Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Yüksek çözünürlüklü Solunum permeabilize ve bozulmamış Hücreleri Mitokondrial fonksiyonu değerlendirmek için

Published: February 8, 2017 doi: 10.3791/54985
Automatic Translation
1, 1
1Department of Intensive Care Medicine, Inselspital, Bern University Hospital, University of Bern

Summary

Yüksek çözünürlüklü Solunum mitokondriyal oksijen tüketimini belirlemek için kullanılır. Bu mitokondriyal solunum zinciri kompleksleri '(I-IV) solunum hızları, maksimum mitokondriyal elektron transport sistem kapasitesi ve mitokondriyal dış membran bütünlüğü belirlemek için basit bir tekniktir.

Introduction

Mitokondri, özellikle adenosin trifosfat (ATP) üretilmesi için oksijen ile, hücresel enerji metabolizmasında önemli rolleri üstlenirler. Bu hücre ölümü ve çeşitli insan hastalıklarında implike edilmiştir. Mitokondrial oksidatif fosforilasyon (OXPHOS) oksijen tüketimi ve ATP sentezi ile elektron taşıma zinciri boyunca elektron taşıma birleştirir. Mitokondriyal trikarboksilik asit (TCA) döngüsü nikotinamid adenin dinükleotit (NADH) ve flavin adenin dinükleotit enerji bakımından zengin bileşimler (FADH 2) içine protein, karbonhidrat ve yağ arasında dönüşüm yer almaktadır. NADH ve FADH 2 elektronlar solunum elektron taşıma zinciri protein kompleksleri aktarılır (I IV), iç mitokondriyal zarın yer. Buna ek olarak, diğer iki redoks yolları ulaşım zinciri elektron elektron aktarabilirsiniz: i) mitokondriyal elektron-transfer flavoprotein (ETF), iç mito matris yüzünde yer almaktadıryağ asidi β-oksidasyon chondrial membran ve malzemeleri elektronlar; ve ii) dihidroksiaseton fosfat gliserofosfat oksitlenir ve mitokondriyal elektron taşıma zinciri elektronları besleyen mitokondriyal gliserofosfat dehidrojenaz. Kompleks IV (elektron kabul eden) su, iki molekül oksijen dönüştürülmesi, tek bir oksijen molekülüne transfer eder. I'den IV'e kadar solunum elektron taşıma zinciri kompleksi elektron taşıma mitokondriyal iç membran boyunca bir elektrokimyasal gradyanı oluşturur arası boşluğa mitokondriyal matris proton akışı ile birleştirilir. Daha sonra, mitokondriyal kompleks V (ATP sentaz) geri mitokondrial matriks içine hidrojen iyonlarını mekik ve ATP molekülleri sentezler. OXPHOS fonksiyonu elde edilebilir çeşitli teknikler ve çeşitli mitokondriyal solunum durumları kullanılarak in vivo ve in vitro olarak değerlendirilebilir. İzole mitokondri aşağıdaki respirato içindeRy Devletler ölçülebilir: i) taban mitokondriyal solunum (durum 1) mitokondriyal solunum zinciri kompleksi, belirli alt-tabakaların ilave edildikten sonra, ii) oksijen tüketimi (durum 2), III) maksimal mitokondriyal oksijen tüketimi doyurucu konsantrasyonlarının ilave edildikten sonra adenozin difosfat (ADP) (devlet 3) ve ATP dönüştürülür ADP tüketimi (sonra iv) istirahat solunum) (devlet 4). sağlam hücrelerde takiben solunum durumları ölçülebilir: i) taban hücresel oksijen tüketimi endojen substratları ve ADP mevcudiyetinde, ii) oligomycin varlığında bazal hücre oksijen tüketimi (oligomycin hassas olmayan solunum) ve oligomycin duyarlı solunum (ATP kaybı) antimisin ve rotenone ilave edilmesinden sonra, iii) FCCP bağlanmamış solunum, ve iv) olmayan mitokondriyal solunum. permeabilize hücrelerde, elektron taşıma zinciri kompleksleri ve ADP özel substratlar eklendi ve maksimal kompleks bağımlı solunum hızları ler olabiliruch gibi karmaşık I-, II- ve IV-bağımlı solunum oranları ölçülebilir.

Hücresel solunum ölçümleri kompleksleri I-IV, mitokondriyal bütünlüğü ve enerji metabolizması 1, 2, 3 özel mitokondriyal solunum kapasitesi önemli bilgiler sağlamaktadır. Yüksek doğruluk, çözünürlük ve hassasiyet ile mitokondriyal oksijen tüketimi ölçümleri sağlayacak cihazlardan biri yüksek çözünürlüklü Oksigraf 4'tür. yüksek çözünürlüklü Oksigraf cihaz enjeksiyon portu ile iki bölmeyi içerir ve her bölme bir polarografik oksijen sensörü ile donatılmıştır. Hücresel ya da izole mitokondriyal süspansiyonlar respirometredeki sürekli karıştırılır. mitokondriyal kompleks aktivitesi için mitokondriyal fonksiyon, alt tabakaların ve inhibitörlerin değerlendirmek için standart protokoller izlenerek eklenebilir. Alt tabakaların ve inhibitörlerin enjeksiyon int ile titre edilebilirOksigraf odaları ve oksijen tüketimi oranları o yazılımı kullanılarak hesaplanır ve hücrelerin sayısı başına saniyede pikomol olarak ifade edilmiştir. Yüksek çözünürlüklü Solunum artan hassasiyet ve sağlam veya permeabilize hücrelerin biyolojik numunelerin az sayıda çalışma yeteneği de dahil olmak üzere, geleneksel ve konvansiyonel polarografik oksijen elektrod cihazlar fazla birkaç avantaj sunar. Buna ek olarak, her bir cihaz iki odayı içeriyor ve solunum hızları, oksijen konsantrasyonlarının karşılaştırmalar için eş zamanlı olarak kaydedilebilir. yüksek çözünürlüklü Oksigraf geleneksel polarografik oksijen elektrod cihazlara kıyasla aygıt odalardan oksijen azalma sızıntı avantajı vardır. Son zamanlarda hücresel oksijen tüketimini ölçmek için geliştirilen başka bir aygıt 96-iyi hücre dışı akı analiz 5'tir. Hücre dışı akı analizörü yerine polarografik sensörler floresan ile donatılmıştır. hücre dışı avantajlarıyüksek çözünürlüklü Oksigraf I olan) bu ii) 24 ve yüksek verimli tarama için 96-yuvalı plakalar içinde oksijen tüketimini ölçmek mümkündür, büyük ölçüde otomatik bir cihaz ile karşılaştırıldığında akış Analiz Cihazı, Bu nedenle, biyolojik numunelerin düşük miktarda gerektiren ve iii) hücresel glikolitik akı ilave ölçüm mümkündür. yüksek çözünürlüklü Oksigraf kıyasla dışı akı analizörü dezavantajları) cihazın ve olmayan tekrar kullanılabilir floresan plakalar gibi sarf yüksek maliyetler i, ve ii) tahlil başına sadece dört bileşikler / kuyu enjektabl vardır için, sistem Alt tabaka uncoupler inhibitörü titrasyon protokolleri için uygun değildir.

