Summary
Hoge-resolutie respirometrie wordt gebruikt om mitochondriale zuurstofconsumptie bepalen. Dit is een eenvoudige techniek om mitochondriale ademhalingsketen complexen (I-IV) ademhalingssnelheid, maximale mitochondriale elektronentransport systeemcapaciteit en buitenste mitochondriale membraan integriteit te bepalen.
Introduction
Mitochondriën vervullen een belangrijke rol in de cellulaire energiemetabolisme, vooral door toepassing van zuurstof aan adenosine trifosfaat (ATP) te produceren. Ze zijn betrokken bij celdood en in verschillende humane ziekten. Mitochondriale oxidatieve fosforylering (OXPHOS) combineert elektron transport langs de elektronen transportketen met zuurstofverbruik en ATP synthese. De mitochondriale tricarbonzuur (TCA) cyclus is betrokken bij de omzetting van eiwitten, koolhydraten en vetten in energierijke verbindingen nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) en flavineadeninedinucleotide (FADH 2). Elektronen van NADH en FADH 2 worden vervolgens overgebracht naar de luchtwegen elektronentransportketen eiwitcomplexen (I tot IV) in het binnenste mitochondriale membraan. Bovendien kunnen twee andere redox pathways elektronen overdragen aan elektronen transportketen: i) mitochondriale elektron overbrengende flavoproteïne (ETF) dat zich op het vlak van de matrix binnenste mitochondrial membraan en levert elektronen van vetzuur β-oxidatie; en ii) mitochondriale glycerofosfaatdehydrogenase die glycerofosfaat oxideert tot dihydroxyacetonfosfaat en voedt elektronen de mitochondriale elektronentransportketen. Complex IV (de uiteindelijke elektronenacceptor) kan de elektronen een zuurstofmolecuul omzetten zuurstof twee moleculen water. Verplaatsen van de elektronen van respiratoire elektronentransportketen complex I tot IV wordt gekoppeld proton stroom vanaf de mitochondriale matrix intermembrane de ruimte die een elektrochemische gradiënt over de mitochondriale binnenmembraan vaststelt. Daarna mitochondriale complex V (ATP synthase) shuttles waterstofionen terug in de mitochondriale matrix en synthetiseert ATP moleculen. OXPHOS functie in vivo en in vitro gebruik van verschillende technieken en verschillende mitochondriale respiratie toestanden kunnen worden verkregen worden beoordeeld. In geïsoleerde mitochondria de volgende respiratory toestanden kunnen worden gemeten: i) basaal mitochondriale respiratie (stand 1), ii) zuurstofverbruik na toevoeging van specifieke substraten van de mitochondriale ademhalingsketen complexen (stand 2), iii) maximale mitochondriale zuurstofconsumptie na toevoeging van verzadigende concentraties adenosine difosfaat (ADP) (toestand 3) en, iv) rusten ademhaling na ADP verbruik (omgerekend naar ATP) (staat 4). In intacte cellen kan de volgende luchtwegen toestanden worden gemeten: i) basale cellulaire zuurstofverbruik in aanwezigheid van endogene substraten en ADP, ii) basale cellulaire zuurstofverbruik in aanwezigheid van oligomycin (oligomycin ongevoelige ademhaling) en oligomycine-gevoelige ademhaling (ATP omzet), iii) FCCP ontkoppeld ademhaling, en iv) niet-mitochondriale respiratie na toevoeging van antimycin A en rotenon. In gepermeabiliseerde cellen kunnen specifieke substraten van de elektronentransport keten complexen en ADP toegevoegd en maximale complexe afhankelijke ademhalingssnelheid such zo complex I, II en IV-afhankelijke respiratoire tarieven kunnen worden gemeten.
Metingen van cellulaire ademhaling belangrijke inzichten in mitochondriale ademhalingscapaciteit specifieke complexen I-IV, mitochondriale integriteit en energiemetabolisme 1, 2, 3. Een van de hulpmiddelen die metingen van mitochondriale zuurstofverbruik met een hoge nauwkeurigheid, resolutie en gevoeligheid in staat is de hoge-resolutie oxygraph 4. De hoge resolutie oxygraph apparaat bevat twee kamers met injectiepoorten en elke kamer is voorzien van een polarografische zuurstofsensor. Cellulair of geïsoleerde mitochondriële schorsingen worden continu in de respirometer geroerd. Mitochondriale functie, substraten en remmers beoordelen op mitochondriale complex activiteit worden toegevoegd volgens standaard protocollen. Substraten en remmers kunnen worden getitreerd door injectie into de kamers van de oxygraph en zuurstofverbruik tarieven worden berekend met behulp van software en uitgedrukt als picomol per seconde per aantal cellen. Hoge-resolutie respirometrie biedt verschillende voordelen vergeleken met traditionele en gebruikelijke polarografische zuurstofelektrode inrichtingen waaronder verhoogde gevoeligheid en kunnen werken met kleine hoeveelheden biologische monsters zoals intacte of gepermeabiliseerde cellen. Bovendien, elke inrichting bevat twee kamers en ademfrequentie tegelijk worden opgenomen voor vergelijkingen van zuurstofconcentraties. De hoge-resolutie oxygraph heeft ook het voordeel van verminderde lekkage van zuurstof uit het apparaat kamers in vergelijking met traditionele polarografische zuurstof stroomdraden. Een ander apparaat recent ontwikkelde cellulaire zuurstofverbruik te meten, is de 96-well extracellulaire flux analyzer 5. Het extracellulaire flux analysator voorzien van fluorescentie in plaats van polarografische sensoren. De voordelen van de extracellulaireflux analyzer vergelijking met de hoge-resolutie oxygraph zijn i) het is een grotendeels geautomatiseerd middel, ii) kan zuurstofconsumptie meten 24- en 96-well platen voor high-throughput screening, daarvoor zijn kleinere hoeveelheden biologische monsters, en iii) aanvullende meting van cellulaire glycolytische flux mogelijk. De nadelen van de extracellulaire flux analysator in vergelijking met de hoge-resolutie oxygraph zijn i) de hoge kosten van het apparaat en verbruiksartikelen zoals fluorescerende platen, die niet herbruikbaar zijn en ii) slechts vier verbindingen per assay / putje injecteerbare daarom is het systeem niet haalbaar substraat-ontkoppelaar-inhibitor titratie protocollen.
