Abstract
גנים עם תפקידים חשובים בפיתוח לעתים קרובות יש מרחבית ו / או דפוסי ביטוי מוגבלים בזמן. לעתים קרובות תמלילי גנים אלה אינם מזוהים או אינם מזוהים כפי שבאו לידי הביטוי באופן דיפרנציאלי (DE) בניתוחי transcriptomic איברי צמח כולו. לייזר Microdissection RNA-seq (LM RNA-seq) הוא כלי רב עוצמה כדי לזהות גנים הם DE בתחומים התפתחותיים ספציפיים. עם זאת, הבחירה של תחומים הסלולר microdissect ולהשוות, ואת הדיוק של microdissections הם קריטיים להצלחת הניסויים. הנה, שתי דוגמאות להמחיש שיקולי תכנון ניסויים transcriptomics; ניתוח RNA-seq LM לזהות גנים דה לאורך ציר הפרוקסימלי-דיסטלי עלה תירס, וכן בניסוי השני כדי לזהות גנים הם DE ב liguleless1-R (lg1-R) מוטציות לעומת wild-type. מרכיבים מרכזיים שתרמו להצלחת הניסויים הללו פורטו היסטולוגית ב סיכלת tu המנתח של האזור להיות מנותחת, מבחר primordia עלה בשלבי התפתחותיים מקבילים, השימוש ציוני דרך מורפולוגיים לבחור אזורים עבור microdissection, ו microdissection של תחומים למדוד בדייקנות. מאמר זה מספק פרוטוקול מפורט לניתוח תחומי התפתחותיים ידי LM RNA-seq. הנתונים המוצגים כאן להמחיש עד כמה את האזור שנבחר עבור microdissection ישפיע על התוצאות שהושגו.
Introduction
העלה התירס הוא מודל אידיאלי לחקור היווצרות שדות התפתחותית במהלך המורפוגנזה, שכן יש בה גבול ברור בין הלהב לבין הנדן כי ניתן לנתיחה גנטית (איור 1 א). במהלך השלבים המוקדמים של פיתוח עלה, להקה ליניארי של תאים קטנים יותר, הלהקה preligule (PLB), subdivides העלה primordium לתחומים מראש להב וטרום-נדן. Ligule שולי דמוי auricles משולש לפתח מן PLB (איור 1 א ', ג', ד). מסך גנטי זיהה מוטציות המשבשות את גבול להב-נדן. לדוגמה, liguleless1 רצסיבי (lg1) מוטציות למחוק את ligule ו auricles 1, 2, 3, 4 (איור 1 ב). באתרו הכלאה גילתה כי תמליל lg1 מצטבר על PLB ומתפתחים ligule, מה שהופך אותו סמן מצוין לפיתוח ligule 5, 6 (איור 1E).
איור 1: wild-type ו liguleless1-R עלי תירס. (א) גבול Blade-נדן באזור עלה wild-type הבוגרת מראים מבני ligule ו אפרכסת. (ב) באזור הגבול Blade-נדן היעדרות מראה עלה בוגרת liguleless1-R של מבנים ligule ו אפרכסת. עלים ב A ו- B קוצצו במחצית לאורך midrib. (ג) אורך קטע דרך primordium עלה wild-type. לדוגמא תעובד ומוכתם לניתוח היסטולוגית. Ligule הייזום ניכר כבליטה הבולטת מהמטוס של העלה (ראש החץ). (ד) כת אורכיתיון דרך primordium עלה wild-type. לדוגמא תעובד עבור LM כמתואר בטקסט. ראש החץ מציין ייזום ligule. (E) lg1 הכלאה באתרו של חתך לאורך לרוחב איפקס לירות. כוכביות מצביעים הצטברות תמליל lg1 בבית PLB של primordium עלה P6. החצים מצביעים על בסיס של primordium P6. בר מציין מדידה מהבסיס של primordium אל PLB. ברי סולם ב A ו- B = 20 מ"מ. ברים בקנה מידה לספירה = 100 מיקרומטר. נתון זה יש הבדל בין התייחסות 6 (אגודה האמריקנית זכויות יוצרים של ביולוגי צמח). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
במחקר זה, LM RNA-seq הועסק לזהות חבילה של הגנים באים לידי ביטוי באופן דיפרנציאלי (DE) בבית ביחס גבול להב-נדן לחלקים אחרים של primordium עלה ל IDE גני ntify כי הם DE ב lg1-R מוטציות ביחס אחי wild-type. LM RNA-seq היא שיטה לכימות הצטברות תמליל בתאים ספציפיים או תחומים הסלולר 7. מערכות LM לשלב לייזר מיקרוסקופ עם מצלמה דיגיטלית. רקמה מחולקת היא רכובה על שקופיות נצפית מבעד למיקרוסקופ. תוכנת LM כוללת בדרך כלל כלי ציור המאפשרים למשתמש להתוות בכל אזור שנבחר עבור microdissection. קיצוצי הליזר לאורך הקו, ואת הרקמה שנבחרו הזניקו את השקופית לתוך צינור התלוי מעל השקופית. LM מאפשר למשתמש microdissect תחומים מדויק, כולל שכבות תאים ספציפיים יחיד, גם תאי 8, 9. RNA ניתן לחלץ אז מרקמת microdissected. בהמשך לכך, מרכיב-Seq RNA מנצל רצף של הדור הבא רצף ספריות cDNA שנוצר מן RNA חילוץ 10,= "Xref"> 11.
יתרונות עיקריים של רנ"א-seq LM הם היכולת לכמת הצטברות תמליל בתחומים מוגדרים במדויק ואת היכולת גטסבי הגדול transcriptome כולו 7 זמנית. הטכניקה מתאימה במיוחד חיטוט אירועים התפתחותי מוקדם שבי את האזור של עניין הוא לעתים קרובות מיקרוסקופי. מחקרים קודמים מנוצל LM בשילוב עם הטכנולוגיה microarray ללמוד תהליכים התפתחותיים בצמחים 9, 12, 13. יש RNA-seq היתרון של לכימות תמלילים על פני טווח דינמי רחב, כוללים גנים נמוכים הביע, ומידע רצף לפני אינו נדרש 10, 11. יתר על כן, LM RNA-seq יש הפוטנציאל להדגיש גנים חשובים מבחינה התפתחותית שעשויות מוחמצות מסכי mutagenesis בשל יתירות גנטית או לערוך קטלני של האובדן-של-מוטצית פונקציה.