Bu çalışmada, biz mitokondriyal solunum belirlemek için yüksek çözünürlüklü Solunum kullanın. Hücresel oksijen tüketimi deneyler için hücreler complexe elektronları beslenmesi için eksojen ADP ve okside mitokondriyal substratların girişine izin permeabilizeSolunum sistemi s. Bu yaklaşım, (çok yüzeye hücre geçirgenliği olmayan olan) olduğu gibi hücrelere kıyasla belirgin bir avantajı bireysel mitokondriyal kompleksleri solunum kapasitelerinin diseksiyon sağlar. Ancak, hücre zarı permeabilization dışı ortam ile dengelenir sitozol ve hücre dışı alan ve orta (sitozolik çözünenlerin dışarı yıkama) ve hücre içi alan kompozisyonu arasındaki engeli bozacak. sağlam hücreler üzerinde permeabilize hücrelerin dezavantajlarından biri, deterjan aşırı miktarda hücre geçirgenliği esnasında kullanılan halinde mitokondriyal dış membran hasar olabilir. sağlam hücrelerde bazal, sağlam hücreler birleştirildi ve bağlanmamış solunum ölçülebilir. Bu yöntem, entegre hücrede solunum fonksiyon üreyen ve aynı zamanda maksimal mitokondriyal elektron transpo hakkında bilgi veren, eksojen substratları ve ADP ilavesi olmadan sağlam hücrelerin oksijen tüketimini değerlendirirrt kapasitesi 6, 7. permeabilize hücrelerin içinde sağlam hücreler avantajlarından biri, hücre ortamında bozulmaz ve mitokondri hücrelerin bütün bileşenleri ile temas halinde olmasıdır. Hücresel plazma membran geçirgenliği için, bu tür digitonin deterjanlar 8 kullanılmıştır. digitonin aşırı miktarda kullanıldığında Ancak, mitokondriyal dış membran bütünlüğünü tehlikeye girebilir. permeabilize hücrelerin bozulmamış olduğunu mitokondriyal dış membran bütünlüğünü doğrulamak için digitonin titrasyon hücre geçirgenliği için optimal konsantrasyonunu belirlemek için gerçekleştirilir. Bu deneyler için hücreler solunum ortam içinde yeniden süspansiyon haline getirildi ve digitonin konsantrasyonu ölçülür mitokondriyal substratları ve ADP ve solunum oranları varlığında Respirometrik titre edilir. sağlam olmayan permeabilize hücrelerin solunum mitocho mevcudiyetinde stimule değildirndrial yüzeyler ve ADP. Bununla birlikte, daha sonra adım adım digitonin titrasyonu plazma zarlarının kademeli geçirgenliği üretebilecektir ve optimal digitonin konsantrasyonu elde edilir. Bu, tam permeabilization solunum up artış gösterilmiştir. Mitokondriyal kalite ve dış membran bütünlüğü eksojen sitokrom c 2, 9 eklenerek kontrol edilebilir. Sitokrom c mitokondrial elektron taşıma zinciri 10, 11, 12, 12 kDa elektron taşıyan proteindir. Bu mitokondriyal arası boşluğa lokalize olur, ve kompleks IV karmaşık III elektron taşıyan, oksijen tüketimi yer almaktadır. mitokondrial dış membran zarar görmüşse, sitokrom-c serbest bırakılır ve mitokondriyal oksijen tüketimi azalır. Eksojen sitokrom c eklenmesi üzerine, mitokondriyal solunum herhangi büyütme bir göstergesidirmitokondriyal dış membran bozulur.

Permeabilize hücreler, yüzeyler ve mitokondriyal karmaşık aktivite inhibitörleri çeşitli protokolleri 3, 9, aşağıdaki eklendi edilir. mitokondriyal kompleks tahrik solunum oranları araştırmak amacıyla, örneğin, aşağıdaki protokol kullanılabilir. hücre geçirgenleştirmeden sonra birinci kompleks I solunum zinciri için alt-tabaka olarak NADH üretir ve sonra ADP ATP (durum 3, aktif bir dönüşüm için ilave kompleks I'in aktivasyonunu tahrik substratlar malat ve glutamat ile uyarılır kompleks I-bağımlı solunum). Bir sabit sinyal ulaşıldıktan sonra, rotenon (mitokondriyal kompleks I inhibitörü) Rotenone FADH 2 süksinat ardından kompleks I. inhibe ettiği ve kompleks II (State 3, aktif bir kompleks II bağımlı solunum) aktif hale getirmek için tatbik edilmektedir. Karmaşık IV-bağımlı solunum, ilk kompleks III ölçmek içinbağımlı solunum antimisin (mitokondriyal kompleks III inhibitörü) eklenerek engellendi. Daha sonra kompleks IV bağlı solunum askorbat ve tetramethylphenylendiamine (TMPD) uygulanması ile uyarılır. TMPD dolayısıyla maksimal kompleksi IV bağımlı solunum hızı (Durum 3) önce ve sodyum azid, mitokondriyal kompleks IV inhibitörünün eklenmesinden sonra solunum oranları çıkarılmasıyla hesaplanır, solunum tamponu otomatik oksitleyebilir. solunum deneyleri, bir kontrol (uyarılmamış hücreler) olarak hizmet eden paralel birinde Oksigraf iki odası, diğer ihtiva eden uyarılmış hücrelerde gerçekleştirilebilir. Bunların oksijen tüketimi Oksigraf odası içinde ölçülmeden önce Açıkçası, hücreler, mitokondriyal fonksiyonlarını etkileyen ilaçlarla, örneğin, çeşitli şekillerde, önceden işleme tabi tutulabilir. Bu protokol, bireysel mitokondriyal solunum zinciri kompleksleri fonksiyonel muayene izin verir. Buna ek olarak, tek bir maksimum ADP-uyarımlı ölçebilirsolunum palmitat şeklinde eksojen yağ asit kullanılarak permeabilize hücrelerin (devlet 3). (: 1 mol oranında palmitat: BSA 6) Bu protokol, sodyum palmitat konsantre edildi stokları derece yağlı asit içermeyen sığır serumu albümini (BSA) ile konjüge edilir. Bundan sonra birinci Digitonin ve mitokondriyal solunum ile permeabilize hücrelerin karnitin eklenmesi ile değerlendirilir ve ADP (durum 3, maksimum solunum) ilave edildi palmitat. Ardından, oligomycin durumu 4 (devlet 4o) ve solunum kontrol oranı (RCR değeri) taklit ilave edilir devlet 3 / devlet 4o olarak hesaplanmıştır. β-oksidasyon elektron transfer flavoprotein ve β-hidroksiaçil-KoA dehidrogenaz tarafından elektron taşıma zinciri geçirilen elektronlar olan FADH 2 ve NADH, bir (TCA döngüsünde girer) asetil CoA üretimini ve üretimi teşvik. Mitokondri palmitat-BSA protokolü yağ inceleyerek araştırmacılar tarafından kullanılabilir yağlı asit metabolizmasının merkezinde ve tarif edilenty asit oksidasyonu. Sağlam hücreler, aktivatörleri ve mitokondriyal karmaşık aktivite inhibitörleri farklı bir protokole 6, 9, aşağıdaki ilave edilir. Bu deneyler için, eksojen alt-tabakaların yokluğunda olmayan permeabilize hücrelerin birinci oksijen tüketimi (solunum oranı fosforile) ile ölçülür. Daha sonra, sigara fosforile solunum hızı mitokondriyal ATP sentazının bir inhibitörü olan oligomycin eklenmesi sonra ölçülür. Daha sonra, protonophore karbonil siyanür p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) çeşitli konsantrasyonlarda yönetilmektedir ve maksimal mitokondriyal uncoupled solunum hızı ölçülür. Böyle FCCP olarak Protonophores kemiosmotik degrade dağıtmak için protonların pasif hareket etmesine izin verir iç zarı proton geçirgenliğinin bir büyütme neden olabilir. Proton geçirgenlik artışı oksidatif solunum (ATP üretimi) birbirinden ayrılacak ve o da bir artışa neden olurxygen tüketimi. Daha sonra, rotenon ve antimisin mitokondriyal solunum inhibe etmek için ilave edilir ve olmayan mitokondriyal solunum diğer solunum hızları çıkarılır.

