Summary
respirometry ברזולוציה גבוהה משמש לקביעת צריכת חמצן המיטוכונדריה. זוהי טכניקה פשוטה כדי לקבוע מתחמי שרשרת הנשימה במיטוכונדריה '(I-IV) מחירי נשימה, קיבולת מערכת תחבורת אלקטרון מקסימלי המיטוכונדריה, ויושרת הממברנה החיצונית של המיטוכונדריה.
Introduction
המיטוכונדריה למלא תפקידים חשובים במטבוליזם האנרגיה בתאים, במיוחד באמצעות חמצן כדי לייצר אדנוזין אדנוזין (ATP). הם מעורבים מוות של תאים בכמה מחלות אנושיות. זרחון חמצוני מיטוכונדריאלי (OXPHOS) משלב הובלת האלקטרונים לאורך שרשרת העברת אלקטרונים עם צריכת חמצן סינתזת ATP. החומצה tricarboxylic המיטוכונדריה (TCA) מחזור מעורב ההמרה של חלבונים, פחמימות ושומנים לתרכובות עתירות אנרגיה כמו dinucleotide אדנין nicotinamide (NADH) ו dinucleotide אדנין פלבין (FADH 2). אלקטרונים של NADH ו FADH 2 ואז מועברים קומפלקסי חלבוני שרשרת העברת אלקטרוני הנשימה (I עד IV) ממוקם קרום המיטוכונדריה הפנימי. בנוסף, שני מסלולי חיזור אחרים יכולים להעביר אלקטרוני אלקטרונים שרשרת תחבורה: i) המיטוכונדריה אלקטרון-העברת flavoprotein (ETF) הנמצא על פני המטריצה של מיטו הפנימיאלקטרוני קרום chondrial, ואספקת β-חמצון חומצות שומן; ו ii) dehydrogenase glycerophosphate המיטוכונדריה אשר מתחמצנים glycerophosphate כדי דהידרוקסיאצטון פוספט ומזינה אלקטרונים לשרשרת הובלת האלקטרונים המיטוכונדריה. IV המורכב (את מקבל אלקטרונים האולטימטיבי) מעביר את אלקטרוני מולקולת חמצן אחד, המרת חמצן שתי מולקולות של מים. העברת האלקטרונים מתסביך שרשרת העברת אלקטרוני נשימת I עד IV מצמידה עם תזרים פרוטון מן מטריקס המיטוכונדריה למרחב intermembrane הקובע שיפוע אלקטרוכימי על פני הקרום הפנימי של המיטוכונדריה. לאחר מכן, V מורכב המיטוכונדריה (synthase ATP) בהסעות יוני מימן בחזרה לתוך מטריקס המיטוכונדריה ו מסנתז מולקולות ATP. פונקצית OXPHOS ניתן להעריכם vivo ו במבחנה תוך שימוש בטכניקות שונות ומצבי נשימה המיטוכונדריאלי שונים ניתן לקבל. במיטוכונדריה בודדה את respirato הבאניתן למדוד מדינות ר"י: i) נשימה המיטוכונדריאלי הבזליים (מדינת 1), ii) צריכת חמצן לאחר התוספת של מצעים ספציפיים של מתחמי שרשרת הנשימה במיטוכונדריה (מצב 2), iii) צריכת חמצן מרבית המיטוכונדריה לאחר התוספת של להרוות ריכוזי diphosphate אדנוזין (ADP) (מצב 3) ו, ד) נשימה במנוחה לאחר צריכת ADP (המרה ל ATP) (מצב 4). בשנת תאי שלמי מדינות הנשימה הבאה ניתן למדוד: i) צריכת חמצן הסלולר הבזליים בנוכחות מצעי אנדוגני ADP, ii) צריכת חמצן הסלולר הבזליים בנוכחות oligomycin (oligomycin רישיות נשימה) ו oligomycin רגיש נשימה (ATP ממחזור), iii) FCCP נשימה זוגית, ו- IV) נשימה הלא המיטוכונדריה לאחר התוספת של antimycin ו rotenone. בתאי permeabilized, מצעים ספציפיים של מתחמי שרשרת העברת אלקטרונים ו ADP ניתן להוסיף s שיעורי נשימה המקסימאלי תלויה מורכבuch אני- מורכב כמו, II- ושיעורי הנשימה IV תלויי ניתן למדוד.
מדידות של הנשימה התאית לספק תובנות חשובות קיבולת הנשימה במיטוכונדריה ספציפי מתחמי I-IV, יושרה המיטוכונדריה ואת חילוף החומרים האנרגיה 1, 2, 3. אחד המכשירים המאפשרים מדידות של צריכת חמצן המיטוכונדריה עם רגישות דיוק, ברזולוציה גבוהה הוא oxygraph 4 ברזולוציה הגבוהה. מכשיר oxygraph ברזולוציה גבוהה מכיל שני תאים עם יציאות הזרקה וכל תא מצויד חיישן חמצן polarographic. השעיות המיטוכונדריה ניידות או מבודדות הם עוררו ברציפות respirometer. כדי להעריך המיטוכונדריה פונקציה, מצעים ומעכבים עבור פעילות מורכבת המיטוכונדריה ניתן להוסיף באי פרוטוקולים סטנדרטיים. מצעים ומעכבים ניתן טיטרציה ידי int הזרקהo לתאי של oxygraph, ושיעורי צריכת החמצן מחושבים באמצעות תוכנה כפי שבא לידי ביטוי picomoles לשנייה לכל מספר התאים. respirometry ברזולוציה גבוהה מציע מספר יתרונות על פני התקני אלקטרודה חמצן polarographic מסורתיים קונבנציונליים כולל רגישות מוגברת ואת היכולת לעבוד עם מספר קטן של דגימות ביולוגיות כגון תאים שלמים או permeabilized. בנוסף, כל התקן מכיל שני תאים, ושיעורי נשימה ניתן להקליט בו זמנית להשוואות של ריכוזי חמצן. Oxygraph ברזולוציה גבוהה גם יש את היתרון של דליפה המופחתת של חמצן מתאי המכשיר לעומת מכשירי אלקטרודה חמצן polarographic מסורתיים. מכשיר נוסף שפותח לאחרונה למדוד צריכת חמצן הסלולר הוא מנתח השטף התאי 96-גם 5. מנתח השטף התאי מצויד קרינה במקום חיישני polarographic. היתרונות של תאימנתח שטף לעומת oxygraph ברזולוציה הגבוהה הם i) הוא מכשיר אוטומטי במידה רבה, ii) ניתן למדוד צריכת חמצן 24- ו 96-גם צלחות להקרנת תפוקה גבוהה, ולכן דורש כמויות נמוכות של דגימות ביולוגיות, ו- III) מדידה נוספת של שטף הסלולר glycolytic אפשרית. החסרונות של הנתח השטף תאיים בהשוואה oxygraph ברזולוציה גבוהה הם i) העלויות הגבוהות של המכשיר ושל מתכלים כגון צלחות פלורסנט, רציפות שאינן לשימוש חוזר, ו-ב '), רק ארבע תרכובות לכל assay / גם הם להזרקה לכן, המערכת אינה ישימה עבור פרוטוקולי טיטרציה מצע-uncoupler-מעכב.
