Abstract
Gener med viktige roller i utviklingen har ofte romlig og / eller tidsmessig begrenset uttrykk mønstre. Ofte disse genet transkripsjoner ikke blir oppdaget eller ikke identifisert som forskjellig uttrykt (DE) i transcriptomic analyser av hele anlegget organer. Laser mikrodisseksjon RNA-Seq (LM RNA-Seq) er et kraftig verktøy for å identifisere gener som er DE i spesifikke utviklings domener. Men til valg av cellulære domener microdissect og sammenligne, og nøyaktigheten av microdissections er avgjørende for å lykkes i forsøkene. Her to eksempler illustrerer design hensyn til transcriptomics eksperimenter; en LM RNA-seq analyse for å identifisere gener som er de langs mais blad proksimale-distale akse, og et andre eksperiment for å identifisere gener som er i DE liguleless1-R (LG1-R) mutanter sammenlignet med vill-type. Sentrale elementer som bidro til suksessen til disse eksperimentene ble rede histologiske og i situ hybridisering analyser for regionen som skal bli analysert, valg av blad primordia ved ekvivalente utviklingsstadier, bruk av morfologiske landemerker for å velge områder for mikrodisseksjon, og mikrodisseksjon av nøyaktig målt domener. Denne artikkelen gir en detaljert protokoll for analyse av utviklings domener ved LM RNA-Seq. Dataene presentert her illustrerer hvordan regionen valgt for mikrodisseksjon vil påvirke de oppnådde resultater.
Introduction
Mais blad er en ideell modell for å studere dannelsen av utviklingsfelt under morphogenesis, som den har en tydelig grense mellom bladet og skjede som er mottagelig for genetisk disseksjon (figur 1A). Under de tidlige stadier av blad utvikling, en lineær band av mindre celler, preligule band (PLB), subdivides bladet primordium inn i pre-blad og pre-kappe domener. En pannelugg-lignende ligule og trekantede ytterøret utvikles fra PLB (Figur 1A, C, D). Genetiske skjermer har identifisert mutasjoner som forstyrrer blad kappe grense. For eksempel recessive liguleless1 (LG1) mutasjoner slette ligule og ytterøret 1, 2, 3, 4 (figur 1B). In situ hybridisering viste at LG1 transkripsjon akkumulerer på PLB og nye ligule, noe som gjør det til et utmerket markør for ligule utvikling 5, 6 (figur 1E).
Figur 1: Wild-type og liguleless1-R mais blader. (A) Blade-kappe grenseområdet av modent villtype blad som viser ligule og aurikkel strukturer. (B) Blade-slire grenseområdet av modne liguleless1-R blad som viser fravær av ligule og auricle strukturer. Blader i A og B har blitt halvert langs midrib. (C) Lengdesnitt gjennom villtype blad primordium. Prøve har blitt behandlet og farget for histologisk analyse. Den initierende ligule er tydelig som en brak stikker ut fra planet til bladet (pilspiss). (D) Longitudinal sektion gjennom villtype blad primordium. Prøve er blitt behandlet for LM som beskrevet i teksten. Arrowhead viser initiere ligule. (E) LG1 in situ hybridisering av shoot apex lateral lengdesnitt. Stjernene viser LG1 transkripsjon opphopning på PLB av P6 blad primordium. Piler indikerer base av P6 primordium. Linjen indikerer målingen fra bunnen av primordium til PLB. Skala barer i A og B = 20 mm. Skala barer i CE = 100 mikrometer. Dette tallet har blitt modifisert fra referanse 6 (Copyright American Society of Plant Biologer). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
I denne studien ble LM RNA-Seq anvendes til å identifisere en rekke gener som er differensielt uttrykt (DE) ved blad-kappe grense i forhold til andre deler av bladet primordium og til Ide ntify gener som er i DE LG1-R-mutanter i forhold til villtype-søsken. LM RNA-Seq er en metode for å kvantifisere transkripsjonen akkumulering i spesifikke celler eller cellulære domener 7. LM systemer kombinerer en laser og et mikroskop med et digitalt kamera. Kåret vev er montert på objektglass og sett gjennom mikroskop. LM programvaren inneholder vanligvis tegneverktøy som tillater brukeren å skissere noen utvalgte region for mikrodisseksjon. Laser kutt langs linjen, og det valgte vevet er slynget ut av lysbildet og inn i et rør suspendert over raset. LM tillater brukeren å microdissect presise domener, inkludert spesifikke cellelagene og til og med enkeltceller 8, 9. RNA kan deretter ekstraheres fra microdissected vev. Deretter benytter RNA-Seq komponent neste generasjons sekvense å sekvensere cDNA bibliotek generert fra den utpakkede RNA 10,= "xref"> 11.
Viktige fordeler med LM RNA-seq er evnen til å kvantifisere transkripsjon opphopning i presist definerte domener og kapasitet til å profilere hele transkriptomet samtidig 7. Teknikken er spesielt egnet til sondering tidlige utviklings hendelser hvor regionen av interesse er ofte mikroskopisk. Tidligere studier har benyttet LM kombinert med mikromatriser å studere utviklingsmessige prosesser i planter 9, 12, 13. RNA-Seq har fordelen av å kvantifisere transkripsjoner over et bredt dynamisk område, inkludert lav uttrykte gener, og før sekvensinformasjon er ikke påkrevd 10, 11. Videre har LM RNA-Seq potensial til å markere utviklingsmessig viktige gener som kan være savnet i mutagenese skjermer på grunn av genetisk redundans eller til dødelighet av tapet-of-funksjon mutant.
Utviklingsmessig viktige gener, for eksempel smale sheath1 (ns1) og cup-formet cotyledon2 (CUC2), har ofte spesifikke uttrykk mønstre av bare ett eller noen få celler 17, 18, 19, 20. Mange er uttrykt bare i løpet av tidlige utviklingsstadier, og ikke i den modne organ. Når hele organer eller store domener er analysert, er disse cellespesifikke transkripsjoner utvannet og kan ikke påvises i mer konvensjonelle analyser. Ved å tillate analyser av nøyaktig definerte områder, muliggjør LM RNA-Seq Disse vevs-spesifikke gener kan identifiseres og kvantifiseres.