Oksijen tüketim oranları (kapalı oksijen odasında) hacim özel oksijen akı bölünmesiyle hesaplanır IO 2 [pmol x saniye -1 x 10 -6 hücre] (milyon hücre başına oksijen akışı), JV, O şeklinde ifade edilebilir 2 [pmol X sn-1 X mi -1] hücre konsantrasyonu hücre odası içinde (hacim başına hücre sayısı [10 6 hücre ∙ mi 1]) 15. Hücre başına kütle bölü hücre-kütle özel oksijen akı, JO 2 [pmol x saniye -1 x mg -1], hücre başına akışı, IO 2 [pmol x saniye -1 x 10 -6 hücre], [mg ∙ 10 6 hücre]; veya hacim özgü akı, JV, O 2 [pmol x saniye -1 x ml -1], vol başına kütle bölüume [mg ∙ mi 1]. JO 2 hücre proteininin, kuru ağırlık veya hücre hacmi başına oksijen akıdır.

yüksek çözünürlüklü Solunum kullanarak bu çalışmada, biz, iii) mitokondriyal solunum zinciri kompleksleri eksojen sitokrom c kullanarak) I tam hücresel plazma zarı geçirgenliği için optimum digitonin konsantrasyonu (digitonin titrasyon deneyi), ii) mitokondrial dış membran bütünlüğü i belirlemek için protokoller tarif eksojen ADP ve mitokondriyal solunum zinciri alt tabakalar ve mevcudiyetinde Digitonin permeabilize HepG2 hücrelerinde II ve IV maksimum solunum oranları IV) bazal, eksojen alt-tabakaların eklenmeden bağlı olan ve sağlam hücreler maksimum bağlanmamış solunumu (maksimum elektron taşıma kapasitesi) ve ADP, entegre hücrede solunum fonksiyon üreyen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Hücre Kültürü

  1. Kültür, insan hepatomu HepG2 hücreleri 6 cm 25 bir inkübatör (% 5 CO, 37 ° C 'de,% 10 ısı ile inaktive edilmiş fetal büyükbaş hayvan serumu (FBS) ve% 1 penisilin-streptomisin içeren Dulbecco Değiştirilmiş Eagle ortamı (DMEM) içinde 2 hücre kültürü şişeleri 2,% 95 hava) (ekim yoğunluğu: 1 x 10 6 hücre başına 25 cm 2 hücre kültürü şişesi, 37 ° C inkübatör inkübasyon süresi: 48 saat, confluency hücre yoğunluğu: 25 cm başına 4-5 x 10 6 hücre 2 hücre kültürü şişesi).
  2. Hücreler% 90,% 95 konfluent olduğunda deneyleri.

Polarografik Oksijen Sensörleri 2. Yüksek çözünürlüklü Solunum Kalibrasyon

  1. Pipet 2.1 bir Oksigraf odası içine solunum ml tampon sürekli kararlı bir oksijen akışının sinyaline kadar 1 saat süre ile 37 ° C 'de hazne (700 rpm) içinde mevcut bir manyetik karıştırma çubuğu kullanılarak tampon karışmayapolarografik oksijen sensörü elde edilir.
    NOT: Her Oksigraf odası ölçü oksijen konsantrasyonu içinde Polarografik oksijen elektrotları ve her odasının içinde oksijen tüketimini (akı) hesaplayın. oksijen konsantrasyonu ve oksijen tüketim oranları (akı) veri toplama ve analiz yazılımı kullanarak bir bilgisayarda çevrimiçi gerçek zamanlı gösterilir.
  2. Üreticinin protokollerine 14'e göre polarografik oksijen sensörünün bir hava kalibrasyonunu gerçekleştirin.
    Not: hava doygunluğu deney sıcaklığında ortam solunum ortam ve oksijen konsantrasyonunda polarografik oksijen sensörlerinin kalibrasyonu yalnızca günde bir kez sabah gerçekleştirilir. Daha sonra ortam odası ve yeni bir solunum ortam içinde yeniden süspansiyon haline hücrelerden çıkarılabilir bir Oksigraf bölmeye ilave edilir ve solunum hızları ölçülür. İlk deneyin ardından, oda yıkanabilir ve deneyler ilave serisi t gerçekleştirilebilirDaha fazla kalibrasyon olmadan aynı bölme.

Yapışık hücreler, Sayma Hücreleri 3. trypsinization

  1. Deney gününde, 25 cm 2 hücre kültür şişesi DMEM aspire.
  2. fosfat tamponlu tuzlu su, 5 ml (PBS) ile kültür şişelerinde hücre kültürü tek tabaka durulayın.
  3. Pipet 0.5 kültür şişelerinde hücre tek içine (37 ° C su banyosu içinde 37 ° C'ye önceden ısıtılmış) Tripsin çözeltisi 25 mg / ml ile yıkanır ve bir inkübatör (% 5 CO2 içinde 37 ° C'de 5 dakika inkübe % 95 hava).
  4. DMEM hücre kültür şişesi içinde müstakil hücreler içine,% 10 FBS ihtiva eden ve pipetleme hücrelerin süspansiyonu Pipet 5 mi.
  5. Aktarım, oda sıcaklığında 350 xg 5 dakika boyunca 15 ml'lik bir santrifüj tüpüne ve santrifüj hücreler yeniden süspansiyon haline getirilmiş ve süpernatantı süzün.
  6. Solunum tamponu 13 (t mümkün 1) 1 ml hücre pelletini.
    7. i> hücre sayacı kullanılarak hücre sayımı, 1 x 10 6 hücre / ml'lik bir son yoğunluğa solunum tampon bunları tekrar süspansiyon. hücresel solunum oranları hücre sayısı normalize olacağından, doğru ve kesin hücre sayacı ile hücreleri saymak.

