Abstract
Gene eine wichtige Rolle bei der Entwicklung haben häufig räumlich und / oder zeitlich beschränkten Expressionsmuster. Oft werden diese Gentranskripten werden nicht erkannt oder nicht als differentiell exprimierte (DE) in transkriptomischen Analysen von ganzen Pflanzenorgane identifiziert. Laser Mikrodissektion RNA-Seq (LM RNA-Seq) ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um Gene zu identifizieren, die DE sind in spezifischen Entwicklungsdomänen. Die Auswahl der zellulären Domänen jedoch auf microdissect und zu vergleichen, und die Genauigkeit der Mikrodissektionen sind entscheidend für den Erfolg der Experimente. Hier sind zwei Beispiele zeigen Design-Überlegungen für Transkriptomik Experimente; a LM RNA-seq Analyse Gene zu identifizieren , die Gene entlang der Maisblatt proximal-distalen Achse, und ein zweites Experiment DE sind zu identifizieren , die in DE liguleless1-R (LG1-R) sind Mutanten im Vergleich zum Wildtyp. Wesentliche Elemente, die zum Erfolg dieser Versuche beigetragen wurden histologische und in si detaillierttu Hybridisierung der Region Analysen analysiert werden, die Auswahl der Blattprimordien in äquivalenten Entwicklungsstadien, die Verwendung von morphologischen Sehenswürdigkeiten Regionen auszuwählen , für die Mikrodissektion und Mikrodissektion von genau gemessen Domänen. Dieses Papier ein detailliertes Protokoll für die Analyse der Entwicklungs-Domänen durch LM RNA-Seq. Die hier präsentierten Daten veranschaulichen, wie die Region für die Mikrodissektion ausgewählt wird, die erhaltenen Ergebnisse beeinflussen.
Introduction
Die Maisblatt ist ein ideales Modell die Bildung von Entwicklungsfelder während der Morphogenese zu untersuchen, da es eine deutliche Grenze zwischen der Klinge und Hülle aufweist , die zu genetischen Dissektion (1A) zugänglich ist. Während der frühen Stadien der Blattentwicklung, einem linearen Band von kleineren Zellen, die preligule Band (PLB), unterteilt die Blatt primordium in vorge Klinge und pre-Mantel-Domänen. Ein saumartig ligule und Dreiecks Vorhöfe entwickeln sich aus der PLB (1A, C, D). Genetische Screens identifiziert Mutationen, die die Klingenscheide Grenze unterbrechen. Zum Beispiel, rezessiv liguleless1 (LG1) Mutationen löschen Sie die ligule und Vorhöfe 1, 2, 3, 4 (1B). In - situ - Hybridisierung zeigte , dass LG1 Transkript sammelt sich an der PLB und Schwellen ligule, es eine ausgezeichnete Marker für ligule Entwicklung 5, 6 (Abbildung 1E) zu machen.
Abbildung 1: Wildtyp und liguleless1-R Maisblätter. (A) Blattscheide Randbereich des reifen Blatt Wildtyp zeigt ligule und Ohrmuschel Strukturen. (B) Blattscheide Grenzbereich von reifen liguleless1-R Blatt zeigt Abwesenheit von ligule und Ohrmuschel Strukturen. Blätter in der A und B wurden in zwei Hälften entlang der Mittelrippe geschnitten. (C) Längsschnitt durch Wildtyp - Blatt primordium. Probe wurde für die histologische Analyse verarbeitet und gefärbt. Der initiierende ligule ist offensichtlich, wie eine Unebenheit von der Ebene des Blattes vorsteht (Pfeilspitze). (D) Längs SekteIon durch Wildtyp-Blatt primordium. Probe wurde für LM verarbeitet, wie im Text beschrieben. Pfeilspitze zeigt ligule initiieren. (E) LG1 in - situ - Hybridisierung von Spross seitlichen Längsschnitt. Sternchen zeigen LG1 Transkriptakkumulation an der PLB des P6 Blatt primordium. Die Pfeile zeigen die Basis von P6 primordium. Balken zeigt Messung von der Basis des primordium zum PLB. Maßstabsbalken in A und B = 20 mm. Maßstabsbalken in CE = 100 & mgr; m. Diese Zahl wurde von Referenz 6 (Urheberrecht American Society of Plant Biologists) modifiziert. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
In dieser Studie wurde LM RNA-Seq verwendet eine Reihe von Genen zu identifizieren, die differentiell exprimierte (DE) an der Messerscheide Grenze relativ zu anderen Teilen des Blatt primordium und ide ntify Gene , die DE in LG1-R - Mutanten im Vergleich zu Wildtyp - Geschwister sind. LM RNA-Seq ist ein Verfahren der 7 Transkriptakkumulation in spezifischen Zellen oder zellulären Domänen zu quantifizieren. LM-Systeme kombinieren einen Laser und ein Mikroskop mit einer Digitalkamera. Geteilter Gewebe wird auf Schlitten montiert und durch das Mikroskop betrachtet. Die LM-Software enthält in der Regel Zeichenwerkzeuge, die dem Benutzer ermöglichen, alle ausgewählten Region für die Mikrodissektion zu skizzieren. Die Laserschnitte entlang der Linie, und das ausgewählte Gewebe wird die Folie und in ein Rohr über dem Objektträger aufgehängt katapultiert. LM ermöglicht es dem Benutzer präzise Domains microdissect, einschließlich spezifischer Zellschichten und sogar einzelne Zellen 8, 9. RNA kann dann aus dem microdissected Gewebe extrahiert werden. Anschließend wird die RNA-Seq Komponente der nächsten Generation Sequenzierung Sequenzierung von cDNA - Bibliotheken erzeugt aus der extrahierten RNA 10 verwendet,= "xref"> 11.
Die wichtigsten Vorteile von LM RNA-seq sind die Fähigkeit , Transkriptakkumulation in genau definierten Bereichen und die Fähigkeit zum Profil des gesamten Transkriptom gleichzeitig 7 zu quantifizieren. Die Technik eignet sich besonders für frühe Entwicklungs Ereignisse Sondieren, wo die Region von Interesse ist oft mikroskopisch. Frühere Studien haben LM mit Microarray - Technologie in Kombination verwendet , um Entwicklungsprozesse in Pflanzen 9, 12, 13 studieren. RNA-Seq hat den Vorteil der Transkripte in einem breiten Dynamikbereich, einschließlich niedrig exprimierten Genen Quantifizieren und vor Sequenzinformation ist nicht erforderlich , 10, 11. Darüber hinaus hat LM RNA-Seq das Potenzial ihrer Entwicklung wichtige Gene hervorzuheben, die durch genetische Redundanz in Mutagenese-sehen werden oder zu Letalität der Verlust-of-Funktion Mutante.