Avgjørende faktorene i suksess for eksperimentene beskrevet her var en grundig histologisk analyse som guidet valg av riktig utviklingsstadiet og domene for analyse, og nøyaktig måling avnt av celle-vev domener for LM. For å sikre at tilsvarende domener ble prøvetatt for alle replikater, ble vev hentet fra bladet primordia på samme utviklingsstadiet og de microdissected domenene ble målt i forhold til morfologiske landemerker, for eksempel den nye ligule (figur 2). Det er kjent at noen gener som skal uttrykkes i en gradient fra spissen til foten av bladet. Ved å måle nøyaktige domener, variasjoner som skyldes sampling fra forskjellige steder langs bladet proksimale-distale akse ble holdt på et minimum (figur 3A). Ved microdissecting domener av samme størrelse, for å variasjon på grunn av differensial fortynning av celle-spesifikke transkripter ble også redusert (figur 3B). Lateral lengdesnitt av skyte apex ble brukt for alle microdissections. Disse er deler som er vinkelrett på midrib-margin akse (figur 4). Ved hjelp av bare deler som inkluderer SAM sikrer at tilsvarende side regioneneblad primordia analyseres.
I prøver bearbeidet og seksjonert for LM, den første morfologiske tegn på ligule utvekst er en kul på adaxial side grunnet periclinal celledelinger i adaxial epidermis (figur 1D, figur 2). Det ble bestemt at den nye ligule kan bli pålitelig identifiseres ved plastochron 7 scenen blad primordia. Vi var interessert i genene kommer til uttrykk i hele ligule regionen, inkludert den nye ligule og cellene umiddelbart distale som vil danne atriet. For å sikre at tilsvarende vev valg ble gjort, ble det ligule bump anvendt som en morfologisk fjell og et 100 um rektangel sentrert på ligule bump ble valgt for LM (figur 2A, 2B). Tilsvarende store rektangler av pre-blad og pre-slire ble valgt ut fra de samme blad primordia.
Analyser av liguleless mutant planter presentert en annen Challenge; LG1-R mutanter danner ikke et ligule, derfor er dette morfologiske funksjonen kan ikke brukes til å velge området for LM. I stedet ble domenet til LG1 transkript akkumulering i vill-type blad primordia bestemmes, og en region som ville omfatte dette domenet ble definert. Disse preliminære analyser ble utført på frøplanter fra det samme plante som ble anvendt for den endelige analysen, siden tidligere arbeid har vist at plasseringen av PLB varierer avhengig av vekstbetingelsene. In situ hybridisering indikerte at LG1 transkripsjoner akkumuleres i PLB av P6 blad primordia (figur 1E). Vi har valgt et domene 400-900 um fra undersiden av bladet primordia som omfattet domenet til LG1 uttrykket (purpur rektangler, figur 2A) og fanges opp de tilsvarende områder fra villtype og LG1-R planter. For å minimere variasjon i genetiske bakgrunn og vekstvilkår når man sammenligner transcript akkumulering i LG1-R og planter av vill type, segregere familier av mutanter og villtype-søsken ble anvendt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Fiks vev for histologisk analyse samtidig som vevet er fast for LM. Undersøk farget seksjoner for morfologiske egenskaper som vil lede senere LM. Når man sammenligner mutant til villtype, utføre in situ hybridisering eller immunolocalization for å definere domene der genet av interesse uttrykkes (i dette tilfellet LG1).
1. Tissue Fiksering og prosessering
- Grow leiligheter av mais planter til to uker gamle under standardbetingelser 6.
- Dissekere skyte toppunktene for sideseksjoner (figur 4).
- Vesenet frøplante like under jorda linje.
- Ved hjelp av et barberblad, fjerne tynne skiver fra undersiden av stammen (kutt 1, figur 4A) til en oval av culm omkranset av ett eller to modne bladene er synlig (figur 4B).
- Lag en annen kuttet omtrent 10 mm over bunnen (kuttet 2, figur 4A).Denne 10 mm segmentet vil inneholde SAM og unge blad primordia.
- Snu 10 mm segment slik at basen er vendt opp. Lag to kutt parallelt med tverraksen, slik at en skive av vev 2-3 mm tykkelse er oppnådd (kutt 3, og 4, figur 4B). Kast de to ytterste delene og beholde den sentrale skive for fiksering og innebygging.
MERK: ytterste bladene kan trimmes og kastes.
- Fiks vev og prosess for innebygging.
- Sørg for at alle materialer som skal brukes i påfølgende trinn er RNase gratis. Behandle oppløsninger med dietylpyrokarbonat (DEPC) (1 ml DEPC per liter oppløsning. Inkuber over natten med leilighetsvis risting, og autoklav). Bake glass i en ovn ved 200 ° C eller høyere i minst 6 timer og behandle plast ware med RNase dekontaminering løsning.
- Dag 1: Fordyp vevssnitt i ~ 10 ml Bondens fix (3: 1 Etanol: Eddiksyre) i hetteglass på is. Etter at alle prøvene har blitt dissekert, gjelder vacuum for å fjerne luftbobler og hjelp penetrasjon av fiksativ. Hold under vakuum i 10 minutter og deretter løsne vakuum sakte. Bytt fiksativ og inkuberes ved 4 ° C over natten med forsiktig risting.
- Dag 2: Inkuber i den følgende serie av løsninger, ~ 10 ml i hver, en time hver, alle med forsiktig risting; 85% etanol ved 4 ° C, 95% etanol ved 4 ° C, 100% etanol ved 4 ° C, 100% etanol ved 4 ° C, 100% etanol ved 4 ° C, 1: 1 etanol: xylen ved værelsestemperatur, 100% xylen ved værelsestemperatur, 100% xylen ved værelsestemperatur.