מבחינה התפתחותית גנים חשובים, כגון sheath1 צר (ns1) ו cotyledon2 בצורת כוס (cuc2), לעתים קרובות יש דפוסי ביטוי ספציפי אחד בלבד או מספר תאים 17, 18, 19, 20. הרבים באים לידי ביטוי רק במהלך שלבי התפתחות מוקדמים ולא באיבר הבוגר. כאשר איברים שלמים או תחומים גדולים מנותחים, תמלילי תא ספציפי אלה הם בדילול וייתכן שלא להתגלות יותר ניתוחים קונבנציונליים. על ידי התרת ניתוחים של תחומים מוגדרים במדויק, LM RNA-seq מאפשר גני הרקמות ספציפיות אלה כדי להיות מזוהים לכימות.
גורמים מכריעים בהצלחתה של הניסויים שתוארו כאן היו ניתוח היסטולוגית יסודי שהנחה מבחר הבמה המושלמת ההתפתחותית המתאימה לניתוח, ו measureme המדויקNT של תחומי רקמות תאים עבור LM. כדי להבטיח כי לדומיינים מקבילים נדגמו לכל משכפל, רקמות נאסף primordia עלה באותו שלב התפתחותי התחומים microdissected נמדדו ביחס ציוני דרך מורפולוגיים כגון ligule המתעוררים (איור 2). זה ידוע כי גנים מסוימים מתבטאים שיפוע מהקצה לבסיס של העלה. באמצעות מדידת תחומים מדויקים, וריאציה בשל דגימה ממקומות שונים לאורך הציר הפרוקסימלי-דיסטלי עלה הוחזק על (איור 3 א) מינימום. על ידי microdissecting תחומים של באותו גודל, וריאציה בשל דיפרנציאלי דילול של תמלילי תא ספציפי הופחת גם (איור 3B). סעיפים אורכים לרוחב של הקודקוד לירות שמשו כל microdissections. אלה הם חלקים כי הם בניצב לציר midrib-שוליים (איור 4). באמצעות סעיפים בלבד הכוללים את SAM מבטיח כי אזורים לרוחב מקבילים שלprimordia עלה מנותחים.
בדגימות מעובדים מחולקים עבור LM, סימן מורפולוגיים הראשון של תולדת ligule הוא בליטה בצד adaxial עקב חלוקות תא periclinal באפידרמיס adaxial (1D איור, איור 2). לעניין זה נקבע כי ligule המתעוררים יכול להיות מזוהה באופן מהימן לפי primordia עלה שלב פלסטוכרון 7. היינו מעוניינים גנים הביעו באזור ligule כולו, כולל ligule המתעוררים והתאים מייד דיסטלי שיהוו את האפרכסת. על מנת להבטיח כי בחירות רקמות מקבילות נעשו, גבשושית ligule שמשה כציון דרך מורפולוגיים מלבנים 100 מיקרומטר מרוכזים על בליטת ligule נבחרה LM (איור 2 א, 2 ב). מלבנים בגודל שווה של שבשבת טרום-נדן מראש נבחרו מאותו primordia עלה.
ניתוח של צמחים מוטנטים liguleless הציג challe שונהnge; מוטציות lg1-R לא יוצרים ligule, ולכן תכונה מורפולוגית זה לא יכול לשמש כדי לבחור את האזור עבור LM. במקום זאת, התחום של הצטברות תמליל lg1 ב primordia עלה wild-type נקבע, וכן באזור שיקיף תחום זה הוגדר. ניתוחים ראשוניים אלה בוצעו על השתילים מאותו שתילה כמו שימשו בסופו של דבר, מאז מחקרים קודמים הראו כי מיקומו של PLB משתנה בהתאם לתנאי הגידול. באתרו הכלאה ציינו כי תמלילי lg1 להצטבר primordia עלה PLB של P6 (איור 1E). בחרנו מיקרומטר תחום 400-900 מהבסיס של primordia עלה שהקיף את תחום ביטוי lg1 (מלבנים סגולים, איור 2 א) וכבש אזורים המקבילים אלה מן wild-type וצמחי lg1-R. כדי למזער וריאציה בתנאי הרקע וצמיחה גנטי כאשר משווים transcripהצטברות t ב lg1-R וצמחים בר-סוג, תוך הפרדת משפחות של מוטציות ואחי wild-type שמשה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: תקן רקמות לניתוח היסטולוגית באותו הזמן כי רקמה הוא קבוע עבור LM. בדוק סעיפים מוכתמים עבור תכונות מורפולוגיות כי תדרכנה מאוחר LM. בהשוואת מוטציה wild-type, לבצע הכלאה באתרו או immunolocalization להגדיר את התחום שבו הגן של עניין מתבטא (ב lg1 במקרה זה).
קיבוע רקמות 1. ועיבוד
- לגדול דירות של שתילי תירס עד שבועות ישנים בתנאים סטנדרטיים 6.
- לנתח apices לירות עבור חלקים לרוחב (איור 4).
- שתיל ובלו רק מתחת לקו הקרקע.
- באמצעות סכין גילוח, להסיר פרוסות דקות מבסיס הגבעול (חתכי 1, איור 4 א) עד אליפסה של culm המוקפת אחד או שני עלים בוגרים גלוי (איור 4B).
- הפוך להורדת ריבית נוספת כ 10 מ"מ מעל הבסיס (לחתוך 2, איור 4 א).קטע 10 מ"מ זה יכיל את SAM ו primordia העלים הצעירים.
- סובב את קטע 10 מ"מימ ולכן הבסיס הוא פונה כלפי מעלה. בשני חתכים מקבילים לצייר לרוחב כך פרוס מ"מ רקמת 2-3 מתקבל עבה (חתכים 3, ו -4, איור 4B). מחק את שני חלקים החיצוניים ולשמר את הפרוסה המרכזת קיבעון והטבעה.
הערה: עלים חיצוניים עשויים להיות מטופחים וזנוח.
- תקן רקמות תהליך להטבעה.
- ודא כי כל החומרים לשמש בשלבים הבאים חופשי RNase. פנקו את הפתרונות עם diethyl pyrocarbonate (DEPC) (1 מ"ל DEPC לליטר פתרון. דגירה לילה עם רעד מדי פעם, החיטוי). כלי זכוכית אופים בתנור ב 200 מעלות צלזיוס ומעלה במשך לפחות 6 שעות ולטפל כלי פלסטיק עם פתרון טיהור RNase.
- יום 1: לטבול בחתכי רקמה ב ~ 10 מ"ל של תיקון של פארמר (3: 1 אתנול: חומצה אצטית) ב בקבוקון זכוכית על הקרח. אחרי הכל הדגימות כבר גזורות, להחיל vacuuמ 'כדי להסיר בועות אוויר וחדירה לעזרת מקבע. חזק תחת ואקום במשך 10 דקות ולאחר מכן לשחרר את הוואקום לאט. החלף מקבע ו דגירה על 4 מעלות צלזיוס לילה עם רעד עדין.