במחקר הנוכחי, אנו משתמשים respirometry ברזולוציה גבוהה כדי לקבוע נשימה המיטוכונדריאלי. בניסויים צריכת החמצן הסלולר, התאים permeabilized כדי לאפשר כניסת ADP אקסוגניים מצעים המיטוכונדריה oxidizable האכלה אלקטרונים לתוך Complexeים של מערכת הנשימה. גישה זו מאפשרת לנתיחה קיבולות הנשימה מתחמי המיטוכונדריה הפרט, המהווה יתרון בולט לעומת תאים שלמים (מצעים רבים הם תאים impermeant). עם זאת, קרום התא permeabilization ישבש את המחסום בין cytosol והמרחב תאי והבינוני (לשטוף החוצה של מומסי cytosolic) והרכב של המרחב התאי הוא equilibrated עם המדיום התאי. אחד החסרונות של תאי permeabilized על תאים שלמים הוא כי הממברנה החיצונית של המיטוכונדריה יכולה להינזק אם כמויות עודפות של חומר ניקוי מועסקות במהלך permeabilization תא. בשנת תאים שלמים, הבזליים, מצמיד ונשימה זוגית של תאי שלמים ניתן למדוד. שיטה זו מעריכה צריכת חמצן של תאים שלמים בלי התוספת של מצעים אקסוגניים ADP, לשחזר את תפקודי הנשימה בתא המשולב גם מתן מידע על transpo אלקטרון המקסימאלי המיטוכונדריהקיבולת 6 rt, 7. אחד היתרונות של תאים שלמים מעל תא permeabilized הוא כי הסביבה הסלולר אינה מופרת המיטוכונדריה נמצאת בקשר עם הרכיבים השלמים של התאים. כדי permeabilize הממברנה התאית, דטרגנטים כגון digitonin שימשו 8. עם זאת, שלמות הממברנה החיצונית של המיטוכונדריה יכולה להיפגע אם כמויות עודפות של digitonin מועסקות. כדי לאשר שלמות הממברנה החיצונית של המיטוכונדריה לא נפגעת בתאי permeabilized, טיטרציה digitonin מתבצעת על מנת לקבוע את הריכוז האופטימלי עבור permeabilization הסלולר. בניסויים אלה, תאי resuspended במדיום נשימה וריכוז digitonin הוא טיטרציה ידי respirometry בנוכחות מצעים המיטוכונדריה ADP, ושיעורי נשימה נמדדים. נשימה של שלם, שאינו permeabilized תאים אינו מגורה בנוכחות mitochoמצעי ADP ndrial. עם זאת, טיטרציה digitonin בשלבים הבאה תניב permeabilization ההדרגתית של ממברנות פלזמה, וריכוז digitonin אופטימלי מתקבל. זו מוצגת על ידי הגידול של נשימה עד permeabilization מלא. איכות מיטוכונדריאלי ויושרת קרום חיצונית יכולים להיות מאומתת על ידי הוספת ג 2 ציטוכרום אקסוגניים, 9. ציטוכרום C הוא חלבון נושאת אלקטרון 12 kDa של שרשרת העברת אלקטרונים המיטוכונדריה 10, 11, 12. זה הוא מקומי במרחב intermembrane המיטוכונדריה, והוא מעורב צריכת חמצן, נושאת אלקטרונים מורכב III ל- IV המורכב. לאחר הממברנה החיצונית של המיטוכונדריה פגומה, ציטוכרום C הוא שוחרר, וצריכת חמצן המיטוכונדריה מצטמצמת. עם התוספת של ציטוכרום C אקסוגניים, הגדלה שום נשימה המיטוכונדריאלי היא מעידה עלשיבשו הממברנה החיצונית של המיטוכונדריה.
בתאי permeabilized, מצעים ומעכבים של פעילות מורכבת המיטוכונדריה מתווספים הבאים פרוטוקולים שונים 3, 9. לדוגמה כדי לחקור שיעורי נשימה מונחה מורכב המיטוכונדריה, הפרוטוקול הבא יכול לשמש. לאחר permeabilization של תאים, אני המתחם הראשון הוא מגורה על ידי malate מצעים ו גלוטמט, אשר יוצרים NADH כמו מצע לשרשרת הנשימה לעורר את ההפעלה של I. מורכבים לאחר מכן, ADP מתווסף לגיור ל- ATP (המדינה 3, פעיל אני תלוי מורכב נשימה). לאחר אות יציבה הוא הגיע, rotenone (מורכב המיטוכונדריה שאני מעכב) מנוהל לעכב I. מורכב Rotenone ואחריו succinate כדי FADH 2 וכדי להפעיל מורכבים שניים (מדינת 3, השני תלויה נשימה מורכבת פעילה). על מנת למדוד מורכבות נשימת IV תלוי, המתחם ראשון IIIנשימה תלויה מעוכבת על ידי הוספת antimycin (מעכב המורכב III המיטוכונדריה). לאחר מכן, נשימת IV התלוי מורכבת היא מגורה על ידי מתן ascorbate ו tetramethylphenylendiamine (TMPD). TMPD יכול אוטומטי לחמצן למאגר הנשימה, ולכן קצב נשימת IV התלוי המורכב המקסימאלי (המדינה 3) מחושב על ידי הפחתת שיעורי נשימה לפני ואחרי התוספת של אזיד הנתרן, מעכב IV המורכב המיטוכונדריה. ניסויי הנשימה יכולים להתבצע בשני תאים של oxygraph במקביל-מנה אחת כביקורת (תאי unstimulated), את מכיל אחרים התאים המגורים. ברור, התאים ניתן מראש לטפל בדרכים שונות, למשל, עם תרופות המשפיעות פונקציות המיטוכונדריה, לפני צריכת החמצן שלהם נמדדה בתא oxygraph. פרוטוקול זה מאפשר בדיקה תפקודית של מתחמי שרשרת הנשימה במיטוכונדריה הפרט. בנוסף, אפשר למדוד ADP מגורה מקסימלינשימה (מדינה 3) של תאי permeabilized, באמצעות חומצת שומן אקסוגניים בצורת palmitate. בפרוטוקול זה, מניות מרוכזות של palmitate נתרן מצומדות עם אלבומין בסרום שור חינם חומצת שומן אולטרה (BSA) (6: palmitate יחס 1 הטוחן: BSA). לאחר מכן, התאים הראשונים הם permeabilized עם הנשימה digitonin ואת המיטוכונדריה נבחנת על ידי תוספת של קרניטין palmitate ואחריו תוספת של ADP (מצב 3, הנשימה מקסימלי). לאחר מכן, מתווסף oligomycin לחקות מדינה 4 (4O מדינה) ויחס מלא נשימה (ערך RCR) מחושב מדינה 3 / מדינה 4O. β-חמצון מקדם ייצור של אצטיל COA (אשר נכנס במחזור TCA) ויצירת FADH 2 ו NADH, האלקטרונים הם צולח לשרשרת הובלת אלקטרונים על ידי flavoprotein העביר-אלקטרוני dehydrogenase β-hydroxyacyl-CoA reductase. המיטוכונדריה הם במרכז מטבוליזם חומצות שומן ותיאר פרוטוקול palmitate-BSA יכול לשמש את החוקרים לבחון שומןחמצון חומצה ty. בשנת תאים שלמים, activators ומעכבים של פעילות מורכבת המיטוכונדריה מתווספים הבא בפרוטוקול אחר 6, 9. בניסויים אלה, צריכת החמצן הראשונה של תאים שאינם permeabilized בהעדר מצעים אקסוגניים נמדדת (phosphorylating קצב הנשימה). לאחר מכן, קצב הנשימה הלא phosphorylating נמדד לאחר תוספת של oligomycin, שהוא מעכב של ה- ATP synthase המיטוכונדריה. לאחר מכן, ציאניד קרבוניל protonophore p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) מנוהל בריכוזים שונים ואת קצב הנשימה הזוגי המקסימאלי המיטוכונדריה נמדד. Protonophores כגון FCCP יכול להשרות הגדלה בחדירות פרוטון של הקרום הפנימי, המאפשר תנועה פסיבית של פרוטונים כדי להפיג את שיפוע chemiosmotic. גידול חדיר פרוטון uncouples נשימת חמצונים (לא מבוצע ייצור ATP) ומשרת גידול oצריכת xygen. לאחר מכן, rotenone ו- A antimycin מתווספים לעכב נשימה המיטוכונדריאלי, והנשימה הלא המיטוכונדריה מופחתת מכל שיעורי הנשימה האחרים.