Entwicklungs wichtige Gene, wie schmal sheath1 (NS1) und becherförmigen cotyledon2 (CUC2), haben oft spezifische Expressionsmuster von nur einem oder wenigen Zellen 17, 18, 19, 20. Viele von ihnen sind in der frühen Entwicklungsstadien und nicht in der reifen Organ nur zum Ausdruck gebracht. Wenn ganze Organe oder große Domänen analysiert werden, wobei diese zellspezifische Transkripte werden verdünnt und kann nicht in konventionelleren Analysen nachgewiesen werden. Durch Analysen von genau definierten Domänen ermöglicht, LM RNA-Seq ermöglicht diese gewebespezifischen Gene identifiziert und quantifiziert werden.
Entscheidende Faktoren für den Erfolg der hier beschriebenen Experimente wurden eine gründliche histologische Analyse, die Auswahl der geeigneten Entwicklungsstadium und Domäne für die Analyse geführt und präzise measurement von Zell-Gewebe-Domänen für LM. Um sicherzustellen , dass äquivalente Domänen für alle Wiederholungs abgetastet wurden, Gewebe wurde aus Blattprimordien auf der gleichen Entwicklungsstadium gesammelt und die microdissected Domänen wurden relativ gemessen zu morphologischen Orientierungspunkte wie die Schwellen ligule (Abbildung 2). Es ist bekannt, dass einige Gene in einem Gradienten von der Spitze bis zur Basis des Blattes exprimiert werden. Durch die Messung präzise Domänen Variation aufgrund der Abtastung von verschiedenen Stellen entlang des Blatt proximal-distalen Achse auf ein Minimum (3A) gehalten werden . Von Domänen der gleichen Größe microdissecting Variation aufgrund unterschiedlicher Verdünnung von zellspezifische Transkripte wurde ebenfalls reduziert werden (3B). Seitliche Längsschnitte des Spross wurden für alle Mikrodissektionen verwendet. Dies sind Bereiche , die senkrecht zur Mittelrippe-margin Achse (Abbildung 4). Mit nur Abschnitte, die die SAM umfassen wird sichergestellt, dass äquivalente Seitenbereiche vonBlattprimor analysiert.
In Proben verarbeitet und LM, der erste morphologischen Zeichen von ligule Auswuchs geschnitten ist eine Beule auf der oberseits aufgrund perikline Zellteilungen in den adaxial Epidermis (1D, 2). Es wurde festgestellt, dass die Schwellen ligule zuverlässig bei Plastochron 7 Stadium Blattanlagen identifiziert werden konnten. Wir waren daran interessiert, Gene in der gesamten Region ligule ausgedrückt, einschließlich der Schwellen ligule und die Zellen unmittelbar distal, die die Ohrmuschel bildet. Um sicherzustellen , dass Selektionen äquivalente Gewebe hergestellt wurden, wurde die ligule Bump als morphologische Wahrzeichen verwendet und eine 100 & mgr; m Rechteck auf der ligule Bump zentriert wurde LM (2A, 2B) ausgewählt. Equivalent große Rechtecke vorge Klinge und pre-Mantel wurden aus den gleichen Blattprimordien ausgewählt.
Die Analysen der liguleless mutierten Pflanzen präsentiert eine andere challenge; LG1-R - Mutanten bilden keine ligule, daher ist diese morphologische Funktion nicht verwendet werden, um die Region für LM auszuwählen. Stattdessen wurde die Domäne von LG1 Transkriptakkumulation in Wildtyp - Blattanlagen bestimmt, und eine Region , die diese Domäne wurde definiert umfassen würde. Diese vorläufigen Analysen wurden auf Sämlingen aus demselben Anpflanzung durchgeführt, wie für die endgültige Analyse verwendet wurden, da frühere Arbeiten haben gezeigt, dass der Ort des PLB variiert je nach Wachstumsbedingungen abhängig. In - situ - Hybridisierung angegeben , dass LG1 - Transkripte in der PLB von P6 Blattanlagen (Abbildung 1E) akkumulieren. Wir haben für Sie eine Domäne 400-900 & mgr; m von der Basis des Blattes primordia, die die Domäne von LG1 Ausdruck umfasste (lila Rechtecke, 2A) und erfasst diese äquivalenten Regionen von Wildtyp und LG1-R Pflanzen. Zur Minimierung der Variation in der genetischen Hintergrund und Wachstumsbedingungen bei einem Vergleich TRANSCRIPt Akkumulation in LG1-R und Wildtyp - Pflanzen, Aussortieren Familien von Mutanten und Wildtyp - Geschwister wurden verwendet.
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Protocol
HINWEIS: Fix Gewebe für die histologische Analyse zur gleichen Zeit, dass Gewebe für LM fixiert ist. Gefärbten Abschnitte für morphologische Merkmale, die später LM führen wird. Wenn Mutante Wildtyp - Vergleich, führen in - situ - Hybridisierung oder Immunolokalisation die Domäne zu definieren , in denen das Gen von Interesse (in diesem Fall LG1) exprimiert wird.
1. Gewebefixierung und Verarbeitung
- Wachsen Wohnungen von Maiskeimlinge bis zwei Wochen alt unter Standardbedingungen 6.
- Sezieren shoot Scheiteln zur seitlichen Abschnitte (Abbildung 4).
- Excise Sämling knapp unterhalb der Bodenlinie.
- Mit einer Rasierklinge, entfernen dünne Scheiben von der Basis des Stiels (Schnitte 1, 4A) , bis ein Oval von culm umgeben von ein oder zwei reifen Blätter sichtbar ist (4B).
- Legen Sie einen anderen Schnitt etwa 10 mm über dem Boden (2 geschnitten, 4A).Das 10 mm-Segment wird die SAM und jungen Blattanlagen enthalten.
- Drehen Sie das 10 mm-Segment, so dass die Basis nach oben zeigt. Machen Sie zwei Schnitte zur Querachse parallel , so dass ein Stück Gewebe 2-3 mm Dicke erhalten wird (Schnitte 3 und 4, 4B). Entsorgen Sie die beiden äußeren Teile und behalten die zentrale Scheibe zur Fixierung und Einbettung.