- יום 2: דגירה בסדרת הפתרונות הבאים, ~ 10 מ"ל כל אחת, 1 hr כל, כל עם רעד עדין; 85% אתנול ב 4 ° C, 95% אתנול ב 4 ° C, אתנול 100% ב 4 ° C, 100% אתנול ב 4 ° C, 100% אתנול ב 4 ° C, 1: 1 אתנול: xylenes בטמפרטורת החדר, xylenes 100% בטמפרטורת החדר, 100 xylenes% בטמפרטורת החדר.
הערה: xylenes רעיל על ידי מגע ושאיפה. העבודה במנדף ולהשתמש בכפפות מתאימות. - להוסיף רקמת פרפין הטבעה כדורי בינוני עד כמחצית היקף xylenes דגירה לילה בטמפרטורת החדר עם רעד עדין.
- יום 3: מעביר את הבקבוקון עד 60 ° C בתנור עד הכדורים להמס. יוצק את הפתרון ולהחליף עם מדיום הטבעת רקמות מומסות טרי. שינוי פעמים הבינוניות יותרבמהלך היום.
- יום 4: רקמת שינוי הטבעה בינונית פעם בבוקר. חזור אל 60 ° C בתנור עד אחר הצהריים.
- בלוקים יצוקים
- מניח תבניות הטבעה על צלחת חמה של תחנת הטבעת רקמות. שימוש במלקחיים להעביר את דגימות רקמה על תבניות הטבעה עם המשטח החתוך כלפי מטה. הוספת כספים את התבנית עם פרפין המומס ומניח את טבעת ההטבעה על גבי התבנית. מעבירים לצלחת קר עד פרפין יש הקרושה. אחסן את אבני פרפין ב 4 מעלות צלזיוס בכלי אטום עם ג'ל סיליקה.
2. חתך וחלק כנה
- חותכים 10 מיקרומטר חלקים על microtome 25.
- בדוק סרטים ולבחור חלקים החציוני. סעיפי חציון הם אלה הכוללים את SAM, אשר נראה כמו כיפה של תאים המוקפים primordia עלה.
- סעיפי הר בשקופיות.
- מקום שקופית מתאימים LM (או RNase חינם אואפוי) על 42 מעלות צלזיוס להחליק חם ולהחיל כמה טיפות של תמיסת אתנול 50% כדי לכסות את השקופית.
- Float מדורי פתרון אתנול עד בסעיפים הרחיבו.
הערה: צפים חלקים על פתרון אתנול ולא מים שומר RNA במצב זירז צמצום השפלה RNA. - הטה שקופיות ולהסיר פתרון אתנול עודף ידי שאיפה עם טפטפת העברת הפנויה. השתמש מגבונים ללא סיבים כדי פתיל משם כל פתרון אתנול נוסף.
- מגלשות יבשות ב 42 מעלות צלזיוס במשך כמה שעות או לילה. חנות מחליקה על 4 מעלות צלזיוס בכלי אטום עם ג'ל סיליקה.
- Deparaffinize מחליק ביום שימוש.
- כן שלוש צנצנות הזכוכית Coplin המכילות; 100% xylenes (xylenes I), 100% xylenes (xylenes II), ו -100% אתנול (~ 50 מ"ל של כל פתרון).
- בעזרת מלקחיים נקיים להעביר שקופיות, לטבול שקופיות xylenes לי למשך 2 דקות, xylenes שנייה למשך 2 דקות, ו 100% אתנול 1 דקות.
- Drain החליקes על מגבונים ללא סיבים ואוויר יבש בטמפרטורת החדר.
Microdissection 3. בלייד, דוגמאות Ligule נדן מ פלסטוכרון 7 ליף primordia
- אבטח את השקופיות על הבמה של מיקרוסקופ LM. השתמש חמש או שש שקופיות עבור כל לשכפל, ניצול חמישה סעיפים לכל שקופית.
הערה: רקמות איגום עבור לשכפל יחיד מתוארת באיור 5. - בדוק שקופיות ולזהות חמשת הסעיפים החציוני ביותר על כל שקופית, באמצעות איפקס SAM כנקודת התייחסות מרכזית.
הערה: ניתן לעשות זאת בהגדלה נמוכה, בדרך כלל מטרת 5X מספיקה. - באמצעות אובייקטיבי 10X או 20X, לזהות את המיקום של ligule על primordium עלה פלסטוכרון 7 של כל קטע. Ligule יהיה גלוי כבליטה הבולטת ממשטח adaxial של primordium עלה. סמן עמדה זו באמצעות כלי הציור של תוכנת LM; בחר את סמל העיפרון, להזיז את הסמן positi המתאיםעל ולחץ וגרור את העכבר כדי לצייר.
הערה: מטרת 10X או 20X מתאימה זה בשלבים הבאים. בעת שימוש בסעיפים לרוחב, שני הצדדים של כל primordium עלה יהיו נוכחים בכל (איור 2 א) בסעיף. - באמצעות הכלי השליט ואת כלי ציור המלבניים, למדוד 100 מיקרומטר מלבנים גבוהים מרוכזים על ligule של כל מקטע (מלבנים אדומים, איור 2 א, 2 ב). אלה יהיו מדגם "Ligule".
- כדי להשתמש בכלי השליט; בחר בסמל שליט, להזיז את הסמן לקצה אחד של האובייקט כדי להימדד, לחץ וגרור כדי למדוד את האובייקט. אורכו של השליט יוצג על המסך.
- כדי לצייר מלבן; בחר בסמל מלבן, להזיז את הסמן לנקודה כי יהיה בפינה אחת של המלבן, לחץ וגרור כדי לצייר מלבן בגודל המתאים. לחלופין, בחרו בכלי ציור קו ישר לצייר ארבעה קווים ישרים.
- מדוד 100 מיקרומטר מלבנים ממוקמים 50 מיקרומטר מעל ומתחת המלבן "Ligule".
הערה: אלה יהיו "בלייד" ו "נדן" דגימות, בהתאמה (ירוק וכחול מלבנים, איור 2 א, 2 ב). בהתבסס על נתונים היסטולוגית שלנו, מלבן 100 מיקרומטר מקיף באזור ligule כולו. חלקים בגודל שווה של להב נדן נבחרו על מנת להבטיח כי כמויות דומות של רקמות נאספו עבור כל אחד. מרווחים של 50 מיקרומטר שימשו כדי לוודא ששום רקמה באזור ligule כלול בשוגג microdissections להב או נדן.
- Microdissect נמדד מלבנים (איור 2 ד - 2F) 7, 8, 9, איסוף Ligule, דגימות להב נדן צינורות נפרדים. השתמש בפונקציה לחתוך לייזר לחתוך את קטע רקמה לאורך קו המתאר של התחום הנבחר. השתמש CATAפונקציה פולטת כדי להניע את המלבן של רקמות את השקופית לתוך המכסה של הצינור (איור 2 ד - 2F).