MERK: xylener er giftig ved kontakt og innånding. Arbeid i et avtrekksskap og bruke egnede hansker. - Legg parafin vev innstøpningsmediet pelletene til omtrent halve volumet av xylener og inkuber over natten ved romtemperatur med forsiktig risting.
- Dag 3: Overfør hetteglasset til 60 ° C ovnen til pellets smelter. Hell av løsning og erstatte med frisk smeltet vev innstøpningsmediet. Endre medium to gangeri løpet av dagen.
- Dag 4: Endre vev innstøpningsmediet gang om morgenen. Gå tilbake til 60 ° C ovnen til ettermiddag.
- Cast blokker
- Plasser innebygging muggsopp på kokeplate av vev embedding stasjon. Bruk pinsett til å overføre vevsprøver til de innebygging formene med snittflaten ned. Fyll opp formen med smeltet parafin og plasser innebygging ring på toppen av formen. Overføring til en kald plate før parafinen har stivnet. Oppbevar parafinblokker ved 4 ° C i en lufttett beholder med silikagel.
2. Seksjonering og Slide Forberedelse
- Klipp 10 mikrometer seksjoner på en mikrotom 25.
- Undersøk bånd og velge median seksjoner. Median delene er de som inkluderer SAM, som vises som en kuppel av celler omgitt av blad primordia.
- Mount seksjoner på lysbilder.
- Plasser lysbilder som er egnet for LM (enten RNase gratis ellerbakt) på 42 ° C skyv varmere og bruke flere dråper 50% etanol løsning for å dekke lysbildet.
- Float seksjoner på etanol løsning inntil delene har utvidet.
MERK: Flytende seksjoner på etanol løsning heller enn vann holder RNA i en utfelt tilstand redusere RNA degradering. - Vipp lysbildet og fjerne overflødig etanol løsning ved aspirasjon med et engangs overføringspipetten. Bruk lofri kluter til transportere bort noen ekstra etanol løsning.
- Tørr lysbilder på 42 ° C i flere timer eller over natten. Oppbevares lysbilder ved 4 ° C i en lufttett beholder med silikagel.
- Deparaffinize glir på den dag i bruk.
- Forbered tre glass Coplin krukker som inneholder; 100% xylener xylener (I), 100% xylener (xylener II), og 100% etanol (~ 50 ml av hver løsning).
- Ved hjelp av rene pinsett til å overføre lysbilder, dyppe objektglass i xylener I i 2 minutter, xylener II i 2 minutter, og 100% etanol i 1 min.
- Drain gledes på lofri kluter og lufttørke ved romtemperatur.
3. mikrodisseksjon av Blade, ligule og skjede Prøver fra Plastochron 7 Leaf Primordia
- Fest lysbilder på scenen av LM mikroskop. Bruk fem eller seks lysbilder for hver replikere, utnytte fem seksjoner per lysbilde.
MERK: Tissue pooling for en enkelt replikat er illustrert i figur 5. - Undersøk lysbilder og identifisere de fem mest median seksjoner på hvert lysbilde, ved hjelp av SAM apex som det sentrale referansepunkt.
MERK: Dette kan gjøres ved lav forstørrelse, er tilstrekkelig vanligvis en 5X mål. - Ved hjelp av 10X eller 20X objektiv, identifisere posisjonen til ligule på plastochron 7 blad primordium av hver seksjon. Den ligule vil være synlig som et brak som stikker ut fra adaxial overflaten av bladet primordium. Marker denne posisjonen ved hjelp av tegneverktøyet av LM programvare; velg blyantikonet, flytte markøren til den aktuelle positipå og klikk og dra musen til å tegne.
MERK: En 10X eller 20X objektiv er egnet for dette og etterfølgende trinn. Ved bruk av sidepartier, vil de to sider av hvert blad primordium være til stede i hver av delene (figur 2A). - Ved hjelp av linjalen verktøyet og den rektangulære tegneverktøy, måle 100 um store rektangler sentrert om ligule av hver seksjon (røde rektangler, figur 2A, 2B). Disse vil være "ligule" sample.
- For å bruke linjal verktøyet; velg hersker ikonet, flytter du markøren til den ene enden av objektet som skal måles, klikke og dra for å måle objektet. Lengden på linjalen vises på skjermen.
- For å tegne et rektangel; Velg rektangelet ikonet, flytter du markøren til et punkt som vil være ett hjørne av rektangelet, klikk og dra for å tegne et rektangel av passende størrelse. Alternativt kan du velge den rette linjen tegneverktøyet og tegne fire rette linjer.
- tiltak 100 mikrometer rektangler plassert 50 mikrometer over og under "ligule" rektangel.
MERK: Disse vil være "Blade" og "skjede" samples, henholdsvis (grønne og blå rektangler, figur 2A, 2B). Basert på våre histologiske data, omfatter en 100 mikrometer rektangel hele ligule regionen. Tilsvarende størrelse deler av blad og slire ble valgt for å sikre at tilsvarende mengder vev ble samlet for hver. Avstandsstykker på 50 mikrometer ble brukt for å sikre at ingen ligule region vev er utilsiktet inkludert i bladet eller skjede microdissections.
- Microdissect målt rektangler (figur 2D - 2F) 7, 8, 9, samle ligule, Blade og skjede prøver i separate rør. Bruke laser cut-funksjonen til å skjære gjennom vevet snitt langs omrisset av den valgte domene. Bruk catapult funksjon for å drive rektangelet av vev av sleiden og i lokket av røret (figur 2D - 2F).
4. mikrodisseksjon av Blade, ligule og skjede Adaxial epidermal Prøver fra Plastochron 7 Leaf Primordia
- Velg seksjoner og bruk linjal verktøy for å måle 100 mikrometer høye segmenter sentrert på plastochron 7 ligule, som beskrevet i kapittel 3 (ovenfor).
- Velg bare de adaxial epidermale celler av hver 100 mikrometer høy "Blade" og "skjede" segment (grønne og blå valg, figur 2C) ved å skissere med tegneverktøyet. Overhuden er det ytre cellelaget; den adaxial side er det en nærmest SAM.
