Summary
Ad alta risoluzione respirometria è utilizzato per determinare il consumo di ossigeno mitocondriale. Questa è una tecnica semplice per determinare mitocondriale complessi della catena respiratoria '(I-IV) frequenza respiratoria, la capacità del sistema di trasporto degli elettroni mitocondriale massima, e l'integrità della membrana mitocondriale esterna.
Introduction
I mitocondri svolgono ruoli importanti nel metabolismo energetico cellulare, particolarmente usando ossigeno per produrre adenosina trifosfato (ATP). Essi sono implicati nella morte cellulare ed in numerose malattie umane. Mitocondriale fosforilazione ossidativa (OXPHOS) combina trasporto degli elettroni lungo la catena di trasporto di elettroni con il consumo di ossigeno e la sintesi di ATP. L'acido ciclo (TCA) mitocondriale tricarbossilici è coinvolto nella conversione di proteine, carboidrati e grassi in composti ricchi di energia come dinucleotide nicotinamide adenina (NADH) e flavina adenina dinucleotide (FADH 2). Gli elettroni del NADH e FADH2 vengono poi trasferiti ai respiratori di trasporto degli elettroni complessi proteici catena (da I a IV) che si trova nella membrana mitocondriale interna. Inoltre, altri due percorsi redox possono trasferire elettroni elettroni catena di trasporto: i) mitocondriale elettron-trasferimento flavoproteina (ETF) che si trova sulla faccia matrice del mito internomembrana mitocondriale, e fornisce elettroni da acidi grassi β-ossidazione; e ii) deidrogenasi mitocondriale glicerofosfato che ossida glicerofosfato di diidrossiacetone fosfato e alimenta gli elettroni nella catena di trasporto degli elettroni mitocondriale. IV Complesso (accettore di elettroni finale) trasferisce elettroni ad una molecola di ossigeno, la conversione di ossigeno a due molecole di acqua. Spostamento degli elettroni dal respiratoria complessa catena di trasporto degli elettroni da I a IV è accoppiato con il flusso di protoni dalla matrice mitocondriale allo spazio intermembrane che stabilisce un gradiente elettrochimico attraverso la membrana mitocondriale interna. In seguito, mitocondriale complesso V (ATP sintasi) navette gli ioni idrogeno indietro nella matrice mitocondriale e sintetizza molecole di ATP. Funzione OXPHOS può essere valutata in vivo e in vitro utilizzando varie tecniche e vari stati respirazione mitocondriale può essere ottenuto. In mitocondri isolati seguente influenzantistati Ry possono essere misurati: i) basale respirazione mitocondriale (stato 1), ii) il consumo di ossigeno dopo l'aggiunta di substrati specifici delle mitocondriale complessi della catena respiratoria (stato 2), iii) massimo consumo di ossigeno mitocondriale dopo l'aggiunta di saturare concentrazioni di adenosina difosfato (ADP) (stato 3) e, iv) riposo respirazione dopo il consumo ADP (convertito in ATP) (stato 4). In cellule intatte le seguenti stati respiratorie possono essere misurati: i) basale consumo di ossigeno cellulare in presenza di substrati endogeni e ADP, ii) basale consumo di ossigeno cellulare in presenza di oligomicina (oligomicina-insensitive respirazione) e oligomicina sensibili respirazione (ATP turnover), iii) FCCP respirazione disaccoppiata, e iv) la respirazione mitocondriale non dopo l'aggiunta di antimicina A e rotenone. Nelle cellule permeabilizzate, substrati specifici dei complessi della catena di trasporto degli elettroni e ADP possono essere aggiunti e massimi complessi-dipendente frequenza respiratoria such I- così complesso, II e frequenza respiratoria IV-dipendenti può essere misurata.
Le misurazioni della respirazione cellulare forniscono importanti intuizioni capacità respiratoria mitocondriale specifico a complessi I-IV, integrità mitocondriale e metabolismo 1, 2, 3 energia. Uno dei dispositivi che consentono misurazioni del consumo di ossigeno mitocondriale con elevata precisione, risoluzione e sensibilità è la oxygraph ad alta risoluzione 4. Il dispositivo ad alta risoluzione oxygraph contiene due camere con fori di iniezione e ciascuna camera è dotata di un sensore di ossigeno polarografico. sospensioni mitocondriali cellulari o isolate si mescolano continuamente nel respirometro. Per valutare la funzione mitocondriale, substrati e inibitori per l'attività mitocondriale complesso può essere aggiunto in seguito protocolli standard. Substrati e inibitori possono essere titolati per int iniezioneo le camere del oxygraph, e tassi di consumo di ossigeno sono calcolati utilizzando il software ed espresso in picomoli al secondo per numero di cellule. Ad alta risoluzione respirometria offre diversi vantaggi rispetto ai dispositivi di elettrodi di ossigeno polarografico tradizionali e convenzionali, tra cui una maggiore sensibilità e la capacità di lavorare con un piccolo numero di campioni biologici come le cellule intatte o permeabilizzate. Inoltre, ogni dispositivo contiene due camere, e frequenza respiratoria può essere registrato contemporaneamente per il confronto di concentrazioni di ossigeno. Il oxygraph ad alta risoluzione ha anche il vantaggio di una ridotta perdita di ossigeno dalle camere del dispositivo rispetto ai dispositivi elettrodo ossigeno polarografiche tradizionali. Un altro dispositivo recentemente sviluppato per misurare il consumo di ossigeno cellulare è il 96 pozzetti extracellulare analizzatore di flusso 5. L'analizzatore di flusso extracellulare è equipaggiato con fluorescenza invece di sensori polarografiche. I vantaggi del extracellulareanalizzatore di flusso rispetto al oxygraph ad alta risoluzione sono i) è un dispositivo fortemente automatizzate, ii) è possibile misurare il consumo di ossigeno in 24 e piastre a 96 pozzetti per lo screening ad alta produttività, quindi richiedono minori quantità di campioni biologici, e iii) misurazione supplementare del flusso glicolitico cellulare è possibile. Gli svantaggi del analizzatore di flusso extracellulare in confronto al oxygraph ad alta risoluzione sono i) i costi elevati del dispositivo e di materiali di consumo come piatti fluorescenti, che sono a perdere, e ii) solo quattro composti per saggio / pozzetto sono iniettabili pertanto il sistema non è fattibile per i protocolli di titolazione substrato-disaccoppiatore-inibitori.