Microdissection 4. של בלייד, Ligule נדן Adaxial עוריות דוגמאות מן פלסטוכרון 7 ליף primordia
- בחר קטעים ולהשתמש בכלי בסרגל למדוד 100 מיקרומטר מגזרים גבוהים מרוכזים על ligule פלסטוכרון 7, כמפורט בסעיף 3 (לעיל).
- בחר את תאי אפידרמיס adaxial רק של כל 100 מיקרומטר "בלייד" גבוה במגזר "נדן" (בחירות ירוקות והכחולות, איור 2 ג) על ידי בהתוויית עם כלי הציור. האפידרמיס הוא שכבת התאים החיצונית; בצד adaxial הוא הקרוב ביותר אל SAM.
- למדגם "Ligule", לבחור רק את התאים של בליטה ligule המתעוררים כמפורט בסעיף 3.3 (מבחר אדום, איור 2C).
- באזורים נבחרים Microdissect, איסוף Blade, Ligule ושייה האפידרמיס דגימות צינורות נפרדים, כמתואר בסעיף 3.5.
Microdissection 5. פלסטוכרון 6 ליף primordia מ lg1-R ואחים wild-type
- לגדול תוך הפרדת משפחות של מוטציה (lg1-R) וצמחי בר-סוג.
- תקן ותהליך לירות apices עבור LM, כמפורט בסעיפים 1.2-1.4. תקן wild-type ו מוטציה לירות apices צלוחיות נפרדות על מנת לשמור אותם נפרדים. דוגמאות מאותו השתילה צריכות להיות קבועות ומעובד הכלאה באתרה.
- לקבוע היכן lg1 הוא עבד ב אחי wild-type, על ידי ביצוע lg1 הכלאה באתרו 6, 26, 27. נמדד מצבה של הצטברות תמליל lg1 מבסיס העלה primordium בדגימות מרובות (איור 1E).
- בהתבסס על נתונים כולים באתרו, לבחור חלק פרימו עלהrdium המקיף את האזור שבו lg1 הוא עבד. במקרה זה, 400-900 מיקרומטר מבסיס primordia עלה פלסטוכרון 6 (מלבנים סגולים, איור 2 א).
- Microdissect שנבחרו חלק primordia עלה, כמתואר בסעיף 3.5, איסוף lg1-R ודוגמאות wild-type צינורות נפרדים.
6. החל RNA הפקת ההצפה
- החל 50 μl חיץ מיצוי RNA לרקמות microdissected והמשך עם מיצוי RNA. המשך עם מיצוי RNA, הגברת RNA, בניית ספרייה, רצף וניתוח ביואינפורמטיקה כמתואר התייחסות 6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
באמצעות סכימת LM התווה באיור 2, כ 1,000,000-1,500,000 מיקרומטר 2 של רקמות נאסף עבור כל לשכפל כל-תא-שכבות LM (איור 5), ו -200,000 מיקרומטר 2 לכל לשכפל עבור LM האפידרמיס adaxial. כ 2,500,000 מיקרומטר 2 של רקמות נאספות עבור כל לשכפל LM של lg1-R ו- primordia עלה wild-type. שני סיבובים של הגברת RNA ליניארי ניב מיקרוגרם כמויות של רנ"א עבור כל לשכפל. כמות RNA המתקבלת מכל microdissection הניתנת תהיה תלויה גודל תא פעילות תעתיק כמו גם את כמות רקמת בשבי. היושרה של RNA תשפיע על היעילות של הגברת RNA.
הצטברות תמליל נותחה בכל שכבות התאים של אזורי הלהב, ligule נדן וכן סך של 2,359 DE genes נמצא, עם שיעור גילוי שווא (FDR) של <0.05 (איור 6 א). באופן ספציפי, 1,714 גנים היו DE בין ligule להב, 1,044 גנים היו DE בין ligule נדן, ו 657 גנים היו DE בין הלהב לבין נדן (כמה גנים DE בלמעלה מ השוואה אחד). גנים סווגו שהוגברו באזור ligule אם הם היו שהוגברו משמעותי בשתי ligule לעומת להב ligule לעומת נדן. ב כל LM שכבות התאים, 373 גנים היו שהוגברו משמעותיים באזור ligule.
הצטברות תמליל נותחה להב האפידרמיס adaxial, אזורי ligule נדן וכן סך של 3,128 גני DE נמצא; 1,971 גנים היו DE בין ligule להב, 2,032 גנים היו DE בין ligule נדן, ו -871 גנים היו DE בין הלהב לבין נדן (איור 6). 287 גנים היו שהוגברו משמעותית ligule לעומת להב ו- EP נדן idermis.
נתונים עבור גנים נבחרים, שהוגברו באזור ligule מוצגים בלוח 1 ואיור 7. ראשוני בניתוח כלאה באתרו ציין כי תמלילי lg1 לצבור דווקא PLB ואת ligule המתעוררים של primordia עלה wild-type, וכי lg1 הוא עבד יותר גבוה באפידרמיס מאשר שכבות תאים פנימיות (איור 6 ג). LM נתוני seq RNA כי התקבלו עולה בקנה אחד עם תוצאה זו; הצטברות תמליל lg1 היא גבוהה משמעותי ligule מאשר אם להב או נדן הוא LM אפידרמיס LM של כל שכבות התאים (טבלת 1, איור 7 א). יש lg1 לאלף הופעות גבוהות בניתוח אפידרמיס מאשר הניתוח של כל שכבות התאים, הדומות לתרחיש באיור 8C.
gether.within-page = "1"> ns1 היה upregulated משמעותי באזור ligule הוא כל שכבות תאי LM ואת LM האפידרמיס adaxial (טבלת 1, איור 7). ממצא זה אושר על ידי הכלאה באתרו, אשר מראה כי תמליל ns1 מצטבר במיוחד קצה ligule המתעוררים (איור 6 ד). יש ns1 ספירה לקרוא הרבה יותר גבוהה בניתוח LM האפידרמיס בלבד מאשר LM של כל שכבות התאים (19.6 CPM ו -2.7 CPM, בהתאמה) עקב דילול לפרוטוקול ב כל השכבות LM. אפקט דילול זה מתואר באיור 8 א. באופן דומה, GRMZM2G101682, גן של תפקוד לא ידוע, היו ספירה לקרוא ממוצע גבוה ב LM אפידרמיס ligule מאשר כל שכבות LM (טבלה 1, איור 7C). באתרו הכלאה גילתה כי תעתיק הגן הזה גם מצטבר הכי חזק בתאי האפידרמיס (איור 6E). ZM PIN1a לא היה DE משמעותי בניתוח כל שכבות תאים, אבל היה upregulated משמעותית ligule בניתוח האפידרמיס בלבד (טבלה 1, איור 7D). זהו ככל הנראה בגלל ZM PIN1a מבוטא בכמות גבוהה ברקמות וסקולרית וזה הבדלים L2 הנגזרות ביטוי וסקולרית מקעקעת בצבירת ZM PIN1a באפידרמיס כשכל שכבות תאים נאספים (איור 6F). תרחיש דומה מתואר באיור 8B.