4. Yüksek çözünürlüklü Solunum

  1. Hava kalibrasyon (sadece günde bir kez uygulandı, 2.1-2.2 adım) eklendikten sonra, Oksigraf bir bölmeden solunum orta aspire ve odanın adım 3,7 hücre süspansiyonu (1 x 10 6 hücre / ml) 2.1 ml.
  2. durdurucunun sokulmasıyla Oksigraf odası kapatın.
  3. Sürekli 37 ° C 'de hazne (700 rpm) içinde mevcut bir manyetik karıştırma çubuğu kullanılarak hücreler ilave edin ve sabit bir oksijen akışı sinyali elde edilinceye kadar, 5-10 dakika boyunca hücresel solunum kaydedin.
    NOT: oksijen konsantrasyonu ve oksijen akı sinyal veri toplama ve analizi için yazılım kullanan bir bilgisayarda çevrimiçi gerçek zamanlı gösterildis = "xref"> 14.
  4. Daha sonra, aşağıdaki protokollerini kullanarak stoper titanyum enjeksiyon portu üzerinden mitokondriyal solunum için alt tabakaların ve inhibitörlerin enjekte edin.

Respirometrik tarafından sağlam hücrelerde 5. Digitonin Titrasyon

  1. Adımları protokol 4.3'e 4.1 tarif edilen prosedür izlenerek, bir Oksigraf odası ihtiva eden bir hücre süspansiyonu (1 x 10 6 / ml) hazırlayın.
  2. bir şırınga kullanılarak odası stoper titanyum enjeksiyon portu aracılığıyla hücre süspansiyonu içeren Oksigraf odasına 0.2 mM rotenone (0.2 uM) 'DİKKAT' 2 ul enjekte edilir ve istikrarlı bir oksijen akı sinyali elde edilene kadar 5-10 dakika hücresel solunum kayıt .
    NOT: Aşağıdaki adımlarda tüm enjeksiyonlar şırıngalar kullanılarak stoper titanyum enjeksiyon portları aracılığıyla yapılmaktadır. rotenone eklenmesi isteğe bağlıdır (ters elektron akışı engeller) ve digitonin titrasyon deneyleri için göz ardı edilebilir, bakınız6.3 adım.
  3. Oksigraf odası içine 1M süksinat (10 mM) 20 ul enjekte edilir ve sabit bir oksijen akışı sinyali elde edilinceye kadar, 5-10 dakika boyunca hücresel solunum kaydedin.
  4. Oksigraf odası içine 0.5 M ADP (2.5 mM) 10 ul enjekte edilir ve sabit bir oksijen akışı sinyali elde edilinceye kadar, 5-10 dakika boyunca hücresel solunum kaydedin.
  5. Oksigraf odasına 2 mM digitonin (2 uM) 2 ul enjekte edilir ve istikrarlı bir oksijen sinyali elde edilene kadar 2-5 dakika boyunca hücresel solunum kaydedin.
  6. Yine Digitonin Oksigraf odası içine 2 mm kadar 2 ul enjekte etmek ve sabit bir oksijen sinyali elde edilinceye kadar 2-5 dakika boyunca hücresel solunum kaydedin.
    NOT: hücrelerine digitonin Basamakları eklenmesi hücresel oksijen tüketiminde bir artış ve artacak oksijen akı sinyalini neden olacaktır.
  7. odasına 2 mM digitonin kademeli (2-4 uM her adımı) 2-4 ul enjekte devam edin. Her adımdan sonra, 2-5 m hücresel solunum kayıtistikrarlı bir oksijen akı sinyali elde edilinceye kadar içinde.
    NOT: Oksijen akı sinyali maksimum seviyeye ulaşır ve digitonin daha enjeksiyonları solunum oranını artırmak olmadığında digitonin enjekte durdurun. okuyucular adım 6.2 ve deneyler için aşağıdaki protokollerden 7.2 kendi reaktifleri ve kullanım elde edilen optimal digitonin konsantrasyonu kullanılarak kendi laboratuarlarında optimal digitonin konsantrasyonunu belirlemek gerekir.

Mitokondriyal Dış Zar Bütünlüğü 6. Değerlendirme: Sitokrom C

  1. Adımları protokol 4.3'e 4.1 tarif edilen prosedür izlenerek, bir Oksigraf odası ihtiva eden bir hücre süspansiyonu (1 x 10 6 / ml) hazırlayın.
  2. Hücre süspansiyonu (1 x 10 6 / ml) ihtiva eden Oksigraf odası içine 8 mM digitonin (8 uM) 2 ul enjekte edilir ve 5 dakika süreyle hücre geçirgenliği.
  3. Oksigraf odası içine 1M süksinat (10 mM) 20 ul enjekte edilir ve hücresel Respirat kayıtsabit bir oksijen akışı sinyali elde edilinceye kadar, 5-10 dakika boyunca iyon.
  4. Oksigraf odası içine 0.5 M ADP (2.5 mM) 10 ul enjekte edilir ve sabit bir oksijen akışı sinyali elde edilinceye kadar, 5-10 dakika boyunca hücresel solunum kaydedin.
    NOT: hücrelerine ADP eklenmesi karmaşık I teşvik ve oksijen tüketiminde artışa neden ve oksijen akı sinyali artırmak ve stabilize edecek olacaktır.
  5. Oksigraf odası içine 4 mM sitokrom c (10 uM) ve 5 ul enjekte edilir ve sabit bir oksijen akışı sinyali elde edilinceye kadar, 5-10 dakika boyunca hücresel solunum kaydedin.
  6. Son olarak, 4 mg / ml oligomycin (2 ug / ml) 1 ul enjekte etmek ve sabit bir oksijen akışı sinyali elde edilinceye kadar hücresel solunum kaydedin.

7. Maksimal ADP ile uyarılmış Solunum permeabilize HepG2 Hücrelerinin (Eyalet 3)

  1. Adımları protokol 4.3'e 4.1 tarif edilen prosedür izlenerek, bir Oksigraf odası ihtiva eden bir hücre süspansiyonu (1 x 10 6 / ml) hazırlayın.
  2. Hücre süspansiyonu içeren Oksigraf odası içine 8 mM digitonin (8 uM) 2 ul enjekte edilir ve 5 dakika süreyle hücre geçirgenliği.
  3. malat 0.8 M (5 mM), 12.5 ul Oksigraf odası içine glutamat 2 M (10 mM), 10 ul enjekte edilir. istikrarlı bir oksijen akı sinyaline kadar rekor hücresel solunum elde edilir.
  4. Oksigraf odasına 0.5 M ADP (2.5 mM) 10 ul enjekte edilir ve oksijen akı sinyal artar kadar hücresel solunum kayıt ve dengeler.
    NOT: hücrelerine ADP eklenmesi oksijen tüketiminde bir artış ve artacak oksijen akı sinyalini neden olacaktır.
  5. Oksigraf odasına 0.2 mM rotenone (0.2 uM) 'DİKKAT' 2 ul enjekte edilir ve oksijen akı sinyal azalır kadar hücresel solunum kayıt ve dengeler.
  6. Daha sonra, Oksigraf odası içine 1M süksinat (10 mM) 20 ul enjekte etmek ve oksijen akışının sinyal artışları kadar hücresel solunum kayıtve sabitler.
  7. Ardından, Oksigraf odasına A (5 mcM) 'DİKKAT' antimycin 5 mM 2 ul enjekte ve oksijen akı sinyal azalır kadar hücresel solunum kayıt ve dengeler.
  8. Daha sonra 0.8 mM askorbat (1 mM) 2.5 ul enjekte etmek ve hemen ardından Oksigraf odası içine 0.2 mM TMPD (0.25 mM) 2.5 ul enjekte oksijen akı sinyali artışları kadar hücresel solunum kayıt ve stabilize eder.
  9. Son olarak Oksigraf odası içine 1 M sodyum azit (5 mM), "Dikkat" 10 ul enjekte etmek ve oksijen akışının sinyal düşene kadar hücresel solunum kayıt ve stabilize eder.

