Summary
С высокой разрешающей способностью респирометрии используется для определения митохондриальной потребления кислорода. Это простой метод для определения дыхательной цепи митохондрий комплексов "(I-IV) частота дыхания, максимальная емкость системы митохондриального транспорта электронов, и целостности митохондриальной наружной мембраны.
Introduction
Митохондрии выполняют важную роль в клеточном метаболизме энергии, особенно при использовании кислорода для производства аденозинтрифосфата (АТФ). Они причастны к гибели клеток, так и в нескольких заболеваний человека. Митохондриальной окислительного фосфорилирования (OXPHOS) сочетает в себе перенос электронов вдоль цепи переноса электронов с потреблением кислорода и синтеза АТФ. Митохондриальной кислота (ТСА) цикл трикарбоновых участвует в превращении белков, углеводов и жиров в энергию богатых соединений в качестве никотинамидадениндинуклеотида (NADH) и флавинадениндинуклеотид (FADH 2). Электроны NADH и FADH 2 затем переносятся в дыхательной цепи переноса электронов белковых комплексов (I до IV) , расположенный во внутренней митохондриальной мембране. Кроме того, два других окислительно-восстановительные пути могут передавать электроны на электрон-транспортной цепи: I) митохондриальной электрон-передачи флавопротеида (ETF), который расположен на матричной поверхности внутренней Mitochondrial мембраны, и поставляет электроны из жирных кислот, бета-окисления; и б) митохондриальной глицерофосфатдегидразы который окисляет глицерофосфат к дигидроксиацетонфосфат и питает электроны в митохондриальной цепи переноса электронов. Комплекс IV (конечная акцептор электронов) переносит электроны в одну молекулу кислорода, превращение кислорода в двух молекул воды. Перемещение электронов из цепи переноса электронов комплекса органов дыхания I к IV связан с потоком протонов из митохондриального матрикса в межмембранное пространство, которое устанавливает электрохимический градиент во внутренней мембране митохондрий. Затем, митохондриальный комплекс V (АТФ-синтазы) челноки ионы водорода обратно в митохондриях и синтезирует молекулы АТФ. Функция OXPHOS может быть оценена в естественных условиях и в пробирке с использованием различных методов и различных митохондриальных состояния дыхания могут быть получены. В изолированных митохондрий следующие respiratoRy состояния могут быть измерены: I) базальный митохондриального дыхания (состояние 1), II) потребления кислорода после добавления специфических субстратов митохондриальных цепных комплексов дыхательных (состояние 2), III) максимальное митохондриальной потребления кислорода после добавления насыщающих концентраций аденозин дифосфат (АДФ) (состояние 3) и, IV) отдыхает дыхания после АДФ потребления (в пересчете на АТФ) (состояние 4). В интактных клетках следующие респираторные состояния могут быть измерены: I) базальный клеточный потребление кислорода в присутствии эндогенных субстратов и АДФ, II) базальный клеточный потребление кислорода в присутствии олигомицином (олигомицином нечувствительные дыхания) и олигомицином-чувствительного дыхания (АТФ оборот), III) FCCP отцеплен дыхание, и IV), не митохондриального дыхания после добавления антимицину а и ротенону. В пермеабилизированных клетках, могут быть добавлены специфические субстраты цепи переноса электронов комплексов и АДФ и максимально комплексных зависящих от интенсивности дыхания сУч, как комплекс I-, II- и IV-зависимые частота дыхания может быть измерено.
Измерения клеточного дыхания дают важную информацию о митохондриальной дыхательной способности , характерные для комплексов I-IV, митохондриальная целостности и энергетического метаболизма 1, 2, 3. Одно из устройств , которые позволяют измерять митохондриальной потребления кислорода с высокой степенью точности, разрешающей способности и чувствительности является высокой разрешающей способностью oxygraph 4. Устройство с высокой разрешающей способностью oxygraph содержит две камеры с инжекционных отверстий и каждая камера снабжена полярографическому кислородным датчиком. Клеточные или изолированные митохондриальной суспензии при непрерывном перемешивании в респирометре. Для оценки митохондриальной функции, субстраты и ингибиторы для митохондриальной сложной деятельности могут быть добавлены в соответствии со стандартными протоколами. Субстраты и ингибиторы могут быть титруют литьевым Intо палатах oxygraph и нормы потребления кислорода рассчитываются с использованием программного обеспечения и выражается как пикомолей в секунду на число элементов. Высокое разрешение респирометрии имеет ряд преимуществ по сравнению с традиционными и обычными электродных устройств полярографическая кислорода, включая повышенную чувствительность и способность работать с небольшим количеством биологических образцов, таких как нетронутых или проницаемыми клеток. Кроме того, каждое устройство содержит две камеры, и частота дыхания могут быть записаны одновременно для сравнения концентраций кислорода. С высокой разрешающей способностью oxygraph также имеет преимущество уменьшенной утечки кислорода из камер устройства по сравнению с традиционными полярографических кислородного электрода устройств. Другое устройство , в последнее время разработаны для измерения клеточного потребления кислорода является 96-луночного внеклеточный анализатор потока 5. Внеклеточный анализатор потока снабжен флюоресценции вместо полярографических датчиков. Преимущества внеклеточномфлюс анализатор по сравнению с высокой разрешающей способностью oxygraph являются I), то в значительной степени автоматизировано устройство, II) можно измерить потребление кислорода в 24- и 96-луночные планшеты для высокопроизводительного скрининга, поэтому требуют меньшего количества биологических образцов, и III) дополнительное измерение клеточного гликолитического потока возможно. К недостаткам внеклеточной анализатора потока по сравнению с высокой разрешающей способностью oxygraph являются I) высокая стоимость устройства и расходных материалов, таких как флуоресцентные пластины, которые не являются многоразовые, и II) только четыре соединения в анализе / лунку являются инъекционный , поэтому система не представляется возможным для протоколов титрования субстрат-разобщитель-ингибитор.