כדי לזהות גנים הם DE מוטנטים lg1-R, הצטברות תמליל הושוותה באזור מוגדר של wild-type ו lg1-R primordia עלה P6. תשעים ושישה גנים היו DE ב lg1-R (FDR <0.05); 59 היו downregulated מוטנטים lg1-R, ו -37 היו שהוגברו. נתונים עבור גנים נבחרים הנמצאים DE <em> מוטציות lg1-R מוצגים בלוח 2. bel14 הוא אחד מ -34 גנים שהוגברו הן באזור ligule ב primordia עלה wild-type downregulated מוטנטים lg1-R. באתרו הכלאה אישר כי תמלילי bel14 להצטבר באזור preligule בצמחים wild-type אך לא באזור המקביל primordia עלה lg1-R 6.
איור 2: תכנית עבור microdissection ליזר של תחומים קדמוניים עלה. (א) בסעיף האורך לרוחב של איפקס תירס לירות מעובד עבור LM. קופסאות לציין אזורים שנבחרו עבור microdissection. רקמה באזור Ligule (תיבה אדומה) הייתה microdissected מ 100 מיקרומטר מלבנים גבוהים, מרוכז על PLB. טרום להב (ירוקה) וטרום-נדן (כחול) רקמה נלקח 100 מיקרומטרמלבנים 50 מיקרומטר מעל ומתחת מבחר preligule בהתאמה. עבור השוואה של wild-type ו transcriptomes lg1-R, רקמה בין 400-900 מיקרומטר מבסיס primordia עלה P6 היה microdissected ממקטעים לרוחב (קו מקווקו סגול). (ב) תקריב של primordium ואזורי P7 שנבחר עבור microdissection של כל שכבות התאים. (C) תקריב של primordium ואזורים P7 שנבחרו עבור microdissection של האפידרמיס adaxial. (ד) Preligule באזור primordium P7 לפני microdissection. ראש החץ מציין מיקום של ייזום ligule. (E) הקו האדום מציין את האזור שנבחר עבור microdissection. הלייזר יהיה לחתוך לאורך הקו הזה. מעגלים מצביעים נקודות שבן פעימות ליזר תהיינה מעוטות רקמות. (F) primordium לאחר microdissection. מעגלים מצביעים נקודות שבן פעימות ליזר יש הזניקו רקמות. SAM = לירות meristem הפסגה. P מציינת מספר פלסטוכרון. ברי סולם = 100 &# 181; מ. נתון זה יש הבדל בין התייחסות 6 (אגודה האמריקנית זכויות יוצרים של ביולוגי צמח). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: האזור שנבחר עבור LM משפיע ספירה לקריאה עבור גני דה לאורך primordium עלה. (א) מיקום מדויק של האזור שנבחר עבור היחסי LM ציוני דרך מורפולוגיים מפחית וריאציה עבור גנים מתבטאים שיפוע לאורך ציר העלה. בשנת משכפל 1-3 על שמאל, בחירות מרוכזות על ligule המתעוררים וכתוצאה מכך הווריאציה נמוכה. בשנת משכפל 1-3 בצד ימין, מיצוב של האזור שנבחר עבור LM אינו עולה בקנה אחד וכתוצאה מכך הווריאציה מוגברת. (ב) microdissecting ים בגודל בעקביותהבחירות מפחית וריאציה (משכפל 1-3 על משמאל) לעומת microdissecting בחירות בגדלים שונים (משכפל 1-3 מימין) עבור גנים עם דפוסי ביטוי ספציפי ligule. תמלילים הם יותר מדוללים מבחר הגדול, וכתוצאה מכך ספירה לקרוא נמוך יותר, מרוכז יותר בבחירה הקטנה, וכתוצאה מכך ספירה לקרוא גבוהה. קריקטורות מייצגות סעיפים האורך באמצעות primordia עלה באזור ligule. ראש החץ מציין ייזום ligule. CPM = ספירת למיליון. SD = סטיית תקן. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4: Dissection של שתיל תירס עבור חלקים לרוחב. (א) שני שבועות בן שתיל תירס ניכר בצומת שורש-לירות. הסר fr פרוסות דקותאום בבסיס לירות (1) עד סגלגל קטן של culm גלוי בבסיס של לירות. הפוך רוחבי לחתוך כ 10 מ"מ מעל הבסיס (2) ולשמר גליל זה. (ב) צילינדר של רקמות אוריינטציה כה שפל הוא פונה כלפי מעלה. הערה סגלגלה של culm המוקף עלה. בשני חתכים אורכיים מקביל לציר לרוחב (3 ו -4). שמור ולתקן פרוסה מרכזית של רקמות, חלק זה יכלול את SAM ו primordia עלים צעיר. (C) קריקטורת ממחישות מטוס סעיף לרוחב (קו מקווקו ירוק) דרך קודקוד לירות. עיגול אדום עולה midrib, חץ אדום עולה בשולי primordium עלה אפור. כחול קו מקווקו: ציר midrib-השוליים. סרגל קנה מידה = 1 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5: קריקטורה הממחישות ואיגום רקמות לייזר microdissected עבור לשכפל אחד באזור ligule. רקמות microdissected מחמש לשש שקופיות הוא נקווה עבור כל לשכפל. חמשה חלקי חציון כל שקופית משמשים ושתי בחירות (מלבנים אדומים) עשויות כל קטע. כל מלבן הוא כ 20,000 מיקרומטר 2. רקמות לכל לשכפל נאספות בצינור נפרד (סגלגל כחול). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 6: מספר גני DE בהשוואות pairwise בין אזורים עלו ב כלאה באתרו של גני DE שנבחרו. (א) מספר גנים DE בהשוואה pairwise ביןלהב, אזורי ligule נדן, LM של כל שכבות התאים. (ב) מספר גני DE בהשוואת pairwise בין להב, אזורי ligule נדן, LM של האפידרמיס adaxial בלבד. (C) lg1 באתרו הכלאה. (ד) ns1 הכלאה באתרה. (E) GRMZM2G101682 הכלאה באתרה. (F) ZmPIN1a הכלאה באתרה. DE: לידי ביטוי באופן דיפרנציאלי. Up in L: עד ב ligule, Up in B: עד להב. למעלה S: עד בנדנה. ראשי חץ ב CF מצביעים המתעוררים ligule. חץ F מציין הצטברות תמליל ברקמות וסקולרית. ברים בקנה מידה = 100 מיקרומטר. נתון זה יש הבדל בין התייחסות 6 (אגודה האמריקנית זכויות יוצרים של ביולוגי צמח). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
t = "איור 7" src = "/ files / ftp_upload / 55004 / 55004fig7.jpg" />