Nel presente studio, usiamo ad alta risoluzione respirometria per determinare la respirazione mitocondriale. Per gli esperimenti di consumo di ossigeno cellulari, le cellule vengono permeabilizzate per consentire l'ingresso di ADP esogeno e substrati mitocondriali ossidabili per alimentare elettroni in complexes del sistema respiratorio. Questo approccio consente la dissezione dei singoli complessi mitocondriali capacità respiratoria, che è un vantaggio rispetto alle cellule intatte (molti substrati sono cellule impermeant). Tuttavia, permeabilizzazione della membrana cellulare interromperà la barriera tra citosol e lo spazio extracellulare e medio (lavare di soluti citosolico) e la composizione dello spazio intracellulare è equilibrata con il mezzo extracellulare. Uno degli svantaggi di cellule permeabilizzate oltre cellule intatte è che la membrana esterna mitocondriale può essere danneggiato se eccessivo consumo di detersivo sono impiegati durante permeabilizzazione cellulare. In cellule intatte, basale, la respirazione accoppiata e disaccoppiata di cellule intatte può essere misurata. Questo metodo valuta il consumo di ossigeno delle cellule intatte senza l'aggiunta di substrati esogeni e ADP, riproducendo la funzione respiratoria nella cella integrato e fornendo anche informazioni sulla massima transpo elettroni mitocondrialeCapacità rt 6, 7. Uno dei vantaggi di cellule intatte oltre cellule permeabilizzate è che ambiente cellulare non interrompere e mitocondri sono in contatto con le intere componenti delle cellule. Per permeabilize membrana plasmatica cellulare, detergenti tipo digitonina sono stati utilizzati 8. Tuttavia, l'integrità della membrana mitocondriale esterna può essere compromessa se vengono impiegate quantità eccessive di digitonina. Per confermare che l'integrità della membrana esterna mitocondriale non è compromessa in cellule permeabilizzate, titolazione digitonina viene eseguito per determinare la concentrazione ottimale per permeabilizzazione cellulare. Per questi esperimenti, le cellule sono risospese in terreno respirazione e concentrazione digitonina viene titolato mediante respirometria in presenza di substrati mitocondriali e ADP e tassi di respirazione vengono misurate. La respirazione di cellule intatte, non permeabilizzate non è stimolata in presenza di mitochosubstrati ndrial e ADP. Tuttavia, la successiva titolazione graduale digitonina produrrebbe graduale permeabilizzazione delle membrane plasmatiche, e la concentrazione digitonina ottimale si ottiene. Ciò è dimostrato dall'incremento della respirazione fino a completa permeabilizzazione. Qualità mitocondriale e l'integrità della membrana esterna possono essere verificate con l'aggiunta di esogeno citocromo c 2, 9. Citocromo c è un 12 kDa elettroni proteina di trasporto della catena mitocondriale di trasporto degli elettroni 10, 11, 12. Esso è localizzato nello spazio intermembrana mitocondriale ed è coinvolta nel consumo di ossigeno, portando elettroni complesso III complesso IV. Una volta che la membrana esterna mitocondriale è danneggiato, citocromo c viene rilasciato, e il consumo di ossigeno mitocondriale è ridotta. Dopo aggiunta di esogeno citocromo c, qualsiasi aumento nella respirazione mitocondriale è indicativo di unperturbato membrana mitocondriale esterna.
Nelle cellule permeabilizzate, substrati e inibitori della complessa attività mitocondriale sono aggiunti in seguito vari protocolli di 3, 9. Ad esempio per investigare la frequenza respiratoria mitocondriale complessi-driven, il seguente protocollo può essere utilizzato. Dopo permeabilizzazione delle cellule, prima del complesso è stimolata dal substrati malato e glutammato, che generano NADH come substrato per la catena respiratoria e provocare l'attivazione del complesso I. Successivamente, ADP viene aggiunto per la conversione di ATP (stato 3, attiva complesso I-dipendente la respirazione). Una volta raggiunto un segnale stabile, rotenone (complesso mitocondriale I inibitore) viene somministrato per inibire complesso I. rotenone è seguito da succinato a FADH2 e per attivare complesso II (stato 3, attiva complesso respirazione II-dipendente). Per misurare la respirazione complesso IV-dipendente, primo complesso IIIrespirazione -dipendente è inibita aggiungendo antimicina A (mitocondriale complesso III inibitore). In seguito, la respirazione complesso IV-dipendente è stimolata con la somministrazione di acido ascorbico e tetramethylphenylendiamine (TMPD). TMPD può auto-ossidare nel buffer respirazione, quindi la massima complesso IV-dipendente frequenza respiratoria (stato 3) viene calcolato sottraendo i tassi di respirazione prima e dopo l'aggiunta di sodio azide, un inibitore del complesso mitocondriale IV. Gli esperimenti respirazione possono essere effettuate in due camere di un oxygraph in parallelo uno che serve come un controllo (cellule non stimolate), altre contenenti le cellule stimolate. Ovviamente, le cellule possono essere pretrattate in vari modi, ad esempio, con farmaci che agiscono funzioni mitocondriali, prima del loro consumo di ossigeno viene misurata nella camera oxygraph. Questo protocollo permette esame funzionale dei singoli complessi della catena respiratoria mitocondriale. Inoltre, si può misurare ADP-stimolata massimarespirazione (stato 3) di cellule permeabilizzate, utilizzando acido grasso esogeno in forma di palmitato. In questo protocollo, le scorte concentrati di palmitato di sodio sono coniugati con acidi grassi ultra libero albumina sierica bovina (BSA) (6: 1 rapporto molare palmitato: BSA). Successivamente, le cellule sono prima permeabilizzate con la respirazione mitocondriale e digitonina è valutata mediante aggiunta di carnitina e palmitato seguita da aggiunta di ADP (stato 3, la respirazione massima). Poi, si aggiunge oligomicina per imitare stato 4 (4o stato) e il rapporto di controllo respiratorio (valore di RCR) è calcolato come stato 3 / stato 4o. β-ossidazione promuove la produzione di acetil CoA (che entra nel ciclo TCA) e la generazione di FADH2 e NADH, gli elettroni che sono passati alla catena di trasporto degli elettroni da flavoproteina elettrone-trasferimento e β-idrossiacil-CoA deidrogenasi. I mitocondri sono al centro del metabolismo degli acidi grassi e descritti protocollo palmitato-BSA può essere utilizzato dai ricercatori esaminando grassoty ossidazione degli acidi. In cellule intatte, attivatori e inibitori dell'attività mitocondriale complesso sono aggiunti seguendo un protocollo differente 6, 9. Per questi esperimenti, prima del consumo di ossigeno di cellule non permeabilizzate in assenza di substrati esogeni viene misurata (fosforilazione frequenza respiratoria). Quindi, la frequenza respiratoria non fosforilante viene misurata dopo l'aggiunta di oligomicina, che è un inibitore della mitocondriale ATP sintasi. In seguito, il protonophore carbonile cianuro p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) è amministrato a varie concentrazioni e la frequenza respiratoria mitocondriale disaccoppiato massima viene misurata. Protonophores come FCCP possono indurre un aumento della permeabilità protonica della membrana interna, permettendo il movimento passivo di protoni per dissipare il gradiente chemiosmotica. Un aumento della permeabilità protone disaccoppia respirazione ossidativa (senza produzione di ATP) e induce un aumento oil consumo xygen. In seguito, rotenone e antimicina A sono aggiunti per inibire la respirazione mitocondriale, e la respirazione mitocondriale non viene sottratto da tutti gli altri tassi respiratori.