- For "ligule" sample, velge bare de cellene i den nye ligule bump som beskrevet i punkt 3.3 (rød markering, figur 2C).
- Microdissect valgte regioner, samle Blade, ligule og Sheath epidermis prøver i separate rør, som beskrevet i kapittel 3.5.
5. mikrodisseksjon av Plastochron 6 Leaf Primordia fra LG1-R og villtype Søsken
- Grow segregerende familier av mutant (LG1-R) og vill-type planter.
- Fiks og prosess shoot toppunktene for LM, som beskrevet i avsnitt 1,2-1,4. Fix villtype og mutant skyte toppene i adskilte beholdere for å holde dem atskilt. Prøver fra samme planting bør være fast og behandlet for in situ hybridisering.
- Bestemme hvor LG1 blir transkribert i villtype-søsken, ved å utføre LG1 in situ hybridisering 6, 26, 27. Mål stilling LG1 avskrift opphopning fra bunnen av bladet primordium i flere prøver (figur 1E).
- Basert på in situ hybridisering data, velger delen av bladet primordium som omfatter regionen der LG1 er transkribert. I dette tilfellet, 400-900 um fra bunnen av plastochron 6 blad primordia (purpur rektangler, figur 2A).
- Microdissect utvalgt del av bladet primordia, slik det er beskrevet i avsnitt 3.5, samle LG1-R og villtypeprøver i separate rør.
6. Påfør RNA Extraction Buffer
- Påfør 50 mL RNA ekstraksjon buffer til microdissected vev og fortsett med RNA ekstraksjon. Fortsett med RNA ekstraksjon, RNA forsterkning, bibliotek konstruksjon, sekvensering og bioinformatikk analyse som beskrevet i referanse 6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bruke LM ordningen skissert i figur 2, ca. 1,000,000-1,500,000 mikrometer 2 av vev ble samlet for hver replikere i alle-Cell-lag LM (figur 5), og 200 000 mikrometer 2 per replikere for adaxial epidermis LM. Omtrent 2.500.000 mikrometer to av vev ble oppsamlet for hvert replikere i LM av LG1-R og vill-type blad primordia. To runder med lineær RNA forsterkning ga mikrogram mengder RNA for hver replikere. Mengden av RNA erholdt fra en hvilken som helst gitt mikrodisseksjon vil være avhengig av cellestørrelse og transkripsjonelle aktivitet samt mengden av vev tatt. Integriteten av RNA vil påvirke effektiviteten av RNA-amplifikasjon.
Avskrift akkumulering ble analysert i alle cellelagene i bladet, ligule og slire regionene og totalt 2359 DE genes ble funnet, med en falsk funnrate (FDR) på <0,05 (figur 6A). Spesielt 1,714 gener var DE mellom ligule og blad, 1,044 gener var DE mellom ligule og slire, og 657 gener var DE mellom blad og slire (noen gener er DE i mer enn en sammenligning). Gener ble klassifisert som oppregulert i ligule regionen hvis de ble betydelig oppregulert i både ligule forhold til bladet og ligule sammenlignet med slire. I alle cellelag LM, ble 373 gener signifikant oppregulert i ligule regionen.
Avskrift akkumulering ble analysert i adaxial epidermis blad, ligule og kappe regionene og totalt 3128 DE genene ble funnet; 1,971 gener var DE mellom ligule og blad, 2032 gener var DE mellom ligule og slire, og 871 gener var DE mellom blad og slire (figur 6B). 287 gener ble betydelig oppregulert i ligule sammenlignet med blad og slire epidermis.
Data for valgte gener som er oppregulert i den ligule region er presentert i Tabell 1 og Figur 7. En innledende in situ hybridisering analyse indikerte at LG1 transkripter akkumuleres spesifikt i PLB og den nye ligule av villtype blad primordia, og at LG1 er sterkere transkribert i overhuden enn i indre cellelag (Figur 6C). LM RNA-seq data som ble oppnådd er i overensstemmelse med dette resultat; LG1 transkripsjon opphopning er vesentlig høyere i den ligule enn i enten blad eller kappe i både epidermal LM og LM av alle cellelagene (tabell 1, figur 7A). LG1 har en høyere CPM i den epidermale analysen enn i analysen av alle cellelagene, i likhet med den situasjon som er vist i figur 8C.
ns1 var signifikant oppregulert i ligule regionen både i alle cellelagene LM og adaxial epidermis LM (tabell 1, figur 7B). Dette funnet ble bekreftet ved in situ hybridisering, som viser at ns1 transkripsjon akkumuleres spesielt i tuppen av den nye ligule (figur 6D). ns1 har en mye høyere lese teller i epidermis-bare LM analyse enn i LM av alle cellelag (19,6 CPM og 2,7 CPM, henholdsvis) på grunn av fortynning av transkripsjon i alle lag LM. Denne fortynningen effekt er illustrert i figur 8A. På samme måte, GRMZM2G101682, et gen av ukjent funksjon, hadde et høyere gjennomsnittlig lese telleverdien i den ligule epidermal LM enn i alle lag LM (tabell 1, figur 7C). In situ hybridisering viste at dette genet transkripsjon akkumuleres også sterkest i epidermal cellene (Figur 6E). Zm PIN1a var ikke signifikant DE i analysen av alle cellelagene, men var signifikant oppregulert i ligule i epidermis er bare for analyse (tabell 1, figur 7D). Dette er mest sannsynlig fordi Zm PIN1a er sterkt uttrykt i vaskulære vev og dette L2-avledet vaskulær uttrykk forundrer forskjeller i Zm PIN1a opphopning i overhuden når alle cellelag er samlet (figur 6F). En lignende situasjon er vist i figur 8B.