שיעורי צריכת החמצן יכולים לבוא לידי ביטוי 2 IO [pmol x שניות -1 x 10 -6 תאים] (זרימת חמצן למיליון תאים) המחושבות על ידי חלוקת שטף חמצן ספציפי נפח (בתא החמצן הסגור), JV, O 2 [sec x pmol -1 x מ"ל -1] על ידי ריכוז תא לתא הסלולרי (מספר התאים לכל נפח [10 6 תאים ∙ מ"ל 1]) 15. Cell-מסת שטף חמצן ספציפי, 2 JO [sec x pmol -1 x מ"ג -1], היא זרימה לכל תא, IO 2 [sec x pmol -1 x 10 -6 תאים], מחולק המוני לכל תא [מ"ג ∙ 10 6 תאים]; או נפח ספציפי השטף, JV, O 2 [sec x pmol -1 x מ"ל -1], מחולק המוני לכל כרךume [מ"ג ∙ מ"ל 1]. JO 2 הוא שטף החמצן לכל חלבון תא, משקל יבש או נפח תא.
במחקר הנוכחי באמצעות respirometry ברזולוציה גבוהה, אנו מתארים פרוטוקולים לקבוע i) digitonin הריכוז האופטימלי עבור permeabilization קרום הפלזמה הסלולר שלם (assay טיטרציה digitonin), ii) שלמות הממברנה החיצונית של המיטוכונדריה באמצעות ציטוכרום C אקסוגניים, iii) מתחמי שרשרת הנשימה במיטוכונדריה לי , שיעורי נשימה מקסימאליים II ו- IV בתאי HepG2-permeabilized digitonin בנוכחות ADP אקסוגניים מצעי שרשרת נשימה במיטוכונדריה, ו- IV) הבזליים, מצמיד ונשימה מקסימלי זוגית (קיבולת העברת אלקטרונים מקסימלי) של תאים שלמים בלי התוספת של מצעים אקסוגניים ו ADP, לשחזר את תפקודי נשימה בתא המשולב.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. תרבית תאים
- תאי HepG2 תרבות hepatoma אדם 6 ב 25 סנטימטר 2 צלוחיות תרבית תאים במדיום של הנשר השונה של Dulbecco (DMEM) המכיל סרום שור עובר חום מומת 10% (FBS) ו -1%, סטרפטומיצין פניצילין ב 37 מעלות צלזיוס CO חממה (5% 2, 95% אוויר) (צפיפות זריעה: 1 x 10 6 תאים לכל 25 ס"מ 2 תאים בקבוק תרבות, זמן הדגירה בחממה 37 ° C: 48 שעות, צפיפות התאים ב confluency: 4-5 x 10 6 תאים לכל 25 ס"מ 2 תא בקבוק תרבות).
- בצע את הניסויים כאשר תאים הם 90% עד 95% ומחוברות.
2. ברזולוציה גבוהה כיול Respirometry חיישני חמצן Polarographic
- פיפטה 2.1 מ"ל של חיץ הנשימה לתוך תא oxygraph ומערבבים למאגר ברציפות באמצעות בר בחישה מגנטית הנוכחי בתא (700 סל"ד) בשעה 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 עד אות השטף חמצן יציבה שלחיישן חמצן polarographic מתקבל.
הערה: אלקטרודות חמצן Polarographic בתוך כל ריכוז חמצן מידת oxygraph קאמרי לחשב צריכת חמצן (שטף) בתוך כל תא. ריכוז החמצן ושיעורי צריכת חמצן (שטף) מוצגים בזמן אמת באינטרנט במחשב באמצעות תוכנה עבור רכישת נתונים וניתוח. - בצע כיול אוויר של חיישן חמצן polarographic פי הפרוטוקולים של יצרן 14.
הערה: כיול של חיישני חמצן polarographic בתקשורת נשימה וריכוז חמצן בתקשורת בטמפרטורת ניסיוני הרוויה אוויר מבוצע רק פעם ביום בבוקר. לאחר מכן בתקשורת ניתן להסיר מתאי התאים resuspended בתוך תקשורת נשימה טריה מתווספים תא oxygraph ושיעורי נשימה נמדדים. אחרי הניסוי הראשון, התא ניתן לכבס סדרות נוספות של ניסויים ניתן לבצע tהוא באותו חדר ללא כיולים נוספים.
3. trypsinization של תאים חסידים, תאי ספירה
- ביום הניסוי, לשאוב DMEM מהבקבוק התרבות 2 תא 25 ס"מ.
- שוטפים את monolayer תרבית תאים בבקבוק תרבות עם 5 מ"ל של בופר פוספט (PBS).
- פיפטה 0.5 מ"ל של 25 מ"ג / מ"ל של תמיסת טריפסין (prewarmed עד 37 ° צלזיוס באמבט מים 37 ° C) לתוך monolayer תא בבקבוק תרבות דגירה במשך 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור (5% CO 2 אוויר, 95%).
- פיפטה 5 מ"ל של DMEM המכיל 10% FBS לתוך התאים מנותקים בבקבוק תרבית תאים להשעות את התאים על ידי pipetting.
- העברת resuspended התאים לצינור צנטריפוגות 15 מ"ל ו צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 350 XG בטמפרטורת החדר למזוג supernatant.
- Resuspend התא גלולה ב 1 מ"ל של הנשימה חיץ 13 (T מסוגל 1).
4. ברזולוציה גבוהה Respirometry
- לאחר כיול אוויר (מבוצע רק פעם ביום, על שלבים 2.1-2.2), לשאוב את המדיום הנשימה מאחד מחדרי של oxygraph ולהוסיף 2.1 מ"ל של תרחיף תאים (1 x 10 6 תאים / מ"ל) משלב 3.7 לתא.