Bozulmamış Hücre 8. Oksijen Tüketimi

  1. Adımları protokol 4.3'e 4.1 tarif edilen prosedür izlenerek, bir Oksigraf odası ihtiva eden bir hücre süspansiyonu (1 x 10 6 / ml) hazırlayın.
  2. Oksigraf odası içeren hücre süspansiyonu içine 4 mg / ml oligomycin (2 ug / ml) 1 ul enjekteistikrarlı bir oksijen akı sinyali gelene kadar d rekor hücresel solunum elde edilir.
  3. Daha sonra Oksigraf odasına FCCP 0.2 mM (0.1 uM) 'DİKKAT' 1 ul enjekte ve oksijen akı sinyal artar kadar hücresel solunum kayıt ve dengeler.
  4. Oksigraf odasına FCCP 0.2 mM (0.4 uM) 3 ul enjekte edilir ve daha fazla oksijen akı sinyal artar kadar hücresel solunum kayıt ve dengeler.
  5. Oksijen akı sinyali daha sonra maksimal seviyeleri ve hiçbir daha da artar ve ulaşıncaya kadar Oksigraf odasına (odasında 0,1-2 uM son konsantrasyon) 0,2 1 mM FCCP için 1-3 ul enjekte edilerek 0.1 mM 0.3 adımlarla FCCP titre azalan başlar.
    NOT: Oksijen sinyali maksimum seviyeye ulaşır ve azalan başladığında FCCP enjekte durdurun.
  6. Daha sonra, 0.2 mM rotenone (0.2 uM) ve hazneye A (5 um) antimycin 5 mM 2 ul 2 ul enjekte edilir. Kayıt solunum t kadaro oksijen akı sinyali azalır ve dengeler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Digitonin Titrasyon Deney: Hücresel permeabilization için Optimum Digitonin Konsantrasyon belirlenmesi

Digitonin titrasyonu HepG2 hücrelerinin nüfuziyet kabiliyeti optimal konsantrasyonunu belirlemek için gerçekleştirilir. Bu deneyler için, digitonin rotenone, süksinat (mitokondriyal kompleks II alt-tabaka) ve ADP bir doyma bir miktarının varlığında sağlam hücrelerde titre edilir, ve solunum başlangıçta ve her sonra ölçülür (karmaşık II bağımlı durumudur 3 indükleme) titrasyon (Şekil 1A ve 1B). Bu deney sonucu, digitonin yokluğunda, hücresel solunum mitokondriyal alt-tabaka ve ADP mevcudiyetinde stimule değildir, çok düşük ve bozulmamış olmayan permeabilize hücrelerin solunum olduğunu göstermektedir. Bununla birlikte, digitonin adım adım eklenmesi üzerine, hücresel plazma membranında geçirgenleştirildi ve mitochon olduğusüksinat ve ADP hücreleri girdiğinizde drial solunum (karmaşık II bağımlı devlet 3) tam permeabilization kadar artar. Sonuçlar 8-12 uM digitonin konsantrasyonda permeabilizasyon HepG2 hücreleri ADP-uyarımlı solunum için uygun olduğunu göstermektedir. digitonin aşırı miktarda kullanıldığında Ancak, mitokondriyal dış membran bütünlüğünü tehlikeye girebilir. Şekil 1 'de gösterildiği gibi, digitonin aşırı miktarda tehlikeye mitokondriyal dış membran bütünlüğünü gösteren kompleksi II bağımlı durumudur 3 solunum bir azalmaya neden.

Mevcut ve aşağıdaki protokoller, tüm oksijen tüketim oranları kapalı olarak (hacim özgü oksijen akı bölünmesiyle hesaplanır IO 2 [pmol x saniye -1 x 10 -6 hücre] (milyon hücre başına oksijen akışı) olarak ifade edilmiştir oksijen odası), JV, O 2 [pmol x saniye -1 x ml -1] hücre concentrat tarafından hücre odası iyon (hacim başına hücre sayısı [10 6 hücre X mi -1]) 15.

Şekil 1
Şekil 1: Digitonin titrasyonu HepG2 hücrelerinin nüfuziyet kabiliyeti optimal konsantrasyonunu belirlemek için. mavi çizgi oksijen konsantrasyonunu temsil eder; Kırmızı çizgi oksijen akışını (oksijen konsantrasyonu eğimi) temsil eder. Hücreler mevcut oksijeni kullanmak olarak oksijen konsantrasyonu zamanla azalır. Oksijen tüketimi pmol / (hücre sn x sayısı) olarak ifade edilir. Yüksek çözünürlüklü Respirometrik (A) iz mitokondriyal kompleks II bağımlı solunum ile ilgili (1 denemesi) için, alt-tabaka olarak ADP ve süksinat Digitonin kullanımı. SD ± aracı olarak 4 ayrı deneyler (B) Mitokondriyal solunum oranları sundu./ 54985 / 54985fig1large.jpg "target =" _ blank "upload> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Bir Optimal Digitonin Konsantrasyon kullanarak Mitokondriyal Dış Zar Bütünlüğü Değerlendirilmesi

dış mitokondrial membran bütünlüğü optimal digitonin konsantrasyonu (8 mcM) etkisini değerlendirmek için, hücreler digitonin ve mitokondriyal dış membran bütünlüğü ile permeabilize süksinat sonraki ilavesinden sonra mitokondriyal solunum ölçümü ile test edilir (mitokondriyal kompleks II bağımlı bir devlet 2 dinlenme ADP yokluğunda solunum), ADP (ADP ((ADP oligomycin ilave edilir, sitokrom c varlığında) devlet 3 solunum II bağımlı kompleks uyarılmış inhibitörü durumu 3 solunum II bağımlı) ve sitokrom C kompleksi uyarılmış Şekil 2'de gösterildiği gibi, ATP sentaz) durumunu 4. taklit etmek için