For å identifisere gener som er i DE LG1-R-mutanter, ble transkript akkumulering sammenlignet i et definert område av villtype og LG1-R P6 blad primordia. Ninety-seks gener var DE i LG1-R (FDR <0,05); 59 ble nedregulert i LG1-R mutanter, og 37 ble oppregulert. Data for utvalgte gener som er DE i <em> LG1-R-mutanter er vist i tabell 2. bel14 er en av 34 gener som er både oppregulert i ligule regionen i vill-type blad primordia og nedregulert i LG1-R mutanter. In situ hybridisering bekreftet at bel14 transkripter akkumuleres i preligule region i planter av vill type, men ikke i det tilsvarende område av LG1-R blad primordia 6.
Figur 2: Skjema for laser mikrodisseksjon av blad primordial domener. (A) Lateral lengdesnitt av mais skuddtopp behandlet for LM. Bokser indikere områder valgt for mikrodisseksjon. Ligule region vev (rød boks) ble microdissected fra 100 mikrometer høye rektangler, sentrert på PLB. Pre-blad (grønn) og pre-kappe (blå) vev ble tatt fra 100 umrektangler 50 um over og under preligule valg hhv. For sammenligning av villtype og LG1-R transcriptomes, vev mellom 400-900 mikrometer fra bunnen av P6 blad primordia ble microdissected fra sideseksjoner (lilla stiplet linje). (B) nærbilde P7 primordium og regioner valgt for mikrodisseksjon av alle cellelagene. (C) nærbilde P7 primordium og regioner valgt for mikrodisseksjon av adaxial epidermis. (D) Preligule regionen P7 primordium før mikrodisseksjon. Arrowhead indikerer posisjon initiere ligule. (E) Den røde linjen viser region valgt for mikrodisseksjon. Laseren vil kutte langs denne linjen. Sirkler indikerer punkter hvor laserpulser vil katapult vev. (F) primordium etter mikrodisseksjon. Sirkler indikerer punkter hvor laserpulser har slynget vev. SAM = skyte apikale meristem. P indikerer plastochron nummer. Skala barer = 100 &# 181; m. Dette tallet har blitt modifisert fra referanse 6 (Copyright American Society of Plant Biologer). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Regionen valgt for LM påvirker lese teller for gener som er de sammen bladet primordium. (A) Nøyaktig plassering av den valgte for LM i forhold til morfologiske landemerker region reduserer variasjonen for gener som blir uttrykt i en gradient langs bladaksen. I gjentak 1-3 på venstre side, er valg sentrert på den nye ligule resulterer i lav variant. I gjentak 1-3 på høyre, er plasseringen av regionen valgt for LM ikke konsekvent resulterer i økt variasjon. (B) Microdissecting en konsekvent størrelse svalget reduserer variasjon (replikerer 1-3 på venstre) sammenlignet microdissecting forskjellige størrelser valg (replikerer 1-3 på høyre) for gener med ligule spesifikke uttrykk mønstre. Transkripter er mer fortynnet i større utvalg, noe som resulterer i en lavere lese teller, og mer konsentrert i den mindre utvalg, noe som resulterer i en høyere lese teller. Tegneserier representerer lengdesnitt gjennom blad primordia i ligule regionen. Arrowhead viser initiere ligule. CPM = tellinger per million. SD = standardavvik. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Disseksjon av mais frøplante for sideseksjoner. (A) To uker gammel mais frøplante skåret på root-shoot veikryss. Fjern tynne skiver from bunnen av shoot (1) til en liten oval av culm er synlig på undersiden av shoot. Kontroller avskåret på tvers omtrent 10 mm over bunnen (2) og beholder denne sylinder. (B) Sylinder av vev orientert slik basen vender opp. Merk oval av culm omkranset av bladet. Foreta to langsgående kutt parallelt med tverraksen (3 og 4). Beholde og fikse sentral bit av vev, vil denne delen omfatter SAM og unge blad primordia. (C) tegneserie illustrerer planet av sideseksjonen (grønn stiplet linje) gjennom skuddtopp. Rød sirkel indikerer midrib, indikerer rød pilspiss marginer av grått blad primordium. Blå stiplet linje: midrib-margin aksen. Scale bar = 1 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Cartoon illustrerer pooling av laser microdissected vev for en gjengivelse av ligule regionen. Tissue microdissected fra fem til seks lysbilder er samlet for hver replikere. Fem median seksjoner fra hvert bilde blir brukt og to valg (røde rektangler) er laget fra hver seksjon. Hver rektangelet er ca 20 000 mikrometer to. Vev for hvert replikat oppsamles i et separat rør (blå oval). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: Antall DE gener i parvise sammenligninger mellom blad regioner og in situ hybridisering av utvalgte DE gener. (A) Antall DE gener i parvise sammenligningen mellomblad, ligule og slire regioner, LM av alle cellelagene. (B) Antall DE gener i parvise sammenligningen mellom blad, ligule og slire regioner, LM av bare adaxial epidermis. (C) LG1 in situ hybridisering. (D) ns1 in situ hybridisering. (E) GRMZM2G101682 in situ hybridisering. (F) ZmPIN1a in situ hybridisering. DE: uttrykt forskjellig. Opp i L: opp i ligule, opp i B: opp i bladet. Opp i S: opp i skjeden. Pilspisser i CF indikerer nye ligule. Arrow i F viser karakter opphopning i vaskulære vev. Skala barer = 100 mikrometer. Dette tallet har blitt modifisert fra referanse 6 (Copyright American Society of Plant Biologer). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
t = "Figur 7" src = "/ files / ftp_upload / 55004 / 55004fig7.jpg" />
Figur 7: Grafisk fremstilling av data for utvalgte DE gener. Figuren illustrerer data som er presentert i tabell 1 og in situ hybridisering resultater. Tegneserier representerer lengdesnitt gjennom blad primordia. Mørk blå indikerer transkripsjon akkumulering for et bestemt gen. Grønn, rød og blå boksene viser region valgt for mikrodisseksjon for blad, ligule og kappe prøver. Tegneserier på venstre illustrere LM av alle cellelag. Tegneserier på høyre illustrerer LM av bare adaxial epidermis. Annonse: adaxial epidermis, AB: abaxial epidermis, CPM: tellinger per million, indikerer stjerne signifikant forskjell mellom to domener. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
"Src =" / files / ftp_upload / 55004 / 55004fig8.jpg "/>
Figur 8: Cartoon illustrerer hvordan lese teller hypotetiske DE genene varierer avhengig av presise regionene valgt for mikrodisseksjon. (A) Gene med ligule-spesifikk ekspresjon. (B) Gene uttrykt i ligule og i vaskulære vev. (C) Gene uttrykkes spesifikt i ligule regionen i alle cellelagene, men med høyere ekspresjon i overhuden. (D) Gene uttrykt i ligule region, L2-avledede cellelagene bare. Tegneserier representerer lengdesnitt gjennom blad primordia. Mørk blå indikerer transkripsjon akkumulering for et bestemt gen. Grønn, rød og blå boksene viser region valgt for mikrodisseksjon for blad, ligule og kappe prøver. Tegneserier på venstre illustrere LM av alle cellelag. Tegneserier på høyre illustrerer LM av bare adaxial epidermis. Annonse: adaxial epidermis, AB: abaxial epidermis, CPM: cou NTS per million. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Tabell 1: Valgt gener oppregulert i den opprinnelige ligule. Tellinger per million: tellinger per million total transkripsjoner, mener tre gjentak, logFC = log base 2 ganger endring, FDR.BH: falske funnrate i henhold til Benjamini og Hochberg metode. Alle lag: LM av alle cellelag. Epidermis: LM av bare adaxial epidermis. Dette tallet har blitt modifisert fra referanse 6 (Copyright American Society of Plant Biologer). Klikk her for å se en større versjon av denne tabellen.