In de huidige studie, maken we gebruik van een hoge resolutie respirometrie mitochondriale ademhaling te bepalen. Voor cellulaire zuurstofverbruik experimenten worden de cellen permeabel gemaakt om de invoer van exogene ADP en mitochondriale oxideerbare substraten mogelijk maken toevoeren elektronen in complexes van de luchtwegen. Deze aanpak maakt het ontleden van afzonderlijke complexen mitochondriale respiratoire capaciteit, hetgeen een duidelijk voordeel in vergelijking met intacte cellen (vele substraten cel-impermeant). Echter celmembraan permeabilisatie de barrière tussen het cytosol en extracellulaire ruimte en medium (wassen cytosolisch opgeloste stoffen) en de samenstelling van de intracellulaire ruimte is geëquilibreerd met de extracellulaire ruimte verstoren. Een van de nadelen van gepermeabiliseerde cellen over intacte cellen die de mitochondriale buitenste membraan kan beschadigd raken als grote hoeveelheden reinigingsmiddel worden gebruikt tijdens cel permeabilisatie. In intacte cellen, basale, gekoppeld en ontkoppeld ademhaling van intacte cellen kan worden gemeten. Deze methode evalueert zuurstofverbruik van intacte cellen zonder toevoeging van exogene substraten en ADP, reproduceren de ademhalingsfunctie in de geïntegreerde cel en het leveren van gegevens over maximale mitochondriale electron transport capaciteit 6, 7. Een van de voordelen van intacte cellen in gepermeabiliseerde cellen die cellulaire omgeving niet verstoord en mitochondria in contact met de gehele componenten van de cellen. Om de cellulaire plasmamembraan permeabel zijn detergentia, zoals digitonine 8 gebruikt. Echter, mitochondriale buitenste membraan integriteit in het gedrang komen als grote hoeveelheden digitonine worden toegepast. Dat mitochondriale buitenste membraan integriteit niet in gepermeabiliseerde cellen aangetast bevestigen, wordt digitonine titratie uitgevoerd om de optimale concentratie voor mobiele permeabilisatie bepalen. Voor deze experimenten worden cellen opnieuw gesuspendeerd in medium ademhaling en digitonine concentratie wordt getitreerd met respirometrie in aanwezigheid van mitochondriale substraten en ADP en ademhalingssnelheden gemeten. Ademhaling van intacte, niet- gepermeabiliseerde cellen niet gestimuleerd in aanwezigheid van mitochondrial substraten en ADP. Toch zou daaropvolgende stapsgewijze digitonine titratie geleidelijke permeabilisatie van plasmamembranen opbrengst en optimale digitonine concentratie verkregen. Dit blijkt uit de toename van de ademhaling tot volledige permeabilisatie. Mitochondriale kwaliteit en buitenste membraan kunnen worden geverifieerd door het toevoegen van exogeen cytochroom c 2, 9. Cytochroom c is een 12 kDa eiwit elektronen uitvoering van de mitochondriale elektronentransportketen 10, 11, 12. Het is gelokaliseerd in het mitochondriaal intermembrane ruimte, en is betrokken bij zuurstofverbruik, dragende elektronen van complex III complex IV. Zodra de mitochondriale buitenste membraan beschadigd wordt cytochroom c vrijgegeven en mitochondriale zuurstofverbruik wordt verlaagd. Na toevoeging van exogene cytochroom c, geen verhoging in mitochondriale respiratie is indicatief voor eenverstoorde mitochondriale buitenmembraan.
In gepermeabiliseerde cellen, substraten en remmers van mitochondriale complexe activiteit worden toegevoegd na diverse protocollen 3, 9. Bijvoorbeeld om mitochondriale complex aangedreven ademhalingssnelheid onderzoeken, kan het volgende protocol worden gebruikt. Na permeabilisatie van de cellen, wordt eerst complex I gestimuleerd door de substraten malaat en glutamaat, die NADH genereren als substraat om de ademhalingsketen en de activering van complexe I. Daarna ADP toegevoegd voor omzetting in ATP (state 3, actieve provoceren complex I-afhankelijke ademhaling). Nadat een stabiel signaal bereikt wordt rotenon (mitochondriale complex I-remmer) toegediend complexe I. Rotenone volgt succinaat tot FADH 2 remmen en complexe II (state 3, actieve complex II-afhankelijke ademhaling) activeren. Om complexe IV-afhankelijke ademhaling, eerste complex III metenafhankelijke ademhaling wordt geremd door toevoeging antimycin A (mitochondriale complex III inhibitor). Daarna wordt complex IV-afhankelijke ademhaling gestimuleerd door toediening van ascorbaat en tetramethylphenylendiamine (TMPD). TMPD kunnen auto-oxideren in de ademhaling buffer derhalve de maximale complex IV-afhankelijke ademhalingssnelheid (State 3) wordt berekend door ademhaling voor en na de toevoeging van natriumazide, een remmer van mitochondriale complex IV. De ademhaling experimenten uitgevoerd in twee kamers van een oxygraph parallel-één dient als een controle (niet-gestimuleerde cellen), de andere met de gestimuleerde cellen worden uitgevoerd. Uiteraard kunnen de cellen worden voorbehandeld verschillende wijzen, bijvoorbeeld met geneesmiddelen beïnvloeden mitochondriale functies voor hun zuurstofverbruik wordt gemeten in de kamer oxygraph. Dit protocol maakt functionele onderzoek van de individuele mitochondriale ademhalingsketen complexen. Bovendien kan men meten maximale ADP-gestimuleerdeademhaling (toestand 3) van gepermeabiliseerde cellen, middels exogeen vetzuur in de vorm van palmitaat. In dit protocol wordt geconcentreerd voorraden natriumpalmitaat geconjugeerd met ultra vetzuurvrij runderserumalbumine (BSA) (6: 1 molverhouding palmitaat: BSA). Daarna cellen eerst worden gepermeabiliseerd met digitonine en mitochondriale ademhaling wordt bepaald door het toevoegen van carnitine en palmitinezure gevolgd door toevoeging van ADP (state 3, maximale ademhaling). Vervolgens wordt oligomycin toegevoegd aan toestand 4 (state 4o) en respiratoire controle ratio (RCR-waarde) na te bootsen wordt berekend als toestand 3 / staat 4o. β-oxidatie bevordert de productie van acetyl CoA (die gaat in de TCA cyclus) en het genereren van FADH 2 en NADH, waarvan de elektronen aan de elektronentransport keten voorbij elektronen overdracht flavoproteïne en β-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase. Mitochondriën zijn in het centrum van vetzuurmetabolisme en beschreven palmitaat-BSA protocol kan worden gebruikt door onderzoekers onderzoeken fatty zuur oxidatie. In intacte cellen, activatoren en remmers van mitochondriale complexe activiteit worden toegevoegd naar aanleiding van een ander protocol 6, 9. Voor deze experimenten wordt eerst zuurstofverbruik van niet-gepermeabiliseerde cellen in de afwezigheid van exogene substraten gemeten (fosforyleert ademhaling). Vervolgens wordt de niet-fosforylerende ademhalingssnelheid gemeten na toevoeging van oligomycin, dat een remmer van mitochondriale ATP synthase. Daarna wordt de protonophore carbonyl cyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) toegediend in verschillende concentraties en de maximale mitochondriale ontkoppelde ademhalingsfrequentie wordt gemeten. Protonophores zoals FCCP kan een verhoging in proton permeabiliteit van het binnenste membraan te induceren, waardoor passieve beweging van protonen aan de chemiosmotic verloop verdwijnen. Een toename van permeabiliteit proton ontkoppeld oxidatieve respiratie (geen ATP productie) en veroorzaakt een toename oxygen consumptie. Daarna rotenon en antimycin A toegevoegd aan mitochondriale ademhaling remmen en non-mitochondriale ademhaling wordt afgetrokken van alle andere ademhalingssnelheid.
