呼吸バッファの選択は（プロトコルのステップ3.6）に再懸濁されています。携帯透過性はintracellulaの損失を誘導することができるので、r個のイオンが、透過性の間に使用される培地は、細胞内環境と互換性があることが非常に重要です。したがって、呼吸バッファは、細胞内および細胞外環境（ 表1）13の両方を反映組成と浸透圧が含まれている必要があります。また、最適かつ効果的な細胞透過性のために、その最適な最低有効濃度を特定するために、各細胞タイプについても、各セルの密度のためだけでなく、ジギトニン濃度を滴定することが重要です。ジギトニン濃度が低すぎると、細胞は透過化されません。これとは対照的に、ジギトニンの大量への細胞の曝露は、ミトコンドリア外膜にダメージを与えます。従って、別の重要な点は、ミトコンドリア外膜の完全性を調べることです。細胞の呼吸能力を過小評価しないように、呼吸計測実験は、生理的温度（37℃）で行われることも重要です。考慮すべきもう一つの重要なポイントは、最大呼吸フラックスを得ることにより、透過性細胞と十分な基板レベルの酸素対ADPの拡散の制限により、ADPの飽和量の使用です。透過性細胞内のいくつかの実験では、外因性基質の添加が起こることができ、ADPは、呼吸の速度のかなりの増加にはつながりません。これは、いくつかの要因によって引き起こされ得ます。例えば、細胞を透過性にするジギトニンの高濃度の使用は、ミトコンドリア外膜を損傷することがあります。したがって、一つは各細胞型および密度のための最適濃度を決定するために、ジギトニン滴定すべきです。さらに、ジギトニンの純度も非常に重要である、と市販のジギトニンは、純度が大幅に変化することができ、購入ジギトニンの新しいバッチは、細胞透過性のためにそれらの最適な濃度を決定するために滴定されるべきです。また、細孔形成細胞の原形質膜のいくつかの種類が存在します異なる特性を有する薬剤。例えば、サポニンは、ジギトニンより穏やかな界面活性剤であり、細胞の種類に応じて、適切な細胞透過試薬が選択されるべきです。
このようなロテノン、アンチマイシンAなどの呼吸計測アッセイで使用されるミトコンドリア機能のほとんど阻害剤は、エタノールのみで可溶性であり、細胞呼吸を阻害し、oxygraph室とストッパーに固執します。この問題を回避するために、oxygraphチャンバ及びストッパーは、各アッセイの後、95％エタノールで徹底的に洗浄しなければなりません。考慮すべきもう一つの重要な点は、両方の無傷および透過化細胞呼吸アッセイのため、細胞密度、タイプ、および細胞培養のコンフルエンスを呼吸数に影響を与える可能性があることです。例えば、HepG2細胞で、我々は通常、チャンバ100万2個の細胞の細胞密度を使用します。呼吸計測中に非常に低い細胞密度を使用すると、非常に弱いシグナルを生じさせることができます。我々はまた、細胞培養の密集度は、呼吸数に影響を与える可能性があることを観察しました。エクサのためHepG2細胞は、（100％以上）が非常にコンフルエントに増殖させmpleが、それらははるかに少ない酸素を消費します。
実験中に安定かつ再現性の酸素フラックスを得るためには、考慮すべきもう一つの重要な点は、 すなわち 、ポーラログラフ酸素センサ膜や楽器背景補正の定期的な交換楽器高解像度の呼吸計測の維持です。脱共役剤FCCPを用いた実験のために、それは、細胞へのFCCPの添加は細胞呼吸を刺激しないと、最大磁束が得られるが、その代わりに細胞呼吸が阻害されないこととすることができます。 FCCPの添加により細胞の酸素消費量の抑制は、FCCPの濃度が最適ではなかったと高すぎたことを示すことができます。これらの実験のために、各アッセイのために、慎重に最大流量を得るために、FCCP濃度を滴定することが必須です。
高解像度の呼吸計測の限界は、確立、高スループットスクリーニングであります用量反応曲線および生物学的サンプルの限られた量の時間経過実験は実現不可能です。これらのアッセイのために、1は、このような細胞外フラックスアナライザーなどの他の機器を使用することができます。他の制限は、装置が自動化され、作業者の継続的な存在を必要とすること、ii）それは楽器のiv）のメンテナンス、ⅲ）それだけで2室があり、唯一の2つのアッセイは、一度に実行することができ、時間がかかりません）私です、膜およびキャリブレーションを変更するなど、多くの時間を必要とし、v）のチャンバは、一回の使用ではなく、阻害剤による汚染になることがあります。従来のポーラログラフ酸素電極装置より高解像度oxygraphの利点は、i）は高感度、ii）の生物学的サンプルの小さい番号が必要なこと、iii）呼吸数は2室で同時に測定することができおよびiv）デバイスは、酸素漏れを低減しています。細胞外フラックスアナライザーを超える高解像度oxygraphのいくつかの利点は、私が）の低コストですデバイスおよび消耗品と基板脱共役剤 - 阻害剤滴定プロトコルのii）の実現可能性。
この技術を習得した後、将来のアプリケーションや方向が同一チャンバ内で光センサーを使用して細胞呼吸の同時測定、ミトコンドリア膜電位、H 2 O 2、ATP及びカルシウムレベルです。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ADP | Sigma | A 4386 | Chemical |
| Antimycin A | Sigma | A 8674 | Chemical, dissolve in ethanol |
| Ascorbate | Merck | 1.00127 | Chemical |
| BSA | Sigma | A 6003 | Chemical |
| FCCP | Sigma | C 2920 | Chemical, dissolve in ethanol |
| Countess automated cell counter | Thermo Fisher Scientific | n/a | Automated cell counting instrument |
| Cytochrome c | Sigma | C 7752 | Chemical |
| Digitonin | Sigma | D 5628 | Chemical, dissolve in DMSO |
| DMEM | Gibco | 31966021 | Medium |
| EGTA | fluka | 3779 | Chemical |
| FBS | Gibco | 26010-074 | Medium component |
| Glutamate | Sigma | G 1626 | Chemical |
| Hepes | Sigma | H 7523 | Chemical |
| KCl | Merck | 1.04936 | Chemical |
| KH2PO4 | Merck | 1.04873 | Chemical |
| K-lactobionate | Sigma | L 2398 | Chemical |
| MgCl2 | Sigma | M 9272 | Chemical |
| O2k-Core: Oxygraph-2k | Oroboros Instruments | 10000-02 | High-resolution respirometry instrument |
| Oligomycin | Sigma | O 4876 | Chemical, dissolve in ethanol |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | Chemical |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | Chemical |
| Rotenone | Sigma | R 8875 | Chemical, dissolve in ethanol |
| Succinate | Sigma | S 2378 | Chemical |
| Taurine | Sigma | T 8691 | Chemical |
| TMPD | Sigma | T 3134 | Chemical |
| Trypsin | Sigma | T 4674 | Chemical |
References
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