- סגור את תא oxygraph ידי החדרת את הפקק.
- מערבב את התאים באופן רציף באמצעות בר בחישה מגנטי נוכחי בתא (700 סל"ד) בשעה 37 ° C ולהקליט נשימה תאית עבור דק '5-10 עד אות שטף חמצן יציבה מושגת.
הערה: ריכוז החמצן ואת אות שטף חמצן מוצג בזמן אמת באינטרנט במחשב באמצעות תוכנה עבור רכישת נתונים וניתוחs = "Xref"> 14. - לאחר מכן, להזריק מצעים ומעכבים לנשימת המיטוכונדריה דרך יציאות הזרקה טיטניום של הפקקים באמצעות הפרוטוקולים הבאים.
5. טיטרציה digitonin ב תאים שלמים ידי Respirometry
- הכין תא oxygraph השעית תא המכיל (1 x 10 6 / ml) הנוהל המתואר בצעדים 4.1 עד 4.3 של הפרוטוקול.
- להזריק 2 μl של rotenone 0.2 מ"מ (0.2 מיקרומטר) 'זהירות' החדרת oxygraph המכילה השעית תא דרך נמל הזרקת טיטניום של הפקק הקאמרי באמצעות מזרק ולהקליט נשימה תאית למשך 5-10 דקות עד אות שטף חמצן יציבה מושגת .
הערה: כל הזריקות בשלבים הבאים מבוצעות דרך יציאות הזרקה טיטניום של פקקים באמצעות מזרקים. תוספת של rotenone היא אופציונלית (הוא מונע זרימת אלקטרונים הפוכה) וניתן להשמיט לניסויי טיטרציה digitonin, ראהצעד 6.3. - להזריק 20 μl של 1 succinate M (10 מ"מ) לתוך תא oxygraph ולהקליט הנשימה התאית למשך 5-10 דקות עד אות השטף חמצן יציב מושגת.
- להזריק 10 μl של 0.5 M ADP (2.5 מ"מ) לתוך תא oxygraph ולהקליט נשימה תאית עבור דק '5-10 עד אות שטף חמצן יציבה מושגת.
- להזריק 2 μl של 2 מ"מ digitonin (2 מיקרומטר) לתוך תא oxygraph ולהקליט הנשימה התאית עבור דק '2-5 עד אות חמצן יציב מושגת.
- שוב להזריק 2 μl של 2 מ"מ digitonin החדרת oxygraph ולהקליט נשימה תאית במשך 2-5 דקות עד אות חמצן יציבה מושגת.
הערה: צעדיים תוספת של digitonin לתאי תניע לעלייה בצריכת חמצן הסלולר אות שטף החמצן תגדל. - המשך הזרקת 2-4 μl של 2 מ"מ בשלבי digitonin (2-4 מיקרומטר כל שלב) לתוך התא. לאחר כל שלב, להקליט נשימה תאית במשך 2-5 מ 'ב עד אות שטף חמצן יציבה מושגת.
הערה: להפסיק הזרקת digitonin כאשר אות שטף החמצן מגיע לרמת מירבית זריקות נוספות של digitonin לא להגדיל את קצב הנשימה. הקוראים צריכים לקבוע ריכוז digitonin אופטימלי במעבדות שלהם באמצעות ריאגנטים וריכוז digitonin האופטימלי המתקבל שימוש שלהם בשלבי 6.2 ו -7.2 של הפרוטוקולים הבאים עבור הניסויים שלהם.
6. הערכת Integrity הממברנה החיצונית מיטוכונדריאלי: ציטוכרום C
- הכין תא oxygraph השעית תא המכיל (1 x 10 6 / ml) הנוהל המתואר בצעדים 4.1 עד 4.3 של הפרוטוקול.
- להזריק 2 μl של 8 מ"מ digitonin (8 מיקרומטר) לתוך תא oxygraph המכיל את ההשעיה תא (1 x 10 6 / ml) ו permeabilize התאים למשך 5 דקות.
- להזריק 20 μl של 1 succinate M (10 מ"מ) לתוך תא oxygraph ולהקליט respirat הסלולריון למשך 5-10 דקות עד אות שטף חמצן יציבה מושגת.
- להזריק 10 μl של 0.5 M ADP (2.5 מ"מ) לתוך תא oxygraph ולהקליט נשימה תאית עבור דק '5-10 עד אות שטף חמצן יציבה מושגת.
הערה: תוספת של ADP לתאי תעודד שאני מורכב לגרום לעלייה בצריכת חמצן, ואת אות שטף החמצן תגדל ולייצב. - להזריק 5 μl של ציטוכרום C 4 מ"מ (10 מיקרומטר) לתוך תא oxygraph ולהקליט נשימה תאית למשך 5-10 דקות עד אות שטף חמצן יציבה מושגת.
- לבסוף להזריק 1 μl של 4 מ"ג / מיליליטר oligomycin (2 מיקרוגרם / מיליליטר) ולהקליט נשימה תאית עד אות שטף חמצן יציבה מושגת.
7. נשימה מגורה ADP מקסימאלי (המדינה 3) של תאים permeabilized HepG2
- הכין תא oxygraph השעית תא המכיל (1 x 10 6 / ml) הנוהל המתואר בצעדים 4.1 עד 4.3 של הפרוטוקול.
- להזריק 2 μl של 8 מ"מ digitonin (8 מיקרומטר) לתוך תא oxygraph המכיל את ההשעיה תא permeabilize התאים למשך 5 דקות.
- להזריק 12.5 μl של 0.8 M של malate (5 מ"מ) ו -10 μl של 2 M של גלוטמט (10 מ"מ) לתוך תא oxygraph. נשימה תאית שיא עד אות שטף חמצן יציבה מושגת.
- להזריק 10 μl של 0.5 M ADP (2.5 מ"מ) לתוך תא oxygraph ולהקליט נשימה תאית עד מגביר אות שטף החמצן ומייצב.
הערה: תוספת של ADP לתאי תניע לעלייה בצריכת חמצן ואת אות שטף החמצן תגדל. - להזריק 2 μl של rotenone 0.2 מ"מ (0.2 מיקרומטר) 'זהירות' החדרת oxygraph ולהקליט נשימה תאית עד ירידות אות שטף חמצן ומייצבת.
- לאחר מכן, להזריק 20 μl של 1 succinate M (10 מ"מ) לתוך תא oxygraph ולהקליט הנשימה התאית עד מגביר אות השטף חמצןומייצב.
- לאחר מכן, להזריק 2 μl של 5 מ"מ antimycin A (5 מיקרומטר) 'זהירות' החדרת oxygraph ולהקליט נשימה תאית עד ירידות אות שטף חמצן ומייצבת.
- ואז להזריק 2.5 μl של ascorbate 0.8 מ"מ (1 מ"מ) ומיד לאחר להזריק 2.5 μl של 0.2 מ"מ TMPD (0.25 מ"מ) לתוך תא oxygraph ולהקליט הנשימה התאית עד מגביר אות השטף חמצן ומייצב.