Het zuurstofverbruik kan worden uitgedrukt als IO 2 [pmol x sec -1 x 10 -6 cellen] (zuurstofstroom per miljoen cellen) die wordt berekend door het volume-specifieke zuurstofstroom (in de gesloten zuurstofkamer), JV, o 2 [pmol x sec -1 x ml -1] van cel-concentratie in de cel kamer (aantal cellen per volume [10 6 cellen ∙ ml 1]) 15. Cell-mass specifieke zuurstof flux, JO 2 [pmol x sec -1 x mg -1], is stroom per cel, IO 2 [pmol x sec -1 x 10 -6 cellen], gedeeld door de massa per cel [mg ∙ 10 6 cellen]; of het volume-specifieke flux, JV, O 2 [pmol x sec -1 x ml -1], gedeeld door de massa per volume [mg ∙ ml 1]. JO 2 is de zuurstof flux per cel eiwit, drooggewicht of cell volume.
In de huidige studie met behulp van hoge-resolutie respirometrie beschrijven we protocollen bij i te bepalen) optimum digitonine concentratie voor complete cellulaire plasmamembraan permeabilisatie (digitonine titratie assay), ii) mitochondriale buitenste membraan integriteit met behulp van exogene cytochroom c, iii) mitochondriale ademhalingsketen complexen I , II en IV maximale ademfrequentie in digitonine gepermeabiliseerde HepG2-cellen in de aanwezigheid van exogeen ADP en mitochondriale ademhalingsketen substraten, en iv) basale, gekoppeld en maximaal ontkoppeld ademhaling (maximale elektronentransport capaciteit) van intacte cellen zonder toevoeging van exogene substraten en ADP, reproduceren de ademhalingsfunctie in de geïntegreerde cel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cultuur van de Cel
- Cultuur humane lever HepG2 cellen 6 in 25 cm2 celkweekkolven in gemodificeerd Eagle's medium van Dulbecco (DMEM) dat 10% hitte-geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline-streptomycine bij 37 ° C in een incubator (5% CO 2, 95% lucht) (zaaien dichtheid: 1 x 10 6 cellen per 25 cm 2 celkweek kolf, incubatietijd in de 37 ° C incubator: 48 uur, mobiele dichtheid bij confluentie: 4-5 x 10 6 cellen per 25 cm 2 celkweek kolf).
- Voer de experimenten wanneer cellen 90% tot 95% confluent.
2. Hoge-resolutie respirometrietest kalibratie van Polarografische Zuurstof Sensors
- Pipetteer 2,1 ml van de ademhaling buffer in een oxygraph kamer en roer de buffer continu met een magnetische roerstaaf in de kamer (700 rpm) bij 37 ° C gedurende 1 uur totdat een stabiele zuurstofflux signaalpolarografische de zuurstofsensor wordt verkregen.
LET OP: Polarografische zuurstof elektroden binnen elke oxygraph kamer maatregel zuurstofconcentratie en bereken zuurstofverbruik (flux) in elke kamer. De zuurstofconcentratie en zuurstofverbruik (flux) worden real-time online in een computer met behulp van software voor data-acquisitie en analyse. - Voer een lucht kalibratie van het polarografische zuurstofsensor volgens de protocollen van de fabrikant 14.
LET OP: De kalibratie van polarografische zuurstofsensoren in ademhaling media en zuurstofconcentratie in de media in de lucht verzadiging experimentele temperatuur wordt slechts eenmaal per dag in de ochtend uitgevoerd. Daarna kunnen de media uit de kamers en de cellen opnieuw gesuspendeerd in een frisse ademhaling media worden verwijderd worden toegevoegd aan een oxygraph kamer en luchtwegen tarieven worden gemeten. Na het eerste experiment kan de kamer worden gewassen en reeksen experimenten kunnen worden uitgevoerd in thij dezelfde kamer zonder verdere kalibraties.
3. trypsine van hechtende cellen, Counting Cells
- Op de dag van het experiment, zuig het DMEM van 25 cm 2 celkweek kolf.
- Spoel de monolaag celcultuur in de kolf met 5 ml fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS).
- Pipetteer 0,5 ml van 25 mg / ml trypsine-oplossing (voorverwarmd tot 37 ° C in een 37 ° C waterbad) in de cel monolaag in de kolf en incubeer gedurende 5 minuten bij 37 ° C in een incubator (5% CO2 , 95% lucht).
- Pipetteer 5 ml DMEM dat 10% FBS in de losgemaakte cellen in de celkweek kolf en suspendeer de cellen door pipetteren.
- Overdracht geresuspendeerde cellen om een 15 ml centrifugebuis en centrifugeer 5 min bij 350 xg bij kamertemperatuur en decanteer het supernatant.
- Resuspendeer de celpellet in 1 ml ademhaling buffer 13 (T abel 1).
4. Hoge-resolutie respirometrietest
- Na kalibratie lucht (eenmaal daags uitgevoerd, de stappen 2.1-2.2), zuigen de ademhaling medium van een kamer van het oxygraph en voeg 2,1 ml van de celsuspensie (1 x 10 6 cellen / ml) van stap 3,7 naar de kamer.
- Sluit de oxygraph kamer door het inbrengen van de stop.
- Roer de cellen continu met een magnetische roerstaaf in de kamer (700 rpm) bij 37 ° C en opnemen cellulaire ademhaling gedurende 5-10 minuten totdat een stabiele zuurstofflux signaal wordt bereikt.
LET OP: De zuurstofconcentratie en zuurstof flux signaal worden weergegeven in real-time online in een computer met behulp van software voor data-acquisitie en analyses = "xref"> 14. - Daarna injecteren substraten en remmers voor mitochondriële ademhaling via titanium injectieopeningen van de stoppen met behulp van de volgende protocollen.