I tassi di consumo di ossigeno possono essere espressi come IO 2 [pmol x sec -1 x 10 -6 cellule] (flusso di ossigeno per milione di celle) che è calcolato dividendo flusso di ossigeno specifico volume (in ossigeno camera chiusa), JV, O 2 [pmol x sec -1 x ml -1] di concentrazione cellulare nella camera celle (numero di cellule per volume [10 6 cellule ∙ ml 1]) 15. Cell-massa del flusso di ossigeno specifico, JO 2 [pmol x sec -1 x mg -1], è il flusso per cella, IO 2 [pmol x sec-1 x 10 -6 celle], divisi in massa per cella [mg ∙ 10 6 celle]; o il volume specifico flusso, JV, O 2 [pmol x sec -1 x ml -1], diviso in massa per volume [mg ∙ ml 1]. JO 2 è il flusso di ossigeno per proteina cellulare, peso secco o volume cellulare.
Nel presente studio utilizzando ad alta risoluzione respirometria, descriviamo i protocolli per determinare i) concentrazione ottimale digitonina per la completa permeabilizzazione della membrana plasmatica cellulare (test di titolazione digitonina), ii) l'integrità della membrana mitocondriale esterna utilizzando esogeni citocromo c, iii) mitocondriale complessi della catena respiratoria I , II e IV frequenze respiratorie massimi in cellule HepG2 permeabilizzate con digitonina in presenza di ADP esogeno e substrati catena respiratoria mitocondriale, e iv) basale, accoppiati e massima respirazione disaccoppiato (massima capacità di trasporto degli elettroni) di cellule intatte senza l'aggiunta di substrati esogeni e ADP, riproducendo la funzione respiratoria nella cella integrata.
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Protocol
Cultura 1. cellulare
- Cellule Culture epatoma HepG2 umano 6 su 25 cm 2 fiasche di coltura cellulare in terreno Dulbecco Modified Eagle (DMEM) contenente siero 10% inattivato al calore bovino fetale (FBS) e 1% di penicillina-streptomicina a 37 ° C in un incubatore (5% CO 2, 95% di aria) (densità di semina: 1 x 10 6 cellule ogni 25 cm pallone di coltura cellulare 2, tempo di incubazione in incubatrice a 37 ° C: 48 hr, densità delle cellule al confluenza: 4-5 x 10 6 cellule per 25 cm pallone di coltura di cellule 2).
- Eseguire esperimenti quando le cellule sono il 90% al 95% confluenti.
2. ad alta risoluzione respirometria taratura di sensori di ossigeno polarografici
- Pipettare 2.1 ml di tampone respirazione in una camera oxygraph e mescolare il buffer continuo mediante ancoretta magnetica presente nella camera (700 rpm) a 37 ° C per 1 ora fino a quando un segnale di ossigeno flusso stabile diil sensore di ossigeno polarografico si ottiene.
NOTA: gli elettrodi di ossigeno polarografici all'interno di ogni camera oxygraph concentrazione di misura di ossigeno e calcolare il consumo di ossigeno (flusso) all'interno di ciascuna camera. La concentrazione di ossigeno e tassi di consumo di ossigeno (flusso) sono visualizzate in tempo reale on-line in un computer utilizzando il software per l'acquisizione e l'analisi dei dati. - Eseguire una taratura dell'aria del sensore di ossigeno polarografico secondo protocolli 14 del produttore.
NOTA: La calibrazione dei sensori di ossigeno polarografici nei media la respirazione e la concentrazione di ossigeno nei media a saturazione dell'aria temperatura sperimentale viene eseguita solo una volta al giorno al mattino. Successivamente i media possono essere rimossi dalle camere e le cellule risospese in un supporto di respirazione fresca sono aggiunti ad una camera oxygraph e frequenza respiratoria sono misurati. Dopo il primo esperimento, la camera può essere lavato e ulteriore serie di esperimenti può essere eseguita in tegli stessa camera senza ulteriori calibrazioni.
3. tripsinizzazione di cellule aderenti, Celle Counting
- Il giorno dell'esperimento, aspirare il DMEM dal da 25 cm pallone di coltura cellulare 2.
- Risciacquare il monostrato di coltura cellulare nel pallone di coltura con 5 ml di tampone fosfato salino (PBS).
- Pipettare 0,5 ml di 25 mg / ml di soluzione di tripsina (preriscaldata a 37 ° C in un bagno d'acqua a 37 ° C) in monostrato cellulare nel pallone di coltura e incubare per 5 min a 37 ° C in un incubatore (5% CO 2 , 95% di aria).