- לבסוף להזריק 10 μl של 1 M יזיד הנתרן (5 מ"מ) 'זהירות' החדרת oxygraph ולהקליט נשימה תאית עד ירידות אות שטף חמצן ומייצבת.
צריכת חמצן 8. של תאים שלמים
- הכין תא oxygraph השעית תא המכיל (1 x 10 6 / ml) הנוהל המתואר בצעדים 4.1 עד 4.3 של הפרוטוקול.
- להזריק 1 μl של 4 מ"ג / מ"ל oligomycin (2 מיקרוגרם / מ"ל) לתוך תא oxygraph השעייה התא המכילנשימה תאית שיא ד עד אות חמצן שטף יציבה מושגת.
- לאחר מכן להזריק 1 μl של 0.2 מ"מ של FCCP (0.1 מיקרומטר) 'זהירות' החדרת oxygraph ולהקליט נשימה תאית עד מגביר אות שטף החמצן ומייצב.
- להזריק 3 μl של 0.2 מ"מ של FCCP (0.4 מיקרומטר) לתוך תא oxygraph ולהקליט נשימה תאית עד מגביר אות שטף חמצן נוסף ומייצב.
- לכייל FCCP 0.1 כדי 0.3 מיקרומטר צעדים על ידי הזרקת 1-3 μl של 0.2 1 המ"מ FCCP (0.1 כדי 2 מיקרומטר ריכוז סופי בתא) לתוך תא oxygraph עד אות שטף החמצן מגיעה לרמות מקסימליים ולא עליות נוספות ולאחר מכן מתחיל בירידה.
הערה: להפסיק הזרקת FCCP כאשר אות החמצן מגיעה לרמה מקסימלי ומתחילה בירידה. - לאחר מכן, להזריק 2 μl של 0.2 rotenone מ"מ (0.2 מיקרומטר) ו -2 μl של 5 מ"מ antimycin A (5 מיקרומטר) לתוך תא. נשימת שיא עד tהוא ירידות אות שטף החמצן ומייצב.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
קביעת הריכוז האופטימלי digitonin לסלולאריות Permeabilization: ניסוי טיטרציה digitonin
טיטרציה digitonin מתבצעת על מנת לקבוע את הריכוז האופטימלי עבור permeabilization של תאי HepG2. בניסויים אלה, digitonin הוא טיטרציה בתאים שלמים בנוכחות rotenone, succinate (המיטוכונדריה מורכבים השנייה המצע) וכמות להרוות של ADP (להשרות מורכבים השנייה תלויי מצב 3), ומערכת הנשימה שיעורי נמדדים בתחילת המחקר ולאחר כל טיטרציה (איורים 1 א ו -1 B). התוצאה של הניסוי הזה מראה כי בהעדר digitonin, נשימה תאית היא נמוכה מאוד ונשימה של שלמים, תאים שאינם permeabilized אינו מגורה בנוכחות מצע המיטוכונדריה ADP. עם זאת, על כן בשלבים של digitonin, קרום הפלזמה הסלולר permeabilized ו mitochonנשימת drial (מדינה השנייה תלויה מורכבת 3) מגדילה עד permeabilization מלא כאשר succinate ו ADP להזין את התאים. התוצאות מראות כי permeabilization בריכוז digitonin של 8-12 מיקרומטר הוא אופטימלי לנשימה ADP מגורה של תאים HepG2. עם זאת, שלמות הממברנה החיצונית של המיטוכונדריה יכולה להיפגע אם כמויות עודפות של digitonin מועסקות. כפי שניתן לראות בתרשים 1, כמויות עודפות של digitonin מושרה צמצום מורכב השני תלויה נשימת מדינת 3 המציין שלמות הממברנה חיצונית נפגעת המיטוכונדריה.
בפרוטוקולים בהווה הבאים, כל שיעורי צריכת חמצן מבוטאים 2 IO [pmol x שניות -1 x 10 -6 תאים] (זרימת חמצן למיליון תאים) המחושבים על ידי חלוקת שטף חמצן ספציפי נפח (ב סגור תא חמצן), JV, O 2 [sec x pmol -1 x מ"ל -1] על ידי תא תרכיזי יון בתא תאים (מספר התאים לכל נפח [10 6 תאים x מ"ל -1]) 15.
איור 1: טיטרציה digitonin כדי לקבוע את הריכוז האופטימלי עבור permeabilization של תאים HepG2. הקו הכחול מייצג ריכוז חמצן; הקו האדום מייצג את זרימת החמצן (שיפוע ריכוז חמצן). ריכוז החמצן יורדת עם הזמן, ככל שתאי הגזע משתמשים חמצן זמין. צריכת חמצן מבוטאת pmol / (sec x מספר התאים). (א) העתקים מן respirometry ברזולוציה הגבוהה באמצעות digitonin, ADP ו succinate כמו מצע לנשימה השנייה תלויה מורכבת המיטוכונדריה (1 ניסוי). (ב) שיעורי נשימה מיטוכונדריאלי של 4 ניסויים בודדים מוצגים כאמצעי ± SD.להעלות / 54,985 / 54985fig1large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
הערכת Integrity הממברנה החיצונית מיטוכונדריאלי באמצעות ריכוז אופטימלי digitonin
כדי להעריך את ההשפעה של ריכוז digitonin אופטימלי (8 מיקרומטר) על שלמות קרום המיטוכונדריה חיצונית, תאי permeabilized עם שלמות הממברנה חיצונית digitonin ואת המיטוכונדריה הוא נבדק על ידי מדידת הנשימה המיטוכונדריאלי לאחר התוספת הבאה של succinate (מורכב המיטוכונדריה השני תלוי נח המדינה 2 נשימה בהעדר ADP), ADP (ADP מגורה מורכבת נשימת מדינת 3 II תלוי) ו ציטוכרום C (ADP מגורה מורכב השני תלויה נשימת מדינת 3 בנוכחות ציטוכרום C), ואחריו התוספת של oligomycin (מעכב של ה- ATP synthase) לחקות המדינה 4. כפי שניתן לראות בתרשים 2
איור 2: ציטוכרום C אינו לשפר הנשימה של תאים שטופלו digitonin (8 מיקרומטר). עקבות נציג נשימה למבחן ציטוכרום C באמצעות respirometry ברזולוציה גבוהה. תאים הם permeabilized עם 8 מיקרומטר digitonin ויושרה הממברנה החיצונית של המיטוכונדריה הוא נבדק על ידי מדידת שיעורי הנשימה לאחר תוספת עוקבות של 10 מ"מ succinate (המדינה 2), 2.5 מ"מ ADP (מצב 3) ו -10 מיקרומטר ציטוכרום C (מצב 3 בנוכחות ציטוכרום C), ואחריו תוספת של 2 מיקרוגרם / מ"ל oligomycin לחקות שיעור המדינה 4. הנשימה מבוטא pmol / (sec x million תאים). כת"ש: מורכב שני. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
הערכת Integrity הממברנה החיצונית מיטוכונדריאלי באמצעות ריכוז גבוה של digitonin
על מנת להוכיח כי ריכוז גבוה מאוד של digitonin יכול להתפשר שלמות הממברנה החיצונית של המיטוכונדריה, ביצענו ניסוי שימוש במינון גבוה של digitonin. לצורך ניסוי זה, תאי permeabilized עם 40 מיקרומטר digitonin במקום 8 מיקרומטר, ואת שלמות הממברנה חיצונית של המיטוכונדריה הוא נבדק על ידי מדידת הנשימה המיטוכונדריאלי לאחר התוספת הבאה של succinate (מורכב המיטוכונדריה השני תלוי נח נשימת מדינת 2 בהעדר ADP) , ADP (ADP המגורה שני תלויה מדינה 3 נשימה מורכבת) ו ציטוכרום C (ADP מגורה מורכב II-דמדינת ependent 3 נשימה בנוכחות ציטוכרום C), ואחריו התוספת של oligomycin לחקות מדינה 4 בנוכחות oligomycin (איור 3). התוצאה של הניסוי הזה מראה כי ציטוכרום C משפר הנשימה של תאים שטופלו במינון גבוה של digitonin, מה שמעיד על אובדן של ציטוכרום C מן הקרום החיצוני המיטוכונדריה המציין שלמות הממברנה החיצונית של המיטוכונדריה נפגעת.