şekil 2
Şekil 2: Sitokrom c digitonin (8 uM) ile muamele hücre solunum geliştirmez. yüksek çözünürlüklü Solunum kullanarak sitokrom-c testi için Temsilcisi solunum izleri. Hücreler varlığında 10 mM süksinat (devlet 2), 2.5 mM ADP (devlet 3) ve 10 uM sitokrom-c (devlet 3 sonraki ilave edildikten sonra solunum oranları ölçümü ile test edilir 8 mcM digitonin ve mitokondriyal dış membran bütünlüğü ile permeabilize State 4. Solunum frekansı taklit etmek için 2 ug / ml oligomycin ilave edildi sitokrom c) pmol / (sn olarak ifade edilir X million hücreleri) içerir. CII: Karmaşık II. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Digitonin'in bir Yüksek Konsantrasyon kullanarak Mitokondriyal Dış Zar Bütünlüğü Değerlendirilmesi

digitonin çok yüksek konsantrasyon mitokondrial dış membran bütünlüğünü tehlikeye olduğunu göstermek için, biz digitonin yüksek dozda kullanarak bir deney gerçekleştirildi. Bu deney için, hücreler 40 uM digitonin yerine 8 uM ve mitokondriyal dış membran bütünlüğü ile permeabilize süksinat daha sonra ilave edildikten sonra mitokondriyal solunumun ölçülmesiyle test edilir (mitokondriyal kompleks ADP yokluğunda durum 2 solunum dinlenme II bağımlı) ADP ve sitokrom c (ADP kompleksi II bağımlı bir devlet 3 solunum uyarılmış) (ADP kompleksi II-d uyarılmışoligomycin mevcudiyetinde (Şekil 3) durumunu 4 taklit etmek oligomycin ilave edilir ependent durumu sitokrom c varlığında, 3 solunum). Bu deney sonucu, sitokrom C tehlikeye mitokondriyal dış membran bütünlüğünü gösteren mitokondriyal dış membran sitokrom c'nin kaybı gösteren, digitonin yüksek bir doz ile tedavi edilen hücrelerin solunum arttırdığını göstermektedir.

Şekil 3,
Şekil 3: digitonin Yüksek doz (40 uM) mitokondrial dış membran bütünlüğünü tehlikeye atmakta. substrat olarak süksinat kullanılarak Solunum yüksek çözünürlük iz. mavi çizgi oksijen konsantrasyonunu temsil eder; Kırmızı çizgi oksijen akışını (oksijen konsantrasyonu eğimi) temsil eder. Hücreler mevcut oksijeni kullanmak olarak oksijen konsantrasyonu zamanla azalır. Oksijen tüketimi olarak ifade edilirpmol / (sn hücrelerinin sayısı x). 40 uM digitonin, süksinat (10 mM), ADP (2.5 mM), sitokrom c (10 uM) ve oligomycin (2 ug / ml) ve ardından, gösterilir. CII: Karmaşık II. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Maksimal Fazla Eksojen Alt Tabakalar kullanarak, Solunum permeabilize HepG2 Hücrelerinin (Devlet 3) ADP-uyarılmış

Kompleks I, geçirgen HepG2 hücreleri (1 x 10 6 hücre / ml) II ve IV-bağımlı maksimal ADP ile uyarılan solunum (durum 3) başarılı bir şekilde aşırı eksojen alt-tabakaların (Şekil 4) kullanılarak ölçülür. Bu deney için, hücreler de tarif edildiği gibi alt tabakaların ve inhibitörlerin daha sonra ilave edildikten sonra ölçülür Digitonin ve mitokondriyal oksijen tüketimi oranlarına sahip permeabilize

Şekil 4,
Şekil 4: permeabilize HepG2 hücrelerinin maksimal ADP ile uyarılmış solunum (devlet 3) Başarılı ölçümü. Solunum hızı pmol / (sn X milyon hücre) olarak ifade edilir. Hücreler 8 mcM digitonin ve mitokondriyal solunum oranları ile permeabilize bir kompleks III inhibe antimycin, karmaşık I, süksinat (devlet 3, kompleks II) inhibe etmek glutamat ve malat (devlet 3, kompleks I) rotenone sonraki ilavesinden sonra ölçülür ve askorbat / TMPD ve sodyum azit kompleksi IV inhibe etmek. Kompleks IV solunum (Eyalet 3)önce ve sodyum azid ilave edildikten sonra oksijen tüketimi çıkarılarak yorumlanır. CI: kompleks I, CII: Karmaşık II, CIV: Karmaşık IV. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Maksimal ADP ile uyarılmış Solunum başarısız Ölçüm permeabilize HepG2 Hücrelerinin (Eyalet 3)

Kompleks I, II ve IV-bağımlı maksimal ADP ile uyarılan solunum permeabilize HepG2 hücreleri (1 x 10 6 hücre / ml) (Durum 3) başarılı bir şekilde aşırı eksojen alt-tabakaların (Şekil 5) ile ölçülmez. Bu deney için, hücreler, Şekil 5'te tarif edildiği gibi alt tabakaların ve inhibitörlerin daha sonra ilave edildikten sonra ölçülür Digitonin ve mitokondriyal oksijen tüketimi oranlarına sahip permeabilize edilmiştir. Şekil 5'te gösterildiği gibi, oranları, Şekil 4'te gösterilen sonuçlar ile karşılaştırıldığında permeabilize hücrelerin içinde oldukça düşüktür. azaltılmış solunum seviyeleri için olası bir açıklama, önceki deneylerden mitokondriyal inhibitörleri ile Oksigraf odaları kirliliğidir. Böyle antimycin ve rotenone olarak Mitokondriyal inhibitörleri etanol içinde çözünür ve Oksigraf odaları ve stoper sopa olabilir. Bu nedenle Oksigraf odaları ve tapalar her deneyden sonra yoğun yıkanmalıdır.

Şekil 5,
Şekil 5: permeabilize HepG2 hücrelerinin maksimal ADP ile uyarılmış solunum (devlet 3) ve Başarısız ölçümü. Karmaşık I- başarısız bir denemenin Temsilcisi solunum izleri, II- ve yüksek çözünürlüklü Solunum kullanarak permeabilize HepG2 hücreleri maksimal ADP ile uyarılmış solunum (devlet 3) IV-güdümlü. Solunum hızı olarak ifade edilirpmol / (sn x milyon hücre). Hücreler 8 mcM digitonin ve mitokondriyal solunum oranları ile permeabilize bir kompleks III inhibe antimycin, karmaşık I, süksinat (devlet 3, kompleks II) inhibe etmek glutamat ve malat (devlet 3, kompleks I) rotenone sonraki ilavesinden sonra ölçülür ve askorbat / TMPD ve sodyum azit kompleksi IV inhibe etmek. Kompleks IV solunum (Devlet 3) öncesi ve sodyum azid ilave edildikten sonra oksijen tüketimini çıkarılarak yorumlanır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Bozulmamış Hücre bağlı olan ve bağlanmamış solunum