HINWEIS: Äußere Blätter abgeschnitten und entsorgt werden können.
- Fix Gewebe und Verfahren zum Einbetten.
- Sicherzustellen, dass alle Materialien, die in nachfolgenden Schritten verwendet werden, sind RNase frei. Behandeln Sie Lösungen mit Diethylpyrocarbonat (DEPC) (1 ml DEPC pro Liter Lösung. Inkubieren über Nacht mit gelegentlichem Schütteln und Autoklaven). Bake Glas in einem Ofen bei 200 ° C oder höher für mindestens 6 Stunden und Behandlung von Kunststoff-ware mit RNase Dekontaminationslösung.
- Tag 1: Tauchen Gewebescheiben in ~ 10 ml Bauern Fix (3: 1 Ethanol: Essigsäure) in Glasfläschchen auf dem Eis. Nachdem alle Proben präpariert wurden, gelten VACUUm, um Luftblasen und Hilfe Eindringen von Fixiermittel zu entfernen. Halten unter Vakuum für 10 Minuten dann langsam das Vakuum freizugeben. Ersetzen Fixiermittel und Inkubation bei 4 ° C über Nacht unter leichtem Schütteln.
- Tag 2: Inkubieren in der folgenden Reihe von Lösungen, ~ 10 ml, 1 h jeweils alle unter leichtem Schütteln; 85% Ethanol bei 4 ° C, 95% Ethanol bei 4 ° C, 100% Ethanol bei 4 ° C, 100% Ethanol bei 4 ° C, 100% Ethanol bei 4 ° C, 1: 1 Ethanol: Xylole bei Raumtemperatur, 100% Xylole bei Raumtemperatur, 100% Xylole bei Raumtemperatur.
HINWEIS: Xylenes giftig sind durch Berührung und Einatmen. Die Arbeit in einer Abzugshaube und geeignete Handschuhe verwenden. - In Paraffin Gewebe Einbettmediums Pellets auf ungefähr die Hälfte von Xylolen und Inkubation über Nacht bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln.
- Tag 3: Übertragen Sie die Fläschchen auf 60 ° C heißen Ofen, bis die Pellets zu schmelzen. Abgießen Lösung und ersetzen mit frischen geschmolzenen Gewebeeinbettungsmedium. Ändern Sie die Medium zwei weitere Malewährend des Tages.
- Tag 4: Gewebe ändern Medium einmal morgens einzubetten. Zurück zu 60 ° C warmen Ofen bis zum Nachmittag.
- Gussblöcke
- Legen Sie Einbettschälchen auf heißer Platte von Gewebeeinbettung Station. Verwenden einer Pinzette, um die Gewebeproben in die Einbettformen zu übertragen mit der Schnittfläche nach unten zeigt. Top die Form mit geschmolzenem Paraffin und legen die Einbettung Ring an der Oberseite der Form. Übertragung auf eine kalte Platte, bis Paraffin erstarrt ist. Speichern der Paraffinblöcke bei 4 ° C in einem luftdichten Behälter mit Kieselgel.
2. Sectioning und Vorbereitung Schieben
- Schnitt 10 um Abschnitte auf einem Mikrotom 25.
- Untersuchen Sie Bänder und wählen mittlere Abschnitte. Median Abschnitte sind solche, die die SAM umfassen, die durch Blattprimor umgeben als Kuppel der Zellen angezeigt.
- Berg Abschnitte auf Folien.
- Die Objektträger, die geeignet sind für LM (entweder RNase frei odergebacken) auf 42 ° C wärmer gleiten und einige Tropfen 50% igen Ethanollösung gelten die Folie abzudecken.
- Float Abschnitte auf Ethanollösung, bis die Abschnitte erweitert.
HINWEIS: Floating Abschnitte auf Ethanollösung statt Wasser hält RNA-Abbau-RNA in einer gefällten Zustand zu reduzieren. - Kippschiebers und überschüssiges Ethanollösung durch Absaugen mit einem Einweg-Transferpipette. Verwenden Sie fusselfreien Tüchern zusätzliche Ethanollösung Feuchtigkeit ab.
- Trockenobjektträger bei 42 ° C für mehrere Stunden oder über Nacht. Store Objektträger bei 4 ° C in einem luftdichten Behälter mit Kieselgel.
- Entparaffinieren gleitet am Tag der Verwendung.
- Bereiten Sie drei Glas Färbetrog enthält; 100% Xylole (Xylole I), 100% Xylole (Xylole II) und 100% Ethanol (~ 50 ml von jeder Lösung).
- Mit sauberen Pinzette zu übertragen Dias, tauchen Dias in Xylolen ich für 2 min, Xylole II für 2 min und 100% Ethanol für 1 min.
- Ablass rutschtees auf fusselfreien Tüchern und Luft bei Raumtemperatur trocknen.
3. Mikrodissektion von Blade, Blatthäutchen und Mantel Proben aus Plastochron 7 Blatt Primordia
- Sichern Sie sich die Folien auf der Bühne von LM Mikroskop. Verwenden Sie fünf oder sechs Folien für jede Wiederholung, unter Verwendung von fünf Abschnitte pro Folie.
HINWEIS: Gewebe für ein einzelnes Replikat Pooling ist in Abbildung 5 dargestellt. - Untersuchen Sie Dias und identifizieren die fünf mittlere Abschnitte auf jeder Folie, die SAM-Spitze als zentraler Bezugspunkt.
HINWEIS: Dies kann bei geringer Vergrößerung durchgeführt werden, in der Regel ein 5X Ziel ausreichend ist. - Mit 10X oder 20X Ziel, identifizieren die Position des ligule auf dem Plastochron 7 Blatt primordium jedes Abschnitts. Die ligule wird als Bump sichtbar sein aus der adaxial Oberfläche des Blattes primordium vorsteht. Markieren Sie diese Position mit dem Zeichenwerkzeug der LM-Software; Wählen Sie das Stift-Symbol, um den Cursor auf die entsprechende positi bewegenauf und klicken Sie auf und ziehen Sie die Maus zu ziehen.