איור 3: מינון גבוה של digitonin (40 מיקרומטר) פשרות שלמות הממברנה החיצונית של המיטוכונדריה. העתקים מן ברזולוציה הגבוהה respirometry באמצעות succinate כמו מצע. הקו הכחול מייצג ריכוז חמצן; הקו האדום מייצג את זרימת החמצן (שיפוע ריכוז חמצן). ריכוז החמצן יורדת עם הזמן, ככל שתאי הגזע משתמשים חמצן זמין. צריכת חמצן מבוטאתpmol / (sec x מספר תאים). בנוסף העוקבת של 40 מיקרומטר digitonin, succinate (10 מ"מ), ADP (2.5 מ"מ), ציטוכרום C (10 מיקרומטר) oligomycin (2 מיקרוגרם / מ"ל) מותווה. כת"ש: מורכב שני. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
המקסימאלי ADP מגורת נשימה (מדינה 3) של תאי permeabilized HepG2, באמצעות מצעים אקסוגניים עודפים
אני- Complex, II- ו- IV תלוי נשימה מקסימלי ADP מגורה (מדינה 3) של תאי HepG2 permeabilized (1 x 10 6 תאים / מיליליטר) נמדדת בהצלחה באמצעות מצעים אקסוגניים עודפים (איור 4). לצורך ניסוי זה, תאי permeabilized עם שיעורי צריכת חמצן digitonin ואת המיטוכונדריה נמדדים לאחר התוספת הבאה של מצעים ומעכבים כמתואר מדידה מוצלחת של המקסימאלי ADP מגורה נשימה (מדינה 3) של תאי permeabilized HepG2 אני- Complex, II- ו- IV תלוי נשימה מקסימלי ADP מגורה (מדינה 3) של תאי HepG2 permeabilized (1 x 10 6 תאים / מיליליטר) אינה נמדד בהצלחה באמצעות מצעים אקסוגניים עודפים (איור 5). לצורך ניסוי זה, תאי permeabilized עם שיעורי צריכת חמצן digitonin ואת המיטוכונדריה נמדדים לאחר התוספת הבאה של מצעים ומעכבים כמתואר באיור 5. כפי שניתן לראות בתרשים 5 באיור 4. הסבר אפשרי רמות נשימה מופחתות הוא זיהום של תאי oxygraph עם מעכבי המיטוכונדריה מניסויים קודמים. מעכבי מיטוכונדריאלי כגון antimycin ו rotenone מסיסים אתנול יכול להיצמד לתאי oxygraph פקקים. לכן oxygraph תאי פקקים יש לשטוף בהרחבה לאחר כל ניסוי. נשימה מצמידה ו זוגית של תאים שלמים צריכת החמצן הבסיסית 'HepG2 התאים נמדדת בנוכחות oligomycin (oligomycin רישיות נשימה) ו בנוסף רציפים של FCCP (איור 6). באסהשיעור l הנשימה התאית מייצג צריכת החמצן של התאים HepG2 שלמים בנוכחות מצעים הסלולר אנדוגני יכול לשנות בתגובה לביקוש ATP הסלולר. קצב הנשימה Oligomycin רישיות מייצג לדלוף הנשימה התאית ואת קצב הנשימה oligomycin רגיש המייצגת מחזור ATP הסלולר, והוא מחושב על ידי הפחתת קצב הנשימה רגישות-oligomycin מ קצב הנשימה הבסיסי אנדוגני. חומר הכימי uncoupler FCCP מתווסף ברצף בריכוזים שונים ונשימה זוגית מקסימלי המוקלטים. קצב הנשימה המקסימאלי המיטוכונדריה הזוגית (קיבולת מערכת תחבורת אלקטרון מקסימלי) עבור תנאי הניסוי הזה מתקבל על 0.9-1.2 מיקרומטר FCCP. התוצאות מראות פעילות בי-פאזית FCCP בתאי HepG2 ללא פגע. לכן, עבור כל תנאי ניסוי, FCCP הוא טיטרציה להשיג קצב נשימה זוגי מקסימאלי. יחס השליטה בדרכי הנשימה הזוגי (uRCR) מחושב על ידי חלוקת FCCPקצב נשימה זוגי ידי קצב הנשימה בנוכחות oligomycin. Oligomycin רגיש הנשימה (מחזור ATP) מחושב על ידי הפחתת oligomycin רישיות קצב הנשימה לרבות הנשימה אנדוגני הבזליים. צימוד יעילות המייצג את שיעור צריכת חמצן המיטוכונדריה בשימוש לסנתז ATP מחושב על ידי חלוקת קצב הנשימה רגישה-oligomycin ידי קצב הנשימה הבסיסי. בסוף הניסוי, כדי להשיג קצב נשימה הלא המיטוכונדריה, מעכבי שרשרת העברת אלקטרונים המיטוכונדריה מתווספים וקצב נשימה הלא המיטוכונדריה ינוכה כל התוצאות. לצורך הניסוי שמוצג באיור 6, קצב הנשימה הלא המיטוכונדריה הוא 26 pmol / (sec x מיליון תאים), קצב הנשימה הבסיסי הוא 48 pmol / (sec x מיליון תאים), oligomycin רישיות קצב הנשימה 7 pmol / (sec x מיליון תאים), הנשימה oligomycin רגיש (מחזור ATP) 41 pmol / (sec x מיליון תאים) ו couplinיעיל 0.85 גרם. טבלה 1: רכב חיץ נשימה. 
איור 4: מדידה מוצלחת של נשימת ADP מגורית מקסימלי (מדינה 3) של תאי HepG2 permeabilized. קצב הנשימה מבוטא pmol / (sec x מיליון תאים). תאים הם permeabilized עם 8 מיקרומטר digitonin ושיעורי נשימה במיטוכונדריה נמדד לאחר התוספת הבאה של גלוטמט Malate (מדינה 3, אני מורכב), rotenone לעכב שאני מורכב, succinate (מדינה 3, שנייה מורכב), antimycin א 'עד לעכב מורכבים III ו ascorbate / TMPD ו אזיד הנתרן לעכב IV מורכבים. IV נשימה מורכבת (מדינה 3)מתפרש על ידי הפחתת צריכת החמצן לפני ואחרי תוספת של אזיד הנתרן. CI: אני מורכב, כת"ש: מורכב שני, CIV: IV המורכב. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. 