HepG2 hücreleri bazal oksijen tüketim oligomycin (oligomycin hassas olmayan solunum) ve FCCP sırayla ilave (Şekil 6) mevcudiyetinde ölçülmüştür. Basal hücresel solunum hızı endojen hücresel alt tabakaların varlığı bozulmamış HepG2 hücrelerinin oksijen tüketimini temsil eder ve hücresel ATP talebine yanıt olarak değiştirebilir. Oligomycin duyarsız solunum hızı hücresel ATP ciro temsil eder ve bazal endojen solunum hızından oligomycin duyarsız solunum hızını çıkarılmasıyla hesaplanır hücresel solunum ve oligomycin duyarlı solunum hızını sızıntı temsil eder. FCCP uncoupler kimyasal ardışık kayıt farklı konsantrasyonlarda ve maksimal bağlanmamış solunum ilave edilir. Bu deneysel koşul için maksimal mitokondriyal bağlanmamış solunum hızı (maksimum elektron taşıma sistemi kapasitesi) 0,9-1,2 iM FCCP elde edilir. Sonuçlar sağlam HepG2 hücrelerinde FCCP bifazik bir aktivite gösterir. Bu nedenle, her bir deney koşulu için, FCCP maksimal bağlanmamış solunum hızı elde etmek için titre edilir. Kuplajsız Solunum kontrol oranı (uRCR) FCCP bölünmesiyle hesaplanıroligomycin varlığında solunum hızı ile Kuplajsız solunum hızı. Oligomycin duyarlı solunum (ATP ciro) oligomycin duyarsız bazal endojen solunum gelen solunum oranı çıkarılarak hesaplanır. Bazal solunum oranı ile oligomycin duyarlı solunum oranı bölünmesiyle hesaplanır ATP sentezlemek için kullanılan mitokondriyal oksijen tüketim oranını temsil etkinliğini bağlanması. Deney sonunda, olmayan mitokondriyal solunum hızını elde etmek için, mitokondriyal elektron taşıma zinciri inhibitörleri ilave edilir ve non-mitokondrial solunum hızı tüm sonuçlar çıkarılır. Şekil 6'da gösterilen deney için, olmayan mitokondriyal solunum hızı 26 pmol / (sn x Milyon hücre), bazal solunum hızı 48 pmol / (sn x milyon hücre) olduğunu, oligomycin duyarsız solunum hızı 7 pmol / (sn x milyon hücre), oligomycin duyarlı solunum (ATP ciro) 41 pmol / (sn x milyon hücre) ve coupling verimi 0.85.

Şekil 6,
Şekil 6: Birleştirilmiş ve sağlam hücrelerin Kuplajsız solunum. HepG2 hücreleri bazal oksijen tüketimi Örnek solunum izleri oligomycin (oligomycin hassas olmayan solunum) ve yüksek çözünürlüklü Solunum kullanılarak FCCP sırayla ilave mevcudiyetinde ölçülmüştür. istikrarlı bir sinyal ulaşıldığında Bundan sonra, solunum tüm sonuçlar çıkarılır rotenone ve antimisin eklenmesi ve kalan arka plan solunum (non-mitokondrial solunum) ile inhibe edilir. Oksijen tüketimi pmol / (hücre sn x sayısı) olarak ifade edilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Solunum tamponu 13
Kimyasal konsantrasyon
Sakaroz 110 mM
EGTA 0.5 mM
MgCI2 3.0 mM
KCI 80 mM
K-laktobionat 60 mM
KH 2 PO 4 10 mM
boğa 20 mM
Hepes 20 mM
BSA 1.0 g / l
pH 7.1

Tablo 1: solunum tampon bileşimi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Mevcut protokolün amacı mitokondriyal solunum zinciri kompleksleri '(I-IV) solunum hızları, maksimum mitokondriyal elektron taşıma sistemi kapasitesi ve mitokondriyal dış membran bütünlüğü ölçmek için yüksek çözünürlüklü Solunum kullanımı idi.

Mevcut protokolde içinde bazı kritik adımlar vardır. İlk olarak, selüler oksijen tüketim oranları genellikle hücrelerin sayısı normalize edilir (pmol / [hücre sn x sayıda]). Bu nedenle, hücre oksijen tüketimini takip etmeden önce, hücre sayısının doğru ve güvenilir ölçümler sağlayan bir cihaz kullanmak için çok önemlidir. Mevcut protokolde otomatik hücre sayacı (adım malzemelerin protokol ve tablo 3.7) kullanılmıştır. Özellikle permeabilize hücreleri ikinci kritik bir adım, hücreler (adım protokolünün 3.6) yeniden süspanse Permeabilize olan solunum tampon seçimdir. Hücresel permeabilization intracellula kaybını tetikleyebilir berir iyonlar, permeabilization sırasında kullanılan orta içi çevre ile uyumlu olması çok önemlidir. Bu nedenle, solunum tamponu hücre içi ve hücre dışı ortamı (Tablo 1) 13 yansıtan bir bileşim ve osmolarite içermelidir. Buna ek olarak, en iyi ve etkin bir hücre geçirgenliği için, optimum ve en etkili konsantrasyonu belirlemek için, her hücre türü için değil, aynı zamanda her bir hücre yoğunluğu için, sadece konsantrasyon Digitonin titre için çok önemlidir. Digitonin konsantrasyonu çok düşük ise, hücre geçirgen edilmez. Buna karşılık, digitonin büyük miktarda hücrelerin maruz mitokondrial dış membran zarar verecektir. Bu nedenle, bir başka önemli nokta mitokondrial dış membran bütünlüğünü araştırmaktır. Hücresel solunum kapasitesini hafife etmemek için, Solunum deneyleri fizyolojik sıcaklıkta gerçekleştirilir da çok önemlidir (37 ° C). Dikkate alınacak diğer bir önemli nokta nedeniyle maksimal solunum akı elde etmek için permeabilize hücreleri ve yeterli alt tabaka seviyelerine oksijen karşı ADP difüzyon sınırlaması nedeniyle, ADP miktarda doyurarak kullanılmasıdır. permeabilize hücrelerin bazı deneylerde, bu dışsal alt tabakalar eklenmesinin meydana gelebilir ve ADP solunum hızı önemli bir artışa yol açmaz. Bu birkaç etkene neden olabilir. Örneğin, hücre geçirgenliği digitonin yüksek konsantrasyonlarda kullanılması mitokondriyal dış membran zarar verebilir. Bu nedenle, her biri hücre tipi ve yoğunluğu için optimal konsantrasyonunu belirlemek için digitonin titre edilmelidir. Bundan başka, digitonin saflığı çok kritik ve hücresel nüfuziyet kabiliyeti optimal konsantrasyonlarını belirlemek için titre edilmelidir saflık ve satın alınan digitonin yeni toplu olarak önemli ölçüde değişebilir digitonin ticari olarak temin edilebilir. Buna ek olarak, gözenek oluşturucu hücre, plazma zarının birçok türü vardırfarklı özelliklere sahip maddeler. Örneğin, saponin Digitonin'dir daha hafif deterjan ve hücre tipine bağlı olarak, uygun bir hücre geçirimli hale reaktifi seçilmelidir.

Bu rotenon antimisin olarak Solunum deneylerde, kullanılan mitokondriyal fonksiyonun en inhibitörleri, sadece etanol içinde çözünür olan ve hücresel solunum inhibe Oksigraf odası ve stoper sopa. Bu sorunu önlemek için, Oksigraf odaları ve tapalar her deneyde sonra% 95 etanol ile iyice yıkanır olması gerekir. Dikkate alınacak diğer bir önemli nokta hem sağlam ve geçirgen hücresel solunum testleri için, hücre yoğunluğu, tipi ve hücre kültürü izdiham solunum oranları etkileyebilir olmasıdır. Örneğin, HepG2 hücreleri ile, genellikle bölme başına 1.000.000 2 hücrelerin bir hücre yoğunluğuna kullanımı. Respirometrik sırasında çok düşük hücre yoğunluğu kullanılarak, çok zayıf bir sinyal ortaya çıkmasına neden olabilir. Biz de hücre kültür confluency solunum oranları etkileyebilir gözlenmiştir. EXA içinHepG2 hücreleri (% 100'den fazla) çok konfluent yetiştirilen mple, onlar çok daha az oksijen tüketir.