В настоящем исследовании мы используем высокого разрешения респирометрии для определения митохондриального дыхания. Для клеточных экспериментов потребления кислорода, клетки проницаемыми, чтобы позволить проникновение экзогенного АДФ и окисляющихся митохондриальных субстратов для подачи электронов в Complexeс дыхательной системы. Такой подход позволяет рассечение отдельных митохондриальных комплексов дыхательных возможностей, что является явным преимуществом по сравнению с интактными клетками (многие субстраты клеточного impermeant). Тем не менее, клеточная мембрана пермеабилизации нарушит барьер между цитозоле и внеклеточное пространство и среду (вымывать из цитозольных растворенные вещества), и состав внутриклеточное пространство уравновешивают внеклеточную среду. Одним из недостатков проницаемыми клеток над неповрежденных клеток является то, что митохондриальная внешняя мембрана может быть повреждена, если чрезмерное количество моющего средства используются во время клеточного пермеабилизации. В интактных клетках, базальный, в сочетании и отсоединяется дыхание интактных клеток могут быть измерены. Этот метод оценивает потребление кислорода интактных клеток без добавления экзогенных субстратов и АДФ, воспроизводя дыхательную функцию в интегрированной камере, а также предоставление информации о максимальном митохондриального электронного TRANSPORT емкость 6, 7. Одним из преимуществ интактных клеток более проницаемыми клеток является то, что клеточная среда не будет нарушена, и митохондрии находятся в контакте с целыми компонентами клеток. Для того , чтобы проницаемыми мембраны клеточной плазмы, детергенты , такие как дигитонина использовались 8. Тем не менее, митохондриальная целостность внешней мембраны может быть поставлена под угрозу, если чрезмерное количество дигитонином заняты. Для того, чтобы подтвердить, что митохондриальная целостность внешней мембраны не подвергается риску в пермеабилизированных клетках, дигитониновый титрование проводится для определения оптимальной концентрации для клеточной проницаемости. Для этих экспериментов, клетки ресуспендировали в среде дыхания и дигитониновый концентрации титруют респирометрии в присутствии митохондриальных субстратов и АДФ, а также скоростей дыхания измеряются. Дыхательный неповрежденных, непермеабилизированных клетки не стимулировали в присутствии mitochondrial субстратов и АДФ. Однако последующее ступенчатое дигитониновый титрование дало бы постепенное пермеабилизации плазменных мембран, и получается оптимальная концентрация дигитониновый. Об этом свидетельствует увеличение дыхания вплоть до полной проницаемости. Митохондриальная качество и целостность внешней мембраны может быть проверена путем добавления экзогенного цитохрома с 2, 9. Цитохром с представляет собой 12 кДа белка , переносящего электрон митохондриальной цепи переноса электронов 10, 11, 12. Она локализована в митохондриальной межмембранном пространстве, а также участвует в потреблении кислорода, несущий электроны из комплекса III в комплексе IV. После того, как митохондриальной наружной мембраны повреждена, цитохром с отпускается, и митохондриальную потребление кислорода снижается. При добавлении экзогенного цитохрома С, любое увеличение в митохондриального дыхания свидетельствует онарушается митохондриальную наружную мембрану.
В проницаемыми клеток, субстратов и ингибиторов митохондриального комплекса активности добавляются следующие различные протоколы 3, 9. Например, для того, чтобы исследовать митохондриальные сложных управляемых частоту дыхания, следующий протокол может быть использован. После того, как пермеабилизации клеток, первый комплекс я стимулируется малат и глутамат субстратов, которые генерируют NADH в качестве субстрата в дыхательной цепи и провоцируют активацию комплексного I. Затем АДФ добавляют для превращения в АТФ (состояние 3, активный комплекс I-зависимый дыхание). После того, как будет достигнут стабильный сигнал, ротенон (митохондриальный комплекс I ингибитор) вводят для ингибирования сложного I. Ротенон сопровождается сукцинат к FADH 2 и для активации сложного II (состояние 3, активный комплекс II-зависимого дыхания). Для измерения сложного IV-зависимого дыхания, первый комплекс III-зависимая дыхание подавляется добавлением антимицина А (митохондриальная ингибитор комплекс III). Затем комплекс IV-зависимого дыхания стимулируется путем введения аскорбата и tetramethylphenylendiamine (ТМФД). TMPD может автоматически окисляется в буфере дыхания, поэтому максимальный комплекс IV-зависимой частоты дыхания (состояние 3) вычисляется путем вычитания скорости дыхания до и после добавления азида натрия, ингибитор митохондриальной сложного IV. Эксперименты дыхания можно проводить в двух камерах с oxygraph параллельно-один, выступающей в качестве контроля (стимулированных клеток), других содержащих стимулированных клеток. Очевидно, что клетки могут быть предварительно обработаны различными способами, например, с препаратами , влияющими на митохондриальные функции, прежде чем их потребление кислорода измеряется в oxygraph камере. Этот протокол позволяет функциональное обследование отдельных митохондриальных цепных комплексов дыхательных. Кроме того, можно измерить максимальную АДФ-стимулированнойдыхание (состояние 3) проницаемыми клеток, с использованием экзогенного жирной кислоты в виде пальмитата. В этом протоколе, концентрированные запасы пальмитат натрия сопрягаются с ультра жирных кислот свободным бычьего сывороточного альбумина (БСА) (6: 1 мольном соотношении пальмитат: БСА). После этого клетки в первую очередь являются проницаемыми дигитонином и митохондриального дыхания оценивается путем добавления карнитина и пальмитат с последующим добавлением АДФ (состояние 3, максимальное дыхание). Затем олигомицином добавляют, чтобы имитировать состояние 4 (состояние 4o) и дыхательный коэффициент (значение RCR) рассчитывается как состояния 3 / состояния 4o. β-окисления способствует производству ацетил - КоА (который входит в цикл TCA) и поколение FADH 2 и NADH, электроны из которых передается в цепи переноса электронов с помощью электронно-передачи флавопротеида и β-hydroxyacyl-СоА - дегидрогеназы. Митохондрии находятся в центре метаболизма жирных кислот и описан протокол пальмитат-БСА могут быть использованы исследователями, исследующих жирти кислоты окисление. В интактных клетках, активаторы и ингибиторы митохондриальной сложной деятельности добавляются следующие другой протокол 6, 9. Для этих экспериментов, первый потребление кислорода непермеабилизированных клеток в отсутствие экзогенных субстратов измеряется (фосфорилирования частоты дыхания). Затем, частота дыхания, не фосфорилирующие измеряют после добавления олигомицином, который является ингибитором митохондриального АТФ-синтазы. После этого протонофор карбонилцианид р-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) администрируется при различных концентрациях и измеряется максимальная митохондриальной отцеплен частота дыхания. Протонофоров, такие как FCCP может индуцировать увеличение протонной проницаемости внутренней мембраны, позволяя пассивное движение протонов, чтобы рассеивать хемиосмотической градиент. Увеличение проницаемости протонов разобщает окислительное дыхание (без производства АТФ) и вызывает увеличение Oxygen потребление. Впоследствии, ротенон и антимицина А добавлены ингибировать дыхание митохондрий, и не митохондриального дыхания вычитается из всех других респираторных ставок.