HINWEIS: Ein 10X oder 20X Ziel ist geeignet für diese und die nachfolgenden Schritte. Wenn Seitenabschnitte verwendet, werden die beiden Seiten jedes Blattes primordium in jedem Abschnitt (2A) zugegen sein. - Mit dem Lineal - Werkzeug und die rechteckige Zeichenwerkzeug, messen 100 & mgr; m hohe Rechtecke zentriert auf dem ligule jedes Abschnitts (rote Rechtecke, 2A, 2B). Diese werden die "Blatthäutchen" Probe sein.
- Um das Lineal-Werkzeug; Wählen Sie das Lineal-Symbol, um den Cursor auf ein Ende des Objekts bewegen gemessen werden, klicken Sie auf und ziehen Sie das Objekt zu messen. Die Länge des Lineals wird auf dem Bildschirm angezeigt.
- So zeichnen Sie ein Rechteck; Wählen Sie das Rechteck-Symbol, um den Cursor auf einen Punkt zu bewegen, die eine Ecke des Rechtecks sein wird, klicken Sie auf und ziehen Sie ein Rechteck in der entsprechenden Größe zu zeichnen. Alternativ können Sie das Zeichenwerkzeug gerade Linie und vier geraden Linien zeichnen.
- Maßnahme 100 um Rechtecke 50 positioniert, um oberhalb und unterhalb des "Blatthäutchen" Rechteck.
HINWEIS: Diese werden die "Blade" und "Mantel" Proben, bzw. (grüne und blaue Rechtecke, 2A, 2B) sein. Auf der Grundlage unserer histologischen Daten umfasst ein 100 & mgr; m Rechteck den gesamten ligule Region. Equivalent große Portionen von Klinge und Hülle wurden ausgewählt, um sicherzustellen, daß ähnliche Mengen von Gewebe für jede gesammelt. Abstandshalter von 50 um wurden verwendet, um sicherzustellen, dass kein Bereich ligule Gewebe wird in den Schaufel oder Hülle Mikrodissektionen versehentlich eingeschlossen.
- Microdissect gemessen Rechtecke (2D - 2F) 7, 8, 9, sammeln Blatthäutchen, Klinge und Mantel Proben in getrennten Röhren. Verwenden Sie die Laser-Cut-Funktion durch den Gewebeschnitt entlang der Kontur der ausgewählten Domäne zu schneiden. Verwenden Sie die Catapult Funktion das Rechteck von Gewebe aus der Folie und in den Deckel des Rohres (- 2F 2D) zu treiben.
4. Mikrodissektion von Blade, Blatthäutchen und Mantel adaxial Epidermal Proben von Plastochron 7 Blatt Primordia
- Wählen Sie Abschnitte und verwenden Sie das Lineal zu messen 100 & mgr; m hohe Segmente zentriert auf dem Plastochron 7 ligule, wie in Abschnitt 3 (siehe oben) beschrieben.
- Wählen Sie nur die adaxial epidermalen Zellen von jeweils 100 & mgr; m hoch "Blade" und "Mantel" Segment (grün und blau Auswahlen, 2C) , indem sie mit dem Zeichenwerkzeug umreißt. Die Epidermis ist die äußere Zellschicht; die adaxial Seite ist der am nächsten zum SAM.
- Für die "Blatthäutchen" Probe, wählen Sie nur die Zellen des entstehenden ligule Beule , wie in Abschnitt 3.3 (rote Auswahl, 2C) beschrieben.
- Microdissect ausgewählten Regionen, sammeln Blade, Blatthäutchen und Sheath Epidermis Proben in getrennten Röhren, wie in Abschnitt 3.5 beschrieben.
5. Mikrodissektion von Plastochron 6 Blatt Primordia von LG1-R und Wildtyp - Geschwister
- Wachsen Familien von mutierten Aussortieren (LG1-R) und Wildtyp - Pflanzen.
- Fix und Prozess schießen Scheiteln für LM, wie 1,2-1,4 in Abschnitten beschrieben. Fix Wildtyp und Mutante schießen Scheiteln in separaten Fläschchen, um sie getrennt zu halten. Proben aus dem gleichen Pflanzungs sollte für die in situ - Hybridisierung fixiert und verarbeitet werden.
- Bestimmen Sie, wo LG1 in Wildtyp - Geschwister transkribiert wird, von LG1 in - situ - Hybridisierung Durchführung 6, 26, 27. Messen die Position von LG1 Transkriptakkumulation von der Basis des Blatt primordium in mehreren Proben (Abbildung 1E).
- Basierend auf in - situ - Hybridisierungsdaten, wählen Teil des Blattes primordium daß umfasst die Region , in der LG1 transkribiert wird. In diesem Fall 400-900 & mgr; m von der Basis des Plastochron 6 Blattanlagen (lila Rechtecke, 2A).
- Microdissect Teil des Blattanlagen ausgewählt, wie in Abschnitt 3.5, sammeln LG1-R und Wildtyp - Proben in getrennten Röhren.
6. Wenden RNA Extraction Buffer
- Bewerben 50 ul RNA-Extraktionspuffer zu microdissected Gewebe und gehen mit RNA-Extraktion. Fahren Sie mit dem RNA - Extraktion, die RNA - Amplifikation, Bibliothekskonstruktion, Sequenzierung und Bioinformatik - Analyse , wie in Bezug auf 6 beschrieben.
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Representative Results
Die LM - Schema in Abbildung 2 wurde für jede Wiederholung gesammelt 1,000,000-1,500,000 um 2 von Gewebe etwa skizziert Verwendung in der all-Zell-Schichten LM (Abbildung 5), und 200.000 & mgr; m 2 pro für die adaxial Epidermis LM replizieren. Etwa 2,5 Millionen um 2 von Gewebe gesammelt wurde für jede in der LM von LG1-R und Wildtyp - Blattanlagen replizieren. Zwei Runden von linearen RNA-Amplifikation ergab Mikrogramm Mengen an RNA für jede Wiederholung. Die Menge an RNA, die aus irgendeiner gegebenen Mikrodissektion erhalten wird, sowie die Menge des Gewebes eingefangen auf die Zellgröße und transkriptionale Aktivität abhängen. Die Integrität der RNA wird die Effizienz der RNA-Amplifikation beeinflussen.