5. Digitonine Titratie in intacte cellen door respirometrietest
- Bereid een oxygraph kamer die celsuspensie (1 x 10 6 / ml) volgens de in stappen 4,1-4,3 van het protocol beschreven procedure.
- Injecteer 2 ui 0,2 mM rotenon (0,2 uM) "PAS" in de kamer die oxygraph celsuspensie door titanium injectiepoort van de kamer stop met een injectiespuit en opnemen cellulaire ademhaling gedurende 5-10 minuten totdat een stabiele zuurstofflux signaal wordt bereikt .
Opmerking: Alle injecties in de volgende stappen worden uitgevoerd door het titanium injectieopeningen van stoppers via spuiten. Toevoeging van rotenon facultatief (het voorkomt reverse elektronenstroom) en kan worden weggelaten digitonine titratie experimenten, ziestap 6.3. - Injecteer 20 pi 1 M succinaat (10 mM) in de kamer en oxygraph opnemen cellulaire ademhaling gedurende 5-10 minuten totdat een stabiele zuurstofflux signaal wordt bereikt.
- Injecteer 10 pi 0,5 M ADP (2,5 mM) in de kamer en oxygraph opnemen cellulaire ademhaling gedurende 5-10 minuten totdat een stabiele zuurstofflux signaal wordt bereikt.
- Injecteer 2 pl 2 mM digitonine (2 uM) in de kamer en oxygraph opnemen cellulaire ademhaling voor 2-5 minuten totdat een stabiele zuurstof-signaal wordt verkregen.
- Met injecteren 2 pl 2 mM digitonine in de kamer en oxygraph opnemen cellulaire ademhaling voor 2-5 minuten totdat een stabiele zuurstof-signaal wordt verkregen.
OPMERKING: Stapsgewijze toevoeging van digitonine aan de cellen tot een toename in cellulaire zuurstofverbruik en de zuurstofstroom signaal toeneemt induceren. - Doorgaan injecteren van 2-4 pl van 2 mM digitonine stapsgewijs (2-4 uM elke stap) in de kamer. Na elke stap opnemen cellulaire ademhaling voor 2-5 mtotdat een stabiele zuurstofflux signaal wordt bereikt.
OPMERKING: Stop met het injecteren van digitonine wanneer de zuurstof flux signaal een maximaal niveau bereikt en de verdere injecties met digitonine niet verhoging van de ademhaling. De lezer moet digitonine optimale concentratie kan worden bepaald in de laboratoria die eigen reagentia en het gebruik verkregen digitonine optimale concentratie in de stappen 6.2 en 7.2 van de volgende protocollen voor hun experimenten.
6. Evaluatie van de mitochondriale Outer Membrane Integriteit: cytochroom c
- Bereid een oxygraph kamer die celsuspensie (1 x 10 6 / ml) volgens de in stappen 4,1-4,3 van het protocol beschreven procedure.
- Injecteer 2 pl 8 mM digitonine (8 uM) in de oxygraph cupje met de celsuspensie (1 x 10 6 / ml) en permeabilize de cellen gedurende 5 min.
- Injecteer 20 pi 1 M succinaat (10 mM) in de kamer en oxygraph opnemen cellulaire respiration gedurende 5-10 minuten totdat een stabiele zuurstofflux signaal wordt bereikt.
- Injecteer 10 pi 0,5 M ADP (2,5 mM) in de kamer en oxygraph opnemen cellulaire ademhaling gedurende 5-10 minuten totdat een stabiele zuurstofflux signaal wordt bereikt.
OPMERKING: Toevoeging van ADP aan de cellen complex I stimuleren en veroorzaken een toename van het zuurstofverbruik en zuurstofstroom signaal zal toenemen en te stabiliseren. - Injecteer 5 ul van 4 mM cytochroom c (10 uM) in de kamer en oxygraph opnemen cellulaire ademhaling gedurende 5-10 minuten totdat een stabiele zuurstofflux signaal wordt bereikt.
- Tenslotte Injecteer 1 ul van 4 mg / ml oligomycin (2 ug / ml) en cellulaire ademhaling opnemen totdat een stabiele zuurstofflux signaal wordt bereikt.
7. Maximale ADP-gestimuleerde Ademhaling (State 3) van permeabel HepG2 cellen
- Bereid een oxygraph kamer die celsuspensie (1 x 10 6 / ml) volgens de in stappen 4,1-4,3 van het protocol beschreven procedure.
- Injecteer 2 pl 8 mM digitonine (8 uM) in de oxygraph cupje met de celsuspensie en permeabilize de cellen gedurende 5 min.
- Injecteer 12,5 gl 0,8 M van malaat (5 mM) en 10 ui 2 M glutamaat (10 mM) in de oxygraph kamer. Neem cellulaire ademhaling totdat een stabiele zuurstofflux signaal wordt bereikt.
- Injecteer 10 pi 0,5 M ADP (2,5 mM) in de kamer en oxygraph cellulaire ademhaling opnemen tot zuurstofstroom signaal toeneemt en stabiliseert.
OPMERKING: Toevoeging van ADP aan de cellen tot een toename van het zuurstofverbruik en de zuurstofstroom signaal toeneemt induceren. - Injecteer 2 pl 0,2 mM rotenon (0,2 uM) 'LET OP' in de oxygraph kamer en cellulaire ademhaling opnemen totdat de zuurstof flux signaal af en stabiliseert.
- Daarna injecteer 20 gl 1 M succinaat (10 mM) in de kamer en oxygraph cellulaire ademhaling opnemen tot zuurstofstroom signaal toeneemten stabiliseert.
- Vervolgens injecteren 2 pl van 5 mM antimycin A (5 uM) 'LET OP' in de oxygraph kamer en cellulaire ademhaling opnemen totdat de zuurstof flux signaal af en stabiliseert.
- Injecteer dan 2,5 ui 0,8 mM ascorbaat (1 mM) en direct na injecteer 2,5 ul 0,2 mM TMPD (0,25 mM) in de kamer en oxygraph cellulaire ademhaling opnemen tot zuurstofstroom signaal toeneemt en stabiliseert.
- Tenslotte Injecteer 10 pi van 1 M natrium azide (5 mM) PAS "in de oxygraph kamer en cellulaire ademhaling opnemen tot zuurstofstroom signaal af en stabiliseert.
8. Oxygen Consumptie van intacte cellen
- Bereid een oxygraph kamer die celsuspensie (1 x 10 6 / ml) volgens de in stappen 4,1-4,3 van het protocol beschreven procedure.