- Pipetta da 5 ml di DMEM contenente 10% FBS nelle cellule staccate nel pallone di coltura delle cellule e di sospendere le cellule pipettando.
- Trasferimento cellule in una provetta da centrifuga da 15 ml e centrifugare risospeso per 5 min a 350 xg a temperatura ambiente e decantare il surnatante.
- Risospendere il pellet di cellule in 1 ml di tampone respirazione 13 (T grado 1).
4. Alta risoluzione respirometria
- Dopo la taratura dell'aria (eseguita solo una volta al giorno, i punti 2.1-2.2), aspirare il terreno respirazione da una sezione del oxygraph e aggiungere 2,1 ml di sospensione cellulare (1 x 10 6 cellule / ml) dal punto 3.7 alla camera.
- Chiudere la camera oxygraph mediante inserimento del tappo.
- Mescolare le cellule continuo mediante ancoretta magnetica presente nella camera (700 rpm) a 37 ° C e registrare la respirazione cellulare per 5-10 min fino ad ottenere un segnale di flusso di ossigeno stabile.
NOTA: la concentrazione di ossigeno e il segnale di flusso di ossigeno vengono visualizzate in tempo reale on-line in un computer utilizzando il software per l'acquisizione e l'analisi dei datis = "xref"> 14. - Successivamente, iniettare substrati e inibitori della respirazione mitocondriale attraverso i fori di iniezione di titanio dei tappi utilizzando i seguenti protocolli.
5. Digitonina Titolazione in cellule intatte di respirometria
- Preparare una sospensione cellulare contenente camera oxygraph (1 x 10 6 / ml) seguendo la procedura descritta nei passaggi 4.1 a 4.3 del protocollo.
- Iniettare 2 ml di 0,2 mM rotenone (0,2 pM) 'ATTENZIONE' nella camera oxygraph contenente sospensione cellulare attraverso la luce di iniezione di titanio del tappo della camera con una siringa e registrare la respirazione cellulare per 5-10 min fino ad ottenere un segnale di flusso di ossigeno stabile .
NOTA: Tutte le iniezioni nei seguenti operazioni vengono eseguite attraverso i fori di iniezione titanio di tappi che utilizzano siringhe. L'aggiunta di rotenone è facoltativo (che impedisce il flusso inverso di elettroni) e può essere omesso per esperimenti di titolazione digitonina, vederestep 6.3. - Iniettare 20 ml di 1 M succinato (10 mM) nella camera oxygraph e registrare la respirazione cellulare per 5-10 min fino ad ottenere un segnale di flusso di ossigeno stabile.
- Iniettare 10 ml di 0,5 M ADP (2.5 mM) nella camera oxygraph e registrare la respirazione cellulare per 5-10 min fino ad ottenere un segnale di flusso di ossigeno stabile.
- Iniettare 2 ml di 2 mM digitonina (2 mM) nella camera oxygraph e registrare la respirazione cellulare per 2-5 minuti fino ad ottenere un segnale di ossigeno stabile.
- Ancora iniettare 2 ml di 2 mM digitonina nella camera oxygraph e registrare la respirazione cellulare per 2-5 minuti fino ad ottenere un segnale di ossigeno stabile.
NOTA: graduale aggiunta di digitonina alle cellule indurrà un aumento del consumo di ossigeno cellulare e il segnale di flusso di ossigeno aumenterà. - Continuare iniettare 2-4 ml di 2 mm graduali digitonina (2-4 micron) ogni passo nella camera. Dopo ogni passaggio, registrare la respirazione cellulare per 2-5 mfinché si ottiene un segnale di flusso di ossigeno stabile.
NOTA: Smettere di iniettare digitonina quando il segnale di flusso di ossigeno raggiunge un livello massimo e di ulteriori iniezioni di digitonina non aumentano il tasso di respirazione. I lettori dovrebbero determinare la concentrazione ottimale digitonina nei loro laboratori utilizzando i propri reagenti e uso ottenuto concentrazione ottimale digitonina nei passi 6.2 e 7.2 dei seguenti protocolli per i loro esperimenti.
6. Valutazione della membrana mitocondriale esterna Integrità: citocromo C
- Preparare una sospensione cellulare contenente camera oxygraph (1 x 10 6 / ml) seguendo la procedura descritta nei passaggi 4.1 a 4.3 del protocollo.
- Iniettare 2 ml di 8 mM digitonina (8 mM) nella camera oxygraph contenente la sospensione cellulare (1 x 10 6 / ml) e permeabilize le cellule per 5 min.
- Iniettare 20 ml di 1 M succinato (10 mM) nella camera oxygraph e registrare respirat cellulareionico per 5-10 minuti fino ad ottenere un segnale di flusso di ossigeno stabile.
- Iniettare 10 ml di 0,5 M ADP (2.5 mM) nella camera oxygraph e registrare la respirazione cellulare per 5-10 min fino ad ottenere un segnale di flusso di ossigeno stabile.
NOTA: L'aggiunta di ADP alle cellule stimolerà complesso I e indurre un aumento del consumo di ossigeno, e il segnale di flusso di ossigeno aumenta e stabilizzare. - Iniettare 5 ml di 4 mm citocromo c (10 micron) nella camera oxygraph e registrare la respirazione cellulare per 5-10 minuti fino ad ottenere un segnale di flusso di ossigeno stabile.
- Infine iniettare 1 ml di 4 mg / ml oligomicina (2 mg / ml) e registrare la respirazione cellulare fino ad ottenere un segnale di flusso di ossigeno stabile.
7. respirazione massima ADP-stimolata (Stato 3) di cellule permeabilizzate HepG2
- Preparare una sospensione cellulare contenente camera oxygraph (1 x 10 6 / ml) seguendo la procedura descritta nei passaggi 4.1 a 4.3 del protocollo.
- Iniettare 2 ml di 8 mM digitonina (8 mM) nella camera oxygraph contenente la sospensione cellulare e permeabilize le cellule per 5 min.
- Iniettare 12,5 ml di 0,8 M di malato (5 mm) e 10 ml di 2 M di glutammato (10 mm) nella camera oxygraph. Record respirazione cellulare fino a quando un segnale di flusso di ossigeno stabile è raggiunto.
- Iniettare 10 ml di 0,5 M ADP (2.5 mM) nella camera oxygraph e registrare respirazione cellulare fino agli ossigeno aumento del segnale di flusso e stabilizza.
NOTA: L'aggiunta di ADP alle cellule indurrà un aumento del consumo di ossigeno e il segnale di flusso di ossigeno aumenterà. - Iniettare 2 ml di 0,2 mm rotenone (0,2 micron) 'ATTENZIONE' nella camera oxygraph e registrare la respirazione cellulare fino a quando il segnale di flusso di ossigeno diminuisce e si stabilizza.
- Successivamente, iniettare 20 ml di 1 M succinato (10 mM) nella camera oxygraph e registrare respirazione cellulare fino all'aumentare del segnale di flusso di ossigenoe stabilizza.
- Poi, iniettare 2 ml di 5 mM antimicina A (5 micron) 'ATTENZIONE' nella camera oxygraph e registrare la respirazione cellulare fino a quando il segnale di flusso di ossigeno diminuisce e si stabilizza.
- Poi iniettare 2,5 ml di 0,8 mM ascorbato (1 mM) e subito dopo l'iniezione di 2,5 ml di 0,2 mM TMPD (0.25 mM) nella camera oxygraph e registrare respirazione cellulare fino agli ossigeno aumento del segnale di flusso e stabilizza.
- Infine iniettare 10 ml di 1 M di sodio azide (5 mM) 'ATTENZIONE' nella camera oxygraph e registrare respirazione cellulare fino il segnale di flusso di ossigeno diminuisce e si stabilizza.
8. Il consumo di ossigeno di cellule intatte
- Preparare una sospensione cellulare contenente camera oxygraph (1 x 10 6 / ml) seguendo la procedura descritta nei passaggi 4.1 a 4.3 del protocollo.
- Iniettare 1 ml di 4 mg / ml oligomicina (2 mg / ml) nella camera di contenimento oxygraph una sospensione cellulared respirazione cellulare registrare fino a quando un segnale di flusso di ossigeno stabile è raggiunto.
- Successivamente iniettare 1 ml di 0,2 mm di FCCP (0,1 micron) 'ATTENZIONE' nella camera oxygraph e registrare la respirazione cellulare fino a quando l'ossigeno aumenta segnale di flusso e stabilizza.
- Iniettare 3 ml di 0,2 mm di FCCP (0,4 micron) nella camera oxygraph e registrare la respirazione cellulare fino a quando l'aumento del segnale di flusso di ossigeno e stabilizza ulteriormente.
- Titolare FCCP in 0,1 a 0,3 pM passi iniettando 1-3 ml di 0,2 ÷ 1 mM FCCP (0,1 a 2 mM concentrazione finale nella camera) nella camera oxygraph finché il segnale di flusso di ossigeno raggiunge i livelli massimi e ulteriori aumenti e poi inizia in declino.
NOTA: Smettere di iniettare FCCP quando il segnale di ossigeno raggiunge un livello massimo e inizia in calo. - Poi, iniettare 2 ml di 0,2 mM rotenone (0,2 mM) e 2 ml di 5 mM antimicina A (5 mM) nella camera. Record respirazione fino a quando tThe Signal flusso di ossigeno diminuisce e si stabilizza.
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Representative Results
Determinazione ottimale Digitonina concentrazione per Cellular Permeabilizzazione: Digitonina Titolazione Experiment
Digitonin titolazione viene eseguita per determinare la concentrazione ottimale per permeabilizzazione delle cellule HepG2. Per questi esperimenti, digitonina viene titolato in cellule intatte in presenza di rotenone, succinato (mitocondriale complesso II substrato) e una quantità saturante di ADP (per indurre statali 3 complesso II-dipendenti), e respiratorie tassi sono misurati al basale e dopo ogni titolazione (figure 1A e 1B). Il risultato di questo esperimento dimostra che in assenza di digitonina, respirazione cellulare è molto basso e respirazione delle cellule non permeabilizzate intatte non è stimolata in presenza di substrato mitocondriale e ADP. Tuttavia, al momento graduale aggiunta di digitonina, membrana plasmatica cellulare è permeabilizzate e mitochonrespirazione drial (complesso II-dipendente statale 3) aumenta fino a completa permeabilizzazione quando succinato e ADP entrano nelle cellule. I risultati mostrano che permeabilizzazione ad una concentrazione di 8-12 mM digitonina è ottimale per la respirazione ADP-stimolata di cellule HepG2. Tuttavia, l'integrità della membrana mitocondriale esterna può essere compromessa se vengono impiegate quantità eccessive di digitonina. Come mostrato in Figura 1, una quantità eccessiva di digitonina indotto una riduzione complesso II-dipendente stato 3 della respirazione indicando integrità della membrana esterna mitocondriale compromessa.
Nei protocolli attuali e seguenti, tutti i tassi di consumo di ossigeno sono espressi come IO 2 [pmol x sec -1 x 10 -6 cellule] (flusso di ossigeno per milione di celle) che è calcolato dividendo flusso di ossigeno specifico volume (in chiusa camera di ossigeno), JV, O 2 [pmol x sec -1 x ml -1] per concentrat cellulare ioni nella camera celle (numero di cellule per volume [10 6 cellule di x ml -1]) 15.
Figura 1: Digitonina la titolazione per determinare la concentrazione ottimale per la permeabilizzazione delle cellule HepG2. La linea blu rappresenta la concentrazione di ossigeno; la linea rossa rappresenta il flusso di ossigeno (pendenza della concentrazione di ossigeno). La concentrazione di ossigeno diminuisce nel tempo come cellule utilizzano l'ossigeno disponibile. Il consumo di ossigeno è espressa come pmol / (sec x numero di cellule). (A) Tracciati dal respirometria ad alta risoluzione usando digitonina, ADP e succinato come substrato per la respirazione mitocondriale complesso II-dipendente (1 esperimento). (B) i tassi di respirazione mitocondriale a partire dai 4 esperimenti individuali presentati come media ± SD.caricare / 54985 / 54985fig1large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Valutazione della membrana mitocondriale esterna l'integrità utilizzando una concentrazione ottimale Digitonina
Per valutare l'effetto della concentrazione digitonina ottimale (8 mM) sull'integrità della membrana esterna mitocondriale, le cellule vengono permeabilizzate con integrità membrana esterna digitonina e mitocondriale viene testato mediante misurazione della respirazione mitocondriale dopo la successiva aggiunta di succinato (mitocondriale complesso II-dipendente stato 2 riposo la respirazione in assenza di ADP), ADP (ADP stimolato complesso II-dipendente stato 3 della respirazione) e citocromo c (ADP stimolato complesso II-dipendente stato 3 della respirazione in presenza di citocromo c), seguita dall'aggiunta di oligomicina (un inibitore di ATP sintasi) per imitare stato 4. Come mostrato in figura 2
Figura 2: citocromo c non migliora la respirazione delle cellule trattate con digitonina (8 mM). tracce respiratorie rappresentante per la prova di citocromo c utilizzando ad alta risoluzione respirometria. Le cellule sono permeabilizzate con 8 micron digitonina e l'integrità della membrana mitocondriale esterna è testato per la misurazione della frequenza respiratoria dopo la successiva aggiunta di 10 succinato mm (stato 2), 2,5 mM ADP (stato 3) e 10 micron citocromo c (stato 3 in presenza citocromo c), seguita dall'aggiunta di 2 ug / ml oligomicina imitare stato 4. la frequenza respiratoria è espressa come pmol / (sec x million celle). CII: complesso II. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Valutazione della mitocondriale esterna Membrane Integrity a concentrazioni elevate di Digitonin
Per dimostrare che l'alta concentrazione di digitonina può compromettere l'integrità della membrana esterna mitocondriale, abbiamo eseguito un esperimento utilizzando una dose elevata di digitonina. Per questo esperimento, le cellule vengono permeabilizzate con digitonina 40 pM invece di 8 mM, e l'integrità della membrana esterna mitocondriale è testato mediante misurazione della respirazione mitocondriale dopo la successiva aggiunta di succinato (mitocondriale complesso II-dipendente riposo stato 2 respirazione in assenza di ADP) , ADP (ADP stimolato stato complesso II-dipendente 3 respirazione) e citocromo c (ADP stimolato complesso II-dStato ependent 3 respirazione in presenza di citocromo c), seguita dall'aggiunta di oligomicina per imitare stato 4 in presenza di oligomicina (figura 3). Il risultato di questo esperimento dimostra che il citocromo c migliora la respirazione delle cellule trattate con una dose elevata di digitonina, indicando una perdita di citocromo c dalla membrana esterna mitocondriale indicando integrità della membrana esterna mitocondriale compromessa.
Figura 3: alta dose di digitonina (40 micron) compromette l'integrità della membrana mitocondriale esterna. Tracciati dal-alta risoluzione respirometria utilizzando succinato come substrato. La linea blu rappresenta la concentrazione di ossigeno; la linea rossa rappresenta il flusso di ossigeno (pendenza della concentrazione di ossigeno). La concentrazione di ossigeno diminuisce nel tempo come cellule utilizzano l'ossigeno disponibile. Il consumo di ossigeno è espresso comepmol / (sec x numero di celle). La successiva aggiunta di 40 mM digitonina, succinato (10 mM), ADP (2,5 mM), citocromo c (10 pM) e oligomicina (2 mg / ml) è indicato. CII: complesso II. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Massima ADP-stimolata respirazione (Stato 3) di cellule permeabilizzate HepG2, Usare eccesso esogeni Substrati
I- complesso, II- e IV-dipendente massima respirazione ADP-stimolata (stato 3) di cellule HepG2 permeabilizzate (1 x 10 6 cellule / ml) è misurato con successo utilizzando substrati esogeni in eccesso (Figura 4). Per questo esperimento, le cellule vengono permeabilizzate con consumi ossigeno digitonina e mitocondriali sono misurate dopo la successiva aggiunta di substrati e inibitori come descritto in Misurazione non riuscita di respirazione massima ADP-stimolata (Stato 3) di cellule permeabilizzate HepG2 I- Complex, II- e IV-dipendente massima respirazione ADP-stimolata (stato 3) di cellule HepG2 permeabilizzate (1 x 10 6 cellule / ml) non è misurata correttamente utilizzando substrati esogeni eccesso (Figura 5). Per questo esperimento, le cellule vengono permeabilizzate con consumi ossigeno digitonina e mitocondriali sono misurate dopo la successiva aggiunta di substrati e inibitori come descritto nella Figura 5. Come mostrato in Figura 5 Figura 4. Una possibile spiegazione per i livelli respiratorie ridotti è la contaminazione delle camere oxygraph con gli inibitori mitocondriali da esperimenti precedenti. Gli inibitori mitocondriali, come antimicina e rotenone sono solubili in etanolo e può attaccare alle camere oxygraph e tappi. Pertanto camere e tappi oxygraph dovrebbero essere lavate estensivamente dopo ogni esperimento. Respirazione accoppiati e disaccoppiati di cellule intatte Consumo di ossigeno basale cellule HepG2 'è misurato in presenza di oligomicina (oligomicina-insensitive respirazione) e sequenziale aggiunta di FCCP (Figura 6). Basal tasso di respirazione cellulare rappresenta il consumo di ossigeno delle cellule HepG2 intatte in presenza di substrati cellulari endogeni e può cambiare in risposta alla richiesta cellulari ATP. frequenza respiratoria oligomicina-insensitive rappresenta fuoriuscire la respirazione cellulare e oligomicina sensibile tasso di respirazione che rappresenta cellulare fatturato ATP ed è calcolato sottraendo il tasso di respirazione oligomicina-insensitive dal basale tasso di respirazione endogena. La sostanza chimica sganciamento FCCP è sequenziale aggiunto a diverse concentrazioni e massima respirazione disaccoppiato registrati. Il tasso di respirazione mitocondriale disaccoppiato massima (massima capacità del sistema di trasporto degli elettroni) per questa condizione sperimentale si ottiene a 0,9-1,2 micron FCCP. I risultati mostrano attività bifasica di FCCP in cellule HepG2 intatte. Pertanto, per ogni condizione sperimentale, FCCP è titolato per ottenere la massima frequenza respiratoria disaccoppiato. Il rapporto di controllo respiratorio disaccoppiato (uRCR) è calcolato dividendo il FCCPfrequenza respiratoria disaccoppiato dal tasso di respirazione in presenza di oligomicina. Oligomicina sensibili respirazione (fatturato ATP) viene calcolato sottraendo oligomicina-insensitive tasso di respirazione dal basale respirazione endogena. Accoppiamento efficienza che rappresenta la percentuale di consumo di ossigeno mitocondriale utilizzato per sintetizzare l'ATP è calcolato dividendo il tasso di respirazione oligomicina sensibile per il tasso di respirazione basale. Alla fine dell'esperimento, per ottenere la frequenza respiratoria non mitocondriale, inibitori della catena di trasporto degli elettroni mitocondriale vengono aggiunti e la frequenza respiratoria mitocondriale non viene sottratto da tutti i risultati. Per l'esperimento mostrato in figura 6, la frequenza respiratoria non-mitocondriale è di 26 pmol / (sec x milioni di cellule), la frequenza respiratoria basale è di 48 pmol / (sec x milioni di cellule), oligomicina-insensitive frequenza respiratoria 7 pmol / (sec x milioni di cellule), oligomicina sensibili respirazione (fatturato ATP) 41 pmol / (sec x milioni di cellule) e couplinefficienza g 0,85. Tabella 1: La composizione del tampone di respirazione. 