e 2 "src =" / files / ftp_upload / 55004 / 55004tbl2.jpg "/>
Tabell 2: Utvalgte gener DE i LG1-R mutanter. Tellinger per million: tellinger per million total transkripsjoner, mener tre gjentak, logFC = log base 2 ganger endring, FDR.BH: falske funnrate i henhold til Benjamini og Hochberg metode. Dette tallet har blitt modifisert fra referanse 6 (Copyright American Society of Plant Biologer). Klikk her for å se en større versjon av denne tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Eksperimentell design er en kritisk faktor i RNA-seq eksperimenter. Viktige betraktninger er den nøyaktige domene (r) og utviklingstrinn (e) som skal analyseres, og hvilke sammenligninger vil bli gjort. Det er viktig å tenke i form av sammenligninger, fordi produksjonen er vanligvis en liste av gener som er de mellom to eller flere betingelser. Som med alle eksperimenter, er det viktig å forandre bare en variabel om gangen. For eksempel, når man sammenligner ulike blad domener, går på samme alder og utviklingsstadiet, dyrkes under de samme forholdene bør sammenlignes.
Målet med disse eksperimentene var å identifisere gener som er særskilt opp- eller ned-reguleres i ligule region av villtype blad primordia, og for å identifisere gener som er i DE LG1-R-mutanter sammenlignet med vill-type. Vi først studert morfologi av utviklings blad primordia og mønsteret av LG1 transkripsjon akkumulering. Disse morfologiske og molekylære landemerker were benyttes til å velge nøyaktige domener for LM 14, 15, 16. I det første forsøket ble avskrift opphopning i ligule regionen sammenlignet med andre regioner i samme blad primordia, og dermed eliminere forskjeller grunnet vekstvilkår, genetisk bakgrunn, utviklingsstadiet, og plante til plante variasjon. For å sammenligne mutant til villtype, er det nødvendig å bestemme hvor og når genet av interesse blir uttrykt. Vi anbefaler å analysere uttrykket oppskriften ved enten in situ hybridisering eller immunolocalization og velge en region for LM som omfatter domenet av genuttrykk. Det er viktig at tilsvarende domener blir sammenlignet og at det genetiske bakgrunn er det samme for både mutant og vill-type.
Nøyaktigheten av microdissections kan verifiseres ved å sjekke lest teller for gener som er uttrykt spesifikt i domenet av interesse, hvis such gener er kjent. Dette kan også gjøres ved å utføre RT-PCR på RNA ekstrahert fra vev LM før å gjøre biblioteker for sekvensering. I forsøkene som beskrives her, LG1 fungerte som kontrollgruppe for LM av ligule regionen, siden in situ hybridisering analyser viste at LG1 uttrykk er spesifikk for PLB og nye ligule 5, 6.
I motsetning til metoder som RT-qPCR, hvor kandidaten gen (e) må være kjent, kvantifiserer RNA-seq akkumulering av alle transkripter i en gitt vevsprøve. Således er LM RNA-seq en nyttig metode for å identifisere kandidat gener. Et eksempel fra denne studien er GRMZM2G101682, et gen av ukjent funksjon som har en slående ligule spesifikke uttrykk mønster (figur 6E). Denne studien også identifisert gener som er DE i LG1-R, som bel14, som ikke hadde tidligere vært innblandet som fungerende nedstrøms LG1. i this eksempel er sammenligningen av flere datasett (oppregulert i villtype-ligule region og DE i LG1-R) var spesielt informativ. Det er viktig å merke seg at uttrykket mønster av et gen som ikke demonstrerer dens funksjon: følgende genetisk og / eller biokjemiske analyser er nødvendig for å etablere genfunksjon.
Transcriptomic analyser som er fokusert på små, diskrete utviklings domener, som er forskjellig tydelig og lett avgrenset, er de mest vellykkede. LM RNA-seq er en hensiktsmessig metode for slike analyser, og har potensiale til å bli brukt på mange utviklings fenomener. Den er særlig egnet til å identifisere differensial genekspresjon i mutanter av gener som er romlig begrenset ekspresjonsmønster, eller mutanter som påvirker utviklingen av spesifikke strukturer. Den kan også anvendes på prosesser som skjer i bestemte og identifiserbare celler eller vev, slik som hud eller blodkar, og har vært brukt ien transcriptomic analyse av mais skyte apikale meristem (SAM) ontogeny 16. Det er mindre hensiktsmessig å studere funksjonen av gener som blir uttrykt overalt, eller prosesser som skjer i alle celler. Metodene som presenteres her har blitt brukt til en rekke plantearter (mais, sorghum, Ocimum, Mentha og Antirrhinum) og strukturer (blad primordia, meristemer, jordstengler og trichomes).