- Injecteer 1 gl 4 mg / ml oligomycin (2 ug / ml) in de oxygraph kamer die een celsuspensied opnemen cellulaire ademhaling tot een stabiele zuurstof flux signaal wordt bereikt.
- Daarna injecteren 1 pi van 0,2 mM van FCCP (0,1 uM) 'LET OP' in de oxygraph kamer en cellulaire ademhaling opnemen totdat de zuurstof flux signaal toeneemt en stabiliseert.
- Injecteer 3 ul van 0,2 mM van FCCP (0,4 uM) in de oxygraph kamer en cellulaire ademhaling opnemen totdat de zuurstof flux signaal verder toeneemt en stabiliseert.
- Titreer FCCP in 0,1 tot 0,3 uM stappen inspuiten 1-3 pl 0,2-1 mM FCCP (0,1 tot 2 uM eindconcentratie in de kamer) in de kamer totdat het oxygraph zuurstofstroom signaal zijn maximale niveaus niet verder toeneemt en bereikt vervolgens begint af.
OPMERKING: Stop met het injecteren van FCCP wanneer de zuurstof signaal een maximale niveau bereikt en begint te dalen. - Vervolgens injecteert 2 ui 0,2 mM rotenon (0,2 pM) en 2 gl 5 mM antimycin A (5 uM) in de kamer. Record ademhaling tot tHij zuurstofstroom signaal af en stabiliseert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bepaling van Optimum Digitonine Concentratie voor Cellular Permeabilisatie: Digitonine titratie Experiment
Digitonine titratie uitgevoerd om de optimale concentratie voor permeabilisatie van HepG2-cellen te bepalen. Voor deze experimenten wordt digitonine getitreerd in intacte cellen in aanwezigheid van rotenon, succinaat (mitochondriale complex II substraat) en een verzadigende hoeveelheid ADP (induceren complex II-afhankelijke state 3) en ademfrequentie worden bepaald bij aanvang en na elke titratie (figuren 1A en 1B). Het resultaat van deze proef blijkt dat bij afwezigheid van digitonine, cellulaire ademhaling is zeer laag en ademhaling van intacte, niet- gepermeabiliseerde cellen niet gestimuleerd in de aanwezigheid van mitochondriale substraat en ADP. Echter, bij stapsgewijze toevoeging van digitonine, de cellulaire plasmamembraan permeabel en mitochondrial ademhaling (complex II-afhankelijke toestand 3) stijgt tot volledige permeabilisatie wanneer succinaat en ADP voer de cellen. De resultaten tonen aan dat permeabilisatie in een digitonine concentratie van 8-12 pM optimaal is voor ADP-gestimuleerde respiratie van HepG2-cellen. Echter, mitochondriale buitenste membraan integriteit in het gedrang komen als grote hoeveelheden digitonine worden toegepast. Zoals getoond in figuur 1, te grote hoeveelheden digitonine veroorzaakte een vermindering complex II-afhankelijke state 3 ademhaling aangeeft gecompromitteerd mitochondriale buitenste membraan integriteit.
In deze en volgende protocollen worden alle zuurstofverbruik het uitgedrukt IO 2 [pmol x sec -1 x 10 -6 cellen] (zuurstofstroom per miljoen cellen) die wordt berekend door het volume-specifieke zuurstofstroom (in de gesloten zuurstofkamer), JV, O 2 [pmol x sec -1 x ml -1] door cell concentrat ion in de celkamer (aantal cellen per volume [10 x 6 cellen ml-1]) 15.
Figuur 1: Digitonine titratie tot de optimale concentratie voor permeabilisatie van HepG2-cellen te bepalen. De blauwe lijn geeft de zuurstofconcentratie; de rode lijn geeft de zuurstoftoevoer (helling van de zuurstofconcentratie). De zuurstof concentratie neemt af in de tijd als de cellen van de beschikbare zuurstof te gebruiken. Zuurstofverbruik wordt uitgedrukt als pmol / (sec x aantal cellen). (A) Tracings van de hoge-resolutie respirometrie behulp digitonine, ADP en succinaat als substraat voor mitochondriële complex II-afhankelijke ademhaling (1 experiment). (B) Mitochondrial ademhaling tarieven van 4 afzonderlijke experimenten gepresenteerd als gemiddelden ± SD.uploaden / 54985 / 54985fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Evaluatie van de mitochondriale uitwendig membraan integriteit Met een optimale concentratie Digitonine
Om het effect van optimale digitonine concentratie (8 uM) op de buitenste mitochondriale membraan integriteit te evalueren worden de cellen gepermeabiliseerd met digitonine en mitochondriale buitenste membraan integriteit getest door meting van mitochondriale respiratie na daaropvolgende toevoeging van succinaat (mitochondriale complex II-afhankelijke rusttoestand 2 ademhaling in afwezigheid van ADP) ADP (ADP gestimuleerd complex II-afhankelijke state 3 ademhaling) en cytochroom c (ADP gestimuleerd complex II-afhankelijke state 3 ademhaling in aanwezigheid van cytochroom c), gevolgd door de toevoeging van oligomycin (een remmer ATP synthase) naar toestand 4. bootsen Zoals getoond in figuur 2
Figuur 2: Cytochroom c is niet bevorderlijk voor de ademhaling van de cellen behandeld met digitonine (8 uM). Vertegenwoordiger van de luchtwegen sporen voor het cytochroom c-test met behulp van hoge-resolutie respirometrie. De cellen worden gepermeabiliseerd met 8 pM digitonine en mitochondriale buitenste membraan integriteit getest door meting van ademfrequentie na daaropvolgende toevoeging van 10 mM succinaat (stand 2), 2,5 mM ADP (state 3) en 10 uM cytochroom c (toestand 3 in aanwezigheid cytochroom c), gevolgd door de toevoeging van 2 ug / ml oligomycin naar toestand 4. de ademhalingsfrequentie bootsen wordt uitgedrukt als pmol / (sec x million cellen). CII: complex II. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Evaluatie van de mitochondriale uitwendig membraan integriteit Met een hoge concentratie Digitonine
Aantonen dat een zeer hoge concentratie digitonine mitochondriale buitenmembraan in gevaar kunnen brengen, voerden we een experiment met een hoge dosis digitonine. Voor dit experiment worden de cellen gepermeabiliseerd met 40 pM digitonine plaats van 8 uM en mitochondriale buitenste membraan integriteit getest door meting van mitochondriale respiratie na daaropvolgende toevoeging van succinaat (mitochondriale complex II-afhankelijke rusttoestand 2 ademhaling in afwezigheid van ADP) ADP (ADP gestimuleerd complex II-afhankelijke toestand 3 ademhaling) en cytochroom c (ADP gestimuleerd complex II-dependent state 3 ademhaling in aanwezigheid van cytochroom c), gevolgd door de toevoeging van oligomycin naar toestand 4 bootsen in aanwezigheid van oligomycin (figuur 3). Het resultaat van dit experiment blijkt dat cytochroom c verbetert ademhaling van de cellen behandeld met een hoge dosis digitonine, hetgeen een verlies van cytochroom c van het mitochondriale buitenmembraan aangeeft gecompromitteerd mitochondriale buitenste membraan integriteit.