איור 7: ייצוג גרפי של נתונים עבור גני DE שנבחרו. איור ממחיש הנתונים המוצגים בלוח מספר 1 בתוצאות הכלאה באתרו. קריקטורות מייצגות סעיפים האורך באמצעות primordia עלה. כחול כהה מציין הצטברות תמליל עבור גן מסוים. תיבות ירוקות, אדום וכחול מצביעות אזור שנבחר עבור microdissection עבור להב, דגימות ligule נדן. קריקטורות מהשמאל להמחיש LM של כל שכבות התאים. קריקטורות מימין להמחיש LM של האפידרמיס adaxial בלבד. האפידרמיס adaxial, Ab:: מודעות האפידרמיס abaxial, CPM: ספירת למיליון, כוכבית מציינת הבדל משמעותי בין שני תחומים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
"Src =" / files / ftp_upload / 55004 / 55004fig8.jpg "/>
איור 8: קריקטורה הממחישות כיצד לקרוא ספירה עבור גני היפותטית DE להשתנות בהתאם לאזורים המדויקים שנבחרו עבור microdissection. (א) ג'ין עם ביטוי ligule הספציפי. (ב) ג'ין לידי ביטוי ligule וברקמות וסקולרית. (C) ג'ין לידי ביטוי במיוחד באזור ligule בכל שכבות תאים אך עם ביטוי גבוה של האפידרמיס. (ד) ג'ין הביע באזור ligule, שכבות תאים L2 הנגזרות בלבד. קריקטורות מייצגות סעיפים האורך באמצעות primordia עלה. כחול כהה מציין הצטברות תמליל עבור גן מסוים. תיבות ירוקות, אדום וכחול מצביעות אזור שנבחר עבור microdissection עבור להב, דגימות ligule נדן. קריקטורות מהשמאל להמחיש LM של כל שכבות התאים. קריקטורות מימין להמחיש LM של האפידרמיס adaxial בלבד. מודעות: האפידרמיס adaxial, Ab: האפידרמיס abaxial, CPM: cou nts למיליון. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
טבלה 1: נבחר גנים שהוגברו ב ligule בראשיתי. ספירה למ': ספירה למיליון תמלילים כולל, כלומר של שלושה משכפל, logFC = יומן בסיס 2 שינוי פולד, FDR.BH: שיעור תגליות שגוי פי Benjamini ו הוכברג שיטה. כל השכבות: LM מכל שכבות התאים. האפידרמיס: LM של האפידרמיס adaxial בלבד. נתון זה יש הבדל בין התייחסות 6 (אגודה האמריקנית זכויות יוצרים של ביולוגי צמח). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של השולחן הזה.
e 2 "src =" / files / ftp_upload / 55004 / 55004tbl2.jpg "/>
טבלה 2: נבחר גנים DE מוטנטים lg1-R. ספירה למ': ספירה למיליון תמלילים כולל, כלומר של שלושה משכפל, logFC = יומן בסיס 2 שינוי פולד, FDR.BH: שיעור תגליות שגוי פי Benjamini ו הוכברג שיטה. נתון זה יש הבדל בין התייחסות 6 (אגודה האמריקנית זכויות יוצרים של ביולוגי צמח). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של השולחן הזה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
עיצוב ניסיוני מהווה גורם קריטי בניסויים seq-RNA. שיקולים עיקריים הם התחום המדויק (הים) ו לשלב ההתפתחותי (ים) להיות מנותחים, ומה השוואות תיעשינה. זה חיוני כדי לחשוב במונחים של השוואות, מאז הפלט הוא בדרך כלל רשימה של גנים אשר עברו דה בין שניים או יותר תנאים. כמו עם כל הניסויים, חשוב לשנות רק משתנה אחד בכל פעם. לדוגמה, כאשר משווים תחומים עלה שונים, משאיר מאותו גיל ובכל שלב התפתחותי, גדל בתנאים זהים יש להשוות.
מטרת המחקרים הללו היתה לזהות גנים כי הם במיוחד למעלה או למטה מוסדר באזור ligule של primordia עלה wild-type, ולזהות גנים הם DE מוטנטים lg1-R לעומת wild-type. אנחנו ראשונים למדנו את המורפולוגיה של primordia עלה בפיתוח התבנית של הצטברות תמליל lg1. ציוני דרך מורפולוגיים ומולקולריים אלה were המשמש לבחירת תחומים מדויקים עבור 14 LM, 15, 16. בניסוי הראשון, הצטברות תמליל באזור ligule הושוותה לאזורים אחרים מאותו primordia עלה, ובכך לחסל הבדלים בשל תנאי גידול, רקע גנטי, שלב התפתחותי, ו וריאציה צמח ל-צמח. כדי להשוות מוטציה wild-type, יש צורך לקבוע מתי והיכן הגן של עניין מתבטא. אנו ממליצים לנתח את דפוס הביטוי או על ידי הכלאה באתרו או immunolocalization ובחירת האזור LM שמקיף את התחום של ביטוי גנים. חשוב תחומים מקבילים מושווים וכי הרקע הגנטי זהה עבור שניהם wild-type המוטציה.
הדיוק של microdissections יכול להיות מאומת על ידי בדיקת ספירה לקרוא גנים באים לידי ביטוי באופן ספציפי בתחום של עניין, אם suגני ch ידועים. זה יכול להיעשות גם על ידי ביצוע RT-PCR על RNA חילוץ מרקמות LM לפני קבלת ספריות עבור סידור. בניסויים המתוארים כאן, lg1 שמש כביקורת על LM אזור ligule, מאז ההכלאה באתרו ניתוחית הראתה כי ביטוי lg1 הוא ספציפית PLB ומתפתחת ligule 5, 6.
בשונה משיטות כגון RT-qPCR, שבו גן המועמד (ים) חייב להיות ידוע, RNA-seq מכמת הצטברות של כל התמלילים ב דגימת רקמה נתונה. לפיכך,-seq RNA LM היא שיטה שימושית כדי לזהות גנים מועמדים. דוגמא ממחקר זה היא GRMZM2G101682, גן של פונקציה ידועה כי יש דפוס ביטוי בולט ligule הספציפי (האיור 6E). גם מחקר זה זיהה גנים הם DE ב lg1-R, כגון bel14, אשר לא היו מעורבים בעבר כממלא מקום במורד הזרם של lg1. ב תיהים למשל, ההשוואה של ערכות נתונים מרובות (שהוגברה באזור wild-type ligule ודה ב lg1-R) הייתה בעיקר אינפורמטיבי. חשוב לציין כי את דפוס הביטוי של גן לא להפגין את תפקידיו: וגנטיים עוקבים / או ביוכימיות ניתוחים נדרשים להקים תפקוד גן.