Figura 4: la misura di successo di massima respirazione ADP-stimolata (stato 3) di cellule HepG2 permeabilizzate. La frequenza respiratoria è espressa come pmol / (sec x milioni di cellule). Le cellule sono permeabilizzate con 8 micron digitonina e frequenza respiratoria mitocondriale sono misurati dopo la successiva aggiunta di glutammato e malato (stato 3, del complesso I), rotenone per inibire complesso I, succinato (stato 3, II complesso), antimicina A per inibire complesso III e ascorbato / TMPD e azide di sodio per inibire complesso IV. Complesso IV respirazione (Stato 3)è interpretato sottraendo il consumo di ossigeno prima e dopo l'aggiunta di sodio azide. CI: Ho complesso, CII: complesso II, CIV: complesso IV. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. 
Figura 5: la misura non riuscita di massima respirazione ADP-stimolata (stato 3) di cellule HepG2 permeabilizzate. Rappresentante tracce respiratorie di un esperimento senza successo di I- complesso, II- e IV-driven massima respirazione ADP-stimolata (stato 3) di cellule HepG2 permeabilizzate utilizzando ad alta risoluzione respirometria. La frequenza respiratoria è espresso comepmol / (sec x milioni di cellule). Le cellule sono permeabilizzate con 8 micron digitonina e frequenza respiratoria mitocondriale sono misurati dopo la successiva aggiunta di glutammato e malato (stato 3, del complesso I), rotenone per inibire complesso I, succinato (stato 3, II complesso), antimicina A per inibire complesso III e ascorbato / TMPD e azide di sodio per inibire complesso IV. Complesso IV respirazione (stato 3) viene interpretato sottraendo il consumo di ossigeno prima e dopo l'aggiunta di sodio azide. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. 
Figura 6: Coupled e la respirazione accoppiata di cellule intatte. Rappresentativi tracce respiratorie del consumo di ossigeno basale cellule HepG2 'misurate in presenza di oligomicina (oligomicina-insensitive respirazione) e sequenziale aggiunta di FCCP utilizzando ad alta risoluzione respirometria. Successivamente, una volta raggiunto un segnale stabile, la respirazione è inibita con l'aggiunta di rotenone e antimicina A e il restante sfondo respirazione (respirazione non mitocondriale) viene sottratto da tutti i risultati. Il consumo di ossigeno è espressa come pmol / (sec x numero di cellule). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. Buffer di respirazione 13 chimico Concentrazione Saccarosio 110 mm EGTA 0,5 mm MgCl 2 3,0 mm KCl 80 mM K-lattobionato 60 mM KH 2 PO 4 10 mM Taurina 20 mm Hepes 20 mm BSA 1,0 g / L pH 7.1
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Discussion
L'obiettivo del presente protocollo è stato quello di usare ad alta risoluzione respirometria per misurare mitocondriale complessi della catena respiratoria '(I-IV) frequenza respiratoria, la capacità del sistema di trasporto degli elettroni mitocondriale massima e l'integrità della membrana mitocondriale esterna.
Ci sono alcuni passaggi critici all'interno del presente protocollo. Primo, i tassi di consumo di ossigeno cellulare sono generalmente normalizzati per il numero di cellule (pmol / [sec x numero di celle]). Pertanto, prima di controllo del consumo di ossigeno cellulare, è fondamentale utilizzare un dispositivo che permette misure accurate ed affidabili del numero di cellule. Nel presente protocollo un contatore di cellule automatizzato è stato utilizzato (fase 3.7 del protocollo e la tabella dei materiali). Un secondo passo critico soprattutto in cellule permeabilizzate, è la scelta di tampone respirazione in cui permeabilizzate cellule sono risospese (passo 3.6 del protocollo). Dal momento che permeabilizzazione cellulare può indurre la perdita di intracellulaioni r, è molto importante che il mezzo usato per permeabilizzazione è compatibile con l'ambiente intracellulare. Pertanto, buffer di respirazione dovrebbe contenere una composizione e osmolarità che riflette sia intracellulare e l'ambiente extracellulare (Tabella 1) 13. Inoltre, per permeabilizzazione cellulare ottimale ed efficace, è fondamentale per titolare digitonina concentrazione non solo per ogni tipo di cellula, ma anche per ogni densità delle cellule, per identificare la sua concentrazione ottimale ed efficace più bassa. Se la concentrazione digitonina è troppo bassa, non saranno permeabilizzate cellule. Al contrario, l'esposizione delle cellule a grandi quantità di digitonina danneggia la membrana esterna mitocondriale. Pertanto, un altro punto importante è quello di indagare l'integrità della membrana mitocondriale esterna. Per non sottovalutare capacità respiratoria cellulare, è anche fondamentale che gli esperimenti respirometria vengono eseguiti a temperatura fisiologica (37 ° C). Un altro punto importante da considerare è l'uso di saturare quantità di ADP, a causa della limitazione diffusione di ADP rispetto ossigeno nelle cellule permeabilizzate e livelli di substrato sufficienti per ottenere flusso respiratorio massima. In alcuni esperimenti in cellule permeabilizzate, può accadere che l'aggiunta di substrati esogeni e ADP non comportare un notevole aumento del tasso di respirazione. Ciò può essere causato da diversi fattori. Ad esempio, l'uso di alte concentrazioni di digitonina per permeabilize cellule può danneggiare la membrana esterna mitocondriale. Pertanto, si dovrebbe titolare digitonina di determinare la concentrazione ottimale per ogni tipo di cellula e densità. Inoltre, la purezza di digitonina è anche molto critico, e disponibile in commercio Digitonina può variare in modo significativo in purezza e nuovi lotti di digitonina acquistati deve essere titolata per determinare le concentrazioni ottimali per permeabilizzazione cellulare. In aggiunta, ci sono diversi tipi di membrana plasmatica cellulare formano poriagenti con proprietà diverse. Ad esempio, saponina è un detergente mite di digitonina, ea seconda del tipo di cellula, un appropriato reagente di permeabilizzazione cellulare dovrebbe essere selezionata.