Figuur 3: Hoge dosis digitonine (40 uM) compromissen mitochondriale buitenste membraan integriteit. Traces van de hoge-resolutie respirometrie behulp succinaat als substraat. De blauwe lijn geeft de zuurstofconcentratie; de rode lijn geeft de zuurstoftoevoer (helling van de zuurstofconcentratie). De zuurstof concentratie neemt af in de tijd als de cellen van de beschikbare zuurstof te gebruiken. Zuurstofverbruik wordt uitgedruktpmol / (sec x aantal cellen). Daaropvolgende toevoeging van 40 uM digitonine, succinaat (10 mM), ADP (2,5 mM), cytochroom c (10 uM) en oligomycin (2 ug / ml) aangegeven. CII: complex II. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Maximale ADP-gestimuleerde Ademhaling (State 3) van gepermeabiliseerde HepG2 cellen, met behulp van Excess Exogene Substrates
Complex I-, II- en is IV-afhankelijke maximale ADP-gestimuleerde respiratie (toestand 3) van gepermeabiliseerde HepG2-cellen (1 x 10 6 cellen / ml) gemeten met succes overmaat exogene substraten (figuur 4). Voor dit experiment worden de cellen gepermeabiliseerd met digitonine en mitochondriale zuurstofverbruik gemeten na de daaropvolgende toevoeging van substraten en inhibitoren als beschreven in Mislukte Meting van Maximal ADP-gestimuleerde Ademhaling (State 3) van permeabel HepG2 cellen Complex I-, II- en IV-afhankelijke maximale ADP-gestimuleerde respiratie (toestand 3) van gepermeabiliseerde HepG2-cellen (1 x 10 6 cellen / ml) niet succesvol gemeten met overmaat exogene substraten (figuur 5). Voor dit experiment worden de cellen gepermeabiliseerd met digitonine en mitochondriale zuurstofverbruik gemeten na de daaropvolgende toevoeging van substraten en remmers zoals beschreven in figuur 5. Zoals getoond in figuur 5 figuur 4. Een mogelijke verklaring voor de verlaagde respiratoire niveau van besmetting van oxygraph kamers met mitochondriale remmers van eerdere experimenten. Mitochondriale remmers zoals antimycin en rotenon zijn oplosbaar in ethanol en kan vasthouden aan de oxygraph kamers en stoppers. Daarom oxygraph kamers en stoppers moeten uitvoerig na elk experiment worden gewassen. Aan- en afgekoppeld ademhaling van intacte cellen Basale zuurstofverbruik HepG2 cellen wordt gemeten in aanwezigheid van oligomycin (oligomycin ongevoelige ademhaling) en sequentiële toevoeging van FCCP (figuur 6). Basal cellulaire ademhaling zuurstof consumptie van intacte HepG2-cellen in de aanwezigheid van endogene cellulaire substraten en kan veranderen als reactie op cellulaire ATP vraag. Oligomycin-ongevoelige ademhaling vertegenwoordigt lekken cellulaire ademhaling en oligomycin-gevoelige ademhaling die cellulaire ATP omzet vertegenwoordigt en wordt berekend door de oligomycin-ongevoelige ademfrequentie van basale endogene ademhaling. De chemische ontkoppelaar FCCP wordt achtereenvolgens in verschillende concentraties en maximaal ontkoppeld ademhaling opgenomen. De maximale mitochondriale ontkoppelde ademhalingsfrequentie (maximale elektronen transport capaciteit van het systeem) voor dit experimentele conditie wordt verkregen bij 0,9-1,2 uM FCCP. De resultaten tonen een bifasisch activiteit van FCCP in intacte cellen HepG2. Daarom is voor elke experimentele conditie, FCCP getitreerd tot maximaal ontkoppeld ademhaling te verkrijgen. De ontkoppelde respiratoire controle ratio (uRCR) wordt berekend door de FCCPontkoppeld ademhaling door de ademhaling in de aanwezigheid van oligomycin. Oligomycin-gevoelige ademhaling (omzet ATP) wordt berekend door oligomycin-ongevoelige ademfrequentie van basale endogene ademhaling. Koppelingsefficiëntie waarvan het aandeel mitochondriale zuurstofconsumptie gebruikt om ATP te synthetiseren vertegenwoordigt wordt berekend door de oligomycin-gevoelige ademhalingssnelheid de basale ademhalingssnelheid. Na afloop van het experiment, niet-mitochondriale ademhaling verkrijgen worden mitochondriale elektronentransportketen inhibitoren toegevoegd en non-mitochondriale ademhaling wordt afgetrokken van alle resultaten. Voor de in figuur 6 experiment, de niet-mitochondriale respiratie bedraagt 26 pmol / (sec x miljoen cellen), de basale ademhalingsfrequentie is 48 pmol / (sec x miljoen cellen), oligomycin ongevoelige ademhalingssnelheid 7 pmol / (sec x miljoen cellen), oligomycin-gevoelige ademhaling (ATP omzet) 41 pmol / (sec x miljoen cellen) en coupling efficiency 0,85. Tabel 1: Samenstelling van de ademhaling buffer. 
Figuur 4: Succesvolle meting van de maximale ADP-gestimuleerde ademhaling (toestand 3) van gepermeabiliseerde HepG2 cellen. Ademfrequentie wordt uitgedrukt als pmol / (sec x miljoen cellen). Cellen worden gepermeabiliseerd met 8 urn digitonine en mitochondriale respiratoire tarieven zijn gemeten na de daarop volgende toevoeging van glutamaat en malaat (toestand 3, complex I), rotenon te complex I, succinaat (toestand 3, complex II) remmen, antimycin Een complexe III remmen en ascorbaat / TMPD en natriumazide complexe IV remmen. Complex IV ademhaling (State 3)geïnterpreteerd door het aftrekken van het zuurstofverbruik voor en na toevoeging van natriumazide. CI: complex I, CII: complex II, CIV: complex IV. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. 