Скорости потребления кислорода может быть выражено как IO 2 [пмоль х с -1 · 10 -6 клеток] (кислород потока на миллион клеток) , который рассчитывается путем деления объема конкретного потока кислорода (в замкнутой кислородной камере), СП, O 2 [пмоль х сек -1 х мл -1] концентрацией клеток в клеточной камере (количество клеток на единицу объема [10 6 клеток ∙ мл 1]) 15. Клеточная масса удельный поток кислорода, JO 2 [пмоль х сек -1 х мг -1], является расход на одну ячейку, IO 2 [пмоль х с -1 · 10 -6 клеток], разделенных по массе на одну клетку [мг ∙ 10 6 ячеек]; или объем конкретного потока, СП, O 2 [пмоль х сек -1 х мл -1], разделенная по массе в тумэ [мг ∙ мл 1]. JO 2 представляет поток кислорода на клеточного белка, сухого веса или объема клеток.
В настоящем исследовании с использованием высокого разрешения респирометрии, мы описываем протоколы для определения I) концентрации оптимальная дигитониновых для полной клеточных мембран плазмы пермеабилизации (дигитониновый титрование анализа), II) митохондриальной целостности наружной мембраны с использованием экзогенного цитохрома С, III) дыхательной цепи митохондрий комплексы I , максимальные частота дыхания II и IV в дигитониновых-проницаемыми HepG2 клетках в присутствии экзогенного АДФ и митохондриальных субстратов дыхательной цепи, и IV) базальный, в сочетании и максимальное отцеплен дыхание (максимальный перенос электронов емкость) интактных клеток без добавления экзогенных субстратов и АДФ, воспроизводя дыхательную функцию в интегрированной клетке.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Культура клеток
- Культура гепатомы человека HepG2 клетки 6 в 25 см 2 для культивирования клеток колбах в модифицированной среде Дульбекко Игла (DMEM) , содержащей 10% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллин-стрептомицина при 37 ° С в инкубаторе (5% CO 2, 95% воздуха) (посев плотность: 1 × 10 6 клеток на 25 см 2 клеточной культуры колбу, время инкубации в инкубаторе при 37 ° C: 48 ч, плотность клеток в сплошности: 4-5 × 10 6 клеток на 25 см 2 культуры клеток колбу).
- Выполните эксперименты, когда клетки на 90% до 95% сплошности.
2. Высокое разрешение респирометрии Калибровка полярографических датчиков кислорода
- Пипетка 2,1 мл буфера дыхания в oxygraph камеру и размешать буфер непрерывно с помощью магнитной мешалки в камере (700 оборотов в минуту) при 37 ° С в течение 1 ч до тех пор, сигнал стабильный поток кислорода изполярографический датчик кислорода получается.
Примечание: Полярографические электроды кислорода внутри каждой камеры oxygraph концентрации измерения содержания кислорода и рассчитать потребление кислорода (потока) в каждой камере. Концентрация кислорода и скорости потребления кислорода (потока) отображаются в режиме реального времени в Интернете на компьютере, используя программное обеспечение для сбора и анализа данных. - Провести калибровку воздуха полярографическому кислородного датчика в соответствии с протоколами изготовителя 14.
ПРИМЕЧАНИЕ: Калибровка полярографических датчиков кислорода в дыхательной средах и концентрации кислорода в среде при насыщении воздуха экспериментальной температуры выполняется только один раз в день утром. После этого средства могут быть удалены из камеры и клетки ресуспендировали в свежем дыхании носители добавляются к oxygraph камеры и дыхания измеряются. После первого эксперимента, камера может быть промыт и дополнительные серии экспериментов могут быть выполнены в тон же камеру без дополнительных калибровок.
3. трипсинизации адгезивных клеток, подсчета клеток
- В день эксперимента, аспирация DMEM из 2 клеток колбу культуры 25 см.
- Полоскание для культивирования клеток монослоя в колбе культуры с 5 мл фосфатно-буферного раствора (PBS).
- Пипетка 0,5 мл 25 мг / мл раствора трипсина (подогретую до 37 ° С в водяной бане при 37 ° С) в монослое клеток в колбе культуры и инкубируют в течение 5 мин при 37 ° С в инкубаторе (5% CO 2 , 95% воздуха).
- Пипеток в 5 мл DMEM, содержащей 10% FBS в отдельных клеток в колбе для культивирования клеток и суспендирования клеток с помощью пипетки.
- Передача ресуспендировали клетки в центрифужную пробирку объемом 15 мл и центрифугируют в течение 5 мин при 350 х г при комнатной температуре и декантируют супернатант.
- Ресуспендируют осадок клеток в 1 мл буфера дыхания 13 (Т) в состоянии 1.
4. Высокое разрешение респирометрии
- После того, как калибровка воздуха (выполняется только один раз в день, шаги 2.1-2.2), аспирация дыхательную среду из камеры oxygraph и добавляют 2,1 мл клеточной суспензии (1 х 10 6 клеток / мл) с шага 3.7 к камере.
- Закройте oxygraph камеру путем вставки стопора.
- Перемешать клетки непрерывно с помощью магнитной мешалки в камере (700 оборотов в минуту) при 37 ° С и записывать клеточное дыхание в течение 5-10 мин до получения стабильного сигнала поток кислорода не будет достигнута.
Примечание: Концентрация кислорода и сигнала поток кислорода отображаются в режиме реального времени в Интернете на компьютере с помощью программного обеспечения для сбора и анализа данныхs = "Xref"> 14. - Затем вводят субстраты и ингибиторы для митохондриального дыхания через нагнетательную титана портов стопоров с использованием следующих протоколов.
5. дигитониновых Титрование в интактных клетках по респирометрии
- Подготовьте oxygraph камеру , содержащую суспензию клеток (1 × 10 6 / мл) в соответствии с процедурой , описанной в пунктах 4.1 до 4.3 протокола.
- Вводят 2 мкл 0,2 мМ ротенону (0,2 мкМ) «Внимание» в oxygraph камеру, содержащую клеточную суспензию через инжекционное титана порт камеры стопора с помощью шприца и записывать клеточное дыхание в течение 5-10 мин до получения стабильного сигнала поток кислорода не будет достигнут ,
ПРИМЕЧАНИЕ: Все инъекции в следующие шаги выполняются через нагнетательные титана портов пробками с использованием шприцев. Добавление ротенону является необязательным (он предотвращает обратный поток электронов) и могут быть опущены для дигитониновых экспериментов титрования, смшаг 6.3. - Вводят 20 мкл 1 М сукцинат (10 мМ) в oxygraph камеру и записывать клеточное дыхание в течение 5-10 мин до получения стабильного сигнала поток кислорода не будет достигнута.
- Вводят 10 мкл 0,5 М АДФ (2,5 мМ) в oxygraph камеру и записывать клеточное дыхание в течение 5-10 мин до получения стабильного сигнала поток кислорода не будет достигнута.
- Вводят 2 мкл 2 мМ дигитонина (2 мкМ) в oxygraph камеру и записывать клеточное дыхание в течение 2-5 мин до получения стабильного сигнала кислорода не будет достигнута.
- И снова вводят по 2 мкл 2 мМ дигитониновый в oxygraph камеру и записывать клеточное дыхание в течение 2-5 мин до получения стабильного сигнала кислорода не будет достигнута.
Примечание: ступенчатым добавлением дигитонинового к клеткам будет индуцировать увеличение клеточного потребления кислорода и сигнал потока кислорода будет увеличиваться. - Продолжить инъекции 2-4 мкл 2 мМ дигитониновый ступенчато (2-4 мкМ каждый шаг) в камеру. После каждого шага записи клеточного дыхания на 2-5 мв до получения стабильного сигнала поток кислорода не будет достигнута.
Примечание: Остановка инъекции дигитониновый, когда сигнал поток кислорода достигает максимального уровня и дальнейшие инъекции дигитонинового не увеличивают частоту дыхания. Читатели должны определить оптимальную концентрацию дигитониновых в своих лабораториях, используя свои собственные реагенты и использовать полученную концентрацию оптимальной дигитониновых в шагах 6.2 и 7.2 из следующих протоколов для своих экспериментов.
6. Оценка митохондриальной наружной мембраны Integrity: цитохром C
- Подготовьте oxygraph камеру , содержащую суспензию клеток (1 × 10 6 / мл) в соответствии с процедурой , описанной в пунктах 4.1 до 4.3 протокола.
- Вводят 2 мкл 8 мМ дигитонина (8 мкМ) в oxygraph камеру , содержащую суспензию клеток (1 × 10 6 / мл) и клетки проницаемыми в течение 5 мин.
- Вводят 20 мкл 1 М сукцинат (10 мМ) в oxygraph камеру и записывать клеточную respiratиону в течение 5-10 мин до получения стабильного сигнала поток кислорода не будет достигнута.
- Вводят 10 мкл 0,5 М АДФ (2,5 мМ) в oxygraph камеру и записывать клеточное дыхание в течение 5-10 мин до получения стабильного сигнала поток кислорода не будет достигнута.
Примечание: Добавление АДФ к клеткам будет стимулировать комплексное I и вызывают увеличение потребления кислорода, а также сигнал поток кислорода будет увеличиваться и стабилизируется. - Вводят 5 мкл 4 мМ цитохрома с (10 мкМ) в oxygraph камеру и записывать клеточное дыхание в течение 5-10 мин до получения стабильного сигнала поток кислорода не будет достигнута.
- Наконец вводят 1 мкл 4 мг / мл олигомицином (2 мкг / мл) и записать клеточное дыхание до тех пор, устойчивый сигнал поток кислорода не будет достигнута.
7. Максимальный АДФ-стимулированной Дыхательный (State 3) проницаемыми клеток HepG2
- Подготовьте oxygraph камеру , содержащую суспензию клеток (1 × 10 6 / мл) в соответствии с процедурой , описанной в пунктах 4.1 до 4.3 протокола.
- Вводят 2 мкл 8 мМ дигитонина (8 мкМ) в oxygraph камеру, содержащую клеточную суспензию и клетки проницаемыми в течение 5 мин.
- Вводят 12,5 мкл 0,8 М малат (5 мМ) и 10 мкл 2 М глутамата (10 мМ) в oxygraph камеру. Запись клеточное дыхание до получения стабильного сигнала потока кислорода достигается.
- Вводят 10 мкл 0,5 М АДФ (2,5 мМ) в oxygraph камеру и не записывать клеточное дыхание до кислорода флюса сигнал возрастает и стабилизируется.
Примечание: Добавление АДФ к клеткам будет стимулировать увеличение потребления кислорода и сигнал потока кислорода будет увеличиваться. - Вводят 2 мкл 0,2 мМ ротенону (0,2 мкМ) 'ВНИМАНИЕ' в oxygraph камеру и не записывать клеточное дыхание, пока уменьшается сигнала потока кислорода и стабилизируется.
- Затем вводят 20 мкл 1 М сукцинат (10 мМ) в oxygraph камеру и не записывать клеточное дыхание, пока сигнал возрастает поток кислородаи стабилизируется.
- Затем вводят 2 мкл 5 мМ антимицина А (5 мкМ) «Внимание» в oxygraph камеру и не записывать клеточное дыхание, пока уменьшается сигнала потока кислорода и стабилизируется.
- Затем вводят 2,5 мкл 0,8 мМ аскорбата (1 мМ) и сразу же после того, как вводят 2,5 мкл 0,2 мМ ТМФД (0,25 мМ) в oxygraph камеру и не записывать клеточное дыхание до кислорода флюса сигнал возрастает и стабилизируется.
- Наконец вводят 10 мкл 1 М азида натрия (5 мМ) «Внимание» в oxygraph камеру и не записывать клеточное дыхание до нормализации сигнала потока кислорода и стабилизирует.
8. Потребление кислорода из неповрежденных клеток
- Подготовьте oxygraph камеру , содержащую суспензию клеток (1 × 10 6 / мл) в соответствии с процедурой , описанной в пунктах 4.1 до 4.3 протокола.
- Вводят 1 мкл 4 мг / мл олигомицином (2 мкг / мл) в oxygraph камеру, содержащую суспензии клеток А.Н.d запись клеточного дыхания до стабильного сигнала потока кислорода достигается.
- Затем вводят 1 мкл 0,2 мМ FCCP (0,1 мкМ) 'ВНИМАНИЕ' в oxygraph камеру и не записывать до клеточного дыхания кислородом потока сигнала увеличивается и стабилизируется.
- Вводят 3 мкл 0,2 мМ FCCP (0,4 мкМ) в oxygraph камеру и не записывать клеточное дыхание, пока сигнал увеличивается поток кислорода и дополнительно стабилизируется.
- Титрование FCCP в 0,1 до 0,3 мкм шагов путем инъекции 1-3 мкл 0,2 до 1 мМ FCCP (от 0,1 до 2 мкМ конечной концентрации в камере) в oxygraph камеру, пока сигнал поток кислорода не достигнет своего максимального уровня и дальнейшая увеличивается, а затем начинает снижаться.
Примечание: Остановка инъекции FCCP, когда сигнал кислорода достигает максимального уровня и начинает снижаться. - Затем вводят по 2 мкл 0,2 мМ ротенону (0,2 мкМ) и 2 мкл 5 мМ Антимицина А (5 мкМ) в камеру. Запись дыхания не до тон сигнала уменьшается поток кислорода и стабилизируется.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Определение оптимальной концентрации дигитониновых для клетчатого пермеабилизирующего: дигитониновых Эксперимент титрования
Дигитониновых титрование проводится для определения оптимальной концентрации для проницаемости клеток HepG2. Для этих экспериментов дигитониновый титруют в интактных клетках в присутствии ротенону, сукцинат (митохондриальной Комплекс II субстрат) и количества насыщающего АДФ (для индукции комплекс II-зависимые состояния 3), а частота дыхания измеряются на исходном уровне и после каждого титрование (Фигуры 1А и 1В). Результатом этого эксперимента показывает, что при отсутствии дигитонин, клеточное дыхание является очень низким и дыхание интактных, непермеабилизированных клетки не стимулировали в присутствии митохондриального субстрата и АДФ. Тем не менее, при ступенчатом добавлении дигитонин, мембрана клеточное плазма проницаемыми и mitochondrial дыхания (комплекс II-зависимого состояния 3) увеличивается до полного пермеабилизации, когда сукцината и АДФ проникать в клетки. Результаты показывают, что пермеабилизации при концентрации дигитонинового 8-12 мкМ является оптимальным для АДФ-стимулированной дыхания клеток HepG2. Тем не менее, митохондриальная целостность внешней мембраны может быть поставлена под угрозу, если чрезмерное количество дигитонином заняты. Как показано на рисунке 1, чрезмерное количество дигитонином вызывало снижение комплекса II-зависимого состояния 3 дыхания , указывающего под угрозу целостность митохондриальной наружной мембраны.
В нынешних и последующих протоколов, все нормы потребления кислорода выражаются как IO 2 [пмоль х с -1 · 10 -6 клеток] (кислород потока на миллион клеток) , который рассчитывается путем деления объема конкретного потока кислорода (в закрытом кислородной камеры), СП, O 2 [пмоль х сек -1 х мл -1] клеточным Концентрат ионов в клеточной камере (количество клеток на единицу объема [10 6 клеток х мл -1]) 15.
Рисунок 1: дигитониновых титрование для определения оптимальной концентрации для проницаемости клеток HepG2. Синяя линия представляет концентрацию кислорода; красная линия представляет собой поток кислорода (наклон концентрации кислорода). Концентрация кислорода уменьшается с течением времени, как клетки используют имеющийся кислород. Потребление кислорода выражается как пмоль / (сек х количество клеток). (A) Прориси от высокого разрешения с использованием респирометрии дигитониновый, АДФ и сукцината в качестве субстрата для митохондриального комплекса II-зависимого дыхания (1 эксперимент). (B) митохондриальной показатели дыхания от 4 индивидуальных экспериментов представлены в виде ± SD.загрузить / 54985 / 54985fig1large.jpg "мишень =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Оценка митохондриальной космического целостности мембраны при использовании концентрации Оптимальное дигитониновых
Для того, чтобы оценить эффект оптимальной концентрации дигитонина (8 мкМ) на внешней целостности митохондриальной мембраны, клетки проницаемыми дигитонином и митохондриальной целостности наружной мембраны тестируют путем измерения митохондриального дыхания после последующего добавления сукцината (митохондриальный комплекс II-зависимый состояние покоя 2 дыхание при отсутствии АДФ), АДФ (АДФ стимулировало комплекс II-зависимое состояние 3 дыхания) и цитохром с (АДФ стимулировало комплекс II-зависимый состояние 3 дыхания в присутствии цитохрома с), с последующим добавлением олигомицином (ингибитор АТФ - синтазы) , чтобы имитировать состояние 4. Как показано на рисунке 2
Рисунок 2: Цитохром С не улучшает дыхание клеток , обработанных дигитонина (8 мкМ). Характерные дыхательные следы для испытания цитохром с использованием высокого разрешения респирометрии. Клетки проницаемыми с 8 мкМ дигитонином и целостности митохондриальной наружной мембраны тестируют путем измерения интенсивности дыхания после последующего добавления 10 мМ сукцината (состояние 2), 2,5 мМ АДФ (состояние 3) и 10 мкМ цитохром с (состояние 3 в присутствии цитохром с), с последующим добавлением 2 мкг / мл олигомицину до имитируют состояние 4. Частота дыхания выражается как пмоль / (сек х millioп клетки). CII: комплекс II. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Оценка митохондриального космического целостности мембраны Использование высокой концентрации дигитониновых
Для того, чтобы продемонстрировать, что очень высокая концентрация дигитонином может поставить под угрозу целостность митохондриальной наружной мембраны, мы провели эксперимент с использованием высоких доз дигитонином. Для этого эксперимента клетки проницаемыми с 40 мкМ дигитонина вместо 8 мкМ и целостности митохондриальной наружной мембраны тестируют путем измерения митохондриального дыхания после последующего добавления сукцината (митохондриальный комплекс II-зависимый состояние покоя 2 дыхания в отсутствии АДФ) , АДФ (АДФ стимулировало комплекс II-зависимое состояние 3 дыхания) и цитохром с (АДФ стимулировало комплекс II-dependent состояние 3 дыхания в присутствии цитохрома с), с последующим добавлением олигомицином имитировать состояние 4 в присутствии олигомицином (рисунок 3). Результатом этого эксперимента показывает, что цитохром С улучшает дыхание клеток, обработанных высокой дозой дигитонин, что указывает на потерю цитохрома с из митохондриальной наружной мембраны, указывающей скомпрометированы митохондриальной целостности наружной мембраны.
Рисунок 3: Высокая доза дигитонином (40 мкМ) ставит под угрозу целостность митохондриальной наружной мембраны. Прориси от высокого разрешения респирометрии с использованием сукцината в качестве субстрата. Синяя линия представляет концентрацию кислорода; красная линия представляет собой поток кислорода (наклон концентрации кислорода). Концентрация кислорода уменьшается с течением времени, как клетки используют имеющийся кислород. Потребление кислорода выражается какпмоль / (сек х количество клеток). Последующее добавление 40 мкМ дигитонин, сукцинат (10 мМ), АДФ (2,5 мМ), цитохром с (10 мкМ) и олигомицином (2 мкг / мл) указывается. CII: комплекс II. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Максимальный АДФ-стимулированной Дыхательный (State 3) проницаемыми HepG2 клеток, используя избыток Экзогенные Субстраты
Комплекс I-, II- и IV-зависимой максимальная АДФ-стимулированной дыхания (состояние 3) проницаемыми клеток HepG2 (1 × 10 6 клеток / мл) успешно измеряют с использованием избыточных экзогенных субстратов (Рисунок 4). Для этого эксперимента клетки проницаемыми с дигитониновых и митохондриальных нормы потребления кислорода измеряют после последующего добавления субстратов и ингибиторов, как описано в Неудачная Измерение Максимальный АДФ-стимулированной Дыхания (State 3) проницаемыми клеток HepG2 Комплекс I-, II- и IV-зависимой максимальная АДФ-стимулированной дыхания (состояние 3) проницаемыми клеток HepG2 (1 × 10 6 клеток / мл) не была успешно измерена с использованием избыточных экзогенных субстратов (рисунок 5). Для этого эксперимента клетки проницаемыми с дигитониновых и митохондриальных нормы потребления кислорода измеряют после последующего добавления субстратов и ингибиторов , как описано на фиг.5. Как показано на рисунке 5 рисунке 4. Возможное объяснение сокращения дыхательных уровней загрязнения oxygraph камер с митохондриальных ингибиторов из предыдущих экспериментов. Митохондриальные ингибиторы, такие как антимицина и ротенону растворимы в этаноле и могут прилипнуть к oxygraph камер и пробками. Поэтому oxygraph камеры и стопоры должны быть тщательно промывают после каждого эксперимента. Соединяли и несвязанных Дыхательный из неповрежденных клеток Базальный потребление кислорода клетками HepG2 'измеряется в присутствии олигомицином (олигомицином нечувствительные дыхание) и последовательное добавление FCCP (рисунок 6). Басал сотовой частоты дыхания представляет собой потребление кислорода интактных клеток HepG2 в присутствии эндогенных клеточных субстратов и может изменять в ответ на клеточный АТФ спроса. Олигомицин нечувствительные частота дыхания представляет утечку клеточного дыхания и олигомицином чувствительные частоты дыхания, которая представляет клеточный АТФ оборот и рассчитывается путем вычитания частоты дыхания олигомицином нечувствительные от базальной эндогенного частоты дыхания. Химический разобщитель FCCP последовательно добавляют при различных концентрациях и максимального несвязанной дыхания записанными. Максимальный митохондриальная отцепили частота дыхания (максимальная емкость системы транспорта электронов) для этого условия эксперимента получено при 0,9-1,2 мкМ FCCP. Результаты показывают двухфазную активность FCCP в интактных клетках HepG2. Таким образом, для каждого условия эксперимента, FCCP титруют, чтобы получить максимальную отцеплен частоту дыхания. Отцепили дыхательная отношение контроля (uRCR) рассчитывается путем деления FCCPотцеплен частота дыхания по частоте дыхания в присутствии олигомицином. Олигомицин-чувствительного дыхания (оборот АТФ) рассчитывается путем вычитания олигомицином-нечувствительной частоты дыхания от базальной эндогенного дыхания. Сцепление эффективность, которая представляет собой долю митохондриальной потребления кислорода, используемого для синтеза АТФ рассчитывается путем деления олигомицином чувствительных частоту дыхания базальной частоты дыхания. В конце эксперимента, чтобы получить не-митохондриальную частоту дыхания, добавлены ингибиторы митохондриальной цепи переноса электронов являются и не митохондриальной частота дыхания вычитают из всех результатов. Для эксперимента , показанного на рисунке 6, не-митохондриальная частота дыхания 26 пмоль / (сек х миллионов клеток), базальная частота дыхания составляет 48 пмоль / (сек х миллионов клеток), олигомицином-нечувствительной частоты дыхания 7 пмоль / (сек х миллионов клеток), олигомицином-чувствительного дыхания (оборот АТФ) 41 пмоль / (сек х миллионов клеток) и couplinкоэффициент полезного действия г 0,85. Таблица 1: Состав дыхания буфера. 
Рисунок 4: Успешное измерение максимального АДФ-стимулированной дыхания (состояние 3) пермеабилизированных HepG2 клеток. Частота дыхания выражается как пмоль / (сек х миллионов клеток). Клетки проницаемыми с 8 мкМ дигитонином и митохондриальной дыхательной ставки измеряются после последующего добавления глутамат и малат (состояние 3, комплекс I), ротенону ингибировать Комплекс I, сукцинат (состояние 3, комплекс II), антимицина А для ингибирования комплекса III и аскорбат / TMPD и азид натрия для ингибирования сложного IV. Комплекс IV дыхание (состояние 3)интерпретируется путем вычитания потребления кислорода до и после добавления азида натрия. CI: комплекс I, CII: комплекс II, CIV: комплекс IV. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. 
Рисунок 5: Неудачная измерение максимального АДФ-стимулированной дыхания (состояние 3) пермеабилизированных HepG2 клеток. Типичные респираторные следы неудачного эксперимента комплекса I-, II- IV и управляемой максимальной АДФ-стимулированной дыхания (состояние 3) проницаемыми клеток HepG2 с использованием высокого разрешения респирометрии. Частота дыхания выражается какпмоль / (сек х миллион клеток). Клетки проницаемыми с 8 мкМ дигитонином и митохондриальной дыхательной ставки измеряются после последующего добавления глутамат и малат (состояние 3, комплекс I), ротенону ингибировать Комплекс I, сукцинат (состояние 3, комплекс II), антимицина А для ингибирования комплекса III и аскорбат / TMPD и азид натрия для ингибирования сложного IV. Комплекс IV дыхание (состояние 3) интерпретируется путем вычитания потребления кислорода до и после добавления азида натрия. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. 
Рисунок 6: В сочетании и отцепили дыхание интактных клеток. Представительные респираторные следы базального потребления кислорода HepG2 клеток измеряли в присутствии олигомицином (олигомицином нечувствительные дыхание) и последовательным добавлением FCCP с использованием высокого разрешения респирометрии. После этого, как только будет достигнут устойчивый сигнал, дыхание угнетается с добавлением ротенону и антимицина А и оставшийся фон дыхания (не митохондриального дыхания) вычитают из всех результатов. Потребление кислорода выражается как пмоль / (сек х количество клеток). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. Дыхательный буфер 13 химическая концентрация Сахароза 110 мМ EGTA 0,5 мМ MgCl 2 3,0 мМ KCl 80 мМ K-лактобионат 60 мМ KH 2 PO 4 10 мМ Таурин 20 мМ Hepes 20 мМ БСА 1,0 г / л pH 7.1
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Цель настоящего протокола заключается в использовании высокого разрешения респирометрии для измерения митохондриальной дыхательной цепи комплексы '(I-IV) частота дыхания, максимальная емкость митохондриального транспорта электронов и целостности митохондриальной наружной мембраны.
Есть несколько важных шагов в рамках настоящего протокола. Во-первых, уровень потребления кислорода сотовой связи, как правило, нормализовали к числу клеток (пмоль / [сек х количество клеток]). Поэтому, перед тем мониторинга потребления кислорода сотовой связи, важно использовать устройство, которое позволяет точные и надежные измерения количества клеток. В настоящем протоколе автоматизированный счетчик клеток используется (этап 3.7 протокола и таблицы материалов). Вторым важным шагом, особенно в клетках проницаемыми, является выбор дыхания буфера, в котором проницаемыми клетки ресуспендировали (шаг 3.6 протокола). Так как клеточная пермеабилизации может вызвать потерю intracellulaИоны г, что очень важно, чтобы среда, используемая во время пермеабилизации совместим с внутриклеточной средой. Таким образом, дыхание буфер должен содержать состав и осмолярность , который отражает как внутриклеточного и внеклеточного среды (таблица 1) 13. Кроме того, для оптимального и эффективного клеточного пермеабилизации, крайне важно, чтобы титровать дигитониновый концентрации не только для каждого типа клеток, но и для каждой плотности клеток, чтобы определить его оптимальную и низкой эффективной концентрации. Если дигитониновый концентрация слишком низкая, клетки не будут проницаемыми. В отличие от этого, облучение клеток до больших количеств дигитонина может привести к повреждению митохондриальной наружной мембраны. Таким образом, еще один важный момент состоит в изучении митохондриальной целостности наружной мембраны. Для того чтобы не недооценить сотовую дыхательную способность, важно также, что эксперименты респирометрии выполняются при физиологической температуре (37 ° С), Еще один важный момент, чтобы рассмотреть использование насыщать количеств АДФ, вследствие диффузии ограничения АДФ против кислорода в клетках проницаемыми и достаточном уровне субстрата, чтобы получить максимальный дыхательный поток. В некоторых экспериментах в пермеабилизированных клетках, может случиться так, что добавление экзогенных субстратов и АДФ не приводит к значительному увеличению частоты дыхания. Это может быть вызвано несколькими факторами. Например, использование высоких концентраций дигитонина для клетки проницаемыми может привести к повреждению митохондриальной наружной мембраны. Таким образом, следует титровать дигитониновый для определения оптимальной концентрации для каждого типа клеток и плотности. Кроме того, чистота дигитонином также очень критично, и коммерчески доступные дигитониновых могут значительно отличаться по чистоте и новых партий приобретенной дигитонином следует титровать, чтобы определить их оптимальные концентрации для клеточной проницаемости. Кроме того, существует несколько типов клеточных плазматических мембран пороформирующийагенты с различными свойствами. Например, сапонин представляет собой более мягкий детергент, чем дигитонина, и в зависимости от типа клеток, соответствующий реагент проницаемости клеточной мембраны должна быть выбрана.
Большинство ингибиторов митохондриальной функции, используемой в респирометрии анализах, таких как ротенон антимицина А, растворимы только в этаноле и придерживаться oxygraph камер и пробками, ингибирующие клеточное дыхание. Чтобы избежать этой проблемы, oxygraph камеры и стопоры должны быть тщательно промывали 95% -ным этанолом, после каждого анализа. Еще один важный момент, чтобы рассмотреть, что для обоих интактных и проницаемыми клеточного дыхания анализов, плотность клеток, тип и клеточная культура Стечение может повлиять на частоту дыхания. Например, с клетками HepG2, мы обычно используем плотность клеток в 1 до 2 миллионов клеток на камеру. Использование очень низкой плотности клеток во время респирометрии может привести к очень слабый сигнал. Мы также наблюдали, что клеточная культура конфлуэнтности может повлиять на частоту дыхания. Для EXAmple, когда клетки HepG2 выращивают очень сливная (более 100%), они потребляют значительно меньше кислорода.
Для того, чтобы получить стабильный и воспроизводимый поток кислорода во время экспериментов, еще один важный момент , чтобы рассмотреть , является поддержание высокого разрешения респирометрии приборо- т.е. регулярного обмена полярографических датчика кислорода мембран и инструментальных фоновых коррекций. Для экспериментов с разобщитель FCCP, может быть, что добавление FCCP к клеткам, не стимулирует клеточное дыхание и максимальный поток не получается, но вместо того, чтобы клеточное дыхание угнетается. Ингибирование клеточного потребления кислорода при добавлении FCCP может указывать, что концентрация FCCP не был оптимальным, и была слишком высокой. Для этих экспериментов для каждого анализа, важно тщательно титруют концентрации FCCP для получения максимального потока.
Ограничение высокого разрешения респирометрии является то, что с высокой пропускной способностью скрининг, установлениеКривые доза-ответ и эксперименты курс времени для ограниченного количества биологических образцов, не представляется возможным. Для этих анализов, можно использовать и другие инструменты, такие как внеклеточный анализатор потока. Другие ограничения я) устройство не автоматизирован и требует постоянного присутствия оператора, б) это отнимает много, III) он имеет только две камеры и только два анализы могут быть запущены одновременно, IV) обслуживание прибора время , такие как изменение мембран и калибровок, требует много времени и v) камеры не одноразового использования и может быть загрязнена с ингибиторами. Преимущества высокого разрешения oxygraph по сравнению с традиционными полярографических кислородного электрода устройств I) выше чувствительность, II) меньшие количества биологических образцов требуется, III) частота дыхания может быть измерено одновременно в двух камерах и IV) устройство сократило утечку кислорода. Некоторые преимущества высокого разрешения oxygraph над внеклеточной анализатора потока являются I) более низкие затраты на проведениеустройства и расходных материалов и б) целесообразность протоколов титрования субстрат-разобщитель-ингибитор.
Будущие приложения или направления после освоения этой техники являются одновременные измерения клеточного дыхания, митохондриального мембранного потенциала, H 2 O 2, уровень АТФ и кальция с использованием оптических датчиков в той же камере.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ADP | Sigma | A 4386 | Chemical |
| Antimycin A | Sigma | A 8674 | Chemical, dissolve in ethanol |
| Ascorbate | Merck | 1.00127 | Chemical |
| BSA | Sigma | A 6003 | Chemical |
| FCCP | Sigma | C 2920 | Chemical, dissolve in ethanol |
| Countess automated cell counter | Thermo Fisher Scientific | n/a | Automated cell counting instrument |
| Cytochrome c | Sigma | C 7752 | Chemical |
| Digitonin | Sigma | D 5628 | Chemical, dissolve in DMSO |
| DMEM | Gibco | 31966021 | Medium |
| EGTA | fluka | 3779 | Chemical |
| FBS | Gibco | 26010-074 | Medium component |
| Glutamate | Sigma | G 1626 | Chemical |
| Hepes | Sigma | H 7523 | Chemical |
| KCl | Merck | 1.04936 | Chemical |
| KH2PO4 | Merck | 1.04873 | Chemical |
| K-lactobionate | Sigma | L 2398 | Chemical |
| MgCl2 | Sigma | M 9272 | Chemical |
| O2k-Core: Oxygraph-2k | Oroboros Instruments | 10000-02 | High-resolution respirometry instrument |
| Oligomycin | Sigma | O 4876 | Chemical, dissolve in ethanol |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | Chemical |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | Chemical |
| Rotenone | Sigma | R 8875 | Chemical, dissolve in ethanol |
| Succinate | Sigma | S 2378 | Chemical |
| Taurine | Sigma | T 8691 | Chemical |
| TMPD | Sigma | T 3134 | Chemical |
| Trypsin | Sigma | T 4674 | Chemical |
References
- Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochem J. 435 (2), 297-312 (2011).
- Lanza, I. R., Nair, K. S. Functional assessment of isolated mitochondria in vitro. Methods Enzymol. 457, 349-372 (2009).
- Zhang, J., et al. Measuring energy metabolism in cultured cells, including human pluripotent stem cells and differentiated cells. Nat Protoc. 7 (6), 1068-1085 (2012).
- Gnaiger, E., Steinlechner-Maran, R., Mendez, G., Eberl, T., Margreiter, R. Control of mitochondrial and cellular respiration by oxygen. J Bioenerg Biomembr. 27 (6), 583-596 (1995).
- Wu, M., et al. Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells. Am J Physiol Cell Physiol. 292 (1), C125-C136 (2007).
- Djafarzadeh, S., Vuda, M., Takala, J., Jakob, S. M. Effect of remifentanil on mitochondrial oxygen consumption of cultured human hepatocytes. PLoS One. 7 (9), e45195 (2012).
- Horan, M. P., Pichaud, N., Ballard, J. W. Review: quantifying mitochondrial dysfunction in complex diseases of aging. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 67 (10), 1022-1035 (2012).
- Niklas, J., Melnyk, A., Yuan, Y., Heinzle, E. Selective permeabilization for the high-throughput measurement of compartmented enzyme activities in mammalian cells. Anal Biochem. 416 (2), 218-227 (2011).
- Jeger, V., et al. Dose response of endotoxin on hepatocyte and muscle mitochondrial respiration in vitro. Biomed Res Int. 2015, 353074 (2015).
- Nicholls, P. Cytochrome c binding to enzymes and membranes. Biochim Biophys Acta. 346 (3-4), 261-310 (1974).
- Cortese, J. D., Voglino, A. L., Hackenbrock, C. R. Multiple conformations of physiological membrane-bound cytochrome c. Biochemistry. 37 (18), 6402-6409 (1998).
- Gorbenko, G. P. Structure of cytochrome c complexes with phospholipids as revealed by resonance energy transfer. Biochim Biophys Acta. 1420 (1-2), 1-13 (1999).
- Gnaiger, E., Méndez, G., Hand, S. C. High phosphorylation efficiency and depression of uncoupled respiration in mitochondria under hypoxia. Proc Natl Acad Sci USA. 97, 11080-11085 (2000).
- Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Methods Mol Biol. 810, 25-58 (2012).
- Gnaiger, E. Mitochondrial Pathways and Respiratory Control. An Introduction to OXPHOS Analysis. Mitochondr Physiol Network 17.18. , OROBOROS MiPNet Publications. Innsbruck. 64 (2012).