Transkriptakkumulation wurde in allen Zellschichten der Klinge, Ligula und Mantelregionen und insgesamt 2.359 DE gen analysiertes wurden gefunden, mit einem falschen Entdeckung Rate (FDR) von <0,05 (6A). Insbesondere 1.714 Gene wurden DE zwischen ligule und Klinge, 1044 Gene waren DE zwischen ligule und Scheide und 657 Gene wurden DE zwischen Klinge und Mantel (einige Gene sind in DE mehr als einem Vergleich). Die Gene wurden in der ligule Region als upregulated klassifiziert, wenn sie deutlich in den beiden oben reguliert wurden ligule zu Klinge verglichen und ligule zu Mantel verglichen. In der alle Zellschichten LM wurden 373 Gene in der ligule Region signifikant hochreguliert.
Transkriptakkumulation wurde in den adaxial Epidermis Klinge, Ligula und Mantelbereiche und insgesamt 3.128 DE Gene gefunden wurden analysiert; 1.971 Gene waren DE zwischen ligule und Klinge, 2032 Gene waren DE zwischen ligule und Scheide und 871 Gene waren DE zwischen Klinge und Mantel (6B). 287-Gene wurden deutlich in der ligule upregulated im Vergleich zu Klinge und Mantel epidermis.
Daten für ausgewählte Gene , die in der Region ligule aufreguliert sind , sind in Tabelle 1 und Figur 7 dargestellt. Eine anfängliche In - situ - Hybridisierungsanalyse zeigte , dass LG1 Transkripte speziell in der PLB und dem aufstrebenden ligule Blatt primordia Wildtyp, und das LG1 höher transkribiert in der Epidermis als in inneren Zellschichten (6C) akkumulieren. Die LM-RNA-seq Daten, die erhalten wurden, sind im Einklang mit diesem Ergebnis; LG1 Transkriptakkumulation ist signifikant höher in der ligule als in entweder Klinge oder die Hülle sowohl in der epidermalen LM und LM aller Zellschichten (Tabelle 1, Abbildung 7A). LG1 hat eine höhere CPM in den epidermalen Analyse als in der Analyse aller Zellschichten, ähnlich zu dem Szenario , in 8C veranschaulicht.
ns1 deutlich im ligule Region upregulated sowohl in den allen Zellschichten LM und der adaxial Epidermis LM (Tabelle 1, Abbildung 7B). Diese Feststellung wurde durch in situ - Hybridisierung bestätigt, die zeigt , dass die NS1 - Transkript spezifisch in der Spitze des Schwellen ligule (6D) akkumuliert. NS1 hat eine wesentlich höhere Lesezählung in der Epidermis-nur LM - Analyse als in LM aller Zellschichten (19,6 CPM und 2,7 CPM, jeweils) durch Verdünnung des Transkripts in der alle Schichten LM. Dieser Verdünnungseffekt ist in 8A gezeigt. In ähnlicher Weise GRMZM2G101682, ein Gen mit unbekannter Funktion, hatten eine höhere mittlere Lesezählung in der ligule epidermalen LM als in der alle Schichten LM (Tabelle 1, Abbildung 7C). In - situ - Hybridisierung zeigte , dass dieses Gen - Transkript sammelt am stärksten in den epidermalen Zellen (6E) auch. Zm PIN1a war nicht signifikant DE in der Analyse aller Zellschichten, aber signifikant in der ligule in der Epidermis-only - Analyse (Tabelle 1, Abbildung 7D) hochreguliert. Dies ist wahrscheinlich , weil Zm PIN1a hoch in vaskulären Geweben und diese L2-derived vaskulären Expressions confounds Unterschiede in Zm PIN1a Akkumulation in der Epidermis exprimiert wird , wenn alle Zellschichten gesammelt (6F). Ein ähnliches Szenario ist in 8B dargestellt.
Um Gene zu identifizieren , die in DE LG1-R - Mutanten sind, Transkriptakkumulation wurde in einem definierten Bereich von Wildtyp und LG1-R P6 Blattanlagen verglichen. Sechsundneunzig Gene waren DE in LG1-R (FDR <0,05); 59 wurden in LG1-R - Mutanten nach unten reguliert, und 37 wurden nach oben reguliert. Daten für ausgewählte Gene, die DE sind in <em> LG1-R - Mutanten sind in Tabelle 2 dargestellt. bel14 eines von 34 Genen , die beide in den Blattprimorwildtyp in der ligule Region upregulated sind und in LG1-R - Mutanten nach unten reguliert. In - situ - Hybridisierung bestätigt , dass bel14 - Transkripte in der preligule Region in Wildtyp - Pflanzen ansammeln , aber nicht in dem entsprechenden Bereich von LG1-R Blattanlagen 6.
Abbildung 2: Schema für Lasermikrodissektion Blatt Ur-Domänen. (A) Seitliche Längsschnitt von Mais Spross für LM verarbeitet. Boxen zeigen Regionen für die Mikrodissektion ausgewählt. Blatthäutchen Region Gewebe (roter Kasten) wurde aus 100 & mgr; m hohe Rechtecke microdissected, auf der PLB zentriert. Pre-blade (grün) und pre-Hülle (blau) Gewebe wurde aus 100 & mgr; m gemachtRechtecke 50 um oben und unten jeweils die preligule Auswahl. Für den Vergleich von Wildtyp und LG1-R Transkriptomen, Gewebe zwischen 400-900 & mgr; m von der Basis des Blatt primordia P6 wurde microdissected aus Seitenabschnitten (lila gestrichelte Linie). (B) Close-up von P7 primordium und Regionen für die Mikrodissektion aller Zellschichten ausgewählt. (C) Close-up von P7 primordium und Regionen für die Mikrodissektion von adaxial Epidermis ausgewählt. (D) Preligule Region von P7 primordium vor Mikrodissektion. Pfeilspitze zeigt an Position ligule zu initiieren. (E) rote Linie zeigt Region für die Mikrodissektion ausgewählt. Der Laser wird entlang dieser Linie geschnitten. Kreise zeigen Punkte, in denen Laserpulse Gewebe katapultieren. (F) Primordium nach Mikrodissektion. Kreise zeigen Punkte, in denen Laserpulse Gewebe katapultiert haben. SAM = Apikalmeristems schießen. P zeigt Plastochron Nummer. Maßstabsbalken = 100 &# 181; m. Diese Zahl wurde von Referenz 6 (Urheberrecht American Society of Plant Biologists) modifiziert. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Die Region für LM ausgewählt beeinflusst Lesezählungen für Gene , die entlang der Blatt primordium DE sind. (A) eine genaue Positionierung der für LM relativ ausgewählten Region zu morphologischen Sehenswürdigkeiten reduziert Variation für Gene in einem Gradienten längs der Blattachse ausgedrückt. In Replikate 1-3 auf der linken Seite sind Auswahlen auf dem aufstrebenden ligule zentriert in geringer Variation ergibt. In Replikate 1-3 auf der rechten Seite, in der Region Positionierung für LM ausgewählt ist nicht konsistent zu einer erhöhten Variation ergibt. (B) Microdissecting ein gleichbleibender Größe sWahl reduziert Variation (repliziert 1-3 links) im Vergleich zu microdissecting verschieden große Auswahl (repliziert 1-3 rechts) für Gene mit ligule spezifische Expressionsmuster. Transkripte sind in der größeren Auswahl verdünnt, in einem unteren Lesezählung führt, und konzentrierteren in die kleinere Auswahl, in einer höheren Lesezählung führt. Cartoons repräsentieren Längsschnitte durch Blattanlagen in der ligule Region. Pfeilspitze zeigt ligule initiieren. CPM = Zählungen pro Million. SD = Standardabweichung. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4: Dissection von Mais Sämling zur seitlichen Abschnitte. (A) Zwei Wochen alten Mais Sämling an der Wurzel-shoot - Übergang ausgeschnitten. Entfernen Sie dünne Scheiben from die Basis des Sprosses (1), bis ein kleines Oval von Halm ist an der Basis der Spross sichtbar. Stellen quer ca. 10 mm über dem Basis geschnitten (2) und diesen Zylinder zu halten. (B) Zylinder des Gewebes ausgerichtet , so ist Basis nach oben zeigt . Hinweis Oval Halm durch Blatt umkreist. Bilden zwei Längsschnitte zur Querachse parallel (3 und 4). Bewahren und fixieren zentrale Scheibe des Gewebes, dieser Teil wird die SAM und jungem Blatt primordia umfassen. (C) Cartoon illustriert Ebene seitlichen Schnitt (grün gestrichelte Linie) durch Spross. Roter Kreis zeigt midrib, rot Pfeilspitze zeigt Ränder der grauen Blatt primordium. Blau gestrichelte Linie: midrib-Marge Achse. Maßstabsbalken = 1 mm. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5: Cartoon illustriert Bündelung der Laser microdissected Gewebe für eine Wiederholung des ligule Region. Tissue microdissected von fünf auf sechs Dias wird für jede Wiederholung gebündelt. Fünf mittlere Abschnitte von jeder Folie verwendet werden, und zwei Auswahlen (rote Rechtecke) werden aus jedem Abschnitt hergestellt. Jedes Rechteck ist etwa 20.000 & mgr; m 2. Gewebe für jede Wiederholung wird in einem separaten Rohr (blau oval) gesammelt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 6: Anzahl der DE - Gene in paarweise Vergleiche zwischen Blattregionen und in situ Hybridisierung ausgewählter DE Genen. (A) Zahl der DE - Gene in paarweisen Vergleich zwischenKlinge, ligule und Mantel Regionen, LM aller Zellschichten. (B) Anzahl der DE - Gene in paarweisen Vergleich zwischen Klinge, Ligula und Mantelbereichen, LM von adaxial Epidermis nur. (C) LG1 in situ Hybridisierung. (D) ns1 in situ Hybridisierung. (E) GRMZM2G101682 in situ Hybridisierung. (F) ZmPIN1a in situ Hybridisierung. DE: unterschiedlich exprimiert. Bis in L: bis in ligule, Up in B: bis in Klinge. Bis in S: bis in Hülle. Pfeilspitzen in CF weisen auf Schwellen ligule. Pfeil in F zeigt Transkriptakkumulation in Gefäßgewebe. Maßstabsbalken = 100 & mgr; m. Diese Zahl wurde von Referenz 6 (Urheberrecht American Society of Plant Biologists) modifiziert. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Abbildung 7: Graphische Darstellung der Daten für die ausgewählte DE Genen. Figur veranschaulicht in Tabelle 1 und in situ Hybridisierungsergebnisse dargestellten Daten. Cartoons repräsentieren Längsschnitte durch Blattanlagen. Dunkelblau zeigt Transkriptakkumulation für ein bestimmtes Gen. Grün, Rot und Blau Kästchen zeigen Region für die Mikrodissektion für Klinge ausgewählt, ligule und Mantel Proben. Cartoons auf der linken Seite veranschaulichen LM aller Zellschichten. Cartoons auf der rechten Seite zeigen LM von adaxial Epidermis nur. Ad: adaxial Epidermis, Ab: abaxial Epidermis, CPM: Counts pro Million, zeigt Sternchen signifikanten Unterschied zwischen den beiden Domänen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Abbildung 8: Cartoon illustriert , wie gelesen zählt für hypothetische DE Gene unterscheiden sich in Abhängigkeit von den genauen Regionen für die Mikrodissektion ausgewählt. (A) Gene mit ligule spezifische Expression. (B) Gene ausgedrückt in der ligule und in Gefäßgewebe. (C) ausgedrückt Gene spezifisch in der ligule Region in allen Zellschichten jedoch höhere Expression in der Epidermis. (D) zu exprimierende Gen in der Region ligule, L2 abgeleiteten Zellschichten nur. Cartoons repräsentieren Längsschnitte durch Blattanlagen. Dunkelblau zeigt Transkriptakkumulation für ein bestimmtes Gen. Grün, Rot und Blau Kästchen zeigen Region für die Mikrodissektion für Klinge ausgewählt, ligule und Mantel Proben. Cartoons auf der linken Seite veranschaulichen LM aller Zellschichten. Cartoons auf der rechten Seite zeigen LM von adaxial Epidermis nur. Ad: adaxial Epidermis, Ab: abaxial Epidermis, CPM: COU nts pro Million. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Tabelle 1: Ausgewählte Gene in der Ur - ligule upregulated. Counts pro Million: Zählungen pro Million Gesamt Transkripte Durchschnitt von drei Replikaten, logFC = log Basis 2 Fold Change, FDR.BH: false Fündigkeitsquote nach Benjamini und Hochberg-Methode. Alle Schichten: LM aller Zellschichten. Epidermis: LM von adaxial Epidermis nur. Diese Zahl wurde von Referenz 6 (Urheberrecht American Society of Plant Biologists) modifiziert. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Tabelle anzuzeigen.