Deneyler sırasında istikrarlı ve tekrarlanabilir oksijen akışını elde etmek için bir başka önemli nokta Araca yani polarografik oksijen sensörü membranlar ve enstrümantal arka plan düzeltmeleri düzenli değişimi yüksek çözünürlüklü Respirometrik korunmasıdır. uncoupler FCCP ile deneyler için, hücresel solunum ve maksimal akış elde edilmez, ancak bunun yerine, hücresel solunum inhibe teşvik etmez hücrelere FCCP bu ilaveli olabilir. FCCP ilavesi üzerine hücresel oksijen tüketiminin önlenmesi FCCP konsantrasyonu optimal değildir ve çok yüksek olduğunu gösteriyor olabilir. Bu deneyler için, her bir deney için, dikkatli maksimum akı elde etmek üzere FCCP konsantrasyonu titre için gereklidir.

yüksek çözünürlüklü Respirometrik bir sınırlaması, kurulması, bu yüksek verimli tarama olduğudoz-yanıt eğrileri ve biyolojik örnekler sınırlı miktarda Zaman serisi deneyleri mümkün değildir. Bu deneyler için, böyle bir hücre dışı akı analizörü gibi diğer araçlar kullanabilirsiniz. Diğer sınırlamalar i) cihaz otomatik değil ve bir operatörün sürekli varlığını gerektirir, ii) zaman enstrümanın, iii) bir seferde çalıştırmak olabilir sadece iki odadan ve sadece iki deneyleri vardır, iv) bakım alıcı bu tür membranlar ve kalibrasyonları değiştirme gibi, çok zaman gerektirir ve v) odaları tek kullanımlık değildir ve inhibitörleri ile kontamine olabilir. Geleneksel polarografik oksijen elektrot cihazlar üzerinden yüksek çözünürlüklü Oksigraf avantajları i) yüksek hassasiyet, ii) biyolojik örneklerin daha az sayıda gerekli iii) solunum oranları iki odalarında aynı anda ölçülebilir ve iv) cihazı, oksijen kaçağı azalttı vardır. Hücre dışı akı analizörü üzerinde yüksek çözünürlüklü Oksigraf bazı avantajları i) daha düşük maliyetler vardırCihaz ve sarf malzemeleri ve yüzey-uncoupler-inhibitör titrasyon protokolleri ii) fizibilite.

Bu tekniği mastering sonra gelecek uygulamalar veya yön, H 2 hücresel solunum, mitokondriyal membran potansiyeli eşzamanlı ölçümler O 2, aynı odasında optik sensörler kullanılarak ATP ve kalsiyum düzeyleri.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ADP Sigma A 4386 Chemical
Antimycin A Sigma A 8674 Chemical, dissolve in ethanol
Ascorbate Merck 1.00127 Chemical
BSA Sigma A 6003 Chemical
FCCP Sigma C 2920 Chemical, dissolve in ethanol
Countess automated cell counter  Thermo Fisher Scientific n/a Automated cell counting instrument
Cytochrome c Sigma C 7752 Chemical
Digitonin Sigma D 5628 Chemical, dissolve in DMSO
DMEM Gibco 31966021 Medium
EGTA fluka 3779 Chemical
FBS Gibco 26010-074 Medium component
Glutamate Sigma G 1626 Chemical
Hepes Sigma H 7523 Chemical
KCl Merck 1.04936 Chemical
KH2PO4 Merck 1.04873 Chemical
K-lactobionate Sigma L 2398 Chemical
MgCl2 Sigma M 9272 Chemical
O2k-Core: Oxygraph-2k  Oroboros Instruments 10000-02 High-resolution respirometry instrument
Oligomycin Sigma O 4876 Chemical, dissolve in ethanol
Penicillin-streptomycin Gibco 15140122 Chemical
Sodium azide Sigma S2002 Chemical
Rotenone Sigma R 8875 Chemical, dissolve in ethanol
Succinate Sigma S 2378 Chemical
Taurine Sigma T 8691 Chemical
TMPD Sigma T 3134 Chemical
Trypsin Sigma T 4674 Chemical

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochem J. 435 (2), 297-312 (2011).
  2. Lanza, I. R., Nair, K. S. Functional assessment of isolated mitochondria in vitro. Methods Enzymol. 457, 349-372 (2009).
  3. Zhang, J., et al. Measuring energy metabolism in cultured cells, including human pluripotent stem cells and differentiated cells. Nat Protoc. 7 (6), 1068-1085 (2012).
  4. Gnaiger, E., Steinlechner-Maran, R., Mendez, G., Eberl, T., Margreiter, R. Control of mitochondrial and cellular respiration by oxygen. J Bioenerg Biomembr. 27 (6), 583-596 (1995).
  5. Wu, M., et al. Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells. Am J Physiol Cell Physiol. 292 (1), C125-C136 (2007).
  6. Djafarzadeh, S., Vuda, M., Takala, J., Jakob, S. M. Effect of remifentanil on mitochondrial oxygen consumption of cultured human hepatocytes. PLoS One. 7 (9), e45195 (2012).
  7. Horan, M. P., Pichaud, N., Ballard, J. W. Review: quantifying mitochondrial dysfunction in complex diseases of aging. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 67 (10), 1022-1035 (2012).
  8. Niklas, J., Melnyk, A., Yuan, Y., Heinzle, E. Selective permeabilization for the high-throughput measurement of compartmented enzyme activities in mammalian cells. Anal Biochem. 416 (2), 218-227 (2011).
  9. Jeger, V., et al. Dose response of endotoxin on hepatocyte and muscle mitochondrial respiration in vitro. Biomed Res Int. 2015, 353074 (2015).
  10. Nicholls, P. Cytochrome c binding to enzymes and membranes. Biochim Biophys Acta. 346 (3-4), 261-310 (1974).
  11. Cortese, J. D., Voglino, A. L., Hackenbrock, C. R. Multiple conformations of physiological membrane-bound cytochrome c. Biochemistry. 37 (18), 6402-6409 (1998).
  12. Gorbenko, G. P. Structure of cytochrome c complexes with phospholipids as revealed by resonance energy transfer. Biochim Biophys Acta. 1420 (1-2), 1-13 (1999).
  13. Gnaiger, E., Méndez, G., Hand, S. C. High phosphorylation efficiency and depression of uncoupled respiration in mitochondria under hypoxia. Proc Natl Acad Sci USA. 97, 11080-11085 (2000).
  14. Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Methods Mol Biol. 810, 25-58 (2012).
  15. Gnaiger, E. Mitochondrial Pathways and Respiratory Control. An Introduction to OXPHOS Analysis. Mitochondr Physiol Network 17.18. , OROBOROS MiPNet Publications. Innsbruck. 64 (2012).

Tags

Hücresel Biyoloji Sayı 120 mitokondri oksidatif fosforilasyon oksijen tüketimi yüksek çözünürlüklü Solunum sitokrom C digitonin
Yüksek çözünürlüklü Solunum permeabilize ve bozulmamış Hücreleri Mitokondrial fonksiyonu değerlendirmek için
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Djafarzadeh, S., Jakob, S. M.… More

Djafarzadeh, S., Jakob, S. M. High-resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Permeabilized and Intact Cells. J. Vis. Exp. (120), e54985, doi:10.3791/54985 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter