Summary
Hög upplösning respiration används för att bestämma mitokondriella syreförbrukning. Detta är en enkel teknik för att bestämma mitokondriella andningskedjan komplex "(I-IV) andningsfrekvens, maximal mitokondriella elektrontransportsystemet kapacitet och mitokondriell yttre membran integritet.
Introduction
Mitokondrier fyller viktiga roller i cellulär energimetabolism, i synnerhet genom att använda syre för att producera adenosintrifosfat (ATP). De är inblandade i celldöd och i flera humana sjukdomar. Mitokondriell oxidativ fosforylering (OXPHOS) kombinerar elektrontransport längs elektrontransportkedjan med syreförbrukning och ATP-syntes. Den mitokondriella trikarboxylsyra (TCA) cykel är inblandad i omvandlingen av proteiner, kolhydrater och fetter i energirika föreningar som nikotinamidadenindinukleotid (NADH) och flavinadenindinukleotid (FADH2). Elektroner av NADH och FADH2 överförs sedan till andningselektrontransportkedjan proteinkomplex (I-IV) som är belägen i det inre mitokondriemembranet. Dessutom kan två andra redox vägar överföra elektroner till elektrontransportkedja: i) mitokondriell elektronöverförande flavoprotein (ETF), som är belägen på matrisen ytan av det inre mitochondrial membran, och levererar elektroner från fettsyra β-oxidation; och ii) mitochondrial glycerofosfatdehydrogenas som oxiderar glycerofosfat till dihydroxiaceton fosfat och matar elektroner till den mitokondriella elektrontransportkedjan. Komplex IV (den ultimata elektronacceptor) överför elektronerna till en syremolekyl, omvandla syre till två vattenmolekyler. Förflyttning av elektronerna från andningselektrontransportkedjan komplex I-IV är kopplad med protonflöde från den mitokondriella matrisen till intermembrane utrymme som etablerar en elektrokemisk gradient över det mitokondriella innermembranet. Efteråt mitokondriella komplex V (ATP-syntas) skyttlar vätejonerna tillbaka in i mitokondriematrisen och syntetiserar ATP-molekyler. OXPHOS funktion kan bedömas in vivo och in vitro med användning av olika tekniker och olika mitokondriella respirationstillstånd kan erhållas. I isolerade mitokondrier följande respiratory tillstånd kan mätas: i) basal mitokondrie andning (tillstånd 1), ii) syreförbrukningen efter tillsats av specifika substrat av mitokondriella andningskedjan komplex (tillstånd 2), iii) maximal mitokondrie syreförbrukning efter tillsats av mättande koncentrationer av adenosindifosfat (ADP) (tillstånd 3) och iv) vilande andning efter ADP konsumtion (omräknat till ATP) (tillstånd 4). I intakta celler följande andningstillstånd kan mätas: i) basalcellsyreförbrukning i närvaro av endogena substrat och ADP, ii) basalcellsyreförbrukning i närvaro av oligomycinkänslig (oligomycinkänslig-okänsliga andning) och oligomycinkänslig känsliga andning (ATP omsättningen), iii) FCCP okopplade andning, och iv) icke-mitokondrie andning efter tillsats av antimycin A och rotenon. I permeabiliserade celler, kan specifika substrat av elektrontransportkedjan komplex och ADP tillsättas och maximala komplexa beroende respirationshastigheter arådana så komplext I-, II- och IV-beroende respirationshastigheter kan mätas.
Mätningar av cellandningen ge viktiga insikter i mitokondriell lungkapacitet är specifik för komplex I-IV, mitokondriell integritet och energiomsättning en, två, tre. En av anordningarna som möjliggör mätningar av mitokondriell syreförbrukning med hög noggrannhet, upplösning och känslighet är den högupplösta oxygraph 4. Den högupplösta oxygraph enheten innehåller två kammare med insprutningsöppningar och varje kammare är utrustad med en polarografisk syresensor. Cellulära eller isolerade mitokondriella suspensioner rörs kontinuerligt i respirometer. För att bedöma mitokondriefunktion, substrat och inhibitorer för mitokondriell komplex aktivitet kan tillsättas efter standardprotokoll. Substrat och inhibitorer kan titreras genom injektion into kamrarna i oxygraph och syreförbrukning beräknas med hjälp av programvara och uttrycktes som pikomol per sekund per antalet celler. Högupplöst respiration erbjuder flera fördelar jämfört med traditionella och konventionella polarografisk syreelektrod enheter inklusive ökad känslighet och förmåga att arbeta med ett litet antal biologiska prover, såsom intakta eller permeabiliserade celler. Dessutom innehåller varje enhet två kamrarna, och respirationshastigheter kan spelas in samtidigt vid jämförelse av syrekoncentrationer. Den högupplösta oxygraph har också fördelen av minskat läckage av syre från enhetens kamrarna jämfört med traditionella polarografiska syreelektrodanordningarna. En annan anordning som nyligen utvecklats för att mäta cellulär syreförbrukningen är 96 brunnar extracellulärt flöde analysator 5. Den extracellulära flödes analysator är utrustad med fluorescens istället för polarografiska sensorer. Fördelarna med den extracelluläraflux analysator jämfört med den högupplösta oxygraph är i) det är en stor del automatiserad enhet, ii) det är möjligt att mäta syreförbrukningen i 24- och 96-brunnsplattor för high-throughput screening, därför kräver mindre mängder av biologiska prover, och iii) ytterligare en mätning av cellulär glykolytiska flux är möjlig. Nackdelarna med den extracellulära flödes analysatorn i jämförelse med den högupplösta oxygraph är i) de höga kostnaderna för enheten och av förbrukningsmaterial såsom fluorescerande plattor, som är icke-återanvändbara, och ii) endast fyra föreningar per analys / brunn är injicerbara systemet är därför inte möjligt för substrat-frikopplare-inhibitor titrering protokoll.
I den aktuella studien använder vi hög upplösning respiration att bestämma mitokondrie andning. För cellulära syreförbrukning experiment cellerna permeabiliseras för att tillåta inträde av exogent ADP och oxider mitokondriella substrat för matning elektroner in i complexes i andningsorganen. Detta tillvägagångssätt gör dissektion av enskilda mitokondriella komplex andningskapacitet, vilket är en klar fördel jämfört med intakta celler (många substrat cell ogenomträngligt). Emellertid kommer cellmembranet permeabilization störa barriären mellan cytosolen och extracellulära utrymmet och medium (tvätta ur cytosoliska lösta ämnen) och sammansättningen av det intracellulära utrymmet jämviktas med det extracellulära mediet. En av nackdelarna med permeabiliserade celler över intakta celler är att det mitokondriella yttre membran kan skadas om stora mängder rengöringsmedel används under cell permeabilization. I intakta celler, basala, kopplade och okopplade andning av intakta celler kan mätas. Denna metod utvärderar syreförbrukningen hos intakta celler utan tillsats av exogena substrat och ADP, återger lungfunktion hos den integrerade cellen och även tillhandahålla information om maximal mitokondriella elektron transport kapacitet 6, 7. En av fördelarna med intakta celler över permeabiliserade celler är att cellulära miljön inte störs och mitokondrier är i kontakt med hela komponenter av cellerna. För att permeabilisering cellplasmamembranet, har rengöringsmedel såsom digitonin använts åtta. Däremot kan mitokondrie yttre membran integritet äventyras om stora mängder digitonin användes. För att bekräfta att mitokondriell yttre membran integritet inte äventyras i permeabiliserade celler, digitonin titrering för att bestämma den optimala koncentrationen för cellulär permeabilization. För dessa experiment, celler återsuspenderades i andningsmedium och digitonin koncentrationen titreras genom respiration i närvaro av mitokondriella substrat och ADP, och andningsfrekvens mäts. Respiration av intakta, icke-permeabiliserade celler stimuleras inte i närvaro av mitochondrial substrat och ADP. Men skulle efterföljande stegvis digitonin titrering ge gradvis permeabilization av plasmamembran, och optimal digitonin koncentration erhålls. Detta visas genom ökningen av andning upp till full permeabilization. Kan verifieras mitokondrie kvalitet och yttre membran integritet genom att tillsätta exogena cytokrom c 2, 9. Cytokrom c är ett 12 kDa elektronbärande proteinet av den mitokondriella elektrontransportkedjan 10, 11, 12. Den är lokaliserad i den mitokondriella intermembrane utrymme, och är involverad i syreförbrukning, bärande elektroner från komplex III till komplex IV. När mitokondriella yttre membranet är skadat, är cytokrom c frigörs och mitokondriesyreförbrukningen minskar. Vid tillsats av exogen cytokrom c, är ett tecken på en något augmentation i mitokondriell andningstörde mitokondriell yttre membranet.
I permeabiliserade celler, substrat och hämmare av mitokondrie komplex aktivitet tillsätts efter olika protokoll 3, 9. Exempelvis i syfte att undersöka mitokondriella komplexa driven respirationshastigheter kan användas följande protokoll. Efter permeabilisering av cellerna, är första komplex I stimuleras av substraten malat och glutamat, som alstrar NADH som ett substrat för andningskedjan och provocera aktiveringen av komplex I. Efteråt ADP tillsättes för omvandling till ATP (tillstånd 3, aktiv komplex I-beroende andning). Efter en stabil signal uppnås, är rotenon (mitokondriell komplex jag hämmare) som administreras för att hämma komplexa I. Rotenon följs av succinat till FADH2 och aktivera komplex II (tillstånd 3, aktivt komplex II-beroende andning). För att mäta komplexa IV beroende andning, första komplex III-beroende andning hämmas genom tillsats av antimycin A (mitokondriell komplex III-hämmare). Efteråt är komplex IV beroende andning stimuleras genom administrering askorbat och tetramethylphenylendiamine (TMPD). TMPD kan auto-oxidera i respiration buffert, därför den maximala komplexa IV beroende respirationshastigheten (State 3) beräknas genom att subtrahera andningsfrekvens före och efter tillsatsen av natrium-azid, en inhibitor av mitokondriell komplex IV. De andnings experiment kan utföras i två kamrar en oxygraph i parallell en portion som en kontroll (ostimulerade celler), det andra innehåller de stimulerade cellerna. Uppenbarligen, kan cellerna förbehandlas på olika sätt, t.ex., med läkemedel som påverkar mitokondriella funktioner, innan deras syreförbrukning mäts i oxygraph kammaren. Detta protokoll möjliggör funktionell undersökning av de enskilda mitokondriella andningskedjan komplex. Dessutom kan man mäta maximal ADP-stimuleraderespiration (tillstånd 3) av permeabiliserade celler, med användning av exogen fettsyra i form av palmitat. I detta protokoll är koncentrerade bestånd av natriumpalmitat konjugerat med ultrafettsyrafritt bovinserumalbumin (BSA) (6: 1 molförhållande palmitat: BSA). Efteråt celler först är permeabiliserade med digitonin och mitokondrie andning bedöms genom tillsats av karnitin och palmitat följt av tillsats av ADP (tillstånd 3, maximal andning). Därefter oligomycin sätts för att efterlikna tillståndet 4 (stat 4o) och andningskontroll kvoten (RCR värde) beräknas som tillstånd 3 / tillstånd 4o. β-oxidation gynnar produktionen av acetyl-CoA (som kommer in i TCA-cykeln) och generering av FADH2 och NADH, elektronerna av vilka överförs till elektrontransportkedjan genom elektronöverförande flavoprotein och β-hydroxiacyl-CoA-dehydrogenas. Mitokondrierna är i centrum för fettsyrametabolism och beskrivs palmitat-BSA protokoll kan användas av forskare undersöker fettty acid oxidation. I intakta celler, aktivatorer och inhibitorer av mitokondriekomplex aktivitet tillsätts efter ett annat protokoll 6, 9. För dessa experiment är första syreförbrukning av icke-permeabiliserade celler i frånvaro av exogena substrat mäts (fosforylerande andningsfrekvens). Därefter är den icke-fosforylerande respirationshastigheten mäts efter tillsatsen av oligomycin, som är en inhibitor av mitokondriell ATP-syntas. Efteråt protonophore karbonylcyanid-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) administreras vid olika koncentrationer och maximal mitokondriella okopplade andningsfrekvens mäts. Protonophores såsom FCCP kan inducera en ökning i proton permeabilitet det inre membranet, vilket möjliggör passiv rörelse av protoner för att skingra chemiosmotic lutning. En ökning av proton permeabilitet syftar till att skilja oxidativ respiration (ingen ATP-produktionen) och inducerar en ökning av oxygen konsumtion. Efteråt är rotenon och antimycin A tillsättes för att hämma mitokondrie respiration, och icke-mitokondriell andning subtraheras från alla andra andningsfrekvenser.
De syreförbrukning kan uttryckas som IO 2 [pmol x sek -1 x 10 -6 celler] (syreflöde per miljon celler) som beräknas genom att dividera volymspecifik syreflödet (i den slutna syrekammaren), JV, O 2 [pmol x sek -1 x ml -1] av cellkoncentrationen i cellkammaren (antalet celler per volym [10 6 celler ∙ ml 1]) 15. Cell-massa specifik syreflödet, JO 2 [pmol x sek -1 x mg -1], är flödet per cell, IO 2 [pmol x sek -1 x 10 -6 celler] dividerat med massa per cell [mg ∙ 10 6-celler]; eller volymspecifik flux, JV, O 2 [pmol x sek -1 x ml -1] dividerat med massa per volymUME [mg ∙ ml 1]. JO 2 är syreflödet per cellprotein, torrvikt eller cellvolym.
I föreliggande studie med användning av högupplösande respiration, beskriver vi protokoll för att bestämma i) optimalt digitonin koncentration för fullständig cellulär plasmamembran permeabilisering (digitonin titrering analys), ii) mitokondriell yttermembranintegritet med användning av exogena cytokrom c, iii) mitokondriella andningskedjan komplex I , II och IV maximala andningsfrekvens i digitonin-permeabiliserade HepG2-celler i närvaro av exogen ADP och mitokondriella andningskedjan substrat, och iv) basal, kopplade och maximal okopplad andning (maximal elektron transportkapacitet) av intakta celler utan tillsats av exogena substrat och ADP, återger lungfunktion hos den integrerade cellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cellodling
- Kultur humana hepatom HepG2-celler 6 i 25 cm 2 cellodlingsflaskor i Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) innehållande 10% värmeinaktiverat fetalt bovint serum (FBS) och 1% penicillin-streptomycin vid 37 ° C i en inkubator (5% CO 2, 95% luft) (såddtäthet: 1 x 10 6 celler per 25 cm 2 cellodlingskolv, inkubationstid i 37 ° C inkubator: 48 h, celldensitet vid sammanflytning: 4-5 x 10 6 celler per 25 cm 2 cellodlingskolv).
- Utföra experimenten när cellerna är 90% till 95% konfluenta.
2. Högupplöst respiration Kalibrering av polarografisk syresensorer
- Pipettera 2,1 ml av andning buffert i en oxygraph kammaren och rör om bufferten kontinuerligt med användning av en magnetisk omrörarstav närvarande i kammaren (700 rpm) vid 37 ° C under 1 h tills en stabil syreflödet signal avden polarografisk syresensorn erhålls.
OBS: polarografisk syreelektroder inom varje oxygraph kammare åtgärd syrehalt och beräkna syreförbrukning (flödet) i varje kammare. Syrekoncentrationen och syreförbrukning (flux) visas i realtid på nätet i en dator med hjälp av programvara för datainsamling och analys. - Utför en luftkalibrering av polarografisk syresensorn enligt tillverkarens protokoll 14.
OBS: Kalibrering av polarografiska syresensorer i andnings media och syrekoncentrationen i medierna vid luftmättnad experimentell temperatur utförs endast en gång per dag på morgonen. Efteråt media kan avlägsnas från kamrarna och cellerna resuspenderades i en ny andning media tillsätts till en oxygraph kammare och andningsfrekvens mäts. Efter det första experimentet, kan kammaren tvättas och ytterligare serie experiment kan utföras i than samma kammare utan ytterligare kalibreringar.
3. Trypsinering vidhäftande celler, räkna celler
- På dagen för experimentet, aspirera DMEM från 25 cm 2 cellodling kolv.
- Skölj cellodlingsmonoskikt i odlingskolv med 5 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- Pipettera 0,5 ml av 25 mg / ml av trypsinlösning (förvärmd till 37 ° C i en 37 ° C vattenbad) i cellmonoskiktet i odlingskolv och inkubera under 5 min vid 37 ° C i en inkubator (5% CO2 , 95% luft).
- Pipettera 5 ml av DMEM innehållande 10% FBS i de lösgjorda cellerna i cellkultur kolv och suspendera cellerna genom pipettering.
- Överföring återsuspenderades cellerna till en 15 ml centrifugrör och centrifugera under 5 min vid 350 xg vid rumstemperatur och dekantera supernatanten.
- Resuspendera cellpelleten i 1 ml andning buffert 13 (T abell 1).
4. Hög upplösning respiration
- Efter luftkalibreringen (utförs endast en gång per dag, steg från 2,1 till 2,2), aspirera andningsmediet från en kammare av oxygraph och tillsätt 2,1 ml av cellsuspensionen (1 x 10 6 celler / ml) från steg 3,7 till kammaren.
- Stäng oxygraph kammaren genom insättning av proppen.
- Rör om cellerna kontinuerligt med användning av en magnetisk omrörarstav närvarande i kammaren (700 rpm) vid 37 ° C och registrera cellulär andning under 5-10 min tills en stabil syreflöde signal uppnås.
OBS: syrehalt och syreflöde signal visas i realtid på nätet i en dator med hjälp av programvara för datainsamling och analyss = "xref"> 14. - Efteråt injicera substrat och inhibitorer för mitokondrie andning genom titaninjektions hamnar propparna med följande protokoll.
5. Digitonin Titrering i intakta celler genom respiration
- Bereda en oxygraph kammare som innehåller cellsuspension (1 x 10 6 / ml) enligt proceduren beskriven i steg 4.1 till 4.3 i protokollet.
- Injicera 2 | il av 0,2 mM rotenon (0,2 | iM) "caution" in i oxygraph kammare innehållande cellsuspension genom titaninjektionsöppningen hos kammaren proppen med hjälp av en spruta och spela in cellulär andning under 5-10 min tills en stabil syreflöde signalen uppnås .
OBS: Alla injektioner i de följande stegen utförs genom titaninjektions hamnar proppar använder sprutor. Tillsats av rotenon är valfri (det hindrar omvänt elektronflöde) och kan utelämnas för digitonin titrering experiment, sesteg 6,3. - Injicera 20 | il av 1 M succinat (10 mM) i oxygraph kammaren och registrera cellulär andning under 5-10 min tills en stabil syreflöde signal uppnås.
- Injicera 10 | il av 0,5 M ADP (2,5 mM) in i oxygraph kammaren och registrera cellulär andning under 5-10 min tills en stabil syreflöde signal uppnås.
- Injicera 2 pl 2 mM digitonin (2 M) i oxygraph kammaren och spela cellandningen för 2-5 minuter tills en stabil syresignal uppnås.
- Återigen injicera 2 pl 2 mM digitonin i oxygraph kammaren och spela cellandningen för 2-5 minuter tills en stabil syresignal uppnås.
OBS: Stegvis tillsats av digitonin till cellerna kommer att inducera en ökning av cellulär syreförbrukning och syreflödet signalen kommer att öka. - Fortsätta att injicera 2-4 | il av 2 mM digitonin stegvis (2-4 ^ M av varje steg) in i kammaren. Efter varje steg, spela cellandningen för 2-5 mi tills en stabil syreflöde signal uppnås.
OBS: Stoppa injicera digitonin när syreflödet signalen når en maximal nivå och ytterligare injektioner av digitonin inte ökar andningsfrekvensen. Läsarna bör bestämma optimal digitonin koncentration i sina laboratorier med hjälp av sina egna reagens och användning erhålls optimal digitonin koncentration i stegen 6.2 och 7.2 i följande protokoll för sina experiment.
6. Utvärdering av Mitochondrial yttermembran Integrity: cytokrom C
- Bereda en oxygraph kammare som innehåller cellsuspension (1 x 10 6 / ml) enligt proceduren beskriven i steg 4.1 till 4.3 i protokollet.
- Injicera 2 pl av 8 mM digitonin (8 ^ M) in i oxygraph kammare innehållande cellsuspensionen (1 x 10 6 / ml) och permeabilisering av cellerna under 5 min.
- Injicera 20 | il av 1 M succinat (10 mM) i oxygraph kammaren och registrera cellulär Respiratjon i 5-10 min tills en stabil syreflöde signal uppnås.
- Injicera 10 | il av 0,5 M ADP (2,5 mM) in i oxygraph kammaren och registrera cellulär andning under 5-10 min tills en stabil syreflöde signal uppnås.
OBS: Tillsats av ADP till cellerna kommer att stimulera komplex I och inducera en ökning av syreförbrukning och syreflöde signal kommer att öka och stabilisera. - Injicera 5 il 4 mM cytokrom c (10 ^ M) i oxygraph kammaren och spela cellandningen i 5-10 minuter tills en stabil syreflödet signal uppnås.
- Slutligen injicera 1 pl av 4 mg / ml oligomycin (2 | ig / ml) och registrera cellandningen tills en stabil syreflöde signal uppnås.
7. Maximal ADP-stimulerade Andning (State 3) av Permeabilized HepG2-celler
- Bereda en oxygraph kammare som innehåller cellsuspension (1 x 10 6 / ml) enligt proceduren beskriven i steg 4.1 till 4.3 i protokollet.
- Injicera 2 pl av 8 mM digitonin (8 ^ M) in i oxygraph kammare som innehåller cellsuspensionen och permeabilisera cellerna under 5 min.
- Injicera 12,5 | il av 0,8 M av malat (5 mM) och 10 | il av 2 M av glutamat (10 mM) in i oxygraph kammaren. Spela cellandningen tills en stabil syreflödet signal uppnås.
- Injicera 10 | il av 0,5 M ADP (2,5 mM) in i oxygraph kammaren och registrera cellandningen tills de syreflödessignalen ökar och stabiliserar.
OBS: Tillsats av ADP till cellerna kommer att inducera en ökning av syreförbrukning och syreflödet signalen kommer att öka. - Injicera 2 pl 0,2 mM rotenon (0,2 M) "VARNING" i oxygraph kammaren och spela cellandningen tills syreflödessignal minskar och stabiliserar.
- Efteråt, injicera 20 | il av 1 M succinat (10 mM) i oxygraph kammaren och registrera cellandningen tills signalen ökar syreflödetoch stabiliseras.
- Sedan injicera 2 pl 5 mM antimycin A (5 M) "VARNING" i oxygraph kammaren och spela cellandningen tills syreflödessignal minskar och stabiliserar.
- injicera därefter 2,5 pl av 0,8 mM askorbat (1 mM) och omedelbart efter injicera 2,5 pl av 0,2 mM TMPD (0,25 mM) i oxygraph kammaren och registrera cellandningen tills de syreflödessignalen ökar och stabiliserar.
- Slutligen injicera 10 | il av 1 M natriumazid (5 mM) "caution" in i oxygraph kammaren och registrera cellandningen tills syreflödessignalen minskar och stabiliserar.
8. syreförbrukningen hos intakta celler
- Bereda en oxygraph kammare som innehåller cellsuspension (1 x 10 6 / ml) enligt proceduren beskriven i steg 4.1 till 4.3 i protokollet.
- Injicera 1 pl av 4 mg / ml oligomycin (2 | ig / ml) in i oxygraph kammare innehållande cellsuspension end rekord cellandningen tills en stabil syreflödet signal uppnås.
- Efteråt injicera 1 pl 0,2 mM FCCP (0,1 M) "VARNING" i oxygraph kammaren och spela cellandningen tills syreflödessignalen ökar och stabiliseras.
- Injicera 3 il 0,2 mM FCCP (0,4 M) i oxygraph kammaren och spela cellandningen tills signalen ökar syreflödes ytterligare och stabiliserar.
- Titrera FCCP i 0,1 till 0,3 ^ M steg genom att injicera 1-3 | il av 0,2 till 1 mM FCCP (0,1 till 2 | iM slutkoncentration i kammaren) i oxygraph kammaren tills syreflödet signalen når sina maximala nivåer och inga ytterligare ökningar och sedan börjar minskar.
OBS: Stoppa injicera FCCP när syre signalen når en maximal nivå och börjar minskar. - Injicera sedan 2 | il av 0,2 mM rotenon (0,2 ^ M) och 2 | j, l av 5 mM antimycin A (5 ^ M) in i kammaren. Post andning tills than syreflödessignal minskar och stabiliserar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bestämningen av optimala Digitonin Koncentration för Cellular Permeabilization: Digitonin Titrering Experiment
Digitonin titrering utförs för att bestämma den optimala koncentrationen för permeabilisering av HepG2-celler. För dessa experiment är digitonin titreras i intakta celler i närvaro av rotenon, succinat (mitokondriell komplex II substrat) och en mättande mängd av ADP (för att inducera komplex II-beroende tillstånd 3), och andningsfrekvens mäts vid baslinjen och efter varje titrering (figurerna 1A och 1B). Resultatet av detta experiment visar att i frånvaro av digitonin, är mycket låg och respiration av intakta, icke-permeabiliserade celler stimuleras inte i närvaro av mitokondriell substrat och ADP cellandningen. Men vid stegvis tillsats av digitonin, är det cellulära plasmamembranet permeabiliserade och mitochondrial respiration (komplex II-beroende tillstånd 3) ökar upp till full permeabilization när succinat och ADP in i cellerna. Resultaten visar att permeabilisering vid en digitonin koncentration av 8-12 pM är optimalt för ADP-stimulerad respiration av HepG2-celler. Däremot kan mitokondrie yttre membran integritet äventyras om stora mängder digitonin användes. Såsom visas i figur 1, överdrivna mängder av digitonin inducerade en minskning av komplex II-beroende tillstånd 3 andning indikerar äventyras mitokondriell yttermembranintegritet.
I förevarande och följande protokoll, är alla syreförbrukning uttryckt som IO 2 [pmol x sek -1 x 10 -6 celler] (syreflöde per miljon celler) som beräknas genom att dividera volymspecifik syreflödet (i den slutna syrekammare), JV, O 2 [pmol x sek -1 x ml -1] genom cell Koncentrat jon i cellen kammaren (antal celler per volym [10 6 celler x ml -1]) 15.
Figur 1: Digitonin titrering för att bestämma den optimala koncentrationen för permeabilisering av HepG2-celler. Den blå linjen representerar syrehalt; den röda linjen representerar syreflöde (lutning syrehalt). Syrekoncentrationen minskar med tiden som cellerna använder tillgängligt syre. Syreförbrukningen är uttryckt som pmol / (sek x antal celler). (A) kurvor från den högupplösta respiration med hjälp av digitonin, ADP och succinat som substrat för mitokondriell komplex II-beroende andning (1 experiment). (B) Mitochondrial andningsfrekvens från 4 individuella experiment presenteras som medelvärde ± SD.ladda / 54.985 / 54985fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Utvärdering av Mitochondrial yttermembran Integrity Använda en optimal Digitonin Koncentration
För att utvärdera effekten av optimala digitonin koncentration (8 pM) på yttre mitokondriemembranbarriären cellerna permeabiliserades med digitonin och mitokondriell yttre membranintegriteten testas genom mätning av mitokondriell andning efter efterföljande tillsats av succinat (mitokondriell komplex II-beroende vilotillstånd 2 respiration i frånvaro av ADP), ADP (ADP stimulerade komplex II-beroende tillstånd 3 respiration) och cytokrom c (ADP stimulerade komplex II-beroende tillstånd 3 andning i närvaro av cytokrom c), följt av tillsats av oligomycin (en inhibitor ATP-syntas) för att efterlikna tillståndet 4. som visas i figur 2
Figur 2: Cytokrom c förbättrar inte respiration av de celler som behandlats med digitonin (8 | iM). Representativa andnings spår för cytokrom c test med hög upplösning respiration. Celler permeabiliserades med 8 iM digitonin och mitokondriell yttre membran integritet testas genom mätning av andningsfrekvens efter efterföljande tillsats av 10 mM succinat (tillstånd 2), 2,5 mM ADP (tillstånd 3) och 10 | iM cytokrom c (tillstånd 3 i närvaro cytokrom c), följt av tillsats av 2 | j, g / ml oligomycin att efterlikna tillståndet 4. Andningsfrekvens frekvens~~POS=HEADCOMP uttrycks som pmol / (sek x million celler). CII: komplex II. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Utvärdering av Mitochondrial yttermembranintegritet med en hög koncentration av Digitonin
För att visa att en mycket hög koncentration av digitonin kan äventyra mitokondrie yttre membran integritet, genomförde vi ett experiment med en hög dos av digitonin. För detta experiment, är cellerna permeabiliserades med 40 | iM digitonin i stället för 8 | iM, och mitokondriell yttre membranintegriteten testas genom mätning av mitokondriell andning efter efterföljande tillsats av succinat (mitokondriell komplex II-beroende vilotillstånd 2 respiration i frånvaro av ADP) ADP (ADP stimulerade komplex II-beroende tillstånd 3 andning) och cytokrom c (ADP stimulerade komplex II-dependent tillståndet 3 andning i närvaro av cytokrom c), följt av tillsats av oligomycin att efterlikna tillståndet 4 i närvaro av oligomycin (Figur 3). Resultatet av detta experiment visar att cytokrom c förbättrar respiration av de celler som behandlats med en hög dos av digitonin, vilket indikerar en förlust av cytokrom c från den mitokondriella yttre membranet som indikerar äventyras mitokondriell yttermembranintegritet.
Figur 3: Hög dos av digitonin (40 M) äventyrar mitokondriell yttre membran integritet. Tracings från den högupplösta respiration med användning succinat som substrat. Den blå linjen representerar syrehalt; den röda linjen representerar syreflöde (lutning syrehalt). Syrekoncentrationen minskar med tiden som cellerna använder tillgängligt syre. Syreförbrukningen är uttryckt sompmol / (sek x antal celler). Efterföljande tillsats av 40 | iM digitonin, succinat (10 mM), ADP (2,5 mM), cytokrom c (10 ^ iM) och oligomycin (2 | ig / ml) indikeras. CII: komplex II. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Maximal ADP-stimulerad andning (State 3) av Permeabilized HepG2-celler, användning av överskott Exogena substrat
Komplexa I-, är II och IV-beroende maximal ADP-stimulerad andning (tillstånd 3) av permeabiliserade HepG2-celler (1 x 10 6 celler / ml) framgångsrikt mäts med hjälp av överskott exogena substrat (Figur 4). För detta experiment, celler permeabiliserades med digitonin och mitokondriella syreförbrukning mäts efter efterföljande tillsats av substrat och inhibitorer som beskrivs i Misslyckad Mätning av maximal ADP-stimulerade Andning (State 3) av Permeabilized HepG2-celler Komplexa I-, är II och IV-beroende maximal ADP-stimulerad andning (tillstånd 3) av permeabiliserade HepG2-celler (1 x 10 6 celler / ml) inte med framgång mäts med hjälp av överskott exogena substrat (Figur 5). För detta experiment, celler permeabiliserades med digitonin och mitokondriella syreförbrukning mäts efter efterföljande tillsats av substrat och inhibitorer som beskrivs i Figur 5. Såsom visas i fig 5 figur 4. En möjlig förklaring till minskade andnings nivåer är kontaminering av oxygraph kammare med mitokondrie-hämmare från tidigare experiment. Mitokondrie-hämmare såsom antimycin och rotenon är lösliga i etanol och kan hålla sig till oxygraph kamrarna och proppar. Därför oxygraph kammare och proppar bör tvättas noggrant efter varje experiment. Kopplat och frikopplat Andning av intakta celler HepG2-celler "basal syreförbrukning mäts i närvaro av oligomycinkänslig (oligomycinkänslig-okänsliga andning) och sekventiell tillsats av FCCP (Figur 6). Basal cellulära respirationshastigheten representerar syre förbrukning av intakta HepG2-celler i närvaro av endogena cellulära substrat och kan förändra som svar på cellulär ATP efterfrågan. Oligomycin okänsliga andningsfrekvensen representerar läcka cellandningen och oligomycinkänslig känsliga andningsfrekvens som representerar cellulär ATP omsättning och beräknas genom att subtrahera oligomycinkänslig okänsliga andningsfrekvens från basala endogena andningsfrekvensen. Den kemiska frikopplare FCCP sekventiellt tillsätts vid olika koncentrationer och maximal okopplad andning registreras. Den maximala mitokondriella okopplade andningsfrekvens (maximal elektrontransport systemets kapacitet) för denna experimentella tillstånd erhålls vid 0,9-1,2 iM FCCP. Resultaten visar en bifasisk aktivitet av FCCP i intakta HepG2-celler. Därför, för varje experimentell tillstånd, är FCCP titreras för att uppnå maximal okopplad andningsfrekvensen. Den okopplade andningskontroll förhållande (uRCR) beräknas genom att dividera FCCPokopplad respirationshastighet av andningsfrekvensen i närvaro av oligomycin. Oligomycinkänslig känsliga andning (ATP omsättning) beräknas genom att subtrahera oligomycinkänslig okänsliga andningsfrekvens från basala endogen respiration. Kopplingseffektivitet som representerar den andel av mitokondriell syreförbrukning för att syntetisera ATP beräknas genom att dividera den oligomycin känsliga andetagsfrekvens genom den basala andningsfrekvensen. Vid slutet av experimentet, för att erhålla icke-mitokondriell andningshastighet, är mitokondriella elektrontransportkedjan inhibitorer sattes och icke-mitokondrierespirationshastigheten subtraheras från alla resultat. För experimentet visas i figur 6, är den icke-mitokondriella andningsfrekvens 26 pmol / (sek x miljoner celler), är den basala andningsfrekvens 48 pmol / (sek x miljoner celler), oligomycin-okänsliga respirationshastighet 7 pmol / (sek x miljoner celler), oligomycinkänslig känsliga andning (ATP omsättning) 41 pmol / (sek x miljoner celler) och coupling effektivitet 0,85. Tabell 1: Sammansättningen av andning buffert. 
Figur 4: Lyckad mätning av maximal ADP-stimulerad andning (tillstånd 3) av permeabiliserade HepG2-celler. Andningsfrekvens är uttryckt som pmol / (sek x miljon celler). Cellerna permeabiliserades med 8 pM digitonin och mitokondriella respirationshastigheter mäts efter efterföljande tillsats av glutamat och malat (tillstånd 3, komplex I), rotenon att inhibera komplex I, succinat (tillstånd 3, komplex II), antimycin A för att hämma komplex III och askorbat / TMPD och natriumazid för att inhibera komplexa IV. Komplex IV andning (State 3)tolkas genom subtraktion av syreförbrukningen före och efter tillsats av natriumazid. CI: komplexa I, CII: komplex II, CIV: komplex IV. Klicka här för att se en större version av denna siffra. 
Figur 5: Misslyckad mätning av maximal ADP-stimulerad andning (tillstånd 3) av permeabiliserade HepG2-celler. Representativa andnings spår av ett misslyckat experiment komplexa I-, II- och IV-driven maximal ADP-stimulerad andning (tillstånd 3) av permeabiliserade HepG2-celler med hjälp av högupplösande respiration. Andningsfrekvens uttrycks sompmol / (sek x miljoner celler). Cellerna permeabiliserades med 8 pM digitonin och mitokondriella respirationshastigheter mäts efter efterföljande tillsats av glutamat och malat (tillstånd 3, komplex I), rotenon att inhibera komplex I, succinat (tillstånd 3, komplex II), antimycin A för att hämma komplex III och askorbat / TMPD och natriumazid för att inhibera komplexa IV. Komplex IV andning (State 3) tolkas genom att subtrahera syreförbrukningen före och efter tillsats av natriumazid. Klicka här för att se en större version av denna siffra. 
Figur 6: Kopplade och okopplade andning av intakta celler. Representativa andnings spår av HepG2-celler "basal syreförbrukning mäts i närvaro av oligomycinkänslig (oligomycinkänslig-okänsliga andning) och sekventiell tillsats av FCCP använder hög upplösning respiration. Därefter en gång en stabil signal uppnås, är andningen hämmas med tillsats av rotenon och antimycin A och resterande bakgrunds andning (icke-mitokondriell andning) subtraheras från alla resultat. Syreförbrukningen är uttryckt som pmol / (sek x antal celler). Klicka här för att se en större version av denna siffra. Respiration buffert 13 Kemisk Koncentration sackaros 110 mM EGTA 0,5 mM MgCl2 3,0 mM KCl 80 mM K-laktobionat 60 mM KH 2 PO 4 10 mM taurin 20 mM Hepes 20 mM BSA 1,0 g / L pH 7,1
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Syftet med detta protokoll var att använda hög upplösning respiration att mäta mitokondriella andningskedjan komplex "(I-IV) andningsfrekvens, maximal mitokondriella elektrontransportsystemet kapacitet och mitokondriell yttre membran integritet.
Det finns några viktiga steg i detta protokoll. Först är cellulära syreförbrukningshastigheter vanligtvis normaliserad till antalet celler (pmol / [sek x antal celler]). Därför innan övervaka cellulär syreförbrukning, är det viktigt att använda en enhet som möjliggör noggranna och tillförlitliga mätningar av antalet celler. I det nuvarande protokollet en automatiserad cellräknare har använts (steg 3,7 i protokollet och tabell av material). Ett andra viktigt steg, särskilt i permeabiliserade celler, är valet av andning buffert i vilken permeabiliserade celler resuspenderas (steg 3.6 i protokollet). Eftersom cellulär permeabilisering kan inducera förlust av intracellular joner, är det mycket viktigt att det medium som används under permeabilization är kompatibel med intracellulära miljön. Därför bör andning buffert innehålla en komposition och osmolaritet som återspeglar både intracellulära och extracellulära miljön (tabell 1) 13. Dessutom, för optimal och effektiv cellulär permeabilisering, är det viktigt att titrera digitonin koncentrationen inte bara för varje celltyp utan också för varje celldensitet, att identifiera dess optimala och lägsta effektiva koncentration. Om digitonin koncentrationen är för låg, kommer cellerna inte att permeabiliseras. Däremot kommer exponering av cellerna till stora mängder av digitonin skada den mitokondriella yttre membranet. Därför är en annan viktig punkt att undersöka mitokondriell yttre membran integritet. För att inte underskatta cellulär lungkapacitet, är det också viktigt att respiration experiment utförs vid en fysiologisk temperatur (37 ° C). En annan viktig sak att tänka på är användningen av mättande mängder av ADP, på grund av diffusion begränsning av ADP mot syre i permeabiliserade celler och tillräcklig substratnivåer för att erhålla maximal andningsflöde. I vissa experiment i permeabiliserade celler, kan det hända att tillsats av exogena substrat och ADP inte leder till en avsevärd höjning av andning. Detta kan bero på flera faktorer. Till exempel kan användningen av höga koncentrationer av digitonin att permeabilisering cellerna skadas mitokondriella yttre membranet. Därför bör en titrera digitonin för att bestämma den optimala koncentrationen för varje celltyp och densitet. Vidare är renheten hos digitonin också mycket kritisk, och kommersiellt tillgängliga digitonin kan variera kraftigt i renhet och nya partier av köpte digitonin bör titreras för att bestämma deras optimala koncentrationer för cellulär permeabilization. Dessutom finns det flera typer av cellulära plasmamembran porbildandemedel med olika egenskaper. Till exempel, är saponin ett mildare detergent än digitonin, och beroende på den celltyp, bör en lämplig cell permeabilitetsreagenset väljas.
De flesta hämmare av mitokondriefunktion som används i respiration analyser, såsom rotenon antimycin A, är lösliga endast i etanol och hålla sig till oxygraph kamrarna och proppar, vilket hämmar cellandningen. För att undvika detta problem måste oxygraph kammare och proppar tvättas utförligt med 95% etanol efter varje analys. En annan viktig sak att tänka på är att både intakta och permeabiliserade cellandningen analyser kan celltäthet, typ och cellodling sammanflödet påverkar andningsfrekvens. Till exempel, med HepG2-celler, använder vi vanligtvis en celldensitet av 1 till 2 miljoner celler per kammare. Med användning av mycket låg celldensitet under respiration kan ge upphov till en mycket svag signal. Vi observerade också att cellodlings confluency kan påverka andningsfrekvens. för example när HepG2-celler odlas mycket sammanflytande (mer än 100%), de förbrukar mycket mindre syre.
För att få en stabil och reproducerbar syreflödet under experiment, är en annan viktig punkt att beakta upprätthållandet av den högupplösta respiration instrument- dvs regelbundet utbyte av polarografiska syresensormembran och instrumentella bakgrunds korrigeringar. För experiment med frikopplare FCCP, kan det vara så att tillsats av FCCP till cellerna stimulerar inte cellulär andning och maximal flux erhålls inte, utan i stället cellulär andning hämmas. Hämning av cellulär syreförbrukning vid tillsättning av FCCP kan tyda på att FCCP koncentrationen var inte optimalt och var alltför hög. För dessa experiment för varje analys, är det viktigt att noggrant titrera FCCP koncentration för att erhålla maximal flux.
En begränsning av högupplösta respiration är att high-throughput screening, fastställande avdos-responskurvor och tidsförloppet experiment för begränsade mängder av biologiska prover inte är genomförbara. För dessa analyser kan man använda andra instrument, såsom den extracellulära flödes analysatorn. Andra begränsningar är i) enheten inte är automatiserad och kräver kontinuerlig närvaro av en operatör, ii) det är tidskrävande, iii) den har endast två kammare och endast två analyser kan köras åt gången, iv) underhåll av instrumentet , till exempel ändra membranen och kalibreringar, kräver mycket tid och v) kamrarna är inte för engångsbruk och kan bli förorenat med hämmare. Fördelarna med hög upplösning oxygraph jämfört med traditionella polarografiska syreelektrodanordningar är i) högre känslighet, ii) mindre antal biologiska prover som krävs, iii) andningsfrekvens kan mätas samtidigt i båda kamrarna och iv) enheten har minskat syreläckage. Några fördelar med den högupplösta oxygraph över den extracellulära flux analysatorn är i) lägre kostnader förenhet och förbrukningsartiklar och ii) genomförbarheten av substratkopplare-inhibitor titrering protokoll.
Framtida tillämpningar eller riktningar efter att behärska denna teknik är samtidiga mätningar av cellandningen, mitokondriell membranpotential, H2O 2, ATP och kalciumnivåer med hjälp av optiska sensorer i samma kammare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ADP | Sigma | A 4386 | Chemical |
| Antimycin A | Sigma | A 8674 | Chemical, dissolve in ethanol |
| Ascorbate | Merck | 1.00127 | Chemical |
| BSA | Sigma | A 6003 | Chemical |
| FCCP | Sigma | C 2920 | Chemical, dissolve in ethanol |
| Countess automated cell counter | Thermo Fisher Scientific | n/a | Automated cell counting instrument |
| Cytochrome c | Sigma | C 7752 | Chemical |
| Digitonin | Sigma | D 5628 | Chemical, dissolve in DMSO |
| DMEM | Gibco | 31966021 | Medium |
| EGTA | fluka | 3779 | Chemical |
| FBS | Gibco | 26010-074 | Medium component |
| Glutamate | Sigma | G 1626 | Chemical |
| Hepes | Sigma | H 7523 | Chemical |
| KCl | Merck | 1.04936 | Chemical |
| KH2PO4 | Merck | 1.04873 | Chemical |
| K-lactobionate | Sigma | L 2398 | Chemical |
| MgCl2 | Sigma | M 9272 | Chemical |
| O2k-Core: Oxygraph-2k | Oroboros Instruments | 10000-02 | High-resolution respirometry instrument |
| Oligomycin | Sigma | O 4876 | Chemical, dissolve in ethanol |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | Chemical |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | Chemical |
| Rotenone | Sigma | R 8875 | Chemical, dissolve in ethanol |
| Succinate | Sigma | S 2378 | Chemical |
| Taurine | Sigma | T 8691 | Chemical |
| TMPD | Sigma | T 3134 | Chemical |
| Trypsin | Sigma | T 4674 | Chemical |
References
- Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochem J. 435 (2), 297-312 (2011).
- Lanza, I. R., Nair, K. S. Functional assessment of isolated mitochondria in vitro. Methods Enzymol. 457, 349-372 (2009).
- Zhang, J., et al. Measuring energy metabolism in cultured cells, including human pluripotent stem cells and differentiated cells. Nat Protoc. 7 (6), 1068-1085 (2012).
- Gnaiger, E., Steinlechner-Maran, R., Mendez, G., Eberl, T., Margreiter, R. Control of mitochondrial and cellular respiration by oxygen. J Bioenerg Biomembr. 27 (6), 583-596 (1995).
- Wu, M., et al. Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells. Am J Physiol Cell Physiol. 292 (1), C125-C136 (2007).
- Djafarzadeh, S., Vuda, M., Takala, J., Jakob, S. M. Effect of remifentanil on mitochondrial oxygen consumption of cultured human hepatocytes. PLoS One. 7 (9), e45195 (2012).
- Horan, M. P., Pichaud, N., Ballard, J. W. Review: quantifying mitochondrial dysfunction in complex diseases of aging. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 67 (10), 1022-1035 (2012).
- Niklas, J., Melnyk, A., Yuan, Y., Heinzle, E. Selective permeabilization for the high-throughput measurement of compartmented enzyme activities in mammalian cells. Anal Biochem. 416 (2), 218-227 (2011).
- Jeger, V., et al. Dose response of endotoxin on hepatocyte and muscle mitochondrial respiration in vitro. Biomed Res Int. 2015, 353074 (2015).
- Nicholls, P. Cytochrome c binding to enzymes and membranes. Biochim Biophys Acta. 346 (3-4), 261-310 (1974).
- Cortese, J. D., Voglino, A. L., Hackenbrock, C. R. Multiple conformations of physiological membrane-bound cytochrome c. Biochemistry. 37 (18), 6402-6409 (1998).
- Gorbenko, G. P. Structure of cytochrome c complexes with phospholipids as revealed by resonance energy transfer. Biochim Biophys Acta. 1420 (1-2), 1-13 (1999).
- Gnaiger, E., Méndez, G., Hand, S. C. High phosphorylation efficiency and depression of uncoupled respiration in mitochondria under hypoxia. Proc Natl Acad Sci USA. 97, 11080-11085 (2000).
- Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Methods Mol Biol. 810, 25-58 (2012).
- Gnaiger, E. Mitochondrial Pathways and Respiratory Control. An Introduction to OXPHOS Analysis. Mitochondr Physiol Network 17.18. , OROBOROS MiPNet Publications. Innsbruck. 64 (2012).