LM er ikke nødvendig når en analyse innebærer relativt store domener. Faktisk har RNA-Seq på hånd dissekert eller hele organer blitt brukt med hell til å identifisere DE gener i planter 14, 15. Denne metoden har den fordel at den er mindre arbeidskrevende og ingen erfaring med histologiske teknikker er nødvendig. Det er imidlertid begrensninger i presisjonen av hånd disseksjoner, noe som betyr at hånd disseksjon er mindre egnet for å studere tidlig developmental prosesser.
For vellykket LM RNA-Seq analyser av fenomener i utvikling, må utviklingssammenheng være godt karakterisert. Vi anbefaler å gjennomføre en grundig histologisk undersøkelse av prosessen eller domenet av interesse før du planlegger et eksperiment. Den histologi av prøver behandlet for LM er generelt dårlig, fordi vevet er unstained og er ikke montert med dekkglass som gir dybde-of-field. Derfor er det nyttig å feste separate prøver for farging og observasjon samtidig som LM prøvene er fast (figur 1C, og D).
RNA oppnådd fra LM materiale er vanligvis fragmentert og det totale utbytte er lavt 8. Et forsterkningstrinn er nødvendig for å generere tilstrekkelig RNA for fremstilling av bibliotek 28. RNA-fragment lengde bør vurderes etter forsterkning og før bibliotek generasjon. En gjennomsnittlig fragment lengde på segVeral hundre basepar er generelt ansett som god, 500 basepar er utmerket. Dårlig RNA utbyttet kan bli resultatet hvis vevet er ikke godt fast, hvis degradering på grunn av RNase forurensning oppstår, eller hvis parafinblokker blir lagret feil. Det er nyttig å teste kvaliteten på fast vev ved å gjennomføre en prøve LM av et forholdsvis stort område før vier mye tid til microdissecting svært små domener. Fordi oppnådd fra LM-celler RNA er fragmentert og amplifikasjon ved anvendelse av en oligo dT-primer innfører en sterk 3'-bias, er denne metoden ikke egner seg for detektering av alternative transkripter som spleisevarianter. Det er heller ikke LM egnet til å påvise små RNA.
En alternativ metode for å kvantifisere transkripsjonen opphopning i bestemte vev eller cellulære domener er RNA-seq av celler adskilt av fluorescensaktivert cellesortering (FACS) 21. Denne metoden krever generelt identifikasjonen av en passende markørgen for området av interesse,generering av transgene planter som uttrykker en fluorescent-merket protein og protoplasting. FACS kombinert med microarray har blitt brukt til å generere et uttrykk kart over Arabidopsis roten ved å separere celler som uttrykker celletypespesifikke promotorer i roten 22, 23. FACS av Shoot vev er mer utfordrende enn rot vev på grunn av klorofyll autofluorescence 24. En begrensning av LM er at domenet av interesse må kunne identifiseres i histologiske snitt. FACS kan være en mer passende metode i tilfeller der en passende markør genet er tilgjengelig. Valget av hvilke celler eller vev for å isolere og sammenligne er en viktig faktor i transcriptomic analyser som bruker enten FACS eller LM.
De data som er presentert her viser at forskjellige resultater kan oppnås avhengig av de nøyaktige domenene som er valgt for LM (figur 3, Figur 8). Transkripsjoner av gener som blir uttrykt i ett eller noen få celler, slik som ns1, vil bli utvannet når store dels domener blir analysert. Det er sannsynlig at hvis hele bladet primordia ble samplet, ns1 avskrift ville ikke bli oppdaget. ZmPIN1a er betydelig oppregulert i ligule forhold til bladet og slire epidermis, men denne forskjellen er forvirret av vaskulær uttrykk når alle cellelag blir samplet. Omvendt gener som uttrykkes kun i L2-avledet cellelag vil ikke bli oppdaget når bare epidermis er samplet (figur 8D). Denne studien viser at mens LM RNA-Seq er et kraftig verktøy for å avdekke forskjeller i genuttrykk under morphogenesis, domener valgt for analyse er avgjørende for å lykkes i forsøket.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Forfatterne takker S. Hake for løpende samarbeid og stimulerende diskusjoner om ligule utvikling. Dette arbeidet er støttet av National Science Foundation Grants MCB 1052051 og IOS-1848478.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Diethyl pyrocarbonate | Sigma-Aldrich | 159220 | Used for RNase treatment of solutions |
| Razor blades | Electron Microscopy Sciences | 72000 | |
| RNase Zap | Sigma-Aldrich | R2020-250ML | RNase decontamination solution |
| Ethanol absolute 200 proof | Fisher Scientific | BP28184 | |
| Acetic acid, glacial | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Glass vials - 22 ml | VWR | 470206-384 | |
| Xylenes, histological grade | Sigma-Aldrich | 534056-4L | |
| Paraplast plus | Sigma-Aldrich | P3683-1KG | |
| Disposable base molds, 15 mm x 15 mm x 5 mm | VWR | 15154-072 | |
| Embedding rings | VWR | 15154-303 | |
| Silica gel packets | Electron Microscopy Sciences | 71206-01 | Desiccant for storage of paraffin blocks |
| Oven | Fisher Scientific | 15-103-0503 | Oven must maintain temperature of 60 °C |
| Paraffin embedding station | Leica | EG1160 | |
| Microtome | Leica | RM2235 | |
| Slide warmer | Electron Microscopy Sciences | 71317-10 | |
| Coplin jars | Electron Microscopy Sciences | 70316-02 | |
| Laser microdissector | Zeiss | ||
| KIMWIPES™ Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark Professional | 34120 | Lint-free wipes for wicking excess solutions from microscope slides |
| Membrane Slide 1.0 PEN | Zeiss | 415190-9041-000 | Slides for laser microdissection |
| Adhesive Cap 200 opaque | Zeiss | 415190-9181-000 | Tubes for laser microdissection |
| PicoPure RNA Isolation Kit | ThermoFisher Scientific | KIT0204 |
References
- Becraft, P. W., Bongard-Pierce, D. K., Sylvester, A. W., Poethig, R. S., Freeling, M. The liguleless-1 gene acts tissue specifically in maize leaf development. Dev Biol. 141 (1), 220-232 (1990).