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Tabelle 2: Ausgewählte Gene DE in LG1-R - Mutanten. Counts pro Million: Zählungen pro Million Gesamt Transkripte Durchschnitt von drei Replikaten, logFC = log Basis 2 Fold Change, FDR.BH: false Fündigkeitsquote nach Benjamini und Hochberg-Methode. Diese Zahl wurde von Referenz 6 (Urheberrecht American Society of Plant Biologists) modifiziert. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Tabelle anzuzeigen.
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Discussion
Experimentelles Design ist ein kritischer Faktor in RNA-seq Experimenten. Wichtige Überlegungen sind die genaue Domain (s) und des Entwicklungsstadiums (en) analysiert werden, und welche Vergleiche gemacht werden. Es ist von entscheidender Bedeutung im Hinblick auf die Vergleiche zu denken, da die Ausgabe typischerweise eine Liste von Genen ist, die zwischen zwei oder mehr conditions de sind. Wie bei allen Experimenten ist es wichtig, nur eine Variable zu einer Zeit zu ändern. Zum Beispiel, wenn verschiedene Blatt Domänen zu vergleichen, lässt der im gleichen Alter und Entwicklungsstufe, verglichen werden sollten unter den gleichen Bedingungen gezüchtet.
Das Ziel dieser Experimente war es, Gene zu identifizieren , die spezifisch nach oben oder nach unten reguliert im ligule Region des Wildtyp - Blattanlagen sind, und die Gene zu identifizieren , die in DE LG1-R - Mutanten im Vergleich zum Wildtyp sind. Wir untersuchten zunächst die Morphologie der Entwicklung von Blattanlagen und das Muster der LG1 Transkriptakkumulation. Diese morphologischen und molekularen Sehenswürdigkeiten were verwendet präzise Domains für 14 LM zur Wahl, 15, 16. In dem ersten Experiment, transcript Ansammlung im ligule Region wurde in andere Regionen des gleichen Blattprimor verglichen, wodurch Unterschiede aufgrund der Wachstumsbedingungen, genetischem Hintergrund, Entwicklungsstadium und Pflanzen-to-Pflanze Variation zu eliminieren. Mutierte Wildtyp vergleichen, ist es notwendig, wann und wo das Gen von Interesse zu bestimmen, wird zum Ausdruck gebracht. Es wird empfohlen , die Analyse der Expressionsmuster entweder durch in - situ - Hybridisierung oder Immunolokalisation und eine Region für LM Auswahl, die die Domäne der Genexpression umfasst. Es ist wichtig, dass äquivalente Domänen verglichen werden und dass der genetische Hintergrund ist die gleiche für sowohl Mutanten- und Wildtyp.
Die Genauigkeit der Mikrodissektionen kann durch Überprüfung gelesen Zählungen für Gene überprüft werden, die speziell in der Domäne von Interesse, wenn su exprimiert werdench-Gene sind bekannt. Dies kann auch durch Ausführen einer RT-PCR auf von LM Gewebe zur Sequenzierung vor der Herstellung Bibliotheken extrahierte RNA durchgeführt werden. In den hier beschriebenen Experimenten diente LG1 als Kontrolle für LM des ligule Region, da in situ - Hybridisierung , dass LG1 Expression spezifisch gezeigt hatte Analysen zur PLB und Schwellen ligule 5, 6.
Im Gegensatz zu Methoden, wie beispielsweise RT-qPCR, wo die Kandidaten-Gen (e) muss bekannt sein, quantifiziert RNA-seq Akkumulation aller Transkripte in einer Gewebeprobe gegeben. Somit ist LM RNA-seq eine nützliche Methode Kandidatengene zu identifizieren. Ein Beispiel aus dieser Studie ist GRMZM2G101682, ein Gen mit unbekannter Funktion , die eine auffallende ligule spezifische Expressionsmuster (6E) hat. Diese Studie auch Gene identifiziert , die DE in LG1-R, wie bel14 sind, die zuvor als stellvertretender hinter LG1 verwickelt worden waren. in this Beispiel war der Vergleich von mehreren Datensätzen (upregulated in dem Wildtyp ligule Region und DE in LG1-R) besonders informativ. Es ist wichtig zu beachten, dass das Expressionsmuster eines Gens seine Funktion nicht zeigen: nachfolgende genetische und / oder biochemische Analysen sind erforderlich Genfunktion zu etablieren.
Transkriptomischen Analysen, die auf die kleinen, diskreten Domänen Entwicklungs fokussiert werden, die differentiell unterschiedlich sind und leicht abgegrenzt, sind die erfolgreichsten. LM RNA-seq ist ein geeignetes Verfahren für solche Analysen und hat das Potential, viele Entwicklungserscheinungen angewendet werden. Es ist besonders geeignet differentiellen Genexpression in Mutanten von Genen zu identifizieren, die Expressionsmuster räumlich eingeschränkt sind, oder Mutanten, die Entwicklung von spezifischen Strukturen beeinflussen. Es können auch Verfahren angewendet werden, die in spezifischen und identifizierbaren Zellen oder Geweben wie der Epidermis oder Vaskulatur auftritt, und ist verwendet worden ineine Transkriptom - Analyse von Mais Sprossapikalmeristem (SAM) Ontogenese 16. Es ist weniger geeignet, um die Funktion von Genen zu studieren, die ubiquitär oder Prozesse zum Ausdruck gebracht werden, die in allen Zellen vorkommen. Die hier vorgestellten Methoden wurden auf eine Vielzahl von Pflanzenarten (Mais, Sorghum, Ocimum, Mentha und Antirrhinum) und Strukturen (Blattprimordien, Meristeme, Rhizome und Trichome) erfolgreich angewendet.
LM nicht erforderlich ist, wenn eine Analyse relativ große Domänen umfasst. Tatsächlich RNA-Seq auf der Hand seziert oder ganze Organe verwendet wurde erfolgreich DE Gene in Pflanzen 14, 15 zu identifizieren. Dieser Ansatz hat den Vorteil, dass es weniger arbeitsintensiv und keine Erfahrung mit histologischer Techniken erforderlich ist. Es gibt jedoch Einschränkungen für die Präzision der Hand Dissektionen, was bedeutet, daß die Hand dissection ist weniger geeignet für die frühe d Studiumevelopmental Prozesse.