Figuur 5: Mislukte meting van de maximale ADP-gestimuleerde ademhaling (toestand 3) van gepermeabiliseerde HepG2 cellen. Vertegenwoordiger van de luchtwegen sporen van een mislukte experiment van complex I, II en IV-driven maximale ADP-gestimuleerde ademhaling (toestand 3) van gepermeabiliseerde HepG2-cellen met behulp van hoge-resolutie respirometrie. Ademfrequentie wordt uitgedrukt alspmol / (sec x miljoen cellen). Cellen worden gepermeabiliseerd met 8 urn digitonine en mitochondriale respiratoire tarieven zijn gemeten na de daarop volgende toevoeging van glutamaat en malaat (toestand 3, complex I), rotenon te complex I, succinaat (toestand 3, complex II) remmen, antimycin Een complexe III remmen en ascorbaat / TMPD en natriumazide complexe IV remmen. Complex IV ademhaling (State 3) wordt geïnterpreteerd door het aftrekken van het zuurstofverbruik voor en na toevoeging van natriumazide. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. 
Figuur 6: Coupled en ontkoppelde ademhaling van intacte cellen. Representatieve respiratoire sporen basale zuurstofverbruik HepG2 cellen gemeten in aanwezigheid van oligomycin (oligomycin ongevoelige ademhaling) en sequentiële toevoeging van FCCP behulp van hoge-resolutie respirometrie. Daarna, nadat een stabiele signaal gevonden ademhaling wordt geremd door toevoeging van rotenon en antimycin A en de resterende achtergrond ademhaling (non-mitochondriale ademhaling) wordt afgetrokken van alle resultaten. Zuurstofverbruik wordt uitgedrukt als pmol / (sec x aantal cellen). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Ademhaling buffer 13 Chemisch Concentratie sucrose 110 mm EGTA 0,5 mM MgCl2 3,0 mM KCl 80 mM K-lactobionaat 60 mM KH 2 PO 4 10 mM taurine 20 mM Hepes 20 mM BSA 1,0 g / l pH 7.1
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het doel van de onderhavige protocol was een hoge resolutie respirometrie om mitochondriale ademhalingsketen complexen (I-IV) ademhalingssnelheid, maximale mitochondriale elektronentransport systeemcapaciteit en buitenste mitochondriale membraan integriteit te meten.
Er zijn een aantal kritische stappen in het huidige protocol. Eerst worden cellen zuurstofverbruik meestal genormaliseerd naar het aantal cellen (pmol / [sec x aantal cellen]). Daarom voordat bewaken cellulaire zuurstofconsumptie, is het essentieel om een apparaat dat nauwkeurige en betrouwbare metingen van het aantal cellen systeem te combineren. In het huidige protocol een geautomatiseerde celgetalmeter is gebruikt (stap 3.7 van het protocol en de tabel van materialen). Een tweede kritische stap, vooral in gepermeabiliseerde cellen, is de keuze van de ademhaling buffer waarin gepermeabiliseerde cellen worden geresuspendeerd (3,6 stap van het protocol). Sinds cellulaire permeabilisatie verlies van intracellula kan inducerenr ionen, is het zeer belangrijk dat het medium tijdens permeabilisatie Geschikt intracellulaire omgeving. Derhalve ademhaling buffer en een osmolariteit samenstelling die zowel de intracellulaire en de extracellulaire omgeving (Tabel 1) weerspiegelt 13 bevatten. Bovendien, voor een optimale en efficiënte cellulaire permeabilisatie, is het cruciaal om titreren digitonine concentratie niet alleen voor elk celtype maar ook voor elke celdichtheid, zijn optimale en de laagste effectieve concentratie te identificeren. Als digitonine concentratie te laag is, zullen de cellen niet permeabel. Daarentegen zal de blootstelling van de cellen aan grote hoeveelheden digitonine de mitochondriale buitenste membraan beschadigen. Daarom is een ander belangrijk punt is het mitochondriale buitenste membraan integriteit onderzocht. Om cellulaire ademhalingscapaciteit niet te onderschatten, is het ook belangrijk dat respirometry experimenten worden uitgevoerd bij een fysiologische temperatuur (37 ° C). Een ander belangrijk punt van overweging is het gebruik van verzadigende hoeveelheden ADP, door de diffusielimitatieen van ADP ten opzichte van zuurstof in gepermeabiliseerde cellen en substraat voldoende niveaus om maximale respiratoire flux te verkrijgen. In sommige experimenten in gepermeabiliseerde cellen, kan het dat de toevoeging van exogene substraten gebeuren en ADP niet leidt tot een aanzienlijke verhoging van de snelheid van de ademhaling. Dit kan worden veroorzaakt door verschillende factoren. Zo kan het gebruik van hoge concentraties digitonine om de cellen te permeabiliseren de mitochondriale buitenste membraan beschadigen. Daarom moet men titreren digitonine de optimale concentratie voor elk celtype en dichtheid te bepalen. Verder zuiverheid van digitonine is eveneens erg kritisch, en commercieel verkrijgbare digitonine kan aanzienlijk variëren in zuiverheid en nieuwe batches van aangekochte digitonine moeten worden getitreerd om de optimale concentratie te bepalen voor mobiele permeabilisatie. Daarnaast zijn er verschillende soorten cellulaire plasmamembraan porie-vormendeagenten met verschillende eigenschappen. Bijvoorbeeld saponine een mildere detergens digitonine dan, afhankelijk van het celtype, moet een passende cel permeabilisatie reagens geselecteerd.
De meeste remmers van de mitochondriale functie gebruikt in respirometrie assays, zoals rotenon antimycin A, zijn oplosbaar alleen in ethanol en vasthouden aan de oxygraph kamers en stoppers, het remmen van cellulaire ademhaling. Om dit probleem te voorkomen, oxygraph kamers en stoppers moeten worden uitgebreid met 95% ethanol na elke test gewassen. Een ander belangrijk punt van overweging is dat voor beide intacte en gepermeabiliseerd cellulaire ademhaling assays, celdichtheid, type en celcultuur samenloop van invloed kunnen zijn luchtwegen tarieven. Bijvoorbeeld, met HepG2 cellen, gebruiken we meestal een celdichtheid van 1 à 2 miljoen cellen per kamer. Met behulp van een zeer lage celdichtheid tijdens respirometrie kan aanleiding geven tot een zeer zwak signaal af te geven. We hebben ook geconstateerd dat celcultuur confluentie de luchtwegen tarieven kunnen beïnvloeden. voor EXAmple, wanneer HepG2 cellen worden gekweekt zeer confluente (meer dan 100%), ze verbruiken veel minder zuurstof.