- Sylvester, A. W., Cande, W. Z., Freeling, M. Division and differentiation during normal and liguleless-1 maize leaf development. Development. 110 (3), 985-1000 (1990).
- Moreno, M. A., Harper, L. C., Krueger, R. W., Dellaporta, S. L., Freeling, M. liguleless1 encodes a nuclear-localized protein required for induction of ligules and auricles during maize leaf organogenesis. Genes Dev. 11 (5), 616-628 (1997).
- Emerson, R. A. The inheritance of the ligule and auricle of corn leaves. Neb. Agr. Exp. Sta. An. Rep. 25, 81-85 (1912).
- Moon, J., Candela, H., Hake, S. The Liguleless narrow mutation affects proximal-distal signaling and leaf growth. Development. 140 (2), 405-412 (2013).
- Johnston, R., et al. Transcriptomic Analyses Indicate That Maize Ligule Development Recapitulates Gene Expression Patterns That Occur during Lateral Organ Initiation. Plant Cell. 26 (12), 4718-4732 (2014).
- Schmid, M. W., et al. A powerful method for transcriptional profiling of specific cell types in eukaryotes: laser-assisted microdissection and RNA sequencing. PLoS One. 7 (1), e29685 (2012).
- Kerk, N. M., Ceserani, T., Tausta, S. L., Sussex, I. M., Nelson, T. M. Laser capture microdissection of cells from plant tissues. Plant Physiol. 132 (1), 27-35 (2003).
- Nakazono, M., Qiu, F., Borsuk, L. A., Schnable, P. S. Laser-capture microdissection, a tool for the global analysis of gene expression in specific plant cell types: identification of genes expressed differentially in epidermal cells or vascular tissues of maize. Plant Cell. 15 (3), 583-596 (2003).
- Marioni, J. C., Mason, C. E., Mane, S. M., Stephens, M., Gilad, Y. RNA-seq: an assessment of technical reproducibility and comparison with gene expression arrays. Genome Res. 18 (9), 1509-1517 (2008).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
- Brooks, L., et al. Microdissection of shoot meristem functional domains. PLoS Genet. 5 (5), e1000476 (2009).
- Cai, S., Lashbrook, C. C. Stamen abscission zone transcriptome profiling reveals new candidates for abscission control: enhanced retention of floral organs in transgenic plants overexpressing Arabidopsis ZINC FINGER PROTEIN2. Plant Physiol. 146 (3), 1305-1321 (2008).
- Li, P., et al. The developmental dynamics of the maize leaf transcriptome. Nat Genet. 42 (12), 1060-1067 (2010).
- Eveland, A. L., et al. Regulatory modules controlling maize inflorescence architecture. Genome Res. 24 (3), 431-443 (2014).
- Takacs, E. M., et al. Ontogeny of the maize shoot apical meristem. Plant Cell. 24 (8), 3219-3234 (2012).
- Aida, M., Ishida, T., Tasaka, M. Shoot apical meristem and cotyledon formation during Arabidopsis embryogenesis: interaction among the CUP-SHAPED COTYLEDON and SHOOT MERISTEMLESS genes. Development. 126 (8), 1563-1570 (1999).
- Ishida, T., Aida, M., Takada, S., Tasaka, M. Involvement of CUP-SHAPED COTYLEDON genes in gynoecium and ovule development in Arabidopsis thaliana. Plant Cell Physiol. 41 (1), 60-67 (2000).
- Takada, S., Hibara, K., Ishida, T., Tasaka, M. The CUP-SHAPED COTYLEDON1 gene of Arabidopsis regulates shoot apical meristem formation. Development. 128 (7), 1127-1135 (2001).
- Nardmann, J., Ji, J., Werr, W., Scanlon, M. J. The maize duplicate genes narrow sheath1 and narrow sheath2 encode a conserved homeobox gene function in a lateral domain of shoot apical meristems. Development. 131 (12), 2827-2839 (2004).
- Bonner, W. A., Hulett, H. R., Sweet, R. G., Herzenberg, L. A. Fluorescence activated cell sorting. Rev Sci Instrum. 43 (3), 404-409 (1972).
- Birnbaum, K., et al. A gene expression map of the Arabidopsis root. Science. 302 (5652), 1956-1960 (2003).
- Brady, S. M., et al. A high-resolution root spatiotemporal map reveals dominant expression patterns. Science. 318 (5851), 801-806 (2007).
- Carter, A. D., Bonyadi, R., Gifford, M. L. The use of fluorescence-activated cell sorting in studying plant development and environmental responses. Int J Dev Biol. 57 (6-8), 545-552 (2013).
- Ruzin, S. E. Plant microtechnique and microscopy. , Oxford University Press. New York; Oxford. (1999).
- Jackson, D., Veit, B., Hake, S. Expression of maize KNOTTED1 related homeobox genes in the shoot apical meristem predicts patterns of morphogenesis in the vegetative shoot. Development. 120, 405-413 (1994).
- Javelle, M., Marco, C. F., Timmermans, M. In situ hybridization for the precise localization of transcripts in plants. J Vis Exp. (57), e3328 (2011).
- Day, R. C., McNoe, L., Macknight, R. C. Evaluation of global RNA amplification and its use for high-throughput transcript analysis of laser-microdissected endosperm. Int J Plant Genomics. , 61028 (2007).