ניתוחי transcriptomic כי הם התמקדו קטנים, תחומי התפתחותיים בדידים, אשר נבדלים באופן דיפרנציאלי ופרטו בקלות, הן המוצלחים ביותר. LM RNA-seq היא שיטה מתאימה עבור ניתוחים כאלה ויש לו הפוטנציאל להיות מיושם על תופעות התפתחותיים רבות. היא מתאימה במיוחד לזהות ביטוי גני הפרש מוטנטים של גנים הגבילו מרחבית דפוסי ביטוי, או מוטציות המשפיעות פיתוח של מבנים ספציפיים. זה עלול לחול גם על תהליכים המתרחשים בתאים ספציפיים לזיהוי או רקמות, כגון האפידרמיס או כלי דם, ויש בו נעשה שימוש בניתוח transcriptomic תירס לירות meristem הפסגה (SAM) ontogeny 16. זה פחות מתאים ללימוד הפונקציה של גנים המתבטאים בכל מקום בגוף או לתהליכים המתרחשים בכל התאים. השיטות שהוצגו כאן יושמו בהצלחה למגוון של מיני צמחים (תירס, דורה, Ocimum, נענע ו לוֹעַ הָאֲרִי) ומבנים (primordia עלה, meristems, קני שורש ו trichomes).
LM אינה נדרשת כאשר ניתוח כרוך תחומים גדולים יחסית. ואכן, RNA-seq על איברים יד-גזור או כולו שימש בהצלחה לזהות גנים DE בצמחים 14, 15. גישה זו יש את היתרון של להיות פחות עבודה אינטנסיבית וללא ניסיון עם טכניקות היסטולוגית נדרש. עם זאת, יש מגבלות הדיוק של וניתוחי יד, כלומר לנתיחת יד היא פחות מתאימה ללימוד ד מוקדםתהליכי evelopmental.
עבור LM RNA-seq מוצלחת מנתח תופעות התפתחותיות, בהקשר התפתחותי חייב להיות מאופיין היטב. אנו ממליצים התחייבות בדיקה היסטולוגית יסודית של התהליך או תחום עניין לפני תכנון ניסוי. היסטולוגיה של דגימות מעובד עבור LM היא עניה בדרך כלל, מאז הרקמות בלא כתם והם לא מקובעים עם מכסה מחליק המספקים עומק השדה. לכן, כדאי לתקן דגימות נפרדות עבור מכתים ותצפית בעת ובעונה אחת כמו דגימות LM שתוקנו (איור 1 ג, ו-ד ').
RNA המתקבל חומר LM הוא מקוטעת כלל לבין התשואה הכוללת היא נמוכה 8. צעד הגברה נדרש לייצר RNA מספיק להכנת הספרייה 28. אורך RNA שבר יש לבחון לאחר הגברה ולפני דור ספרייה. אורך קטע ממוצע של several מאה זוגות בסיסים נחשבים טובים בדרך כלל, 500 זוגות בסיסים מצוינים. תשואת RNA מסכן עלולה לגרום אם הרקמה אינה קבועה היטב, אם שפלה בשל RNase זיהום מתרחש, או אם בלוקי פרפין מאוחסנים בצורה לא נכון. זה יעזור לבדוק את איכות רקמה קבועה בתקופה שלא יפחת משפט LM של אזור גדול יחסית לפני המקדיש הרבה זמן כדי microdissecting תחומים קטנים מאוד. מכיוון RNA המתקבל תאי LM הוא מקוטעת והגברה באמצעות אוליגו פריימר dT משלב הטיה 3 חזקה ', שיטה זו אינה מתאימה לאיתור תמלילים חלופיים כגון הגירסות אחוי. גם הוא LM מתאים לאיתור RNA הקטן.
שיטה חלופית לכמת הצטברות תמליל ברקמות ספציפיות או תחומי הסלולר הוא RNA-seq של תאים המופרדים על ידי קרינה הופעלו מיון תאים (FACS) 21. שיטה זו בדרך כלל דורשת זיהוי של גן סמן מתאים את האזור של עניין,הדור של צמחים מהונדסים מבטא חלבון פלואורסצנטי-מתויג protoplasting. FACS בשילוב עם microarray נעשה שימוש כדי ליצור מפת ביטוי של שורש ארבידופסיס ידי הפרדת תאי מבטאי יזמי סוג תא ספציפי בשורש 22, 23. FACS של רקמות לירות היא אתגר גדול יותר מאשר רקמות השורש בשל autofluorescence כלורופיל 24. הגבלה של LM היא כי תחום העניין חייב להיות מזוהה בסעיפים היסטולוגית. FACS עשוי להיות שיטה מתאימה יותר במקרים בם גן סמן מתאים זמין. הבחירה של אילו תאים או רקמות לבודדות ולהשוות היא שיקול חשוב בניתוחי transcriptomic העושים שימוש בשתי FACS או LM.
הנתונים המוצגים כאן להמחיש כי תוצאות שונות תושגנה בהתאם התחומים המדויקים שנבחרו עבור LM (איור 3, איור 8). תמלילי הגנים באים לידי ביטוי אחד או מספר תאים, כגון ns1, ידוללו כאשר תחומי רקמה גדולים מנותחים. סביר להניח שאם primordia עלה כולו נדגמו, תמליל ns1 לא להתגלות. ZmPIN1a הוא שהוגבר משמעותי ligule לעומת האפידרמיס להב נדן אבל ההבדל הזה הוא מבולבל ידי ביטוי וסקולרית כאשר כל שכבות התאים נדגמים. לעומת זאת, הגנים באים לידי ביטוי רק שכבות תאים שמקורם L2 לא יזוהו כאשר רק האפידרמיס ידגמו (האיור 8D). מחקר זה מוכיח כי, בעוד LM RNA-seq הוא כלי רב עוצמה לאיתור ההבדלים בביטוי הגנים במהלך המורפוגנזה, התחומים שנבחרו לניתוח הם קריטיים להצלחת הניסוי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
המחברים מודים ס הייק עבור נמשכת, שיתוף פעולה ועידוד דיונים על פיתוח ligule. עבודה זו נתמכת על ידי הקרן הלאומית למדע מענקים MCB 1052051 ו IOS-1,848,478.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Diethyl pyrocarbonate | Sigma-Aldrich | 159220 | Used for RNase treatment of solutions |
| Razor blades | Electron Microscopy Sciences | 72000 | |
| RNase Zap | Sigma-Aldrich | R2020-250ML | RNase decontamination solution |
| Ethanol absolute 200 proof | Fisher Scientific | BP28184 | |
| Acetic acid, glacial | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Glass vials - 22 ml | VWR | 470206-384 | |
| Xylenes, histological grade | Sigma-Aldrich | 534056-4L | |
| Paraplast plus | Sigma-Aldrich | P3683-1KG | |
| Disposable base molds, 15 mm x 15 mm x 5 mm | VWR | 15154-072 | |
| Embedding rings | VWR | 15154-303 | |
| Silica gel packets | Electron Microscopy Sciences | 71206-01 | Desiccant for storage of paraffin blocks |
| Oven | Fisher Scientific | 15-103-0503 | Oven must maintain temperature of 60 °C |
| Paraffin embedding station | Leica | EG1160 | |
| Microtome | Leica | RM2235 | |
| Slide warmer | Electron Microscopy Sciences | 71317-10 | |
| Coplin jars | Electron Microscopy Sciences | 70316-02 | |
| Laser microdissector | Zeiss | ||
| KIMWIPES™ Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark Professional | 34120 | Lint-free wipes for wicking excess solutions from microscope slides |
| Membrane Slide 1.0 PEN | Zeiss | 415190-9041-000 | Slides for laser microdissection |
| Adhesive Cap 200 opaque | Zeiss | 415190-9181-000 | Tubes for laser microdissection |
| PicoPure RNA Isolation Kit | ThermoFisher Scientific | KIT0204 |
References
- Becraft, P. W., Bongard-Pierce, D. K., Sylvester, A. W., Poethig, R. S., Freeling, M. The liguleless-1 gene acts tissue specifically in maize leaf development. Dev Biol. 141 (1), 220-232 (1990).