Für eine erfolgreiche LM RNA-Seq entwicklungs Phänomene analysiert, muss der Entwicklungskontext gut charakterisiert werden. Wir empfehlen die Durchführung einer gründlichen histologische Untersuchung des Prozesses oder der Domäne von Interesse vor, ein Experiment zu planen. Die Histologie von Proben für LM verarbeitet ist im allgemeinen schlecht, da die Gewebe ungefärbt sind und nicht mit Deckplättchen angebracht, die Schärfentiefe-Bereich bereitzustellen. Daher ist es sinnvoll , getrennte Proben für die Färbung und Beobachtung zur gleichen Zeit zu beheben , wie LM - Proben festgelegt sind (Abbildung 1C und D).
RNA aus LM erhaltene Material ist in der Regel fragmentiert und die Gesamtausbeute ist gering 8. Ein Verstärkungs Schritt ist erforderlich , 28 ausreichend RNA zur Bibliothek Vorbereitung zu erzeugen. RNA-Fragment Länge sollte nach Verstärkung bewertet werden und vor der Bibliothek Generation. Eine durchschnittliche Fragmentlänge von seVeral hundert Basenpaare wird in der Regel als gut betrachtet, ist 500 Basenpaare ausgezeichnet. Schlechte RNA-Ausbeute kann, wenn die Gewebe nicht gut fixiert ist, wenn Abbau durch RNase Kontamination auftritt, oder wenn Paraffinblöckchen falsch gespeichert. Es ist hilfreich, um die Qualität von fixiertem Gewebe zu testen, indem Sie eine Test LM von einer relativ großen Fläche Unternehmen, bevor Sie eine Menge Zeit, um microdissecting sehr kleinen Domänen widmen. Weil die RNA von LM-Zellen erhalten ist fragmentiert und Amplifikation unter Verwendung eines Oligo-dT-Primers eine starke 3'-Vorspannung führt, ist dieses Verfahren nicht geeignet für den Nachweis alternative Transkripte wie Spleißvarianten. Auch ist LM geeignet für den Nachweis kleiner RNAs.
Ein alternatives Verfahren transcript Akkumulation in bestimmten Geweben oder Zell Domänen zu quantifizieren durch Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) 21 getrennt ist , RNA-seq von Zellen. Dieses Verfahren erfordert im allgemeinen die Identifizierung eines geeigneten Markergens für die Region von Interesse,die Erzeugung von transgenen Pflanzen ein fluoreszierendes-markiertes Protein und Protoplastierung exprimieren. FACS mit Mikroarray kombiniert verwendet worden ist durch Abtrennen exprimierenden Zellen zelltypspezifischen Promotoren in der Wurzel 22, 23 einen Ausdruck Karte der Arabidopsis Wurzel zu erzeugen. FACS von Spross Gewebe ist schwieriger als Wurzelgewebe aufgrund Chlorophyll Autofluoreszenz - 24. Eine Begrenzung von LM ist, dass die Domäne von Interesse in histologischen Schnitten erkennbar sein müssen. FACS kann eine geeignetere Methode in Fällen, in denen ein geeigneter Marker-Gen vorhanden ist. Die Wahl, welche Zellen oder Gewebe zu isolieren und zu vergleichen, ist eine wichtige Überlegung in transkriptomischen Analysen, die entweder FACS oder LM verwenden.
Die hier präsentierten Daten zeigen , dass unterschiedliche Ergebnisse werden in Abhängigkeit von den genauen Domänen für LM (Abbildung 3, Abbildung 8 ausgewählt erhalten werden). Transkripte von Genen , die in einer oder wenigen Zellen, wie NS1 exprimiert werden, wird verdünnt werden , wenn große Gewebe Domänen analysiert werden. Es ist wahrscheinlich , dass , wenn ganze Blattprimor abgetastet wurden, würden ns1 Transkript nicht erkannt werden. ZmPIN1a deutlich im ligule upregulated im Vergleich zu Klinge und Mantel Epidermis aber dieser Unterschied durch vaskuläre Ausdruck verwechselt wird , wenn alle Zellschichten abgetastet werden. Umgekehrt Gene , die nur in L2-abgeleitete Zellschichten ausgedrückt werden , werden nicht detektiert werden , wenn nur die Epidermis abgetastet wird (Figur 8D). Diese Studie zeigt, dass, während LM RNA-Seq ein leistungsfähiges Werkzeug zum Detektieren Unterschiede in der Genexpression während der Morphogenese ist, die Domänen für die Analyse ausgewählt sind entscheidend für den Erfolg des Experiments.
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Acknowledgments
Die Autoren danken S. Hake für die Zusammenarbeit im Gange und Diskussionen über ligule Entwicklung zu stimulieren. Diese Arbeit wird von der National Science Foundation Grants MCB 1052051 und IOS-1848478 unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Diethyl pyrocarbonate | Sigma-Aldrich | 159220 | Used for RNase treatment of solutions |
| Razor blades | Electron Microscopy Sciences | 72000 | |
| RNase Zap | Sigma-Aldrich | R2020-250ML | RNase decontamination solution |
| Ethanol absolute 200 proof | Fisher Scientific | BP28184 | |
| Acetic acid, glacial | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Glass vials - 22 ml | VWR | 470206-384 | |
| Xylenes, histological grade | Sigma-Aldrich | 534056-4L | |
| Paraplast plus | Sigma-Aldrich | P3683-1KG | |
| Disposable base molds, 15 mm x 15 mm x 5 mm | VWR | 15154-072 | |
| Embedding rings | VWR | 15154-303 | |
| Silica gel packets | Electron Microscopy Sciences | 71206-01 | Desiccant for storage of paraffin blocks |
| Oven | Fisher Scientific | 15-103-0503 | Oven must maintain temperature of 60 °C |
| Paraffin embedding station | Leica | EG1160 | |
| Microtome | Leica | RM2235 | |
| Slide warmer | Electron Microscopy Sciences | 71317-10 | |
| Coplin jars | Electron Microscopy Sciences | 70316-02 | |
| Laser microdissector | Zeiss | ||
| KIMWIPES™ Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark Professional | 34120 | Lint-free wipes for wicking excess solutions from microscope slides |
| Membrane Slide 1.0 PEN | Zeiss | 415190-9041-000 | Slides for laser microdissection |
| Adhesive Cap 200 opaque | Zeiss | 415190-9181-000 | Tubes for laser microdissection |
| PicoPure RNA Isolation Kit | ThermoFisher Scientific | KIT0204 |
References
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