La maggior parte degli inibitori della funzione mitocondriale utilizzati in saggi respirometria, come rotenone antimicina A, sono solubili solo in etanolo e bastone alle camere oxygraph e tappi, inibendo la respirazione cellulare. Per evitare questo problema, le camere oxygraph e tappi devono essere lavate estensivamente con il 95% di etanolo dopo ogni test. Un altro punto importante da considerare è che per entrambi i dosaggi respirazione cellulare intatte e permeabilizzate, densità cellulare, il tipo e la cultura di cellule confluenza possono influenzare la frequenza respiratoria. Ad esempio, con le cellule HepG2, usiamo solitamente una densità cellulare di 1 a 2 milioni di cellule per camera. Utilizzando bassissima densità delle cellule durante respirometria può dar luogo ad un segnale molto debole. Abbiamo anche osservato che la cultura di cellule confluenza può influenzare la frequenza respiratoria. per example, quando le cellule HepG2 vengono coltivate molto confluenti (più del 100%), che consumano molto meno ossigeno.
Per ottenere un flusso di ossigeno stabile e riproducibile durante gli esperimenti, un altro punto importante da considerare è il mantenimento della respirometria ad alta risoluzione strumento- cioè, regolare scambio di polarografiche membrane del sensore di ossigeno e di sfondo correzioni strumentali. Per gli esperimenti con il FCCP disaccoppiante, può essere che l'aggiunta di FCCP alle cellule non stimola la respirazione cellulare e flusso massimo non è ottenuto, ma invece respirazione cellulare viene inibito. L'inibizione del consumo di ossigeno cellulare dopo l'aggiunta di FCCP può indicare che la concentrazione FCCP non era ottimale e era troppo alto. Per questi esperimenti, per ogni saggio, è essenziale per titolare accuratamente concentrazione FCCP avere flusso massimo.
Una limitazione di ad alta risoluzione respirometria è che high-throughput screening, la creazione dicurve dose-risposta e esperimenti corso orari della quantità limitate di campioni biologici non sono realizzabili. Per questi saggi, si possono usare altri strumenti, come l'analizzatore di flusso extracellulare. Altre limitazioni sono i) il dispositivo non è automatizzato e richiede la presenza continua di un operatore, ii) è in termini di tempo, iii) ha solo due camere e due soli test può essere eseguito in un momento, iv) la manutenzione dello strumento , come ad esempio la modifica delle membrane e tarature, richiede un sacco di tempo e v) le camere non sono monouso e può essere contaminato con inibitori. I vantaggi del oxygraph alta risoluzione su dispositivi elettrodi ossigeno polarografiche tradizionali sono i) una maggiore sensibilità, ii) un numero inferiore di campioni biologici necessari, iii) frequenza respiratoria possono essere misurati contemporaneamente in due camere e iv) il dispositivo è ridotta perdita di ossigeno. Alcuni vantaggi del oxygraph alta risoluzione su dell'analizzatore flusso extracellulare sono i) costi inferiori deldispositivi e materiali di consumo e ii) la fattibilità di protocolli di titolazione substrato-disaccoppiatore-inibitori.
Le future applicazioni o direzioni Dopo aver imparato questa tecnica sono misure simultanee di respirazione cellulare, potenziale di membrana mitocondriale, H 2 O 2, i livelli di ATP e di calcio che utilizzano sensori ottici nella stessa camera.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ADP | Sigma | A 4386 | Chemical |
| Antimycin A | Sigma | A 8674 | Chemical, dissolve in ethanol |
| Ascorbate | Merck | 1.00127 | Chemical |
| BSA | Sigma | A 6003 | Chemical |
| FCCP | Sigma | C 2920 | Chemical, dissolve in ethanol |
| Countess automated cell counter | Thermo Fisher Scientific | n/a | Automated cell counting instrument |
| Cytochrome c | Sigma | C 7752 | Chemical |
| Digitonin | Sigma | D 5628 | Chemical, dissolve in DMSO |
| DMEM | Gibco | 31966021 | Medium |
| EGTA | fluka | 3779 | Chemical |
| FBS | Gibco | 26010-074 | Medium component |
| Glutamate | Sigma | G 1626 | Chemical |
| Hepes | Sigma | H 7523 | Chemical |
| KCl | Merck | 1.04936 | Chemical |
| KH2PO4 | Merck | 1.04873 | Chemical |
| K-lactobionate | Sigma | L 2398 | Chemical |
| MgCl2 | Sigma | M 9272 | Chemical |
| O2k-Core: Oxygraph-2k | Oroboros Instruments | 10000-02 | High-resolution respirometry instrument |
| Oligomycin | Sigma | O 4876 | Chemical, dissolve in ethanol |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | Chemical |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | Chemical |
| Rotenone | Sigma | R 8875 | Chemical, dissolve in ethanol |
| Succinate | Sigma | S 2378 | Chemical |
| Taurine | Sigma | T 8691 | Chemical |
| TMPD | Sigma | T 3134 | Chemical |
| Trypsin | Sigma | T 4674 | Chemical |
References
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