איור 5: מדידה מוצלחת של נשימת ADP מגורית מקסימלי (מדינה 3) של תאי HepG2 permeabilized. עקבות נציג נשימה של ניסוי מוצלח של אני- המורכב, II- ו- IV מונחות נשימת ADP מגורית מקסימלי (מדינה 3) של תאי HepG2 permeabilized באמצעות respirometry ברזולוציה גבוהה. קצב נשימה מבוטאpmol / (sec x מיליון תאים). תאים הם permeabilized עם 8 מיקרומטר digitonin ושיעורי נשימה במיטוכונדריה נמדד לאחר התוספת הבאה של גלוטמט Malate (מדינה 3, אני מורכב), rotenone לעכב שאני מורכב, succinate (מדינה 3, שנייה מורכב), antimycin א 'עד לעכב מורכבים III ו ascorbate / TMPD ו אזיד הנתרן לעכב IV מורכבים. IV נשימה מורכבת (מדינה 3) מתפרשת על ידי הפחתת צריכת החמצן לפני ואחרי תוספת של אזיד הנתרן. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. 
איור 6: מצמידים ונשימה זוגית של תאים שלמים. עקבות נציג נשימה של צריכת החמצן הבסיסית 'HepG2 התאים נמדדו בנוכחות oligomycin (oligomycin רישיות נשימה) ו בנוסף רציפים של FCCP באמצעות respirometry ברזולוציה גבוהה. לאחר מכן, פעם אות יציבה הוא הגיעה, נשימה נעצרת בתוספת rotenone ו- A antimycin ואת נשימת רקע הנותרת (לא המיטוכונדריה הנשימה) תנוכה כל התוצאות. צריכת חמצן מבוטאת pmol / (sec x מספר התאים). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. נשימת חיץ 13 כִּימִי ריכוז סוכרוז 110 מ"מ EGTA 0.5 מ"מ MgCl 2 3.0 מ"מ KCl 80 מ"מ K-lactobionate 60 מ"מ KH 2 PO 4 10 מ"מ טאורין 20 מ"מ Hepes 20 מ"מ BSA 1.0 גר '/ ל pH 7.1
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מטרת הפרוטוקול הנוכחי הייתה להשתמש respirometry ברזולוציה גבוהה כדי למדוד מתחמי שרשרת הנשימה במיטוכונדריה '(I-IV) מחירי נשימה, קיבולת מערכת תחבורת אלקטרון מקסימלי המיטוכונדריה שלמות הממברנה החיצונית של המיטוכונדריה.
ישנם כמה צעדים קריטיים בתוך הפרוטוקול הנוכחי. ראשית, שיעורי צריכת חמצן הסלולר בדרך כלל הם מנורמלים למספר התאים (pmol / [מספר x שניות של תאים]). לכן, לפני צריכת חמצן הסלולר הניטור, זה קריטי להשתמש מכשיר המאפשר מדידות מדויקות ואמינות של מספר התאים. בפרוטוקול הנוכחי, משקל נגד תא אוטומטי נוצל בעבר (שלב 3.7 של הפרוטוקול והשולחן של חומרים). בשלב שני קריטי, במיוחד בתאי permeabilized, הוא הבחירה של חיץ נשימה שבו permeabilized תאי resuspended (שלב 3.6 של הפרוטוקול). מאז permeabilization הסלולר יכול לגרום לאובדן intracellulaיוני r, זה מאוד חיוני כי מדיום שימוש במהלך permeabilization תואם סביבה תאית. לכן, חיץ נשימה צריך להכיל רכב osmolarity משקף הוא את תאיים הסביבה התאית (טבלת 1) 13. בנוסף, עבור permeabilization הסלולר אופטימלי ויעיל, זה הכרחי כדי לכיל digitonin ריכוז לא רק עבור כל סוג תא אלא גם עבור כל צפיפות התאים, לזהות ריכוז אופטימלי והנמוך ביותר של אותה מכונה. אם ריכוז digitonin הוא נמוך מדי, התאים לא יהיה permeabilized. לעומת זאת, חשיפה של תאי כמויות גדולות של digitonin תזיק הממברנה החיצונית של המיטוכונדריה. לכן, נקודה חשובה נוספת היא לחקור שלמות הממברנה החיצונית של המיטוכונדריה. כדי לא לזלזל קיבולת הסלולר נשימה, הוא גם חיוני כי ניסויי respirometry מבוצעים בטמפרטורה פיזיולוגית (37 ° C). נקודה נוספת שיש לקחת בחשבון היא השימוש להרוות סכומי ADP, בשל ההגבלה דיפוזיה של ADP לעומת חמצן בתאי permeabilized ורמות מצע מספיק כדי להשיג שטף נשימה מקסימאלי. בניסויים מסוימים בתאים permeabilized, זה יכול לקרות בנוסף לזה של מצעים אקסוגניים ADP לא להביא לעלייה ניכרת בקצב הנשימה. זה יכול להיגרם על ידי מספר גורמים. לדוגמה, שימוש בריכוזים גבוהים של digitonin כדי permeabilize התאים עלול לגרום נזק הממברנה החיצונית של המיטוכונדריה. לכן, יש לכיל digitonin כדי לקבוע את הריכוז האופטימלי עבור כל סוג תא וצפיפות. יתר על כן, טוהר digitonin הוא גם מאוד קריטי, זמין מסחרי digitonin יכול להשתנות באופן משמעותי טוהר קבוצות חדשות של digitonin שנרכש יש טיטרציה לקבוע ריכוזים האופטימליים שלהם עבור permeabilization הסלולר. בנוסף, ישנם מספר סוגים של קרום תא הסלולרי נקבובי יוצריםסוכנים בעלי תכונות שונות. לדוגמא, saponin הוא חומר ניקוי מתון יותר מאשר digitonin, ו בהתאם לסוג התא, מגיב permeabilization התא מתאים צריך להיות מסומן.
רוב מעכבי תפקוד המיטוכונדריה בשימוש מבחני respirometry, כגון A antimycin rotenone, נמסים רק אתנול להיצמד לתאי oxygraph פקקים, עיכוב הנשימה התאית. כדי להימנע מבעיה זו, תאי פקקים oxygraph יש לרחוץ באופן נרחב עם אתנול 95% לאחר כל assay. נקודה חשובה נוספת שיש לקחת בחשבון היא כי הן מבחני נשימה תאית שלמי permeabilized, צפיפות תאים, סוג מפגש תרבית תאים עשויים להשפיע על שיעורי נשימה. לדוגמא, עם תאי HepG2, אנחנו בדרך כלל משתמשים צפיפות תאים של 1 עד 2 מיליון תאים לכל תא. שימוש צפיפות תאים נמוך מאוד במהלך respirometry יכול להצמיח אות חלשה מאוד. אנו הבחנו גם כי תרבית תאי confluency עשוי להשפיע על שיעורי הנשימה. עבור EXAmple, כאשר תאי HepG2 גדלים מאוד ומחוברים (יותר מ -100%), הם צורכים הרבה פחות חמצן.
כדי לקבל שטף חמצן יציב לשחזור במהלך ניסויים, נקודה חשובה נוספת שיש לקחת בחשבון היא התחזוקה של respirometry ברזולוציה הגבוהה instrument- כלומר, דיאלוג על בסיס קבוע ממברנות חיישן חמצן polarographic ותיקוני רקע אינסטרומנטלית. בניסויים עם FCCP uncoupler, ייתכן כי תוספת של FCCP לתאים לא לעורר נשימה תאית ושטף מקסימאלי לא מתקבלים, אבל במקום נשימה תאית היא עצורה. עיכוב של צריכת חמצן הסלולר על תוספת של FCCP עשוי להצביע על כך ריכוז FCCP לא היה אופטימלי היה גבוה מדי. בניסויים אלה, עבור כל assay, זה הכרחי כדי לכייל בזהירות ריכוז FCCP להשיג שטף מקסימאלי.
הגבלה של respirometry ברזולוציה גבוהה היא כי הקרנת תפוקה גבוהה, הקמהמנת תגובה עקומה וניסויים כמובן זמן כמויות מוגבלות של דגימות ביולוגיות אינם מתאימים. מבחנים אלה, ניתן להשתמש בכלים אחרים, כגון מנתח השטף התאי. מגבלות אחרות הן i) שההתקן אינו אוטומטית מחייבות נוכחות הרציפה של מפעיל, ii) זה זמן רב, iii) יש רק שני תאים ורק שני מבחנים ניתן להפעיל בכל פעם, iv) תחזוקה של המכשיר , כגון שינוי ממברנות וכיולים, דורש המון זמן v) לתאי אינם לייחד ועלולות להזדהם עם מעכבים. היתרונות של oxygraph ברזולוציה הגבוה על פני מכשירי אלקטרודה חמצן polarographic מסורתיים הם i) רגישות גבוהה יותר, ii) מספרים קטנים של דגימות ביולוגיות נדרשו, iii) מחירי נשימה ניתן למדוד בו זמנית בשני תאים iv) המכשיר צמצם דליפת חמצן. כמה יתרונות של oxygraph ברזולוציה הגבוהה מעל שער מנתח השטף התאי הם i) בעלויות נמוכות יותר שלהמכשיר והחומרים המתכלים ו- II) היתכנות של פרוטוקולים טיטרציה המצע-uncoupler-מעכב.
יישומים עתידיים או כיוונים אחרי מאסטרינג טכניקה זו הם מדידות סימולטני של נשימה תאית, פוטנציאל הממברנה של המיטוכונדריה, H 2 O 2, רמות ATP וסידן באמצעות חיישנים אופטיים באותו התא.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ADP | Sigma | A 4386 | Chemical |
| Antimycin A | Sigma | A 8674 | Chemical, dissolve in ethanol |
| Ascorbate | Merck | 1.00127 | Chemical |
| BSA | Sigma | A 6003 | Chemical |
| FCCP | Sigma | C 2920 | Chemical, dissolve in ethanol |
| Countess automated cell counter | Thermo Fisher Scientific | n/a | Automated cell counting instrument |
| Cytochrome c | Sigma | C 7752 | Chemical |
| Digitonin | Sigma | D 5628 | Chemical, dissolve in DMSO |
| DMEM | Gibco | 31966021 | Medium |
| EGTA | fluka | 3779 | Chemical |
| FBS | Gibco | 26010-074 | Medium component |
| Glutamate | Sigma | G 1626 | Chemical |
| Hepes | Sigma | H 7523 | Chemical |
| KCl | Merck | 1.04936 | Chemical |
| KH2PO4 | Merck | 1.04873 | Chemical |
| K-lactobionate | Sigma | L 2398 | Chemical |
| MgCl2 | Sigma | M 9272 | Chemical |
| O2k-Core: Oxygraph-2k | Oroboros Instruments | 10000-02 | High-resolution respirometry instrument |
| Oligomycin | Sigma | O 4876 | Chemical, dissolve in ethanol |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | Chemical |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | Chemical |
| Rotenone | Sigma | R 8875 | Chemical, dissolve in ethanol |
| Succinate | Sigma | S 2378 | Chemical |
| Taurine | Sigma | T 8691 | Chemical |
| TMPD | Sigma | T 3134 | Chemical |
| Trypsin | Sigma | T 4674 | Chemical |
References
- Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochem J. 435 (2), 297-312 (2011).
- Lanza, I. R., Nair, K. S. Functional assessment of isolated mitochondria in vitro. Methods Enzymol. 457, 349-372 (2009).
- Zhang, J., et al. Measuring energy metabolism in cultured cells, including human pluripotent stem cells and differentiated cells. Nat Protoc. 7 (6), 1068-1085 (2012).
- Gnaiger, E., Steinlechner-Maran, R., Mendez, G., Eberl, T., Margreiter, R. Control of mitochondrial and cellular respiration by oxygen. J Bioenerg Biomembr. 27 (6), 583-596 (1995).
- Wu, M., et al. Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells. Am J Physiol Cell Physiol. 292 (1), C125-C136 (2007).
- Djafarzadeh, S., Vuda, M., Takala, J., Jakob, S. M. Effect of remifentanil on mitochondrial oxygen consumption of cultured human hepatocytes. PLoS One. 7 (9), e45195 (2012).
- Horan, M. P., Pichaud, N., Ballard, J. W. Review: quantifying mitochondrial dysfunction in complex diseases of aging. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 67 (10), 1022-1035 (2012).
- Niklas, J., Melnyk, A., Yuan, Y., Heinzle, E. Selective permeabilization for the high-throughput measurement of compartmented enzyme activities in mammalian cells. Anal Biochem. 416 (2), 218-227 (2011).
- Jeger, V., et al. Dose response of endotoxin on hepatocyte and muscle mitochondrial respiration in vitro. Biomed Res Int. 2015, 353074 (2015).
- Nicholls, P. Cytochrome c binding to enzymes and membranes. Biochim Biophys Acta. 346 (3-4), 261-310 (1974).
- Cortese, J. D., Voglino, A. L., Hackenbrock, C. R. Multiple conformations of physiological membrane-bound cytochrome c. Biochemistry. 37 (18), 6402-6409 (1998).
- Gorbenko, G. P. Structure of cytochrome c complexes with phospholipids as revealed by resonance energy transfer. Biochim Biophys Acta. 1420 (1-2), 1-13 (1999).
- Gnaiger, E., Méndez, G., Hand, S. C. High phosphorylation efficiency and depression of uncoupled respiration in mitochondria under hypoxia. Proc Natl Acad Sci USA. 97, 11080-11085 (2000).
- Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Methods Mol Biol. 810, 25-58 (2012).
- Gnaiger, E. Mitochondrial Pathways and Respiratory Control. An Introduction to OXPHOS Analysis. Mitochondr Physiol Network 17.18. , OROBOROS MiPNet Publications. Innsbruck. 64 (2012).