Om een stabiele en reproduceerbare zuurstof flux tijdens de experimenten te verkrijgen, een ander belangrijk punt van overweging is de handhaving van de hoge-resolutie respirometrie instrument- dwz regelmatige uitwisseling van polarografische zuurstof sensor membranen en instrumentele achtergrond correcties. Voor experimenten met de ontkoppelaar FCCP, kan dat toevoeging van FCCP om de cellen niet stimuleert cellulaire ademhaling en maximale flux wordt verkregen, maar cellulaire ademhaling geremd worden. Remming van cellulaire zuurstofverbruik na toevoeging van FCCP kunnen erop wijzen dat FCCP concentratie niet optimaal en te hoog. Voor deze experimenten voor elke test, is het noodzakelijk om nauwkeurig titreren FCCP concentratie maximale flux te verkrijgen.
Een beperking van hoge-resolutie respirometrie is dat high-throughput screening, oprichting vandosis-respons curven en tijdsverloop experimenten voor beperkte hoeveelheden biologische monsters niet haalbaar. Voor deze testen kan men andere instrumenten, zoals de extracellulaire flux analyse gebruiken. Andere beperkingen zijn i) het apparaat niet geautomatiseerd en vereist de continue aanwezigheid van een operator, ii) het is tijdrovend, iii) het heeft slechts twee kamers en twee assays kunnen worden uitgevoerd tegelijk, iv) het behoud van het instrument , zoals het veranderen van de membranen en kalibraties, vergt veel tijd en v) de kamers zijn niet voor eenmalig gebruik en kunnen verontreinigd met remmers worden. De voordelen van de hoge resolutie oxygraph boven traditionele polarografische zuurstofelektrode inrichtingen i) hogere gevoeligheid, ii) een kleiner aantal biologische monsters vereist, iii) ademfrequentie gelijktijdig worden gemeten in twee kamers en iv) het apparaat zuurstoflek verminderd. Enkele voordelen van de hoge-resolutie oxygraph over de extracellulaire flux analyser zijn i) lagere kosten van deapparaat en verbruiksartikelen en ii) de haalbaarheid van substraat-ontkoppelrail-remmer titratie protocollen.
Toekomstige toepassingen of aanwijzingen na het beheersen van deze techniek zijn gelijktijdige metingen van cellulaire ademhaling, mitochondriale membraanpotentiaal, H 2 O 2, ATP en calcium niveaus met behulp van optische sensoren in dezelfde kamer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ADP | Sigma | A 4386 | Chemical |
| Antimycin A | Sigma | A 8674 | Chemical, dissolve in ethanol |
| Ascorbate | Merck | 1.00127 | Chemical |
| BSA | Sigma | A 6003 | Chemical |
| FCCP | Sigma | C 2920 | Chemical, dissolve in ethanol |
| Countess automated cell counter | Thermo Fisher Scientific | n/a | Automated cell counting instrument |
| Cytochrome c | Sigma | C 7752 | Chemical |
| Digitonin | Sigma | D 5628 | Chemical, dissolve in DMSO |
| DMEM | Gibco | 31966021 | Medium |
| EGTA | fluka | 3779 | Chemical |
| FBS | Gibco | 26010-074 | Medium component |
| Glutamate | Sigma | G 1626 | Chemical |
| Hepes | Sigma | H 7523 | Chemical |
| KCl | Merck | 1.04936 | Chemical |
| KH2PO4 | Merck | 1.04873 | Chemical |
| K-lactobionate | Sigma | L 2398 | Chemical |
| MgCl2 | Sigma | M 9272 | Chemical |
| O2k-Core: Oxygraph-2k | Oroboros Instruments | 10000-02 | High-resolution respirometry instrument |
| Oligomycin | Sigma | O 4876 | Chemical, dissolve in ethanol |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | Chemical |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | Chemical |
| Rotenone | Sigma | R 8875 | Chemical, dissolve in ethanol |
| Succinate | Sigma | S 2378 | Chemical |
| Taurine | Sigma | T 8691 | Chemical |
| TMPD | Sigma | T 3134 | Chemical |
| Trypsin | Sigma | T 4674 | Chemical |
References
- Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochem J. 435 (2), 297-312 (2011).
- Lanza, I. R., Nair, K. S. Functional assessment of isolated mitochondria in vitro. Methods Enzymol. 457, 349-372 (2009).
- Zhang, J., et al. Measuring energy metabolism in cultured cells, including human pluripotent stem cells and differentiated cells. Nat Protoc. 7 (6), 1068-1085 (2012).
- Gnaiger, E., Steinlechner-Maran, R., Mendez, G., Eberl, T., Margreiter, R. Control of mitochondrial and cellular respiration by oxygen. J Bioenerg Biomembr. 27 (6), 583-596 (1995).
- Wu, M., et al. Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells. Am J Physiol Cell Physiol. 292 (1), C125-C136 (2007).
- Djafarzadeh, S., Vuda, M., Takala, J., Jakob, S. M. Effect of remifentanil on mitochondrial oxygen consumption of cultured human hepatocytes. PLoS One. 7 (9), e45195 (2012).
- Horan, M. P., Pichaud, N., Ballard, J. W. Review: quantifying mitochondrial dysfunction in complex diseases of aging. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 67 (10), 1022-1035 (2012).
- Niklas, J., Melnyk, A., Yuan, Y., Heinzle, E. Selective permeabilization for the high-throughput measurement of compartmented enzyme activities in mammalian cells. Anal Biochem. 416 (2), 218-227 (2011).
- Jeger, V., et al. Dose response of endotoxin on hepatocyte and muscle mitochondrial respiration in vitro. Biomed Res Int. 2015, 353074 (2015).
- Nicholls, P. Cytochrome c binding to enzymes and membranes. Biochim Biophys Acta. 346 (3-4), 261-310 (1974).
- Cortese, J. D., Voglino, A. L., Hackenbrock, C. R. Multiple conformations of physiological membrane-bound cytochrome c. Biochemistry. 37 (18), 6402-6409 (1998).
- Gorbenko, G. P. Structure of cytochrome c complexes with phospholipids as revealed by resonance energy transfer. Biochim Biophys Acta. 1420 (1-2), 1-13 (1999).
- Gnaiger, E., Méndez, G., Hand, S. C. High phosphorylation efficiency and depression of uncoupled respiration in mitochondria under hypoxia. Proc Natl Acad Sci USA. 97, 11080-11085 (2000).
- Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Methods Mol Biol. 810, 25-58 (2012).
- Gnaiger, E. Mitochondrial Pathways and Respiratory Control. An Introduction to OXPHOS Analysis. Mitochondr Physiol Network 17.18. , OROBOROS MiPNet Publications. Innsbruck. 64 (2012).