- Sylvester, A. W., Cande, W. Z., Freeling, M. Division and differentiation during normal and liguleless-1 maize leaf development. Development. 110 (3), 985-1000 (1990).
- Moreno, M. A., Harper, L. C., Krueger, R. W., Dellaporta, S. L., Freeling, M. liguleless1 encodes a nuclear-localized protein required for induction of ligules and auricles during maize leaf organogenesis. Genes Dev. 11 (5), 616-628 (1997).
- Emerson, R. A. The inheritance of the ligule and auricle of corn leaves. Neb. Agr. Exp. Sta. An. Rep. 25, 81-85 (1912).
- Moon, J., Candela, H., Hake, S. The Liguleless narrow mutation affects proximal-distal signaling and leaf growth. Development. 140 (2), 405-412 (2013).
- Johnston, R., et al. Transcriptomic Analyses Indicate That Maize Ligule Development Recapitulates Gene Expression Patterns That Occur during Lateral Organ Initiation. Plant Cell. 26 (12), 4718-4732 (2014).
- Schmid, M. W., et al. A powerful method for transcriptional profiling of specific cell types in eukaryotes: laser-assisted microdissection and RNA sequencing. PLoS One. 7 (1), e29685 (2012).
- Kerk, N. M., Ceserani, T., Tausta, S. L., Sussex, I. M., Nelson, T. M. Laser capture microdissection of cells from plant tissues. Plant Physiol. 132 (1), 27-35 (2003).
- Nakazono, M., Qiu, F., Borsuk, L. A., Schnable, P. S. Laser-capture microdissection, a tool for the global analysis of gene expression in specific plant cell types: identification of genes expressed differentially in epidermal cells or vascular tissues of maize. Plant Cell. 15 (3), 583-596 (2003).
- Marioni, J. C., Mason, C. E., Mane, S. M., Stephens, M., Gilad, Y. RNA-seq: an assessment of technical reproducibility and comparison with gene expression arrays. Genome Res. 18 (9), 1509-1517 (2008).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
- Brooks, L., et al. Microdissection of shoot meristem functional domains. PLoS Genet. 5 (5), e1000476 (2009).
- Cai, S., Lashbrook, C. C. Stamen abscission zone transcriptome profiling reveals new candidates for abscission control: enhanced retention of floral organs in transgenic plants overexpressing Arabidopsis ZINC FINGER PROTEIN2. Plant Physiol. 146 (3), 1305-1321 (2008).
- Li, P., et al. The developmental dynamics of the maize leaf transcriptome. Nat Genet. 42 (12), 1060-1067 (2010).
- Eveland, A. L., et al. Regulatory modules controlling maize inflorescence architecture. Genome Res. 24 (3), 431-443 (2014).
- Takacs, E. M., et al. Ontogeny of the maize shoot apical meristem. Plant Cell. 24 (8), 3219-3234 (2012).
- Aida, M., Ishida, T., Tasaka, M. Shoot apical meristem and cotyledon formation during Arabidopsis embryogenesis: interaction among the CUP-SHAPED COTYLEDON and SHOOT MERISTEMLESS genes. Development. 126 (8), 1563-1570 (1999).
- Ishida, T., Aida, M., Takada, S., Tasaka, M. Involvement of CUP-SHAPED COTYLEDON genes in gynoecium and ovule development in Arabidopsis thaliana. Plant Cell Physiol. 41 (1), 60-67 (2000).
- Takada, S., Hibara, K., Ishida, T., Tasaka, M. The CUP-SHAPED COTYLEDON1 gene of Arabidopsis regulates shoot apical meristem formation. Development. 128 (7), 1127-1135 (2001).
- Nardmann, J., Ji, J., Werr, W., Scanlon, M. J. The maize duplicate genes narrow sheath1 and narrow sheath2 encode a conserved homeobox gene function in a lateral domain of shoot apical meristems. Development. 131 (12), 2827-2839 (2004).
- Bonner, W. A., Hulett, H. R., Sweet, R. G., Herzenberg, L. A.
- Birnbaum, K., et al. A gene expression map of the Arabidopsis root. Science. 302 (5652), 1956-1960 (2003).
- Brady, S. M., et al. A high-resolution root spatiotemporal map reveals dominant expression patterns. Science. 318 (5851), 801-806 (2007).
- Carter, A. D., Bonyadi, R., Gifford, M. L. The use of fluorescence-activated cell sorting in studying plant development and environmental responses. Int J Dev Biol. 57 (6-8), 545-552 (2013).
- Ruzin, S. E. Plant microtechnique and microscopy. , Oxford University Press. New York; Oxford. (1999).
- Jackson, D., Veit, B., Hake, S. Expression of maize KNOTTED1 related homeobox genes in the shoot apical meristem predicts patterns of morphogenesis in the vegetative shoot. Development. 120, 405-413 (1994).
- Javelle, M., Marco, C. F., Timmermans, M. In situ hybridization for the precise localization of transcripts in plants. J Vis Exp. (57), e3328 (2011).
- Day, R. C., McNoe, L., Macknight, R. C. Evaluation of global RNA amplification and its use for high-throughput transcript analysis of laser-microdissected endosperm. Int J Plant Genomics. , 61028 (2007).
